פרופיל טרנסקריפטומי וניתוח ביואינפורמטי של דגימות מח עצם לזיהוי חתימות עמידות לכימותרפיה בלוקמיה מיאלואידית חריפה

סיכום

פרוטוקול זה מציג תהליך ביואינפורמטי סטנדרטי לניתוח שינויים טרנסקריפטומיים בלוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). המטרה היא להשוות דגימות מח עצם שאובחנו לאחרונה וחזרו לטיפול ולתעדף חתימות מולקולריות הקשורות לעמידות לכימותרפיה ולהתקדמות המחלה לצורך חקירה עתידית.

תקציר

לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) היא ממאירות המטולוגית הטרוגנית מאוד, שבה הישנות ועמידות כימונית-נרכשת נותרות הגורמים העיקריים לכישלון הטיפול. מאמר זה מציג פרוטוקול ביואינפורמטי לניתוח טרנסקריפטומי של שאיפות מח עצם. המטרה העיקרית של הפרוטוקול היא לספק זרימת עבודה סטנדרטית לזיהוי חתימות מולקולריות הקשורות להתקדמות מחלה ועמידות לטיפול ב-AML עם הישנות. הצינור מפרט את ההליכים החישוביים להשוואת דגימות מח עצם לא מזווגות, שהודגמו באמצעות נתוני ריצוף מחמישה מקרים שאובחנו לאחרונה וארבעה מקרים עם הישנות. שיטה זו מפרטת את השלבים החיוניים לעיבוד נתוני ריצוף RNA, ביצוע ניתוח ביטוי גנים שונה וביצוע הערכות פונקציונליות במורד הזרם. יישום זרימת עבודה זו זיהה 2,025 גנים מבוטאים באופן שונה (DEGs), כולל FOXC1, HOXA11, HOXA11-AS ו-AXL, כמועמדים לתמלולים הקשורים להישנות במאגר הנתונים המייצג הזה. ניתוחים פונקציונליים ורשתיים העדיפו עוד יותר את מערכי הגנים ומרכזי האינטראקציה הקשורים לאיתות GTPase קטן, איתות דלקתי, אינטראקציות במטריצות חוץ-תאיות ותהליכים ביוסינתטיים של RNA. בסך הכול, שיטה זו מספקת צינור חישובי ניתן לשחזור למיפוי חתימות טרנסקריפטומיות הקשורות ל-AML שנחשף וליצירת השערות שדורשות אימות ניסויי נוסף.

מבוא

לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) היא קבוצה של ניאופלזמות ממאירות קלונליות שמקורן בתאי גזע/אב המטופואטיים, המאופיינת בהתרבות לא תקינה של תאי מיאלואידים לא בשלים במח העצם ובדיכוי התמיינות המטופואטית ^1,2,3. למרות שכימותרפיה אינדוקטיבית סטנדרטית כיום (כגון ציטרבין בשילוב עם אנתרציקלינים) יכולה לגרום להפוגה מלאה ברוב המטופלים, שיעור ההישנות נשאר גבוה עד 50%–70%, והפרוגנוזה אצל מטופלים שנשארו פגועה משמעותית ^4,5,6. עמידות לכימותרפיה נרכשת קשורה לכישלון טיפול ב-AML, מה שמחייב ניתוח מעמיק של החתימות המולקולריות הקשורות לתהליך זה לשיפור אסטרטגיות טיפוליות ושיעורי הישרדות מטופלים ^7,8.

בגוף הספרות הרחב, מחקרים קיימים מצביעים על כך שעמידות לכימותרפיה ב-AML אינה מוגבלת להגברת משאבות פליטת תרופות או חילוף חומרים חריג של התרופות, אלא גם קשורה לשימור הישרדות של תאי גזע של לוקמיה (LSCs), להיווצרות פנוטיפים דמויי מעבר אפיתליאלי-מזנכימי (EMT) בנישה ההמטולוגית, ולאינטראקציות עם מיקרו-סביבת מח עצם^{9. 10, 11}. לדוגמה, אוכלוסיות LSC מציגות יכולת התחדשות עצמית גבוהה ושקט, הקשורה לעמידות מולדת לסוכנים כימותרפיים ספציפיים למחזור התא¹². בנוסף, העלאת ויסות הקינאזות של טירוזין קולטן, כגון AXL, נקשרה לעמידות ב-AML של FLT3-ITD+, המתרחשת לצד הפעלת מסלולי PI3K/AKT ו-MAPK ושיפור היכולות האנטי-אפופטוטיות^13,14. תכנות מחדש מטבולי ועיצוב אפיגנטי זוהו גם הם כצירי רגולציה חשובים ביצירת ההתנגדות. הראיות מצביעות על כך שתאי AML במהלך הישנותה עשויים להסתגל ללחץ חמצוני המושרה על ידי כימותרפיה ולנזק DNA באמצעות פעילות מוגברת של זרחון חמצוני (OXPHOS), ויסות יחסי NAD⁺/NADH, ושינויים במצבי שינוי בהיסטונים 15,16,17. גורמים דלקתיים בסביבת מח העצם, כגון IL-6 ו-CXCL8, קשורים גם להישרדות LSC ולעמידות לכימותרפיה, לעיתים קרובות מתרחשים בתיאום עם הפעלת מסלולי איתות STAT3/NF-κB^11,18.

למרות המנגנונים המוכרים הללו, השינויים הטרנסקריפטומיים הקשורים להישנות AML ולכימורזיסטנס נותרו מאופיינים באופן לא מלא, במיוחד כאשר אותות מטבוליים, אפיגנטיים ומיקרו-סביבה של מח עצם מוערכים יחד בדגימות קליניות. תהליך עבודה זה עונה על צורך זה על ידי מתן עדיפות ל-DEGs מועמדים, מסלולים ורשתות רגולטוריות הקשורות למעבר מאבחון ראשוני לחזרה קלינית. הגישה משלבת ניתוח ביטוי דיפרנציאלי, ניתוח העשרת קבוצות גנים (GSEA) ובניית רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI) כדי למפות תכנות מחדש של שעתוק מערכתי ולמנות מועמדים לאימות מכני עתידי.

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להציג צינור ביואינפורמטיקה סטנדרטי וניתן לשחזור להשוואת טרנסקריפטומים נרחבים של דגימות מח עצם AML שאובחנו לאחרונה לעומת דגימות מח עצם של AML שאובחנו לאחרונה. ההיגיון מאחורי השימוש בטכניקת הסיליקו הזו הוא יכולתה ללכוד אירועים שעתוקיים בלתי מוטים ברחבי הגנום, תוך מעבר למגבלות ניתוח חד-נתיבי כדי לתת עדיפות לרשתות רגולטוריות מורכבות ורב-ממדיות. טכניקה זו מציעה יתרונות משמעותיים על פני שיטות חלופיות, כמו מיקרו-אריי או פאנלים ממוקדים של qPCR מרובה ממוקדים, בכך שהיא מספקת טווח דינמי גבוה יותר, יכולת לזהות תמלולים חדשניים וכימות מדויק של ביטוי גנים ללא מגבלות של גשושים מתוכננים^{מראש 19,20}. כדי לקבוע האם שיטה זו מתאימה ליישומם, יש לשים לב שצינור זה מיועד במיוחד לחוקרים המעבדים נתוני ריצוף RNA בכמויות גדולות מקבוצות קליניות מזווגות או לא מזווגות, כגון שאיפת רקמות. הוא מתאים לזיהוי חתימות רחבות הקשורות להתנגדות ורשתות רגולטוריות מועמדות, בעוד שחוקרים הזקוקים לרזולוציה ספציפית לסוג תא או מרחבי יצטרכו להשתמש בתהליכי עבודה משלימים של רצף תא יחיד או מרחבי. בסופו של דבר, פרוטוקול חישובי זה מאפשר עדיפות של גנים מועמדים, מסלולים ורשתות רגולציה לצורך מחקר ניסויי עתידי.

פרוטוקול

כל השיטות הכוללות דגימת רקמות אנושיות בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות ולהצהרת הלסינקי (שעודכנה ב-2013). דגימות מח העצם הקליניות התקבלו באישור ועדת האתיקה המוסדית (אישורים מס' TY-ZKY2024-116-01 ו-TY-ZKY2024-116-02).

1. איסוף דגימות קליניות וסיווג מטופלים

1. נבחרו דגימות שאיפת מח עצם ממטופלים שאובחנו רשמית עם לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) בהתבסס על קריטריוני סיווג ארגון הבריאות העולמי (WHO).
2. יישמו קריטריונים ספציפיים להכללה והחרגה במהלך בחירת המטופלים כדי להבטיח הומוגניות ושחזוריות של הקוהורטים. כלול מטופלים בוגרים עם AML ראשוני, והחריג מטופלים עם AML משנית, לוקמיה פרומיאלוציטית חריפה או היסטוריה קודמת של ממאירות אחרת (טבלה 1).
3. הקצו את הדגימה שנאספה לקבוצת האבחנה החדשה אם המטופל מציג AML שלא טופל קודם לכן בזמן האבחון הקליני הראשוני.
4. יש להקצות את הדגימה שנאספה לקבוצת החזרה אם המטופל מראה הופעה חוזרת של פיצוצים לוקמיים בדם ההיקפי או פיצוצים מעל 5% במח העצם לאחר הפוגה מלאה מתועדת.
5. אסוף את דגימות מח עצם שנותרו ללא זיהוי מיד לאחר הליך שאיבת מח עצם קליני שגרתי.
   הערה: בהדגמת הפרוטוקול הספציפי הזה, נאספו תשע דגימות רצופות (חמש שאובחנו לאחרונה וארבע חזרו למחלה) בין ספטמבר 2024 לספטמבר 2025. מכיוון שזה השתמשו רק בדגימות קליניות שנותרו לא מזוהות, ועדת האתיקה ויתרה על הדרישה להסכמה מדעת בכתב.
6. עבדו מיד את שאיפת מח העצם שנאספה לשימור RNA באמצעות שיטת פירוק פנול-גואנידיניום סטנדרטית²¹.
   1. העבר את שאיפת מח העצם שנאסף זה עתה לצינור איסוף המכיל נוגד קרישה. נער את הצינור כדי לערבב היטב את השאיפה ואת נוגד הקרישה.
   2. יש להוציא נפח מדוד של הדגימה הנוגדת קרישה ולהוסף אותו למגיב פירוק פנול-גואנידיניום מסחרי. שמור על יחס נפח של 3 חלקים של תגובת ליזה לדגימה של חלק אחד.
      אזהרה: תגובת הפנול-גואנידיניום לליזה מכילה כימיקלים רעילים וקורוזיביים העלולים לגרום לכוויות חמורות ולנזק לרקמות. בצע את כל הטיפול במגיב בתוך מכסה אדים כימי תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים.
   3. נער את הצינור בעוצמה כדי להומוגן לחלוטין את הדגימה ואת תגובת הליזה. ודאו שהתערובת טמעונה לחלוטין וודאו שאין קרישים נראים לעין בתמיסה.
   4. הקפאה מיידית של הדגימה ההומוגנית על ידי הטבלת הצינור בחנקן נוזלי.
      זהירות: חנקן נוזלי קר מאוד ועלול לגרום לכוויות קור חמורות במגע. לבש כפפות קריוגניות ומגן פנים מלא בעת טיפול בחנקן נוזלי.
7. העבר את הדגימות המוקפאות למקפיא בטמפרטורה של -80°C לאחסון ארוך טווח לפני צינור בידוד ה-RNA והרצף של טרנסקריפטום. זה מייצג נקודה בטוחה שבה ניתן להשהות את הניסוי ולהתחיל מחדש מאוחר יותר.
   הערה: תהליך העבודה המוצג בפרוטוקול זה מתמקד כולו ביצירת חתימות התנגדות חישובית. לא בוצעה אימות ניסויי עצמאי, כגון PCR כמותי בזמן אמת (RT-qPCR), על גנים מרכזיים שזוהו בצינור הספציפי הזה.

2. בקרת איכות RNA והכנת ספרייה

1. הערכו את שלמות ה-RNA באמצעות מערכת אלקטרופורזה קפילרית מיקרופלואידית. לזרימת עבודה מייצגת זו, כלול דגימות RNA עם מספר שלמות RNA (RIN) ≥ 6.0, יחס A260/280 בין 1.8 ל-2.1, וללא שיא התדרדרות נראית לעין. רשמו את יחס ה-RIN והטוהר שנמדדו עבור כל דגימה לפני הכנת הספרייה.
2. קלט 1 מיקרוגרם RNA כולל לכל דגימה להכנת הספרייה. לטהר את ה-mRNA מתוך כל ה-RNA באמצעות חרוזים מגנטיים מחוברים לפולי-T אוליגו להעשיר עבור תעתיקים עם זנב פוליA.
3. פרצו את ה-mRNA המועשר באמצעות קטיונים דו-ערכיים. דגרו את התערובת בטמפרטורה של 94 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בבופר סינתזה של 5X בגדיל ראשון.
4. סינתז את cDNA הגדילי הראשון באמצעות פריימרים אקראיים של הקסאמר וטרנסקריפטאז הפוך ללא פעילות RNase H.
5. פירוק גדיל תבנית ה-RNA באמצעות RNase H. סינתז את ה-cDNA של הגדילון השני באמצעות DNA פולימראז I ו-dNTPs במערכת תגובה בנפח 20 מיקרוליטר.
6. דגרו את תגובת הסינתזה של הגדילים השני בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס למשך שעה. צנטריפוגה את תערובת התגובה לזמן קצר בעוצמה של 2,000 x גרם כדי לאסוף את הנוזל בתחתית הצינור.
7. הפכו את הבליטות הנותרות לקצוות קהים באמצעות אקסונוקלאז ופולימראז. יש לאדנילציה את קצות 3' של חלקי ה-DNA ולקשור מתאמים עם מבני לולאת סיכה ראשית כדי להתכונן להיברידיזציה.
8. לטהר את שברי הספרייה באמצעות חרוזי קיבוע מגנטיים הפיכים בפאזה מוצקה כדי לבחור בהעדפה קטעי cDNA באורך 370–420 bp.
9. בצע שטיפות באתנול במהלך טיהור החרוזים. צנטריפוגה את הצינורות בעוצמה של 2,000 x גרם למשך 30 שניות כדי לאסוף ולהסיר לחלוטין כל שארת אתנול לפני השחרור הסופי.
10. לבצע הגברה של PCR באמצעות פולימראז DNA באיכות גבוהה, פריימרים אוניברסליים PCR ופריימרים אינדקסים ספציפיים לדגימה.
11. בצע את פרופיל התרמי של PCR עם דנאטורציה ראשונית ב-98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. לאחר מכן יש 12 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 60 מעלות צלזיוס ל-30 שניות, ו-72 מעלות צלזיוס ל-30 שניות, ומסתיימים בהארכה סופית של 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
12. לטהר שוב את מוצרי ה-PCR באמצעות החרוזים המגנטיים. החלו את אותם פרמטרים של צנטריפוגה משלב 2.9 כדי לקבל את הספרייה הסופית.
13. כמת את ריכוז הספרייה הראשוני באמצעות פלואורומטר. מדלל את הספרייה הסופית לריכוז של 1.5 ng/μL.
14. ערבב היטב את הספרייה המדוללת. צנטריפוגה את התערובת בעוצמה של 10,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי להסיר כל פסולת שנותרה לפני הניתוח הסופי.
15. הערכו את גודל ההוספה של הספרייה באמצעות מערכת האלקטרופורזה המיקרופלואידית הקפילרית.
16. כימות מדויק את הריכוז האפקטיבי של הספרייה באמצעות PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR) לאחר אישור שגודל ההכנסה עומד בציפיות. ודא שהריכוז גבוה מ-1.5 ננומטר כדי להבטיח יציבות ספרייה ואיכות ריצוף.
    הערה: זהו נקודה בטוחה שבה ניתן להשהות את הניסוי. הספריות המוכנות יכולות להישמר בטמפרטורה של -20°C עד לקיבוץ וריצוף.

3. אשכולות וריצוף טרנסקריפטומים

1. בצע אשכולות של הדגימות המקודדות באינדקס במערכת יצירת אשכולות אוטומטית. השתמש בערכת אשכולות זוגית מסחרית לפי הוראות היצרן.
2. רצף את ההכנות לספרייה על פלטפורמת רצף בתפוקה גבוהה לאחר יצירת אשכולות מוצלחת. יצר 150 קריאות זוגות בסיס (bp) בקצה מזווג.

4. בקרת איכות נתונים ומיפוי קריאה

1. הערך את איכות הנתונים הגולמיים (פורמט FASTQ) באמצעות fastp v0.23.2 לבקרת איכות וסינון קריאה גולמית. רשם את פרמטרי שורת הפקודה ביומן ניתוח. בתהליך עבודה זה, קריאות נקיות נוצרו על ידי הסרת קריאות המכילות מתאמים, קריאות המכילות רצפי פולי-N, וקריאות באיכות נמוכה תוך שימוש בהגדרות סינון זהות בין דגימות שונות. פקודה זוגית מייצגת מסופקת בקובץ משלים 1.
2. עבד את הקריאות הגולמיות דרך תוכנת עיבוד מוקדם אוטומטית. השגת קריאות נקיות על ידי הסרת קריאות המכילות מתאמים, קריאות המכילות רצפי פולי-N, וקריאות באיכות נמוכה. השתמשו בפרמטרי סינון זהים לכל הדגימות ורשמו את מספר הקריאה השמור, Q20, Q30 ותוכן GC לאחר הסינון.
3. חשב את תוכן ה-Q20, Q30 וה-GC של הנתונים הנקיים. הגדירו משתני אצווה פוטנציאליים לפני ניתוח במעבר, כולל תאריך איסוף דגימה, תאריך חילוץ RNA, אצווה להכנת ספרייה, מסלול ריצוף וריצוף.
4. הערכת השפעות אצווה באמצעות PCA וניתוח קורלציה בין דגימה באמצעות ערכי ביטוי מנורמלים. אם הדגימות מתאספות בעיקר לפי משתנים טכניים ולא לפי מצב קליני, יש לתעד את המשתנה המושפע ולכלול אותו כמשתנה משותף בנוסחת עיצוב הביטוי הדיפרנציאלי או ליישם שיטת התאמת אצווה מבוססת לפני ההדמיה בהמשך.
5. רכישת הגנום הייחוס (Homo sapiens, GRCh38) וה-Ensembl המתאימים משחררים 109 קבצי אנוטציה גנטיים ליישור קריאה.
6. בנה את האינדקס של הגנום הייחוס באמצעות HISAT2 v2.0.5.
7. יישר את הקריאות הנקיות בקצה הזוגי לגנום הייחוס באמצעות HISAT2 v2.0.5. השתמשו בגישה זו של יישור מודע לחיבור כדי ליצור מאגר נתונים של חיבורי חיבור המבוסס על קובץ האנוטציה של מודל הגנים.

5. חיזוי תמלול חדש וכימות ביטוי גנים

1. הרכיבו את הקריאות הממופות של כל דגימה באמצעות StringTie v1.3.3b בגישה מבוססת ייחוס. השתמש בכלי זה כדי להרכיב ולכמת תמלולים באורך מלא המייצגים מספר וריאנטים של חיבור עבור כל לוקוס גן.
2. סופר את מספר הקריאות שממופים לכל גן באמצעות featureCounts v1.5.0-p3. השתמשו במטריצת קריאה-ספירת הספרים הגולמית שהתקבלה כקלט לניתוח ביטויים דיפרנציאליים במורד הזרם.
3. הגדר את featureCounts v1.5.0-p3 לנתוני רצף בקצה זוגי באמצעות אפשרות הקצה הזוגי (למשל, -p). ספק את קובץ ההערות GRCh38 GTF שהורד כדי להגדיר את גבולות התכונות הגנומיות הנכונים.
4. חשב את הקטעים לכל קילובסיס של תמלול למיליון קריאות ממופות (FPKM) עבור כל גן. השתמשו בערכי FPKM רק להדמיה תיאורית, PCA, תצוגת מפת חום וסיכומי ביטויים חקרניים; אין להשתמש בערכי FPKM כמטריצת קלט לבדיקות ביטוי דיפרנציאלי DESeq2.

6. ניתוח ביטוי גנים שונה

1. לבצע ניתוח ביטוי שונה בין קבוצות שאובחנו לאחרונה וחזרו באמצעות R v3.5.0 וחבילת DESeq2 R v1.20.0. ייבא את מטריצת ספירת הקריאה הגולמית שנוצרה בשלב 5.2 לסביבת R, ושמור ערכי FPKM רק לצורך ויזואליזציה וניתוחים חקירתיים.
2. בנה את אובייקט מערך הנתונים המיוחד הנדרש על ידי חבילת הניתוח. בצע את הפקודה הספציפית (למשל, DESeqDataSetFromMatrix()) כדי לקשור את מטריצת נתוני הספירה לטבלת המטא-דאטה של הדגימה המתאימה.
3. הגדר את נוסחת העיצוב הניסויי בתוך אובייקט התוכנה. יש לציין את המצב הקליני (אבחנה חדשה לעומת חזרה) כמשתנה העיקרי להשוואה (למשל, design = ~ condition). אם משתנה אצווה טכני מזוהה בשלב 4.3 ואינו מתבלבל לחלוטין עם מצב קליני, יש לכלול אותו בנוסחת העיצוב (למשל, design = ~ batch + condition).
4. בצע את פונקציית ניתוח הביטוי הדיפרנציאלי המרכזי (למשל, DESeq()). אפשר לתוכנה לבצע אוטומטית הערכת גורמי גודל, הערכת פיזור, והתאמה שלילית של בדיקת וולד בינומיאלית²².
5. חלץ את טבלת התוצאות באמצעות פונקציית חילוץ התוצאות (למשל, results()). ציין את טיעון הניגוד כדי להגדיר את ההשוואה המדויקת (חזרה לעומת אבחנה חדשה).
6. כוון את ערכי ה-P המתקבלים כדי לשלוט בקצב הגילוי השגואה. נצל את ההליך המשולב Benjamini and Hochberg המיושם אוטומטית על ידי חבילת התוכנה²³.
7. סינון טבלת התוצאות שהופקה כדי לבודד את הגנים המובהקים באופן שונה (DEGs). יש להקצות כל גן עם ערך P מותאם < 0.05 ושינוי מוחלט בלוגריתם_כפולה > 1 כבעל ביטוי שונה באופן משמעותי.

7. ניתוח העשרה של אונטולוגיית גנים (GO)

1. בצע ניתוח העשרת אונטולוגיית גנים (GO) של ה-DEGs שזוהו באמצעות clusterProfiler v3.8.1 ו-org. Hs.eg.db v3.6.0. הזן את רשימת מזהי הגנים של Entrez התואמים ל-DEGs המשמעותיים שזוהו בשלב 6.7.
2. בצע את פונקציית ההעשרת GO (למשל, enrichGO()). יש לציין את הפרמטרים הנדרשים, כולל מסד הנתונים המתאים לאורגניזמים ברקע (למשל, OrgDb = org. Hs.eg.db), תחום האונטולוגיה הספציפי (תהליך ביולוגי, רכיב תאי או פונקציה מולקולרית), והחיתוך המותאם של ערך P (0.05).
3. ודא שהאלגוריתם מיישם את התיקונים הנדרשים במהלך חישוב ההעשרה. אשר שהתוכנה מתקנת פנימית את הטיית אורך הגן ומכוונת את ערכי ה-P באמצעות שיטת בנימיני והוכברג²⁴.
4. נבחן מונחי GO עם ערך P מתוקן קטן מ-0.05 כמועשר משמעותית. צור תרשים נקודות או תרשים עמודות תוך שימוש בפונקציות ההמחשה המשולבות של החבילה כדי להציג את מונחי ה-GO המועשרים ביותר.

8. אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) ניתוח העשרת מסלולים

1. השתמש במאגר נתונים מקיף המוקדש להבנת פונקציות מערכות ביולוגיות ברמה גבוהה כדי לזהות מסלולים לא מוסדרים. הכן את אותה רשימה של מזהים משמעותיים של DEG Entrez ששימשו בשלב 7.1.
2. בצע את פונקציית ההעשרה KEGG (למשל, enrichKEGG()) בתוך חבילת האנוטציה הפונקציונלית R.
3. הגדר את הפרמטרים הקריטיים בתוך קריאת הפונקציה. הגדר את קוד האורגניזם אך ורק לאדם (למשל, אורגניזם = 'יש') והגדר את שיטת התאמת ערך P (למשל, pAdjustMethod = 'BH').
4. להוציא את מסלולי KEGG המובהקים סטטיסטית. סנן את הפלט כך שישמור רק את אותם מסלולים שמראים ערך P מתוקן קטן מ-0.05.
5. המחישו את מסלולי KEGG המועשרים ביותר. השתמש בפונקציות הגרפוטינג המשולבות (למשל, dotplot()) כדי למפות את המובהקות הסטטיסטית וספירת הגנים הקשורות לכל מסלול.

9. ניתוח העשרת קבוצות גנים (GSEA)

1. הכן את רשימת הגנים המדורגת מראש הנדרשת לניתוח. חשב את מדד הדירוג לכל הגנים המובעים באמצעות ה-log10(ערך P) המוכפל בסימן השינוי הלוגריתמי_הכפול שמקורו בניתוח הביטוי הדיפרנציאלי.
2. השיק התקנה מקומית של תוכנת Broad Institute GSEA גרסה 4.2.3. הזן את רשימת הגנים המדורגת מראש לתוך ממשק התוכנה²⁵.
3. הורד את מערכי הגנים המוגדרים מראש הנדרשים. רכשו את אונטולוגיית הגנים (GO) ואת אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) מתוך מאגר החתימות המולקולריות (MSigDB, גרסה 7.5.1)²⁶.
4. הגדר את פרמטרי התוכנה לביצוע בדיקת העשרה סטטיסטית. הגדר את מספר הפרמוטציות ל-1,000 ובחר את סוג הפרמוטציה כ'gene_set'.
5. הפעל את אלגוריתם הניתוח כדי לקבוע האם קבוצות הגנים המוגדרות מראש מראות הבדל תואם ומובהק סטטיסטית בין המצב הביולוגי המאובחן החדש לבין המצב הביולוגי שחזר.
6. העריך את המשמעות הסטטיסטית של פרופילי ההעשרה שנוצרו. הגדר קבוצות גנים משמעותיות באמצעות ספים מחמירים: ערך מוחלט של ציון העשרה מנורמל (NES) > 1.0, ערך P נומינלי < 0.05, וערך Q של קצב גילוי שגוי (FDR) < 0.25.

10. ניתוח רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI)

1. גש למסד הנתונים של STRING לאינטראקציות ידועות וחזויות בין חלבון-חלבון. בתהליך עבודה זה, ניתוח PPI בוצע באמצעות STRING v11.5²⁷.
2. הזן את רשימת מזהי הגנים של Entrez או סמלי גנים רשמיים עבור הגנים המובהקים בביטוי שונה (זוהו בשלב 6.7) לממשק החיפוש של מסד הנתונים. בחרו בהומו ספיינס כאורגניזם המטרה.
3. הגדר את פרמטרי בניית הרשת כדי להבטיח שאינטראקציות באיכות גבוהה יוחזרו. קבע את ציון האינטראקציה המינימלי הנדרש לסף ביטחון גבוה (ציון > 0.700).
4. ייצא את נתוני רשת האינטראקציה שנוצרו לתיקייה מקומית. שמור את מפת האינטראקציה כקובץ טבולרי סטנדרטי (למשל, פורמט TSV).
5. ייבא את נתוני האינטראקציה המיוצאים ל-Cytoscape v3.9.1 לצורך ויזואליזציה וניתוח רשת²⁸.
6. סנן את הרשת הבנויה כדי לשפר את בהירות הוויזואליזציה ולהדגיש מרכזי רגולציה מרכזיים. הסר כל צמת מנותקת או גנים יתומים שאינם מציגים אינטראקציות רציפות העומדות בסף האמון שנקבע.

תוצאות

קוהורה קלינית ואימות ריצוף

הביצוע המוצלח של פרוטוקול חילוץ RNA והכנת ספרייה (איור 1) אושר על ידי נתוני ריצוף ואיכות נתונים. במאגר הנתונים המייצג הזה, דגימות מח עצם מחמישה חולי AML שאובחנו לאחרונה וארבעה מטופלים עם AML שאובחנו מחדש הניבו בממוצע כ-6.0GB של נתונים גולמיים לכל דגימה. הערכת בקרת איכות (טבלה 2) אישרה כי איכות הבסיס ועומק הקריאה עמדו בסף הנדרש לניתוח ביואינפורמטי במורד הזרם9. שלמות RNA נמוכה (למשל, RIN < 6.0), קצבי מיפוי נמוכים או הטיית התמלול גבוהה ייצגו איכות קלט תת-אופטימלית ויפגעו באמינות ניתוח הביטוי הדיפרנציאלי במורד הזרם.

שונות גלובלית של טרנסקריפטומיה ו-PCA

כדי להעריך שונות גלובלית בטרנסקריפטום ולבחון קיבוץ קליני, בוצע PCA על נתוני הביטוי המנורמלים. במאגר הנתונים המייצג הזה, הקבוצות שאובחנו לאחרונה וחזרו הראו הפרדה במרחב דו-ממדי (איור 2A)²⁰, כאשר PC1 ו-PC2 אחראים ל-23.82% ו-18.75% מהשונות הכוללת, בהתאמה. דיאגרמות ון באיור 2B,C מספקות סיכום תיאורי נוסף של גנים שזוהו בדגימות בתוך הקבוצות שאובחנו לאחרונה וחזרו על הבריאות, ותומכות בבדיקות שחזוריות ברמת הדגימה לפני ניתוח ביטוי שונה בהמשך. מכיוון שהקבוצה הייתה קטנה ולא מזווגת, הפרדת PCA פורשה כפלט של תהליך עבודה מהמחיש ולא כהוכחה חד-משמעית לביולוגיה ספציפית למצב מחלה.

ניתוח גנים לביטוי שונה (DEG)

החלת ספי הפרוטוקול שנקבעו (|log₂FC| ≥ 1 וערך P מותאם ≤ 0.05) על פלט DESeq2 זיהתה 2,025 DEGs, הכוללים 772 גנים מופרזים ו-1,253 גנים עם ויסות נמוך בקבוצת החזרה (איור 3A). תמלילים מועמדים עם שונות גבוהה כללו FOXC1 (log₂FC = 7.55, P = 4.92 x ^10-5), HOXA11 (log₂FC = 7.76), HOXA11-AS (log₂FC = 7.23), ו-AXL (log₂FC = 3.50), לצד RHOB, PTX3 ו-CXCL8 עם ויסות מופחת. הספרות הקיימת מקשרת כמה מהגנים הללו לשורש AML, לאיתות או לתגובה טיפולית^13,29; עם זאת, תהליך העבודה הנוכחי מזהה אותם רק כתמלילי מועמדים הקשורים לחזרה. כל תפקיד מכניסטי סופי בהתנגדות קלינית דורש אימות תפקודי עצמאי לאחר מכן.

העשרה פונקציונלית ונתיבים (GO, KEGG ו-GSEA)

פרוטוקול ההערות הפונקציונלית מיפה את ה-DEGs למערכות ביולוגיות רחבות יותר. ניתוח GO זיהה העשרה של מונחים הקשורים להעברת אותות קטנים, העברת יוני מתכת והרכבת כרומטין (איור 4A–C). מיפוי מסלולי KEGG זיהה קשרים בין אינטראקציות בין קולטני ECM ואינטראקציות בין קולטני ציטוקין (איור 4D). GSEA הראה העשרה של תהליכי RNA ביוסינתטיים בקבוצת ההישנות והעשרת מסלולי מטבוליזם אנרגיה בקבוצה החדשה שאובחנה (איור 5A). תוצאות ההעשרה הללו מספקות מפת דרכים תיאורית של סטים גנים משתנים ויש לפרשן כאסוציאציות שמייצרות השערות ולא כמניעים מוכחים לחזרה.

בניית רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI)

רשת STRING הראשונית כללה 56 צמתים ו-193 אינטראקציות. לאחר הסרת צמתים מנותקים או יתומים, תת-רשת Cytoscape המוצגת כללה 42 צמתים ו-136 אינטראקציות (איור 5B). ניתוח מודולרי רשת נתן עדיפות ל-TP53, CCL2, CXCL8 ו-IL6 כמרכזים מתמטיים עם מספר האינטראקציות הגבוה ביותר. מכיוון שרשת ה-PPI מסתמכת על ציוני אינטראקציה חזויים על ידי מסדי הנתונים (למשל, ציון ATF3: 0.982), יש לפרש את זיהוי המרכז כעדיפות מטרות למחקרים אמפיריים עתידיים ולא כהוכחה ישירה להתחמקות אפופטוזיס בתיווך p53 או מנגנוני התנגדות אחרים.

נתוני ריצוף ה-RNA הגולמיים שנוצרו בפרוטוקול זה הופקדו במאגר Figshare ונגישים לציבור דרך DOI: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.30655814 הבא. הנתונים המעובדים וקבצי הניתוח הנלווים כלולים במאמר ובחומרים המשלימים שלו. פרמטרים מייצגים של שורת פקודה והגדרות ניתוח המשמשים לשחזור זרימת העבודה החישובית מסופקים כקובץ משלים 1. כל הנתונים התומכים בממצאי מחקר זה זמינים ללא הגבלה.

מזהה מטופל	גיל (שנים)	מין	מוטציות מולקולריות	הישרדות/מעקב (חודשים)	סטטוס קליני
R_AML_1	70	זכר	FLT3-ITD (+)	22	נפטר
R_AML_2	29	נקבה	NPM1 (+)	11	חי
R_AML_3	40	זכר	CEBPA (+)	17	חי
R_AML_4	55	נקבה	שלילי משולש*	24	נפטר

טבלה 1: מאפיינים דמוגרפיים וקליניים של מטופלים בקבוצת ה-AML (R_AML) שחזרה. טבלה 1 מסכמת את המאפיינים הדמוגרפיים והקליניים של קבוצת AML ההישנות ששימשה בניתוח המייצג, כולל מאפיינים קליניים ברמת המטופל הרלוונטיים לפרשנות תהליך העבודה הטרנסקריפטומי.

דוגמה	ספרייה	Raw_reads	Raw_bases	Clean_reads	Clean_bases	Error_rate	שאלה 20	Q30	GC_pct
AML_1	FRAS25 0244891-1r	48705066	7.31G	47807532	7.17G	0.01	99.35	97.48	47.48
AML_2	FRAS25 0244896-1r	42969940	6.45G	42237962	6.34G	0.01	99.35	97.44	46.74
AML_3	FRAS2502 44906-1r	48738386	7.31G	47744462	7.16G	0.01	99.36	97.48	47.28
AML_4	FRAS250 244915-1r	48723650	7.31G	47688240	7.15G	0.01	99.29	97.26	47.45
AML_5	FRAS2502 44920-1r	49508198	7.43G	47740308	7.16G	0.01	99.37	97.53	47.73
R_AML_1	FRAS2502 44892-1r	47879408	7.18G	46671584	7.0G	0.01	99.39	97.49	47.63
R_AML_2	FRAS2502 70005-1r	47657378	7.15G	46957882	7.04G	0.01	99.39	97.49	50.5
R_AML_3	FRAS250 405722-1r	58754766	8.81G	56867112	8.53G	0.01	99.38	97.42	46.52
R_AML_4	FRAS2502 44902-1r	48491122	7.27G	47469334	7.12G	0.01	99.23	97.21	46.43

טבלה 2: סיכום איכות הנתונים. טבלה 2 מדווחת על מדדי איכות ריצוף לכל מדגם, כולל תפוקת קריאה, איכות בסיס, תוכן GC ומידע בקרת איכות הקשור למיפוי ששימש לקביעת האם הדגימות מתאימות לניתוח במורד הזרם.

איור 1: תהליך העבודה של הפרוטוקול. תהליך העבודה מסכם את השלבים הניסיוניים והחישוביים המרכזיים, כולל איסוף דגימות קליניות, בקרת איכות RNA, הכנת ספרייה וריצוף, עיבוד ויישור קריאה, כימות תמלול, ניתוח ביטוי דיפרנציאלי, העשרת GO/KEGG, GSEA ובניית רשת PPI. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: ניתוח כמותי של דגימות. (א) בוצע ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) להערכת הבדלים בין קבוצות ויכולת שחזור המדגם בתוך הקבוצה. PCA בוצע בשיטות אלגבריות ליניאריות המבוססות על ערכי ביטוי גנים מנורמלים בכל הדגימות. (B, C) דיאגרמות ון המציגות גנים שזוהו בין דגימות בקבוצות AML ובקבוצות R_AML, בהתאמה. אזורים מוגבלים על דגימה מצביעים על גנים שזוהו בדגימות בודדות, בעוד שאזורים חופפים מייצגים גנים שמזוהים בדרך כלל בשתי דגימות או יותר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: ניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי. (א) תרשים בר המציג את מספר הגנים המובעים באופן שונה (DEGs) בין קבוצות השוואה, שזוהו על ידי DESeq2 עם סף של ערך P מותאם ≤ 0.05 ו-|log₂FoldChange| ≥ 1. (ב) גרף הר געש של DEGs. ציר ה-x מייצג ערכי FoldChange log₂, וציר ה-y מייצג -log10(ערך P). קווים כחולים מקווקו מציינים את קווי הסף המשמשים לבחירת DEG. (C) מפת חום היררכית של קבוצות DEG. ציר ה-x מציין שמות דגימות, וציר ה-y מציג ערכי ביטוי מנורמלים של ה-DEGs. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4: ניתוח העשרה פונקציונלית של גנים מבוטאים באופן דיפרנציאלי. (א) מגרש בר העשרה GO. ציר ה-x מייצג את מונחי GO, וציר ה-y מציג משמעות העשרה, המובעת כ-log10(padj). הצבעים מייצגים BP (תהליך ביולוגי), CC (רכיב תאי) ו-MF (פונקציה מולקולרית). (ב) בועת העשרה של GO. ציר ה-x מייצג את היחס בין ה-DEGs המסומנים לכל מונח GO ביחס למספר הכולל של DEGs, וציר ה-y מציין את איברי GO. גודל הבועה תואם למספר הגנים המוערים, וגרדיאנטים צבעוניים מייצגים חשיבות העשרה. (ג) מגרשים בר העשרה של KEGG. ציר ה-x מייצג מסלולי KEGG, וציר ה-y מציין חשיבות העשרה. (ד) בועת העשרה של KEGG. גודל הבועה מציין את מספר הגנים המוערים, וגרדיאנטים צבעוניים משקפים חשיבות ההעשרה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 5: העשרת GSEA וניתוח רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI). (א) גרף בר המציג ציוני העשרה מנורמלים (NES) עבור קבוצות גנים משמעותיות נבחרות. ערכי NES חיוביים מצביעים על העשרה בקבוצת R_AML, בעוד ערכי NES שליליים מצביעים על העשרה בקבוצת AML שאובחנה לאחרונה. (B) רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI). כל צומת מייצג חלבון, וכל קצה מציין אינטראקציה בין חלבונים מחוברים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

דיון

שלבים קריטיים בפרוטוקול

הביצוע המוצלח של תהליך הביואינפורמטיקה הזה תלוי במספר שלבים קריטיים. ראשית, הקפאה מיידית וניתוק נכון של שאיפת מח העצם (שלב 1.6) הם קריטיים, שכן המיקרו-סביבה עשירה בריבונוקלאזים שיכולים לפגוע במהירות בשלמות טרנסקריפטומית³⁰. במהלך שלב החישוב, התצורה הנכונה של נוסחת עיצוב הניסוי בתוך חבילת DESeq2 (שלב 6.3) היא קריטית לביטוי דיפרנציאלי מדויק, במיוחד כאשר המצב הקליני (מאובחן לאחרונה לעומת הישנות) מנוגד תוך התחשבות במשתנים פוטנציאליים מבלבלים. לבסוף, יישום ספי שיעור גילוי שגוי (FDR) קפדניים במהלך ניתוח העשרת קבוצות גנים (GSEA) (שלב 9.6) הוא נקודת ביקורת סטטיסטית קריטית למניעת פרשנות יתר של רשתות פונקציונליות חיוביות שגויות.

שינויים ופתרון תקלות

אתגר נפוץ בשיטה זו הוא נוכחות של השפעות אצווה, שמתרחשות לעיתים קרובות כאשר דגימות קליניות נאספות ומרוצות לאורך מסגרות זמן ממושכות. משתני אצווה צריכים להיות מוגדרים לפני הניתוח, כולל תאריך איסוף דגימות, תאריך חילוץ RNA, אצווה להכנת ספרייה, מסלול ריצוף וריצת רצף. אם ניתוח PCA או קורלציה מדגימה מגלה אשכולות בהתבסס על תאריך ריצוף או משתנה טכני אחר ולא על פנוטיפ קליני, על המשתמשים לשנות את הפרוטוקול על ידי הכללת משתנה האצווה בנוסחת עיצוב הביטוי הדיפרנציאלי כאשר זה אפשרי סטטיסטית או על ידי יישום אלגוריתמים לתיקון אצווה, כגון ComBat או SVA, לפני הדמיה³¹. אם מיישמים פרוטוקול זה על דם מלא במקום על שאיפות מח עצם, שינוי חיוני הוא הכללת שלב דלדול גלובין mRNA במהלך הכנת הספרייה, כדי למנוע תמלול גלובין בשפע גבוה למונופול על רצף עומק הקריאה. גרסאות תוכנה והפרמטרים העיקריים לזרימת העבודה המייצגת הושלמו כך: fastp v0.23.2, HISAT2 v2.0.5, StringTie v1.3.3b, featureCounts v1.5.0-p3, R v3.5.0, DESeq2 v1.20.0, clusterProfiler v3.8.1, org. Hs.eg.db v3.6.0, רצף זוגות של 150 bp, GSEA v4.2.3 עם 1,000 פרמוטציות גנים, MSigDB v7.5.1, STRING v11.5 עם אינטראקציות ביטחון גבוהות, ו-Cytoscape v3.9.1. פרמטרים מייצגים של שורת פקודה והגדרות ניתוח מסופקים בקובץ המשלים 1.

מגבלות השיטה

למרות שהוא מקיף, לפרוטוקול זה יש מגבלות מתודולוגיות מובנות. ראשית, היא משתמשת בריצוף RNA בכמויות גדולות, שתופס את הפרופיל הטרנסקריפטומי הממוצע של כל שאיבת מח העצם וחסרה רזולוציה מרחבית של תא יחיד. לכן, זרימת העבודה אינה יכולה לקבוע האם חתימה מיותרת הקשורה להישנות נובעת מתאי גזע של לוקמיה, תאי סטרומל, תאי חיסון, או משינויים בהרכב סוג התא³². שנית, מערך הנתונים המייצג קטן (n = 9) ואינו מזווג, מה שמגביל את החוסן הסטטיסטי ומונע הסקה סיבתית סופית. שלישית, זרימת העבודה היא טהורה בסיליקו. הוא יוצר מרכזי רגולציה ומסלולי איתות מועמדים, אך אינו יכול לאמת באופן עצמאי את הצורך התפקודי שלהם בכימורזיסטנסיות ללא אימות ניסויי אורתוגונלי במבחנה או in vivo.

מחקרים גנומיים חד-תאיים וחד-תאיים עדכניים הרחיבו את מסגרת הייחוס של AML על ידי פתרון הטרוגניות במצב תא, ארכיטקטורה קלונית ואבולוציה הקשורה לטיפול ברזולוציה גבוהה יותר ^33,34,35,36. גישות אלו משלימות את תהליך ה-RNA-seq המתואר כאן: ריצוף בתפזות מספק אסטרטגיית סקר מעשית וחסכונית לחתימות טרנסקריפטומיות ברמת קוהורט, בעוד ששיטות חד-תאית ורב-אומיות יכולות לשמש במחקרי המשך להקצות אותות מועמדים לאוכלוסיות תאים ממאירות או מיקרו-סביבתיות ספציפיות.

חשיבות ביחס לשיטות קיימות

למרות מגבלות אלו, צינור הטרנסקריפטומיקה, מציע יתרונות על פני טכניקות אבחון ואנליטיות חלופיות. הערכות קליניות מסורתיות של הישנות AML לעיתים קרובות מתבססות על פאנלים qPCR מרובי ממוקדים או ציטומטריית זרימה סטנדרטית. בעוד שהן שימושיות לאבחון מהיר, שיטות ממוקדות אלו מוגבלות על ידי גשושים מוגדרים מראש ויכולות להעריך רק סמני התנגדות ידועים¹⁹. באמצעות ריצוף טרנסקריפטום גנומי בלתי מוטה, בשילוב עם ניתוח רשת, פרוטוקול זה יכול למנות תמלילים חדשים וקשרים מערכתיים רחבי היקף ששיטות ממוקדות קיימות עשויות להתעלם מהם.

חשיבות ויישומים פוטנציאליים

המתודולוגיה המפורטת בפרוטוקול זה רלוונטית להמטולוגיה תרגומית ורפואה מותאמת אישית, משום שהיא יכולה להעדיף חתימות טרנסקריפטומיות הקשורות להישנות למחקר נוסף. יישום פוטנציאלי בהמשך הוא מינוי אנטיגנים שטחיים או מסלולי התחמקות חיסונית שמופיעים במהלך הישנות. מועמדים כאלה עשויים להנחות את עיצוב מחקרי האימות העתידיים, ואם יאושרו ניסויית, עשויים לתרום לפיתוח אימונותרפיות מהדור הבא, כולל אסטרטגיות תאי CAR-T או CAR-NK³⁷. יישומים תרגומיים אלו צריכים להיחשב כמייצרי השערות ולא כמסקנות מבוססות מתוך מאגר הנתונים הנוכחי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA	RRID:SCR_019389	G2939BA
AMPure XP system	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	RRID:SCR_008452	A63881
cBot Cluster Generation System	Illumina, San Diego, CA, USA	-	SY-301-2002 or institution-specific system ID
clusterProfiler (Software)	Bioconductor	RRID:SCR_016884	v3.8.1
Cytoscape (Software)	Cytoscape Consortium	RRID:SCR_003032	v3.9.1
DESeq2 (Software)	Bioconductor	RRID:SCR_015687	v1.20.0
DNA Polymerase I	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	M0209L
dNTP Solution Mix	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	N0447L
edgeR (Software)	Bioconductor	RRID:SCR_012802	v3.22.5
fastp (Software)	OpenGene	RRID:SCR_016962	v0.23.2
featureCounts / Subread (Software)	The Walter and Eliza Hall Institute	RRID:SCR_012919	featureCounts v1.5.0-p3
GRCh38 reference genome	Genome Reference Consortium / Ensembl	-	GRCh38; Ensembl release 109
GSEA software	Broad Institute	RRID:SCR_003199	v4.2.3
HISAT2 (Software)	Johns Hopkins University	RRID:SCR_015530	v2.0.5
M-MuLV Reverse Transcriptase (RNase H-)	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	M0253L
MSigDB gene sets	Broad Institute	RRID:SCR_016863	v7.5.1
NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	E7760L/E7765L or laboratory-specific kit
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	E7770L
NovaSeq sequencing platform	Illumina, San Diego, CA, USA	RRID:SCR_016387	NovaSeq system; service-provider instrument ID
org.Hs.eg.db (Annotation package)	Bioconductor	-	v3.6.0
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	RRID:AB_2756816	F530L
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	RRID:SCR_018095	Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	-	Q32851
R software	R Foundation for Statistical Computing	RRID:SCR_001905	v3.5.0
Random Hexamer Primer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	-	SO142
RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA	-	5067-1511
RNase H	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	M0297L
RNA-seq Library Prep Kit / Sequencing Service	Novogene, Beijing, China	-	Project No. X101SC25054246-Z01-J003
STRING database	STRING Consortium	RRID:SCR_005223	v11.5
StringTie (Software)	Johns Hopkins University / Center for Computational Biology	RRID:SCR_016323	v1.3.3b
TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS	Illumina, San Diego, CA, USA	-	PE-401-3001