שיטה להתאמת Euglena gracilis למצעי קסבה לגידול הטרוטרופי

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את השיטה השלעדית להתאמת Euglena gracilis למצעי קסבה והערכת הצמיחה, הקיימות וייצור הביומסה במגוון מוצרי קסאווה בתנאי גידול הטרוטרופיים.

תקציר

עיבוד קסאווה מייצר תוצרי לוואי עשירים בחומרים מזינים שעדיין לא מנוצלים מספיק בשל הרכב משתנה, תרכובות ציאנוגניות וקהילות מיקרוביאליות פעילות. פרוטוקול זה מציג אסטרטגיית התאמה רב-שלבית להקמת שושלת עמידה לקסאווה של Euglena gracilis המתאימה לגידול הטרוטרופי במצעי קאסבה. השיטה מתחילה בחשיפה סימולטנית של תרביות אוגלנה למדיה של קסאווה מאוטוקלבת ולא מאוטוקלבת ולמדיום ריכוז גארי של 10–30 גרם לליטר, כדי להעריך את הסבילות למורכבות מיקרוביאלית ולעומס הסובסטרטים. התרביות נחשפות לאחר מכן לגרדיאנט ריכוז גבוה יותר של 30–50 גרם לליטר כדי להעריך ביצועים עם תת-קרקעיות צפופות יותר. השושלת המתקבלת מושווית לזן לא מותאם מסוג בר על פני חמישה מוצרי קסאבה; גארי, עיסת עץ מיובשת, כדורים, קליפות ומזון לבעלי חיים להערכת עקביות הצמיחה בחומרים רלוונטיים לשטח. הפרוטוקול כולל מדידת שינויים ב-pH, רמות ציאניד באמצעות רצועות קולורימטריות, והכנת ביומסה מיובשת לניתוח חלבונים בהתבסס על כימות חנקן כולל. ביחד, הליכים אלו מספקים מסגרת שחזורית להתאמת Euglena gracilis לסובסטרטים שמקורם בקסאווה ולהערכת ביצועי הזנים במגוון מוצרי קסאבה. שיטה זו מאפשרת פיתוח שושלות אצות עמידות לשימוש בביו-עיבוד ממוקדי קסבה וביישומי הערכת פסולת.

מבוא

קסאווה (Manihot esculenta) היא גידול מזון ותעשייתי עיקרי ברחבי מערב אפריקה, ומייצר תוצרי לוואי מעובדים כגון גארי, עיסה מיובשת, קליפות וכדורים^1.

תת-החומרים שמקורם בקסאווה מורכבים בעיקר מפחמימות מותססות וחומרים מזינים שאריתיים, וכן תכולת חלבון וסיבים מינורית, אם כי ההרכב יכול להשתנות בהתאם לתנאי העיבוד ולחומר המקור ^2,3. הם עדיין לא מנוצלים מספיק בשל הרכבם ההטרוגני, נוכחות גליקוזידים ציאנוגניים וקהילות מיקרוביאליות מגוונות שנוצרות במהלך עיבוד ותסיסה מסורתיים. מאפיינים אלו מציבים אתגרים לגידול מיקרוביאלי ישיר ומגבילים את שילוב תוצרי הלוואי של הקסאווה בתהליכי עיבוד ביולוגי סטנדרטיים. למרות השפע של תוצרי לוואי שמקורם בקסבה, כיום קיימת כיום מחסור בשיטות שכפוליות וברות-קיימא לגידול מערכות מיקרוביאליות על מצעים כימיים מורכבים ופעילים מיקרוביאלית אלו. מערכת גידול המסוגלת להעשיר או לנקות רעלים של מקור מזון פופולרי כזה, תוך פעולה אמינה בתנאים אלו, תתמוך בתהליכי עבודה ברי קיימא יותר של עיבוד קסווה ובניצול מעגלי של משאבים.

Euglena gracilis היא שוטה חד-תאית בתוך ה-Euglenozoa⁵ , הידועה בגמישותו של הפליקל, המורפולוגיה הדינמית ויכולות ההפיכה שלה, בתגובה לתנודות משמעותיות בזמינות חומרי המזון, בלחץ האוסמוטי ובהרכב הכימי⁶. ההסתגלות המטבולית שלו מאפשרת לו גם לסנתז את הפוליסכרידים פאראמילון⁶ ולוויסות את ה-pH התאית באמצעות מטבוליזם של חומצות אורגניות. תכונות מטבוליות אלו, במיוחד הצטברות פרמילונים, עשויות לשפר את אגירת האנרגיה והסבילות ללחץ, ולתמוך בהישרדות והסתגלות בתנאים משתנים של חומרים מזינים וכימיים המאפיינים את הסובסטרטים שמקורם בקאסבה. תכונות אלו מאפשרות ל-E. gracilis לשרוד בתנאי מים מתוקים משתנים כימית, מה שהופך אותו למועמד מבטיח לגידול על מצעים הטרוגניים ולא מזוקקים⁷.

כאשר נחשפים לסובסטרטים כימיים מורכבים או פעילים מיקרוביאלית, תרביות E. gracilis שאינן מותאמות מציגות לעיתים קרובות תגובות לחץ כגון הגברת האינסיסטמנט והפחתת תנועתיות, בעוד שאוכלוסיות מותאמות עשויות לשמור על מורפולוגיה ופעילות מטבולית יציבות יותר⁸. אינטראקציות עם קהילות מיקרוביאליות קשורות עשויות להשפיע עוד יותר על הביצועים הפיזיולוגיים במהלך חשיפה ממושכת למצעי מורכב. מאפיינים אלו מדגישים את הרלוונטיות של גישות מבוססות הסתגלות בעת גידול E. gracilis על חומרים שמקורם בקסאבה⁹.

כדי להתמודד עם אתגרים אלו, שיטה זו משתמשת באסטרטגיית הסתגלות מדורגת שנועדה להרגיל בהדרגה את E. gracilis למצעי הקסבה. הגישה משלבת חשיפה מבוקרת למורכבות מוגברת של המצע ולפעילות מיקרוביאלית, ומאפשרת בחירת אוכלוסיות המסוגלות לשמור על חיוניות וצמיחה בתנאי גידול הטרוגניים. עיצוב זה מאפשר ל-E. gracilis לקיים אינטראקציה עם המיקרוביום הנלווה, ואולי להפיק מהם יתרונות, ולהסתגל לריכוזי מדיה הולכים וגדלים.

לאחר ההסתגלות, הפרוטוקול מוביל הערכה השוואתית של שושלות E. gracilis מותאמות ולא מותאמות על פני מספר מוצרים שמקורם בקסאבה. מסגרת השוואתית זו מאפשרת הערכה של עקביות צמיחה, יציבות מורפולוגית ותגובות פיזיולוגיות בתנאי תת-קרקע רלוונטיים לשדה, כאשר תהליך ההסתגלות מכין בהדרגה את E. gracilis לניווט בשונות התזונתית, הלחצים הכימיים והפעילות המיקרוביאלית האופיינית לתוצרי לוואי של קסאבה.

השיטה משלבת ניטור סטנדרטי של רמות pH וציאניד¹⁰ במהלך הגידול, וכן הכנת ביומסה שנקצרה לניתוח חלבונים במורד הזרם באמצעות כימות חנקן^{כולל 11}, המאפשרת השוואת פוטנציאל תזונתי בין מצעים וזנים. יחד, מדידות אלו תומכות בהערכת יציבות מטבולית, אינטראקציות עם המצע ומאפייני הביומסה במהלך גידול והתאמה מבוססי קסאווה, כדי להראות כי שושלת E. gracilis מותאמת יכולה לגדול בצורה יציבה ועקבית לאורך מספר תוצרי לוואי של קסאווה.

שיטה זו מתאימה במיוחד לסביבות מחקר מעבדה או יישומי, עם גישה לתשתיות מיקרוביולוגיות בסיסיות ולתת-קרקעיות מקומיות שמקורן בקסאבה. שיקולים מעשיים כוללים את הצורך בטיפול עקבי במדיה הטרוגנית, גישה למיקרוסקופיה למעקב אחר בריאות התרבית, ושליטה קפדנית בערבוב כדי למנוע מאמץ גזירה במהלך הגידול.

פרוטוקול

פרוטוקול זה עושה שימוש בפרוטיסטים שאינם פתוגניים ומצעים צמחיים שמקורם בקסאבה. בצע את כל ההליכים בהתאם לדרישות הבטיחות הביולוגית והבטיחות הכימית המוסדית לחומרים צמחיים ציאנוגניים.

1. הכנה ותסיסה של מדיה מבוססת קסאבה

זהירות: חומרים שמקורם בקסאבה עשויים להכיל גליקוזידים ציאנוגניים ויכולים לשחרר ציאניד מימן בתנאים מסוימים. בצע את כל שלבי השקילה, המים, הערבוב והדגימה בתוך מכסה אדים כימיקלים. לבשו חלוק מעבדה, כפפות ניטריל ומשקפי מגן. ניקו משטחי עבודה לאחר טיפול במצעי קסאווה והשליכו פסולת מוצקה ונוזלית כפסולת כימית מסוכנת בהתאם להנחיות המוסדיות.

1. הכינו מתלים של גארי
   הערה: סוג הבר Euglena gracilis גודל בתנאי חשכה מתמשכים בטמפרטורה של 28°C עם רעידות אורביטליות בעוצמה של 120 x g. הרכב התווך ההטרוטרופי הוכן כנוסחה מוגדרת הכוללת 1.5% גלוקוז, 0.5% תמצית שמרים, 0.1% KH2PO4, 0.1% MgSO4, 0.2% (NH4)2SO4, 0.01% CaCL2.2H2O ועוד 0.4 מ"ל/ליטר של תמיסת מלאי ויטמינים (ויטמין B1: 2.50 גרם לליטר; ויטמין B12: 12.5 מ"ג/ליטר; ויטמין B6: 0.5 מ"ג/ליטר; ויטמין B7: 0.025 מ"ג/ליטר) ו-2.0 מ"ל/ליטר של תמיסת מתכת עקבות (Na2EDTA.2H2O: 25.00 גרם לליטר; FeCl3.6H2O: 21.00 גרם לליטר; ZnSO4.7H2O: 11.0 גרם לליטר; MnCl2.4H2O: 4.0 גרם לליטר; CuSO4.5H2O: 0.39 גרם לליטר; H3BO3: 0.285 גרם לליטר; Na2MoO4.2H2O: 0.9 גרם לליטר).
   1. יש לסמן כל בקבוק סטרילי בנפח 500 מ"ל עם כובע מאוורר עם סוג תת-קרקע (garri), ריכוז יעד (10, 20, 30, 40 או 50 גרם ^L-1), שכפול מזה, ותנאי עיקור מתוכנן (אוטוקלב או לא אוטוקלב).
   2. הנח סירת שקילה על מאזן האנליטי ולחץ על TARE/Zero כדי לכוון את התצוגה ל-0.000 גרם.
   3. שקלו את הגארי כדי להתאים לנפח העבודה הסופי (למשל, ל-300 מ"ל, 3.0 גרם ל-10 גרם ^L-1, 6.0 גרם ל-20 גרם ^L-1, 9.0 גרם ל-30 גרם ^L-1, 12.0 גרם ל-40 גרם ^L-1, או 15.0 גרם ל-50 גרם ^L-1).
      הערה: טווח הריכוזים שנבחר (10–50 גרם ^L-1) תוכנן כך שיכלול תנאים מהצמיחה הבסיסית ועד לעומס סובסטרט גבוה, ולאפשר הערכת התאמה במורכבות פיזיקוכימית הולכת וגדלה.
   4. מוסיפים את הגארי השקול באופן אספטי לכל בקבוק סטרילי בנפח 500 מ"ל המכיל 300 מ"ל מים מזוקקים או מנוטרלים, והחלו מחדש את המכסה המאוורר.
   5. מערבבים כל תלייה למשך 3 דקות, עד שהתערובת מתאחדת באמצעות אחת מהשיטות הבאות.
      הערה: E. gracilis רגיש לגזירה מכנית; לכן, נבחרו תנאי ערבוב כדי למזער את המתח הנגרם מערבבות, תוך שמירה על מגע מספק בין התאים למצע.
      1. לערבוב ידני, הדק את המכסה המאוורר וסובב את הבקבוקון ביד בתנועה מעגלית במשך 3 דקות עד שהמוצקים מתפזרים באופן שווה.
      2. לערבוב מגנטי, הוסף באופן אספטי מוט ערבוב סטרילי לבקבוק, הנח את הבקבוק על צלחת ערבוב, ומכוון את המהירות ל-200 x גרם כדי ליצור מערבולת רדודה בלי להתיז.
   6. תן למתלה להידרדר ללא הפרעה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס).
   7. מיד לפני התסיסה, יש להומגני את התערובת בעדינות על ידי הידוק פקק האוורור וסיבוב הבקבוקים ביד במשך 5 פעמים כדי להחזיר את החומר שיישב.
      הערה: הגארי ששימש במחקר זה היה מוצר מסחרי שמקורו בקסאבה. בהתבסס על מידע תזונתי שסופק על ידי היצרן, הוא כלל בעיקר פחמימות, עם כמויות קטנות של חלבון ותכולת שומן זניחה בלבד. הרכב זה משקף את מצעי הקסאווה המעובדים הטיפוסיים המשמשים בהקשרים של מזון ותעשיית.
2. הכינו מדיה נוספת של מוצר קסבה
   1. יש לתייג כל בקבוק סטרילי בנפח 500 מ"ל עם כובע מאוורר עם סוג המצע (עיסה מיובשת, כדורים, פילינגים או מזון לבעלי חיים), ריכוז (30 גרם ^L-1), שכפול זיהוי ותנאי עיקור (אוטוקלב או לא אוטוקלב).
   2. הנח סירת שקילה על מאזן האנליטי ולחץ על TARE/Zero כדי לכוון את התצוגה ל-0.000 גרם.
   3. שקלו את המצע כדי להגיע ל-30 גרם ^L-1 בהתאם לנפח העבודה (למשל, ל-300 מ"ל, משקל 9.0 גרם).
   4. הוסף את המצע המשוקל באופן אספטי לכל בקבוק סטרילי המכיל 300 מ"ל מים מזוקקים או דה-יוניים והחלו מחדש את המכסה המאוורר.
   5. שתו וערבבו כל מתלה באחת מהשיטות הבאות.
      1. לערבוב ידני, הדק את פקק האוורור וסובב בעדינות את הבקבוקון 10 פעמים כל 3 דקות במהלך תקופת ההידרציה.
      2. לערבוב מגנטי, הוסיפו אספטית מוט ערבוב סטרילי וערבבו ב-200 x גרם עד שהחומר מיובש ומפוזר באופן שווה.
   6. בדקו כל תלייה ויזואלית וודאו שהמוצקים מיובשים ושאין גושים יבשים גדולים שנשארו.
      הערה: אין לסנן מדיום קסאבה אלא אם נדרש למדידה אנליטית במורד הזרם.
3. מדיה מבוססת קסאבה בתסיסה אירובית
   1. ודאו שכל בקבוק מצויד במכסה אוורור סטרילי חדיר לגז כדי לאפשר החלפת גזים תוך מזעור זיהום סביבתי.
   2. הניחו את הבקבוקים זקופים בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס) באזור ייעודי הרחק מאור שמש ישיר ומזרימת אוויר בתנועה גבוהה.
   3. דגרו ללא ערבוב למשך מינימום של 72 שעות.
   4. רשמו את תאריך ושעת תחילת התסיסה עבור כל בקבוק ומצב.
4. הכינו מדיה אוטוקלבת
   1. לאחר התסיסה, ודא שכל בקבוק בנפח 500 מ"ל מכיל ≤300 מ"ל נוזל (≤ שני שלישים מנפח הכולל) כדי למנוע רתיחה במהלך העיקור.
   2. שחרר את הפקק המאוורר למצב "הדוק עד האצבע" המתאים לאוטוקלב והדביק סרט אינדיקציה של אוטוקלאב על הבקבוקון.
   3. טעין בקבוקים לאוטוקלב במגש בטוח לאוטוקלב ובחר במחזור נוזלי P13.
   4. ודאו את פרמטרי הסטריליזציה ל-121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (עיקור נוזלי) והתחלו את המחזור.
   5. לאחר סיום המחזור, אפשר ללחץ תא האוטוקלבה לחזור ללחץ האטמוספרי לפני פתיחת הדלת. הסר את הבקבוקים באמצעות כפפות עמידות לחום ואפשר להם להתקרר לטמפרטורת החדר.
   6. שמרו בקבוקים מקוררים ללילה בטמפרטורת החדר לפני החיסון.
      זהירות: נוזלים חמים ואדים עלולים לגרום לכוויות. פתח את דלת האוטוקלאב לאט והוציא את הבקבוקים רק אחרי שהלחץ התאזן והנוזלים התקררו.
5. הכנת מדיה לא-אוטוקלבת
   1. השתמשו במדיום קסאווה מותסס ישירות ללא אוטוקלבינג לשימור קהילות מיקרוביאליות מקומיות.
   2. חיסון מדיום שאינו אוטוקלב מיד לאחר תקופת התסיסה בת 72 השעות כדי למזער זיהום סביבתי לא מכוון.
   3. שמרו על טיפול עקבי בין הרפליקטים על ידי שימוש באותו סוג כלי (בקבוקי 500 מ"ל סטריליים עם כובע מאוורר), אותו נפח עבודה (300 מ"ל), ואותו משך תסיסה (≥72 שעות) לכל תנאי המצע.

2. הקמת תרבויות ההתחלה של E. gracilis

1. תחזוקה של תרביות אב E. gracilis
   1. החדרו את E. gracilis לתוך מדיום חומרי הזנה הטרוטרופי טריים ודגרו תרביות בחושך מוחלט בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס עם רעידות אורביטליות רציפות בעוצמה של 120 x גרם עד שהתרביות מגיעות לגדילה לוגריתמית אמצעית.
   2. בדקו תרביות באמצעות מיקרוסקופ אור מורכב (brightfield) 100×–400× הגדלה כוללת (10× עיניים עם 10×–40× מטרות) כדי לאשר תנועתיות פעילה, מורפולוגיית תאים מוארכת טיפוסית ורמות נמוכות של אנסיסטמנט.
      הערה: החיוניות הוערכה בהתבסס על נוכחות תאים שלמים עם גבולות תאים מוגדרים ופסולת מינימלית. תנועתיות פעילה הוגדרה כתנועה כיוונית נצפית של תאים בשדה הראייה. היציבות המורפולוגית הוערכה בהתבסס על דומיננטיות של צורות תאים אופייניות ותדירות נמוכה של צורות קורסות או לא סדירות מאוד.
   3. יש לשלול תרביות המציגות פסולת תאית מופרזת, מורפולוגיה לא תקינה או אנסיסטם מוגבר לפני השימוש בניסויי הסתגלות.
2. הכינו את החיסון להתאמה
   1. הומוגניזציה עדינה של תרביות ההתחלה על ידי הידוק פקק האוורור וסיבוב הבקבוקים ביד למשך 15 שניות כדי להבטיח חלוקה אחידה של התאים מבלי לגרום למתח גזירה.
   2. קביעת צפיפות התאים באמצעות המוציטומטר נויבאואר.
      1. ערבבו בעדינות את התרבית על ידי סיבוב ידני למשך 15 שניות.
      2. פיפט 1.0 מ"ל תרבית לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי בנפח 1.5 מ"ל.
      3. נקה את ההמוציטומטר והכיסוי עם 70% אתנול ואפשר להם להתייבש באוויר.
      4. פיפט של 10 מיקרוליטר תרבית על שני הרשתות בהמוקציטומטר ומניח את הכיסוי על הדגימה הרטובה.
      5. באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר (10× מטרה), מתמקדים ברשת וסופרים תאים בקבוצת ריבועים מוגדרת (למשל, ארבעת הריבועים הפינות של הרשת הגדולה).
      6. החלו כללי גבול סטנדרטיים (ספירת תאים שנוגעים בגבולות העליון והשמאלי; החריגו תאים שנוגעים בגבולות התחתונים והימניים).
      7. ספירת חזרה על התא השני (ו/או טעינה מחדש) ומחשבת את ממוצע התאים למילילטר.
      8. חשב צפיפות תאים באמצעות המשוואה הבאה: תאים/מ"ל= (ממוצע תאים לריבוע × 10⁴× מקדם דילול)/1
         הערה: כדי לשפר את הדמיית התאים, דילל את הדגימה במים דה-יוניים לפי הצורך (למשל, לקחת אליקו של 100uL דגימה ולדלל ב-600 מיקרול מים דה-יוניים, וחזור על הערכת צפיפות התא)
   3. כוונן את נפחי החיסון כדי להשיג חיסון סופי של 5% (v/v) בכל המדיות הניסיוניות.
      הערה: יחסי האינוקולום הנבחרים נבחרים כדי להבטיח צפיפות תאים ראשונית מספקת ותחזוקה של התרביות.
   4. הכינו חיסון נפרד לכל מצב טיפול כדי לשמור על צפיפויות תאים ראשוניות עקביות בין קבוצות ניסוי.

3. התאמה ראשונית במדיה של קסאווה עם אוטוקלב ולא אוטוקלב

1. מדיה להסתגלות לחיסונים
   הערה: נפחי האינוקולום נבחרו כדי לאזן צפיפות תאים התחלתית מספקת עם רגישות להשפעות הסתגלות, כאשר נפחים נמוכים יותר שימשו במהלך ההסתגלות המוקדמת ונפחים גבוהים יותר לשמירה על תרביות יציבות במהלך מעבר שגרתי.
   1. הוסף את ה-E. gracilis inoculum המוכן למדיום קסאווה מאוטוקלב ולא מאוטוקלב שהוכנה בריכוזי גארי סופיים של 10 ^gL-1, 20 ^gL-1 ו-30 ^gL-1.
   2. השתמש בנפחי חיסון שווים בכל תנאי הטיפול כדי לתקן את צפיפות התא ההתחלתית.
   3. כדי לערבב את התרביות, הדק את הפקק המאוורר וסובב את הבקבוקון בעדינות בתנועה מעגלית למשך 15 שניות כדי לפזר את התאים.
   4. דגרו תרביות בחושך מוחלט בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס כדי להתחיל בצמיחה הטרוטרופית.
2. שמירה על תנאי התרבות
   1. במדיה שאינה אוטוקלב, יש למזער ערבוב כדי לשמור על מבנה הקהילה המיקרוביאלית המקומית ושיבוץ הסובסטרטיפיקציה.
   2. ערבבו את כל התרביות פעם ביום באמצעות סיבוב ידני עדין למשך 15 שניות כדי לשמור על מגע בין תאי E. gracilis לחומר הקסאווה התלוי.
      זהירות: הימנעו מרעידות עזות או ערבובות מתמשכות כדי למנוע מאמץ גזירה והפרעה לא מכוונת של אינטראקציות מיקרוביאליות-מצע.
3. לעקוב אחרי ההתאמה המוקדמת
   1. כל 48 שעות, אוספים דגימות אספטיות של 1 מ"ל מכל תרבית באמצעות קצות פיפטות סטריליות.
      1. הדק את הפקק המאוורר וסובב בעדינות את בקבוק התרבית במשך 15 שניות לפני הדגימה כדי להבטיח חלוקה אחידה של התאים והחומר התלוי.
      2. העבר אליקו של תרבית לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי בנפח 1.5 מ"ל.
      3. דילל את הדגימה במים דה-יוניים לפי הצורך כדי לשפר את ההדמיה של התאים הבודדים. (למשל, 100 מיקרוליטר דגימה מדוללת ב-600 מיקרוליטר מים דה-יוניים).
      4. הכינו סלייד מיקרוסקופ רטוב על ידי פיפטרינג של 10 מיקרו ליטר מהדגימה המדוללת על סלייד וכיסוי נקי עם סלייד כיסוי.
   2. הערכת תרביות באמצעות מיקרוסקופ אור
      1. בדקו דגימות באמצעות מיקרוסקופ אור מורכב (שדה-בהיר) בהגדלה כוללת של 100×–400× (10× עיניים עם מטרות של 10×–40×).
      2. הערכת תנועתיות התאים, המורפולוגיה ותדירות ההסתגלות כמדדים למצב ההסתגלות.
         הערה: החיוניות הוערכה בהתבסס על נוכחות תאים שלמים עם גבולות תאים מוגדרים ופסולת מינימלית. תנועתיות פעילה הוגדרה כתנועה כיוונית נצפית של תאים בשדה הראייה. היציבות המורפולוגית הוערכה בהתבסס על דומיננטיות של צורות תאים אופייניות ותדירות נמוכה של צורות קורסות או לא סדירות מאוד.
4. לבצע מעבר סדרתי במהלך העיבוד
   הערה: מרווחי דגימה והעברה מסופקים כטווחים מוגדרים כדי להתאים לשונות בדינמיקת הצמיחה תוך שמירה על תזמון ניסויי עקבי בין שכפולים.
   1. כל 7 ימים, העבירו באופן אספטי 20% (v/v) מכל תרבית למדיום קסאווה טרי עם אותו ריכוז גרי ותנאי עיקור.
   2. שמור על נפחי העברה עקביים בין המעברים כדי לשמור על לחץ בחירה.
   3. חזרו על מעבר סדרתי עד שהתרביות מראות גדילה עקבית, תנועתיות מתמשכת ותדירות נמוכה של סעיף במדיה של 30 גרם ^L-1 קסאבה.
      נקודת הפסקה: התרביות עשויות להישאר ללא הפרעה עד 24 שעות בין ערבוב שגרתי לשלב דגימה.

4. סלקציה בריכוז גבוה (30–50 גרם לליטר)

1. הכינו מצעים בעלי עומס גבוה
   1. הכינו מדיום קסאווה מבוסס גארי בריכוזים סופיים של 30 ^gL-1, 40 ^gL-1 ו-50 ^gL-1 על ידי ביצוע ההליכים המתוארים בשיטה 1.
   2. אפשר למצעדים להידרדר במלואם במהלך תקופת התסיסה כדי להבטיח חשיפה אחידה של התאים לרכיבים מומסים וחלקיקים.
   3. החזירו בעדינות את החלקיקים היציבים על ידי סיבוב עדין של הבקבוקים ביד למשך 10–15 שניות מיד לפני החיסון.
2. חיסון תרביות בעומס גבוה
   1. החסן כל תווך קסאווה בריכוז גבוה ב-5% (v/v) משושלת E. gracilis שהותאמה קודם ל-30 גרם ^ל-1 גארי.
   2. תקן את נפחי החיסון בכל הריכוזים כדי לשמור על צפיפויות תא ראשוניות דומות.
   3. דגרו תרביות בחושך מוחלט בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עם רעידות אורביטליות רציפות בעוצמה של 120 x גרם לשמירה על תנאי גדילה הטרוטרופיים.
   4. ערבבו תרביות פעם ביום על ידי סיבוב ידני עדין למשך 15 שניות כדי לשמור על מגע בין התאים למצע התלוי מבלי לגרום למתח גזירה
3. ביצועי ניטור תחת עומס מצע גבוה
   1. בדקו תרביות כל 48 שעות לשינויים נראים לעין בעכירה, בפיגמנטציה ובאינטראקציה בין תאי E. gracilis לחומר קסווה ששקע.
   2. אוספים אליקווטים קטנים באופן אספטי ובודקים תאים באמצעות מיקרוסקופ אור מורכב בהגדלה כוללת של 100×–400× (10× עיניים עם 10×–40× מטרות).
   3. הערכת תנועתיות, מורפולוגיית תאים ותדירות האינסיסטמנט כאינדיקטורים לסבילות פיזיולוגית לריכוז מוגבר של הסובסטרטים (ראו שיטה 2).
4. אשר התאמה לריכוזי מצע גבוהים
   1. זהה תרביות השומרת על תנועתיות מתמשכת, מורפולוגיה עקבית ותדירות נמוכה של אנסיסטם בריכוזי קסאווה של ≥40 גרם ^L-1.
   2. מינו תרביות העומדות בקריטריונים אלו כשושלת גרסיליס המותאמת לקסאבה להערכה ניסיונית עתידית.

5. בדיקות גידול השוואתיות במדיות מוצר קסאווה

1. הכינו תנאי בדיקה זוגיים
   1. לכל מוצר קסאווה, כולל גארי, עיסה מיובשת, כדורים, קליפות ומזון לבעלי חיים, הכינו שני כלים זהים המכילים את אותו ריכוז ונפח מצע זהים.
   2. חיסון כלי אחד עם שושלת E. gracilis המותאמת לקסבה ואת הכלי המזווג בזן הלא מותאם מסוג פרא.
   3. השתמש בנפחי חיסון שווים לכל מצב זוגי כדי להבטיח צפיפויות תא התחלתיות דומות בין השושלות
2. שמירה על תרבויות זוגיות
   1. דגרו את כל התרביות הזוגיות בחושך מוחלט בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עם רעידות אורביטליות רציפות בעוצמה של 120 x גרם לשמירה על תנאי גדילה הטרוטרופיים.
   2. ערבבו תרביות פעם ביום באמצעות היפוך ידני עדין כדי לשמור על מגע בין התאים למצע התלויה.
   3. מתעד שינויים נראים לעין, כולל עכירות (עכירה), פיגמנטציה ודפוסי שקיעה, לאורך תקופת הדגירה.
3. תיעוד הבדלים מורפולוגיים שנצפו
   1. במרווחי דגימה מוגדרים, אספו אליקווטים מכל תרבית לניתוח מיקרוסקופי (ראו שיטה 2.2 לאיסוף אליקווט וניתוח מיקרוסקופ)
   2. בדקו דגימות באמצעות מיקרוסקופ אור מורכב (שדה-בהיר) בהגדלה כוללת של 100×–400× (10× עיניים עם מטרות של 10×–40×).
   3. תעד הבדלים בין תרביות מותאמות לתרביות מסוג פרא מבחינת תנועתיות, תדירות הקיסטום ומורפולוגיית התא הכללית.

6. ניטור pH

1. איסוף דגימות pH
   1. בימים 0, 3, 6, 9 ו-12, יש למשוך אספטית 1 מ"ל תרבית מכל תנאי ניסוי באמצעות קצות פיפטה סטריליים.
   2. אפשר לדגימות לעמוד ללא הפרעה במשך 2 דקות כדי לאפשר שקיעה של מוצקים תלויים.
   3. העבר בזהירות את הסופרנטנט המובהר לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי מבלי להפריע לחומר השקוע.
2. pH מדידה
   1. כיילן את מד ה-pH לפי הוראות היצרן באמצעות מאגרים סטנדרטיים מתאימים לפני המדידה.
   2. הכנס את גלאי ה-pH המכויל לתוך הסופרנטנט המוקף מבלי להפריע לחומר שיישאר שיישב.
   3. רשמו ערכי pH מיד לאחר שהקריאה התייצבה.
   4. שטוף היטב את הגשוש במים דה-יוניים בין דגימות כדי למנוע זיהום צולב.

7. בדיקות ציאניד באמצעות רצועות צבע

אזהרה: סופרנטנטים המכילים ציאניד מסוכנים. בצע את כל שלבי הדגימה והבדיקה במכסה אדים כימי או באזור מאוורר היטב. לבש ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות והגנה לעיניים. הימנעו ממגע ישיר בעור עם דגימות ורצועות בדיקה והשלכו רצועות משומשות ופסולת נוזלית בהתאם להנחיות מוסדיות לפינוי פסולת כימית מסוכנת.

1. איסוף דגימות ציאניד
   1. בימים 0, 4, 8 ו-12, משוך אספטית 1 מ"ל של סופרנטנט תרבית מכל תנאי ניסוי באמצעות קצות פיפטות סטריליות.
   2. אפשר לדגימות לעמוד ללא הפרעה במשך 2 דקות כדי לאפשר שקיעה של מוצקים תלויים.
   3. אסוף בזהירות את הסופרנטנט המובהק מבלי להפריע לחלקיקים.
2. בצע בדיקת ציאניד קולורימטרית.
   1. טבלו רצועת בדיקת ציאניד קולורימטרית בתוך הסופרנטנט המובהק למשך הזמן שנקבע על ידי היצרן.
   2. הסירו את הרצועה ואפשרו להתפתחות צבע מלאה לזמן המומלץ בתנאי הסביבה.
   3. השווה את הרצועה המפותחת לסולם ההתייחסות שסופק על ידי היצרן כדי לקבוע את ריכוז הציאניד.
3. רמות שיא של ציאניד
   1. ריכוזי ציאניד לכל דגימה בכל נקודות זמן לפי סולם הייחוס.
   2. צלמו כל רצועת בדיקה שפותחה לצד קנה המידה הייחוס או שמרו את הרצועה בהתאם להמלצות היצרן לאימות עתידי.

8. תחזוקה ואיחוד תרביות E. gracilis מותאמות

1. שילוב תרבויות מותאמות
   1. לאחר התאמה מוצלחת בריכוזי קסאווה של ≥40 גרם ^ל-1 גארי, מאשרים חזותית את נוכחות תאי E. gracilis ברי חיים בכל תרבית משוכפלת.
   2. משלבים בעדינות את כל הבקבוקים המשכפלים של השושלת המותאמת לכלי סטרילי יחיד באמצעות טכניקה אספטית ליצירת תרבית מאסטר הומוגנית.
2. הכנת מדיה לתחזוקה
   1. הכינו מדיה טרייה מבוססת קסבה בריכוז התחזוקה שנבחר על ידי ביצוע ההליכים המתוארים בשיטה 1.
   2. בחר בין מדיה אוטוקלבת או לא-אוטוקלבת בהתאם לדרישות הניסוי בהמשך.
   3. שמור על אותו תנאי עיקור בכל המעברים הבאים כדי להבטיח עקביות בחשיפה למיקרוביאליים.
3. תרביות תחזוקת חיסון
   1. החסן את חומר התחזוקה הטרי ב-20% (v/v) מהתרבות המאוחדת הראשית.
   2. ערבבו תרביות בעדינות על ידי סיבוב ידני כדי לפזר תאים באופן שווה מבלי לגרום למתח גזירה.
   3. דגרו תרביות בחושך מוחלט בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עם רעידות אורביטליות רציפות בעוצמה של 120 x גרם לשמירה על תנאי גדילה הטרוטרופיים.
4. ביצוע תחזוקה שוטפת ומעבר
   1. שמרו על תרביות באמצעות היפוך ידני עדין פעם ביום כדי למנוע שקיעה ממושכת של תאים וחומר תת-קרקעי.
   2. כל 30 יום, אחד תרביות תחזוקה על ידי שילוב בקבוקים משוכפלים בטכניקה אספטית.
   3. חיסון מחדש של חומר תחזוקה טרי באמצעות התרבית המאוחדת כפי שמתואר בסעיף 8.3.
5. יציבות תרביות מוניטור
   1. בכל מעבר, העריכו את המורפולוגיה והתנועתיות של התאים באמצעות מיקרוסקופ אור מורכב (Brightfield) ב-100×–400× הגדלה כוללת (10× עיניים עם מטרות של 10×–40×).
   2. שינויים בשיאים לקראת הגברת הקיצור, הצטברות פסולת תאית או ירידה בתנועתיות כאינדיקטורים לירידה ביציבות התרבית.

9 קצירת ביומסה לניתוח חלבונים במורד הזרם

1. איסוף דגימות תרבית
   1. בנקודת הקצה הרצויה, העבר נפחי תרבית לצינורות צנטריפוגות סטריליים.
   2. ודא שהדגימות מייצגות את כל התרבית על ידי ערבוב עדין על ידי סיבוב בקבוקי התרבית לפני ההעברה.
2. איסוף ביומסה באמצעות צנטריפוגה
   1. דגימות צנטריפוגה ב-≥3,500 × גרם למשך 10 דקות כדי לפרוק את הביומאסה. חזור על השלב הזה אם המשקעים עדיין לא התייצבו לחלוטין.
   2. אשר את היווצרות כדור תא קומפקטי בתחתית הצינור.
3. הסרת סופרנטנט
   1. דקט או פיפט בזהירות מהסופרנטנט מבלי להפריע לכדור.
   2. השליך את הנוזל העל-טבעי בהתאם לפרוטוקולי הפסולת במעבדה.
4. הכינו ביומסה לניתוח במורד הזרם
   1. שמור את כדור התא לעיבוד נוסף (למשל, ייבוש, אחסון או ניתוח חלבונים).
   2. אם לא מעובדים מיד, יש לאחסן את הכדורים בטמפרטורה של 4°C לשימוש קצר טווח או להקפיא לפי הצורך לאחסון ארוך טווח.

10. טיפול וארכיון נתונים

1. ארגון מערך נתונים
   1. הזן את כל המדידות הכמותיות, כולל pH, ריכוז ציאניד, הערכות כדאיות, ספירת תאים וערכי ביומסה, בגיליון אלקטרוני מסומן.
   2. שמור תמונות מיקרוסקופיה והערות תצפית נלוות באמצעות שמות קבצים סטנדרטיים שמציינים את סוג המצע, ריכוז, זהות הזן, מספר השכפול ותאריך הדגימה (למשל, NAG40G_WT1_05-01-25).
2. הכנת מערכי נתונים לניתוח
   1. ודאו שכל השכפולים הניסיוניים ונקודות הזמן המתוזמנות מיוצגים ומושלמים בתוך מערך הנתונים.
   2. דיגיטציה של כל הערות מעבדה בכתב יד וגבה את כל הקבצים האלקטרוניים כדי לאבטח אחסון ולמנוע אובדן נתונים. ניתוח נתונים ויצירת נתונים בוצעו באמצעות תוכנת גיליונות אלקטרוניים (Microsoft Excel) וכאשר רלוונטי, R (R Foundation for Statistical Computing). כל ניתוחי הליבה ניתנים לשחזור באמצעות חישובים מבוססי גיליונות אלקטרוניים, כאשר R משמש רק להמחשה משלימה.

תוצאות

התוצאות המייצגות הבאות ממחישות את התוצאות הצפויות כאשר הפרוטוקול המתואר מיושם בהצלחה, וכן את טווח התוצאות שנצפו בתנאים תת-אופטימליים. הנתונים המייצגים התואמים לתוצאות אלו מוצגים באיור 1, איור 2, איור 3, איור 4, איור 5, איור 6, איור 7. יחד, תוצאות אלו מספקות הנחיות מעשיות לפרשנות דינמיקות גדילה, חיות, מורפולוגיה ותוצאות חלבונים בעת התאמת E. gracilis למצעי קסאבה בתנאי גידול הטרוטרופיים וחשוכים לחלוטין. יתרה מזאת, תוצאות אלו מאשרות תוצאות ביולוגיות מרכזיות של הפרוטוקול, כולל התאמה מוצלחת, צמיחה מתמשכת, חיוניות גבוהה, מורפולוגיה יציבה, ביצועים עקביים בין הסובסטרטים וייצור חלבונים מדיד.

במהלך הניסויים, נעשה שימוש בשלושה שכפולים בכל טיפול (כל סוגי מדיום הקסאבה). אנו מכירים בכך שמספר השכפולים תלוי בשיקול הדעת ובמגבלות הלוגיסטיות של כל קבוצה הפועלת לפי הפרוטוקולים הנ״ל. יישום מוצלח של פרוטוקול זה מוביל לצמיחה הטרוטרופית מתמשכת של E. gracilis במדיה מבוססת גארי בתנאים חשוכים לחלוטין. תוצאות חיוביות מאופיינות במסלולי גדילה חלקים וסיגמואידיים, סטייה מוגבלת בין השכפולים, וצפיפויות תאים יציבות בשלב מאוחר. תכונות מורפולוגיות שסימנו תוצאות חיוביות ונצפו בעקביות באוכלוסיות מותאמות כללו עגלגלות תאים וממברנות תא עבה. לעומת זאת, תאים לא בריאים שהתמוטטו נראים בדרך כלל לא סדירים, מפורקים או פגומים מבניים וקשורים לירידה בחיוניות, מה שמבדיל אותם מצורות מעוגלות או חצי-אנסיסטיות שלמות שנצפו בתרביות מותאמות. לשם השוואה, נכללות תמונות מייצגות של E . gracilis מסוג בר עם מורפולוגיה מוארכת אופיינית (איור 8) כדי להבחין בין מבנה תאי בסיסי לבין צורות מותאמות או משותפות. תרביות שגודלו ב-30 גרם ^L-1 גארי הציגו צמיחה משולבת גבוהה יותר, כפי שנמדד על ידי שטח מתחת לעקומת הגדילה (AUC), בהשוואה לריכוזים נמוכים יותר, מה שמרמז על ניצול יעיל יותר של מצע הקסאווה והסתגלות פיזיולוגית מוצלחת (איור 1).

תוצאות תת-אופטימליות נצפות לעיתים קרובות בריכוזי גארי נמוכים יותר (10–20 גרם ^L-1), שם הגידול ניתן לזיהוי אך מופחת בעוצמה ומשתנה יותר בין השכפולים. בריכוזים גבוהים יותר (40–50 גרם ^L-1), התרביות עשויות להגיע לצפיפות תאים גבוהה יותר; עם זאת, מצבים אלו מציגים לעיתים קרובות התעכבות בייצוב או שינוי זמני מוגבר (איור 2).

בניסויים מוצלחים, עמידות התאים נשארת גבוהה לאורך כל תקופת התרבית, עם תנודות קלות בלבד באמצע הניסוי. בדיקות החרגה של Trypan Blue מצביעות על כך שתרביות שנשמרות ב-30 גרם ^L-1 גארי שומרות על אחוז גבוה של תאים חיים (לא מוצבעים) ביחס לתאים לא קיימים (עם צבע כחול) לאורך נקודות זמן שנדגמו (איור 3). סטיות מדפוס זה, כולל עלייה בשיעור התאים המוכתמים, ירידה בתנועתיות, או שינויים לעבר מורפולוגיות מעוגלות או מקורסות, עשויות להצביע על תנאים לא אופטימליים ולשמש כטריגרים מוקדמים לפתרון תקלות. הערכות הקיימות והמורפולוגיות התבססו על קריטריונים תצפיתיים עקביים, כולל שלמות התא, תנועתיות כיוונית, והנפוצה היחסית של צורות מוארכות לעומת מעוגלות או מקורסות.

תוצאות לא אופטימליות מאופיינות בירידות חולפות בחיוניות, הנפוצות ביותר בריכוזי גארי גבוהים. ניתן להבחין בהתאוששות חלקית בנקודות זמן מאוחרות יותר; עם זאת, תנאים אלו מציגים שונות מוגברת ביכולת הקיימות לאורך תקופת התרבות (איור 4). דפוסי גידול אלו מראים שריכוזי תת-יסוד ביניים (למשל, 30 גרם ^L-1) מספקים איזון בין זמינות חומרים מזינים ללחץ, מה שמוביל לצמיחה יציבה יותר. מגמות אלו משקפות את השפעת תנאי העיבוד המוקדם וההתאמה המדורגת על ביצועי התרבית, שכן חשיפה הדרגתית למורכבות גוברת של המצע תומכת ביציבות פיזיולוגית משופרת ובהתנהגות גדילה שניתנת לשחזור. ריכוזים נמוכים מגבילים את ייצור הביומאסה, בעוד שריכוזים גבוהים מובילים לשונות גדולה יותר ולייצוב מאוחר.

הערכה מורפולוגית מספקת אינדיקטור איכותי למצב ההסתגלות. תוצאות חיוביות כוללות הופעת והתמדה של תאים מעוגלים או חצי-אנסיסטיים עם תנועתיות מופחתת שנשארים שלמים לאורך תת-גידול חוזר (איור 5).

לעומת זאת, תרביות תת-אופטימליות, המזוהות בעיקר עם זנים מסוג פרא או הסתגלות בשלבים מוקדמים, מציגות מעברים פתאומיים מתאים מוארכים וניידים למורפולוגיות לא סדירות או קרוסות, המקבילות לירידה ביציבות הצמיחה.

כאשר הפרוטוקול מיושם על סובסטרטים נוספים שמקורם בקאסבה, כולל עיסת, כדורים וקילפים, תרביות E. gracilis מותאמות מציגות צמיחה ניתנת לשחזור בין סוגי תת-קרקע שונים. תוצאות חיוביות מאופיינות בייצוב מוקדם יותר של עקומות הצמיחה ובהפחתת ירידה בשלבים מאוחרים יחסית לתרביות מסוג בר (איור 6).

תוצאות לא אופטימליות כוללות עיכוב בתחילת צמיחה או הגדלת שונות השכפול, במיוחד בסובסטרטים עם הטרוגניות פיזית גבוהה יותר.

יישום מוצלח של הפרוטוקול מניב ביומסה של E. gracilis עם תכולת חלבון גולמי מדידה, כפי שמוגדר בניתוח מעבדה חיצוני בשיטת הבעירה (Dumas). אחוזי החלבון שנצפו בתרביות מותאמות דומים לאלו שנמדדו בתרביות מסוג פראי, כאשר תפוקת חלבון כוללת גבוהה יותר תואמת לעלייה בהצטברות ביומסה (איור 7).

ניטור כימיה של מדיה תמך באינטראקציות בין תרבית למצע במהלך ההסתגלות ואימת את הכללת מדידות pH וציאניד בפרוטוקול. ערכי ה-pH הצביעו על שינויים הדרגתיים לאורך זמן, מה שמעיד על פעילות מטבולית וניצול הסובסטרטים, עם מגמות יציבות יותר בתרביות מותאמות. מדידות ציאניד תמכו בכך עוד יותר, שכן תרביות מותאמות הראו ירידה ברמות הניתנות לזיהוי, בעוד שתרביות מסוג בר נותרו משתנות יותר. יחד, תוצאות אלו מראות שצעדי המעקב הללו לוכדים ביעילות שינויים בכימיה של המדיה הקשורים להסתגלות ותומכים בפרשנות של ביצועי תרבות. למרות שהמנגנונים הבסיסיים לא נחקרו, זהו תחום חשוב למחקר עתידי, במיוחד ליישומים תעשייתיים.

תהליך התחזוקה והאיחוד לטווח ארוך תמך בהמשך הקיימות של שושלת Euglena gracilis המותאמת לאורך תקופות תרבות ממושכות. תרביות שנשמרו באמצעות מעבר חוזר שמרו בעקביות על תנועתיות, מורפולוגיה אופיינית והתנהגות צמיחה יציבה לאורך מחזורי התחזוקה. למרות שהביצועים ארוכי הטווח לא הוערכו כמותית, תצפיות אלו מספקות ראיות מייצגות לכך שהשושלת המותאמת ניתנת לשמירה אמינה תחת התנאים שנקבעו.

יחד, תוצאות אלו מאשרות כי פרוטוקול ההסתגלות תומך בצמיחה איתנה, בחיוניות ובייצור ביומסה של E. gracilis על פני מצעים מבוססי קסאווה, עם ביצועים עקביים ורמות ציאניד מופחתתות לאורך זמן.

כל האיורים והטבלאות מסופקים כקבצים נפרדים ואינם מוטמעים במסמך כתב היד. העדפות מיקום האיורים והטבלאות מסומנות בתוך טקסט כתב היד באמצעות הערות מסודרות בסוגריים (למשל, (איור 1)). אלא אם צוין אחרת, כל הנתונים והטבלאות מיועדים להופיע מתחת לסעיף התוצאות הייצוגיות בפרסום הסופי.

כל הדמויות מוגשות כקבצים נפרדים, כאשר דמויות מרובות פאנלים מסופקות כתמונה משולבת אחת. תמונות מיקרוסקופיה כוללות פסי קנה מידה בכל פאנל. איורי הנתונים כוללים צירים מסומנים עם יחידות מדידה מוגדרות, וסרגלי השגיאה מוגדרים באגדות האיור המתאימים.

כל הטבלאות מוגשות כקבצי .xls או .xlsx נפרדים ומכילות נתונים מספריים גולמיים או מסוכמים ללא עיצוב דקורטיבי.

איור 1: דינמיקת הצמיחה של E. gracilis שגודלה ב-10, 20 ו-30 ^gL-1 גארי בתנאים חשוכים לחלוטין. צפיפויות התאים הממוצעות מוצגות לאורך זמן עבור כל ריכוז סובסטרטי. פסי השגיאה מייצגים SEM על פני שכפולים ביולוגיים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: ביצועי גדילה של E. gracilis בריכוזי גארי גבוהים (30–50 גרם ^L-1). מסלולי צפיפות התאים ממחישים הבדלים בצפיפות השיא, תזמון הייצוב והשונות בין ריכוזי סובסטרט גבוהים יותר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: מגמות החיות התאית של E. gracilis שנמדדה ב-30 ^gL-1 garri ונמדדה על ידי הדרת Trypan Blue. היחס של התאים הקיימים מוצג לאורך נקודות זמן שנדגמו. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4: תנודות החיוניות של E. gracilis שגודלו בריכוזי גארי גבוהים יותר. שינויים חולפים בחיוניות התאים מוצגים לאורך תקופת הניסוי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 5: מורפולוגיה מייצגת של אוכלוסיות E. gracilis מותאמות. תמונות מיקרוסקופיות אור הפוך מייצגות מציגות תאים מעוגלים וחצי-אנסיסטיים שנצפו לאחר ההסתגלות. פס קנה מידה = XX מיקרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: ביצועי צמיחה של E. gracilis מותאם ופראי על פני מצעים שמקורם בקסאבה. מסלולי צמיחה מוצגים עבור תרביות מותאמות ופראיות המגודלות על מספר מוצרי קסאווה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 7: תכולת חלבון גולמית ותפוקת חלבון כוללת של ביומסה E. gracilis שגדלה בקסאבה. תכולת החלבון נמדדה באמצעות ניתוח חיצוני באמצעות שיטת SGS Combustion (Dumas). סך תפוקת החלבון מוצגת לצד הצטברות ביומסה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 8: מורפולוגיה מייצגת של E. gracilis מסוג בר בתנאים סטנדרטיים (הגדלה של 40X). תמונה מייצגת של Euglena gracilis בריאה, לא מותאמת, המציגה מורפולוגיה מוארכת אופיינית תחת מיקרוסקופ אור. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

דיון

גורם מרכזי להצלחה בפרוטוקול זה הוא האיזון בין ריכוז סובסטרט הקסאווה לבין יציבות פיזיולוגית במהלך גידול הטרוטרופי של E. gracilis. חומרים שמקורם בקאסבה מכניסים הטרוגניות פיזית, חלקיקים שאריתיים וקינטיקה משתנה של שחרור חומרים מזינים שמשפיעים ישירות על התנהגות הצמיחה ויציבות התרבית ^2,3. מבין שלבי הפרוטוקול, הכנת המצע ובחירת הריכוז מהווים את נקודות הבקרה הרגישות ביותר. כפי שמודגם בתוצאות המייצגות, ריכוזי סובסטרט ביניים תומכים באופן אמין בצמיחה מתמשכת עם התפצלות שכפולה מוגבלת, בעוד שריכוזים נמוכים מגבילים את הצטברות הביומסה וריכוזים גבוהים מגבירים את השונות הזמנית ואת תגובות הלחץ החולפות. תוצאות אלו מדגישות כי עומס מקסימלי של מצע אינו בהכרח מניב ביצועי גידול אופטימליים או יציבים בעבודה עם חומרים חקלאיים-תעשייתיים הטרוגניים. שלבי הקדם-עיבוד הנבחרים ורמות הריכוז של הסובסטרט תוכננו לאתגר בהדרגה את E. gracilis תחת מורכבות כימית ומיקרוביאלית הולכת וגוברת. ההבדלים שנצפו ביציבות ובקיום הצמיחה בתנאים אלו תומכים בתוקף הגישה המדורגת הזו ומאשרים שריכוזי הסובסטרט הביניים מספקים איזון בין זמינות חומרים מזינים לבין לחץ פיזיולוגי.

טיפול בתרבות במהלך גדילה הטרוטרופית משפיע עוד יותר על תוצאות ההסתגלות. ערבוב עקבי אך עדין בתנאים חשוכים לחלוטין היה קריטי לשמירה על מגע בין תאי E. gracilis לחומר תת-קרקעי תלוי תוך הימנעות ממתח גזירה מופרז. ערבוב לא מספק עודד שקיעה וגרדיאנטים מקומיים של חומרים מזינים ממוקדים, מה שבלבל הן את מדידות הצמיחה והן את מדידות החיוניות, במיוחד במדיה לא אוטוקלבית¹². תצפיות אלו תואמות לדיווחים קודמים שהראו כי הטרוגניות מרחבית וחשיפה לא אחידה למצע עלולות לטשטש תגובות פיזיולוגיות במערכות גידול מיקרוביאליות. לכן, הפרוטוקול מדגיש היפוך שגרתי במקום ערבוב מתמשך כפשרה מעשית בין הומוגניות לשלמות תרבותית.

כדי להתאים לשונות הטבועה בתת-קרקעיות מבוססי קסאווה, הפרוטוקול משלב נקודות פתרון תקלות וגמישות רבות. אוטוקלבינג של מדיום קסאווה מותסס שיפר את העקביות לטווח הקצר על ידי הפחתת עומס מיקרוביאלי ושינוי מבנה המצע, במיוחד בשלבי ההסתגלות המוקדמים. לעומת זאת, ניתן להשתמש במדיה שאינה אוטוקלבה ביעילות לאחר התאמה מוצלחת, בתנאי שצפיפות וערבוב האינוקולום מספיקים לשמירה על צמיחה יציבה. גישה מדורגת זו תואמת מחקרים קודמים שהראו כי לחץ סלקטיבי הדרגתי מאפשר לאוכלוסיות מיקרוביאליות לסבול מורכבות סביבתית הולכת וגוברת לאורך זמן^13,14. ניטור אורך היה חיוני בהקשר זה, שכן הפחתות חולפות בצמיחה או ביכולת הקיימות התאוששו לעיתים קרובות במהלך מעברים לאחר מכן מבלי לפגוע בהצלחה הכוללת בהסתגלות.

בדיקות חיוניות וניטור מורפולוגי שימשו ככלי אבחון מהיר לאורך כל תהליך ההסתגלות. הדרה מ-Trypan Blue סיפקה אינדיקטור כמותי לעמידות פיזיולוגית, בעוד שהערכת תנועתיות ואקסיסטמנט מבוססת מיקרוסקופיה סיפקה אזהרה מוקדמת לתנאים לא אופטימליים כגון עומס יתר של מצע או עיכוב בהסתגלות¹⁵. חשוב לציין שהפרוטוקול מדגיש מגמות לאורך זמן ולא מדידות חד-נקודתיות, שכן תנודות קצרות טווח ביכולת הקיימות או במורפולוגיה לא תמיד חיזו כישלון תרבית ארוך טווח. פרספקטיבה אורך זו התבררה כקריטית להבחנה בין תגובות לחץ חולפות לבין ירידה פיזיולוגית מתמשכת. ירידות ברמות הציאניד הניתנות לזיהוי שנצפו במהלך הגידול מצביעות על ניקוי חלקי של תת-קרקעיות שמקורם בקסאבה בתנאים המתוארים. הפחתות אלו עשויות לנבוע משילוב של התפרקות הקשורה לתסיסה, התנדפות ופעילות מיקרוביאלית. למרות שהמנגנונים הביוכימיים והקינטיקה הספציפיים של הסרת ציאניד לא נחקרו ישירות במחקר זה, תצפיות אלו תומכות בהכללת ניטור ציאניד כאינדיקטור מעשי לטרנספורמציה של תת-קרקע וכידימות תרבית במהלך ההסתגלות.

יש להכיר בכמה מגבלות של השיטה. ראשית, אחוז החלבון הגולמי לבדו אינו תופס במלואו ערך תזונתי או איכות חלבון פונקציונלית, ויש לקחת בחשבון את סך תפוקת הביומסה לצד מדדי הרכב¹⁶. שנית, השימוש במצעדים מעובדים מינימלית והטרוגניים יוצר שונות שלא ניתן לבטל, אפילו בהכנה סטנדרטית. אתגר זה מוכר היטב בעיבוד ביולוגי אגרו-תעשייתי¹⁷ ומשקף מגבלות מהעולם האמיתי ולא ליקויים ניסיוניים. שלישית, בעוד שהפרוטוקול מותאם לגידול בקנה מידה מעבדה ופיילוט, הגדלה מעבר לנפחים בקנה מידה ספסלי תדרוש שליטה נוספת על דינמיקת הערבוב, העברת חמצן וטיפול במוצקים, וכן התחשבות בתצורת הכור ובתנאים הידרודינמיים, כפי שהודגם במערכות מיקרואלגיות ופרוטיסטיות אחרות¹⁸.

בהשוואה לשיטות גידול קיימות של E. gracilis התלויות בסוכרים מזוקקים או במערכות פוטוטרופיות מבוקרות היטב, פרוטוקול זה מציע יתרון מתודולוגי ברור בכך שהוא מאפשר צמיחה על מצעים זולים שמקורם בקסאבה בתנאים הטרוטרופיים מלאים. הגישה מונעת תלות במקורות פחמן מטוהרים^19,20 ואינה דורשת תשתית תאורה מיוחדת, מה שמרחיב את הגמישות התפעולית של גידול E. gracilis. דבר זה רלוונטי במיוחד ליישומים המתמקדים ביעילות משאבים, הערכת פסולת וייצור מבוזר באזורים המייצרים קסבה.

המשמעות הרחבה של שיטה זו טמונה ביכולתה ליישומה בתחומי מחקר המתמקדים בהסתגלות מיקרוביאלית, עיבוד ביולוגי בר-קיימא והערכת ביומסה. על ידי שילוב חשיפה הדרגתית למצע עם כלי ניטור פשוטים וזולים, הפרוטוקול מספק מסגרת ניתנת לשחזור לשילוב תת-קרקעים לא מסורתיים בתהליכי עבודה של גידול מיקרוביאלי. למרות שפותחו עבור E. gracilis, העקרונות הבסיסיים של התאמה מדורגת, הערכת ביצועים לאורך זמן וקבלת החלטות מבוססת מורפולוגיה ניתנים להעברה רחבה למערכות מיקרו-אצות ופרוטיסטים אחרות הנבדקות ליישומים ביולוגיים מעגליים^21,22. לכן, פרוטוקול זה משמש לא רק כשיטת גידול אלא גם כמסגרת הכללה להתאמה מישומית למיקרואורגניזמים תחת מגבלות סובסטרט אמיתיות. שיטה זו תוכננה עם נגישות כמטרה עיקרית, ולכן היא המתאימה ביותר למעבדות או לסביבות מחקר יישומיות עם תשתית מיקרוביולוגית בסיסית וגישה למשאבים ביולוגיים מרכזיים, במיוחד תרביות Euglena gracilis ותת-קרקעיות שמקורן בקסבה. בנוסף, המערכת מציעה גמישות זמנית, שכן ניתן להכין ולתסוס מדיה מבוססת קסבה לאורך כל השנה ללא מגבלות עונתיות. בעוד שפרוטוקול זה פותח ואומת בקנה מידה מעבדתי, השימוש בו במצעדים זולים שמקורם בקסאווה ודרישות עיבוד מינימליות תומכים בקנה מידה פוטנציאלי למערכות גידול גדולות יותר.

בעוד שפרוטוקול זה קובע מסגרת שניתן לשחזר להסתגלות ולגידול, ניתוחים כמותיים נוספים של קינטיקת גדילה, פרודוקטיביות ביומסה ויעילות המרת תת-קרקע יהיו חשובים לאופטימיזציה של ביצועים ביישומים מורחבים או תעשייתיים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אוטוקלב - 533LS סטריליזציה באדים	Getinge	533LS	סטריליזציה בקיטור של מדיה קסאבה. סטריליזציה של מדיה באמצעות מחזור נוזלי.
Bright-Line™ המצית החלפה מכסה מגע	Millipore Sigma	BR723015- 100EA	מכסי זכוכית עבים מיוחדים המיועדים לשימוש בהמצית.
קסאבה מיובשת עיסה	Psaltry International	N/A	סובסטראט קסאבה מסופק
גלולה קסאבה	Psaltry International	N/A	סובסטראט קסאבה מסופק
קליפות קסאבה	Psaltry International	N/A	סובסטראט קסאבה מסופק
קסאבה סובסטראט (גארי)	ספק מקומי	N/A	גארי מקסאבה חומר גלם לפחמימות מקור; הוכן עם מים מודחים.
צנטריפוגה Thermo Scientific Sorvall ST16 צנטריפוגה	Thermo Scientific Sorvall ST16 צנטריפוגה	75004241	מסוגל ל- ≥3,500 × g, משמש לקצירת ביומסה.
צינורות צנטריפוגה למשל Axygen (A מותג Corning)	Corning	MCT-150-C-S	סטרילי, נפח מינימלי 1.5 מ"ל
מים נקיים למשל UltraPure™ DNase/RNase- Free Distilled Water	ThermoFisher Scientific	10977035	מים מודחים או מזוקקים. משמש להכנת מדיה
מיקרוסקופ אור מורכב	Olympus	N/A	מיקרוסקופ מורכב סטנדרטי המתאים לתצפית וספירת תאים שגרתית.
רצועת ציאניד בדיקה, צבעונית. CN- 10-30 מ"ג/ל	MQuant	110044	גילוי ציאניד חצי כמותי. יש להשליך כפסולת מסוכנת
סירת שקילה סטנדרטית סטרילית	Fisher Scientific	01-549-750	משמש לשקילה של סובסטראטים קסאבה וביומאסה יבשה.
Euglena gracilis (קו מותאם )	N/A	N/A	זן קסאבה מותאם שנוצר במחקר זה
Euglena gracilis (סוג בר)	N/A	N/A	זן ייחוס לא מותאם. לשמור על אותם תנאי סטנדרט.
רכיבים של מדיום גידול Euglena	שונים	N/A	מדיום Euglena בסיסי שהוכן על פי פורמולות תקן המעבדה.
מייבש הקפאה 6 ליטר FreeZone Console	Labconco	70061xxxx	משמש להתייבשות ביומסה
המצית עם קווים סטנדרטיים	Weber Scientific	NC1587539	משמש לספירת תאים ידנית.
מתגרר מגנטי עם צלחת חמה	IKA	N/A	אופציונלי; משפר עקביות במהלך הכנת מדיה ושעיית סובסטראט.
מיקרופיפטות (P20, P200, P1000)	Eppendorf	N/A	פיפטות נפח מתכווננות המשמשות להעברת נוזלים אספטיים.
מיני-צנטריפוגה	Eppendorf	N/A	אופציונלי; מקל על פלטית מהירה במהלך קצירת ביומסה.
Parafilm	Bemis	PM996	משמש לאיטום זמני של בקבוקים או צלחות כאשר אין מכסי הזרמה.
רצועות מד pH	Fisher Scientific	13-640-520	חלופה למד pH להערכה איכותית מהירה של מדיה תרבות.
מד pH עם חריט Thermo Scientific Orion Star A211 מד pH שולחני	Thermo Scientific Orion Star A211 מד pH שולחני	13-645-519	מכויל לפני השימוש. למדידת pH של הסופרנט התרבות
אחסון מקורר (4°C)	Frigidaire	FRT18S6JW7	אחסון קצר טווח של מדיה
חממה רועדת (חשוכה)	Thermolyne	M49235	חממה רועדת מסלולית שיכולה ל- 100–150 RPM, טווח טמפרטורה 24–28 °C; משמשת בתנאים חשוכים לתמיכה בגידול Euglena הטרוטרופי.
בקבוק ריסוס (32oz)	Boardwalk	BWK03010	משמש לסטריליזציה על שולחן העבודה ולטיפול אספטי שגרתי (תמיסת 70% אתנול)
תוכנת