מחקר זה מציג שיטת הזנה מבוססת ג'לטין המאפשרת מתן תרופות אוראליות מדויקות, לא פולשניות, המבוססות על מסת גוף, בדגי זברה בוגרים. הפרוטוקול מדגים קבלת הזנה אמינה, וכהוכחת עקרון, אספקה מוצלחת של MK-801, שהובילה להשפעות ההתנהגות הצפויות.
מאמר שיטה
גישה פשוטה ומדויקת מבוססת מזון למתן תרופות דרך הפה בדגים
במאמר זה
סיכום
תקציר
שיטות טיפוסיות למתן תרופות בדגים (למשל, מינון בקבוקון, הזרקות תוך-פריטוניאליות או סערה אוראלית) הן גוזלות זמן, לא מדויקות ו/או בזבוזניות. מכיוון ששיטות אלו גם מלחיצות עבור בעלי החיים, הן אינן מתאימות במיוחד למתן תרופות חוזר או ארוך טווח ולניסויים התנהגותיים הרגישים לבלבולים הקשורים לטיפול, ובכך מגבילים את השימוש במודלים של דגים במחקר ביו-רפואי. כדי להתגבר על מכשולים אלו, פותחה שיטת הזנה מבוססת ג'לטין שאפשרה מינון מהיר ומדויק של תרופות בדגים עם הפרעה מינימלית. השיטה כוללת הכנת חתיכות מזון מותאמות אישית המורכבות מג'לטין, תמצית שרימפס במי מלח, ספירולינה והתרופה המועדפת. התכונות הגמישות של הג'לטין מאפשרות לנוזל תכשיר הומוגני אחד, לחלק אותו במדויק לפי מסת הגוף האישית, ולהיצמד מחדש לחלקי גוף מותאמים אישית. כהוכחה לעיקרון, האנטגוניסט של קולטני NMDA MK-801 (4 מ"ג ק"ג) ניתן לדגי זברה בוגרים לפני מבחן האקווריום החדש, מה שהוביל להשפעות התנהגותיות התואמות להפחתת התנהגות דמוית חרדה. גישה זו מתאימה היטב לפרמקולוגיה התנהגותית וניתנת להתאמה בקלות לאורגניזמים אחרים במודל ימי.
מבוא
דגי זברה (Danio rerio) משמשים באופן נרחב במחקר ביו-רפואי לחקר התפתחות, פיזיולוגיה, התנהגות ופרמקולוגיה 1,2,3. עם זאת, התועלת של דג הזברה למחקרים פרמקולוגיים, במיוחד בבעלי חיים בוגרים, מוגבלת על ידי זמינות שיטות מתן תרופות מדויקות ומינימליות מפריעות 4.
טכניקות נפוצות למתן תרופות בדגי זברה, כגון מינון בקבוק, הזרקה תוך-פריטונלית וגז אוראלי, לכל אחת מהן חסרונות משמעותיים. חשיפה בטבילה מלאה בגוף באמצעות מינון בכוס מספקת שליטה מוגבלת על קליטת התרופות, גורמת לפסולת תרכובת משמעותית, ומכניסה שונות בשל הבדלים בקצב הספיגה וביציבות התרכובות 5,6,7. גישות מבוססות הזרקה וגלידג' אורלי מאפשרות מינון מדויק יותר אך דורשות הרדמה, איפוק וטיפול חוזר, שכולם יכולים לעורר תגובות לחץ תוך הגברת הסיכון לפציעה או היפוקסיה, מה שעלול לבלבל מדידות התנהגותיות ופיזיולוגיות 8,9,10. מגבלות אלו מהוות בעיה במיוחד בניסויים הכוללים מתן תרופות חוזר או ארוך טווח.
כדי להתמודד עם אתגרים אלו, פותחה שיטת הזנה מבוססת ג'לטין המאפשרת העברת תרופות מהירה, מדויקת ולא פולשנית לדגי זברה11. גישה זו מאפשרת לשלב תרכובות פרמקולוגיות בחתיכות מזון קטנות ומותאמות אישית המורכבות מג'לטין, תמצית שרימפס במי מלח וספירולינה. אספקת תרופות מבוססת מזון היא חלופה לא פולשנית התואמת את עקרונות 3R (החלפה, הפחתה וזיקוק) במחקר אתי על בעלי חיים. למרות שמחקרים קודמים הוכיחו את היתכנות אספקת תרופות מבוססות מזון בדגי זברה בוגרים 12,13,14, הגישות הקיימות מסתמכות על מטריצות מזון הטרוגניות או נפחי מזון קבועים שאינם מתחשבים בשונות האישיות במסת הגוף. השיטה המתוארת כאן מתמודדת עם מגבלות אלו על ידי הפעלת כיול מינון מבוסס משקל.
פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט, שלב אחר שלב, של הכנה ומתן מזון מבוסס ג'לטין בדגי זברה בוגרים. למרות שהשיטה מודגמת באמצעות מבחן התנהגותי, מבחן האקווריום החדש, היא רלוונטית באופן רחב לתחומים אחרים בביולוגיית דגי הזברה וצפויה להיות גמישה לשימוש באורגניזמים אחרים של מודלים ימיים. פרוטוקול זה מציע פתרון מעשי לחוקרים המחפשים אספקת תרופות יעילה, ניתנת לשחזור וללא לחץ בדגי זברה, במיוחד במחקרים הדורשים מניפולציה פרמקולוגית מדויקת, חוזרת ו/או ארוכת טווח.
פרוטוקול
דגי זברה בוגרים זכרים ונקבות מסוג AB ו-TL (בני 4–12 חודשים) שימשו במחקר זה. כל בעלי החיים גודלו והוחזקו באוניברסיטת ויין סטייט. כל ההליכים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדיים בהתאם להנחיות אוניברסיטת ויין סטייט. הדגים הוחזקו בתנאים סטנדרטיים על מדפים בצפיפות גבוהה (טמפרטורה 27.5 ± 0.5 מעלות צלזיוס, מוליכות מים 500 מיקרו-שנייה ± 10 מיקרו-שניות, ו-pH 7.5 ± 0.2) עם מחזור של 14 שעות ו-10 שעות של אור-חושך (אורות דלוקים ב-08:00). הדגים הואכלו פעמיים ביום עם אוכל יבש בבוקר ושרימפס מלח שבקעו זה עתה אחר הצהריים. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.
1. שקילת דגים וחישוב נפח המזון
- מלא בקבוק זכוכית בנפח 100 מ"ל בכ-50 מ"ל מים של מערכת והניח אותו על קנה מידה דיגיטלי. תעמוד בסולם.
- רשת עדינה דג אחד מהאקווריום הביתי באמצעות רשת דקה. נגעו בקצרה ברשת במגבת נייר יבשה כדי להסיר מים עודפים.
- העבר בזהירות את הדג לתוך הבקבוק, וודא שמים לא יישפכו על הקשקשים.
- רשמו את המשקל והשתמשו במשקל זה כדי לחשב את נפח המזון הנדרש בהתבסס על נפח של 1% למשקל גוף (V/BW) לכל דג בנפרד.
2. הכנת תמצית שרימפס במי מלח
- השלת אבקת שרימפס במי מלח במים מזוקקים לריכוז סופי של 250 מ"ג/מ"ל. מערבבים שעה בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה את המתלים ב-12,500 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ושמרו על הסופרנאנט.
- חזור על הצנטריפוגציה שוב ואסף שוב את הסופרנטנט.
- אחסן את תמצית השרימפס במי מלח בטמפרטורה של −20°C עד 6 חודשים.
3. הכנת מזון מבוסס ג'לטין
- הפשיר את תמצית השרימפס במי מלח לפני ההכנה וחשב את מסות היעד של ג'לטין (12% w/v), ספירולינה (4% w/v), ואם רלוונטי, תרכובות פרמקולוגיות הנדרשות לנפח הרצוי של מזון ג'לטין.
- שקול אבקת ספירולינה וג'לטין (שמקור בחזיר; בלום ≈ 300 גרם) לצינורות מיקרוצנטריפוגה נפרדים בנפח 1.5 מ"ל ותיעד את המסה האמיתית בכל צינור. ודא שהמסה הנמדדת נמצאת במשקל היעד או מעליו עבור הנפח הסופי המיועד.
- הוסף את הנפחים המתאימים של תמצית שרימפס, תרכובת תרופה ומים לצינור המכיל ספירולינה, כדי להגיע לריכוזים סופיים של 4% w/v ספירולינה ותמצית שרימפס במי מלח של 80 מ"ג/מ"ל.
- מערבולת כדי להודג'יז באופן יסודי. העבר את נפח התערובת הנדרש מהשלב הקודם לצינור המכיל ג'לטין כדי לקבל ריכוז ג'לטין סופי של 12% w/v.
- מניחים את הצינור על בלוק חימום מחומם מראש בטמפרטורה של 45°C למשך 5 דקות, תוך סחרור לסירוגין עד שהג'לטין נמס לחלוטין. אם המסה אינה שלמה, ערבבו בעדינות באמצעות מקל ערבוב עץ או מתכת סטרילי כדי לסייע בהומוגניזציה.
- עליקו את התערובת ההומוגנית המלאה (עד 100 מיקרוליטר לכל צינור) לצינורות מיקרוצנטריפוגה מסומנים בנפח 1.5 מ"ל.
- אחסן את האליקוויטים בטמפרטורה של −20°C במהלך הלילה כדי לאפשר התמצקות מלאה ולהקל על הטיפול במהלך האכלה.
4. היווצרות חתיכות מזון בודדות
- חממו מחדש את תערובת הג'לטין שנקבעה ל-45 מעלות צלזיוס עד לנוזל מלא לפני ההאכלה.
- מערבולת את תערובת הג'לטין הנוזלי לעומק.
- פיפט את הנפח המקביל ל-1% ממסת גוף הדג על שכבת פרפין ליצירת חתיכות בודדות (איור 1).
הערה: כדי להקל על הטיפול והאחסון, הניחו דף סרט פרפין בתוך צלחת פטרי לפני חלוקת הנפח. דבר זה מאפשר לפרפין להישאר שטוח ומקל על העברת החתיכות המוכנות לטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס לאחסון. - הניחו חתיכות בטמפרטורה של −20°C למשך לפחות 20 דקות כדי לאפשר התגבשות מחדש.
- תשמור את הפירסים על הקרח עד להאכלה.
5. מתן מזון לג'לטין
- העבר דגים מהמתקן לחדר ההתנהגות ותן להם להתרגל לשעה.
- בודדו זמנית כל דג באקווריום באמצעות מחסומים שקופים למשך 2–5 דקות לפני האכלה.
- באמצעות מלקחיים, הנח את חתיכת הג'לטין המותאמת ל-1% ממשקל גוף הדג על פני המים מול כל דג מבודד.
- עקבו אחרי כל דג כדי לאשר את צריכת כל חתיכת המזון תוך 5 דקות.
- לאחר שהדגים צרכו את המזון, יש להסיר את המחסומים ולהחזיר את הדגים לאקווריום הבית שלהם או להמשיך בהליכים ניסיוניים.
הערה: דוגמה מעובדת המתארת הכנת המזון וחישוב כמויות המיקוד והמינון בפועל מסופקת בקובץ המשלים 1, עם ערכי דוגמה המוצגים גם בטבלה 1.
תוצאות
טעימות המזון לג'לטין
כדי להעריך את טעימות המזון, דגי הזברה הבוגרים AB ו-TL קיבלו מזון מבוסס ג'לטין במשך חמישה ימים רצופים במקום האכלת הבוקר (איור 2). כל דגי TL צרכו את המזון בתוך 5 דקות בחשיפה הראשונה, בעוד דגי AB דרשו חשיפה חוזרת, כאשר 15 מתוך 16 פרטים צרכו את המזון בעקביות לאחר ארבעה ימים רצופים של הסתגלות (איור 2A). ניתוח זמן לצריכת המזון באמצעות אנובה תלת-כיוונית (זן × מין × יום) חשף השפעות עיקריות משמעותיות של מאמץ (F₁,₁₂₅ = 19.4, P < 0.0001) ושל יום (F₄,₁₂₅ = 5.80, P < 0.001), אך לא היה השפעה עיקרית של מין (F₁,₁₂₅ = 0.24, P = 0.63). נצפו אינטראקציות משמעותיות בין מאמץ ליום (F₄,₁₂₅ = 3.35, P = 0.012) ובין זן, יום ומין (F₄,₁₂₅ = 2.55, P = 0.04). דגי TL משני המינים צרכו את המזון במהירות מהחשיפה הראשונה (4–20 שניות), בעוד דגי AB הראו זמני צריכה ראשוניים ארוכים יותר (7–144 שניות) שירדו במהלך ימים (איור 2B). בימים הרביעי והחמישי, כל הדגים פרט לזכר AB אחד צרכו את המזון בתוך 10 שניות. כ-95% מהדגים צורכים את מזון הג'לטין בתוך 30 שניות מההצגה לאחר 2–3 ימים של הסתגלות, כפי שדווח קודםלכן 15,16.
ההשפעה ההתנהגותית של MK-801 שניתנה באמצעות הזנת ג'לטין
כדי להדגים את יעילות מתן תרופות מבוססות ג'לטין, ניתן MK-801, אנטגוניסט לקולטן N-מתיל-D-אספרטט (NMDAR), באמצעות הזנת ג'לטין. מרחק הקרקעית במהלך חקר מיכל חדש נמדד כקריאה התנהגותית. MK-801 ידוע בשינוי תנועה והתנהגויות דמויות חרדה או הימנעות מטורף בדגי זברהבוגרים 17. דגי זברה בוגרים מסוג AB התרגלו להליך האכלה על ידי קבלת חתיכות ג'לטין ללא התרופה במשך יומיים רצופים, כדי להבטיח היכרות וצריכה אמינה. ביום השלישי, דגים שהוקצו לקבוצת הטיפול קיבלו מנה אחת של MK-801 (4 מ"ג ק"ג) ששולבה במזון הג'לטין. דגי הבקרה קיבלו חתיכת ג'לטין זהה בלבד עם כלי רכב (מים). ההאכלה ניתנה 30 דקות לפני הערכת ההתנהגות במבחן האקווריום החדש.
התנהגות דמוית חרדה או הימנעות מטורף, שנמדדה כמרחק מהתחתית, נותחה באמצעות תרופה × מין (ANOVA) 2 × 2, שחשפה השפעה עיקרית משמעותית של MK-801 (איור 3) (F₁,₆₉ = 24.5, P < 0.001). דגים שטופלו בתרופות בילו יותר זמן קרוב לחלק העליון של האקווריום, דפוס שמפורש בדרך כלל כהתנהגות מופחתת דמוית חרדה או הימנעות מטורף. לא הייתה השפעה עיקרית של מין (F1,69=2.52, P=0.12) או של אינטראקציה עם תרופות (F 1,69=1.0, P=0.32). מבחני t זוגיים שתוקנו על ידי FDR אישרו כי MK-801 הגדיל את המרחק התחתון הן בנשים (P = 0.0076) והן בזכרים (P = 0.023).
ביחד, ממצאים אלו מראים כי מזון מבוסס ג'לטין מאפשר אספקה יעילה דרך הפה של תרכובות פרמקולוגיות, ויוצר שינויים צפויים בהתנהגות החיים בתחתית בניסוי המיכל החדש.
איור 1: הכנת הזנת ג'לטין. הזנת ג'לטין הושפכה על סרט פרפין בחלקים מותאמים אישית המתאימים ל-1% ממסת הגוף, והותרה על טמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס. איור זה שונה מאוצ'וקי ואח' 11. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.
איור 2: צריכת מזון מבוסס ג'לטין על ידי דגי זברה בוגרים. (א) אחוז דגי AB ו-TL משני המינים שצרכו את המזון בתוך 5 דקות מהמנה. (ב) זמן לצריכת דגי AB ו-TL לפי מין. דגים שלא צרכו את המזון הוצאו מניתוח זמן האכילה. הנתונים מוצגים כממוצעים ± s.e.m.; n = 8 דגים לכל זן ומין. איור זה שונה מאוצ'וקי ואח' 11. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.
איור 3: השפעות התנהגותיות של מתן אנטגוניסטים לקולטני NMDA. MK-801 (4 מ"ג/ק"ג) ניתן 30 דקות לפני ניסוי האקווריום החדש בדגי זברה AB בוגרים משני המינים. המרחק מהתחתית של המיכל שימש כמדד להתנהגות דמוית חרדה/הימנעות מטורף. הנתונים מוצגים כגרפים של קופסה ושפם המציגים את החציון (קו המרכז), הטווח הבין-רבעוני (קופסה) ו-±1.5× את טווח הרבעון (שפמים). *P < 0.05 בהתבסס על מבחני t מתוקנים בקצב גילוי שגוי. גודל מדגם: רכב נשי, n = 20; נקבה MK-801, n = 19; רכב גברי, n = 19; זכר MK-801, n = 15. חמישה בעלי חיים הוצאו מהניתוח כי לא צרכו את המזון הג'לטיני. איור זה שונה מאוצ'וקי ואח' 11. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.
| רכיב | ריכוז מלאי | ריכוז מטרות | מסה/נפח יעד | מסה/נפח בפועל |
| ג'לטין | - | 12% (עם ניצחון) | 60 מ"ג | 62 מ"ג |
| ספירולינה | - | 4% (עם ניצחון) | 20 מ"ג | 25 מ"ג |
| תמצית שרימפס במי מלח | 250 מ"ג/מ"ל | 80 מ"ג/מ"ל | 160 מיקרוליטר | 200 מיקרוליטר |
| סם | 10 מ"ג/מ"ל | 0.4 מ"ג/מיקרוליטר (4 מ"ג/ק"ג ב-1% משקל גוף) | 20 מיקרוליטר | 25 מיקרוליטר |
| מים | - | - | 320 מיקרוליטר | 400 מיקרוליטר |
| סך הנפח של מזון נוזלי | - | - | 500 מיקרוליטר | 625 מיקרוליטר |
| נפח המזון המוגמר | - | - | 500 מיקרוליטר | 516.7 מיקרוליטר |
טבלה 1: דוגמה להכנת מזון לג'לטין. ריכוזי המלאי, המטרה והמסות או הנפחים ההיפותטיים המשמשים להכנת מזון מבוסס ג'לטין למשלוח תרופות של 4 מ"ג/ק"ג במשקל גוף של 1%.
קובץ משלים 1: דוגמה להכנת מזון מבוסס ג'לטין למספר דגים. דוגמה מטופלת המדגימה את נוסח המזון המכיל תרופה ואת חישוב נפחי מינון מותאמים אישית לפי משקל גוף אישי. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.
דיון
שיטת ההזנה מבוססת הג'לטין המוצגת כאן מתגברת על מגבלות מרכזיות בשיטות נפוצות למתן תרופות בדגי זברה על ידי מתן מינון מותאם אישית מבוסס מסת גוף עם טיפול מינימלי. דבר זה משפר את הדיוק והשחזור הניסיוני. הטבע הגמיש של הג'לטין בחום מאפשר לנוזל תכשיל הומוגני יחיד, לחלוקה מדויקת ולהיצקות מחדש לחלקיקים אישיים, תוך שמירה על חלוקה אחידה של התרופות תוך התחשבות בשונות בגודל בין אנשים. בנוסף, מתן דרך הפה באמצעות הזנת ג'לטין מונע את הלחץ והפציעה האפשרית הקשורים לשיטות מבוססות הזרקה, מה שמהווה שיפור חשוב במסגרת 3Rs4.
היתרונות של גישה זו תלויים בביצוע מדויק. מספר גורמים פרוצדורליים הם קריטיים ליישום מוצלח. מדידה מדויקת של מסת הגוף האישית היא חיונית, שכן דגי זברה בוגרים יכולים להראות הטרוגניות משמעותית גם בקבוצות גיל, מין ומתח, כאשר מסת הגוף משתנה כמעט פי שלושה בין אנשים 11,18,19. הומוגניזציה יסודית של התרכובת בתוך מטריצת הג'לטין חשובה לא פחות כדי להבטיח מינון עקבי בין חלקי המזון. לבסוף, הסתגלות דגים למזון ג'לטין לפני מתן התרופות מפחיתה סירוב למזון; מומלץ לקבל אישור חזותי של בליעת המזון כדי להבטיח מתן מינון מדויק.
גם עם ביצוע נכון, קיימים אתגרים מעשיים באספקת תרופות מבוססת מזון. בעיה פוטנציאלית היא סידור לא נכון של חלקי המזון שיכולים לגרום להתפוררות מהירה של המזון לאחר הנחתה במים. זה בדרך כלל נובע משליטה לא מספקת בטמפרטורה ו/או ערבוב לא מספק במהלך ההכנה, חימום ממושך או מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים של חומרי הגלם. כדי למנוע זאת, יש להבטיח המסה מלאה של הג'לטין באמצעות חימום/ערבוב נכון, ויש לחלק את הצירים המוכנים למנות חד-פעמיות שמופשרות פעם אחת בלבד ומשתמשות בהן במהירות. להכנות רגישות מומלץ להכין חתיכת מזון נוספת, שניתן להוסיף לבקבוק מים, תוך אישור ההגדרה הנכונה לפני הניסוי. עבור תרכובות שמפחיתות את טעימות המזון, ניתן לשפר את הקבלה על ידי שילוב מושכים כמו מיץ צדפות12-13 או מושכי דגים מסחריים20. במחקר הנוכחי, תמצית שרימפס במי מלח שימשה לשיפור הטעם והוכיחה את יעילותה. חלופה נוספת היא מתן מספר מנות קטנות יותר עשוי לשפר את הצריכה תוך השגת החשיפה המצטברת הרצויה. מעבר לשיקולים מעשיים אלו, לאספקה מבוססת מזון יש גם מגבלות פרמקוקינטיות מובנות. כמו בכל שיטות המתן הפה, הספיגה במערכת העיכול עשויה לעכב או להפחית את הזמינות הביולוגית ביחס לשיטות מבוססות הזרקה, ויציבות התרכובות במטריצת המזון עשויה להשתנות.
למרות ההסתגלות, חלק קטן מהבעלי חיים עשויים שלא לצרוך את המזון הג'לטיני ויש להוציא אותם מהניתוח, שכן ייתכן שלא יקבלו את מנת התרופה הצפויה. שיעורי הסירוב נעים בדרך כלל בין 2.4% ל-6.4%15,16, ולכן אינם מהווים מכשול מתודולוגי מרכזי. צריכת המזון עשויה להשתנות גם בין זנים. אפקט הזן הזה תואם דיווחים קודמים המראים כי רקע גנטי יכול להשפיע על השהיה להגיע למזון20. יש לקחת בחשבון גורמים אלה בעת תכנון ניסויים. מומלץ לדווח על עמידה בתזונה לצד זהות הזן כדי לשפר את השקיפות והשחזור.
מגבלה חשובה נוספת של המחקר הנוכחי היא שהפרוטוקול פותח ואומת אך ורק בדגי זברה בוגרים ולכן אינו ניתן להעברה ישירה לשלב הזחל. שיטה זו מתבססת על מינון אישי מבוסס מסת גוף וצריכה של חתיכות ג'לטין נפרדות. זה אפשרי אצל בוגרים אך אינו מעשי בזחלים בשל גודלם הקטן, התנהגות האכילה המבוססת על תלייה והקושי לקבל מדידות אמינות של מסת גוף בודדת. כתוצאה מכך, התאמה ליישומים של זחלים תדרוש שינויים משמעותיים. שינויים אלו עשויים לכלול פיתוח חלקיקים בקנה מידה מיקרו ואסטרטגיות הפצה חלופיות.
בהשוואה לשיטות מבוססות מזון שתוארו קודם, גישה זו מציעה דיוק מינון טוב יותר ונוחות שימוש. מזונות ג'לטינים מסחריים דורשים חלוקה של חומר הטרוגני, מה שמגביל את דיוק המינון12, בעוד ששיטות אחרות מספקות כמויות אחידות לכל בעלי החיים ומניחות את אותה מסת גוף 14,21. על ידי מתן מינונים מותאמים אישית, שיטת ההזנה מבוססת הג'לטין המתוארת כאן מונעת מנת יתר או יתר ומשפרת את השליטה הניסיונית; זה גם מקנה את מינון התרופות בדגי זברה בוגרים בהתאם לפרקטיקות הטובות ביותר במכרסמים שבדרך כלל מנקבות לפי משקל. שיטה זו מתאימה גם למחקרים הדורשים מניפולציה פרמקולוגית מדויקת וחוזרת, שכן היא גורמת ללחץ מינימלי. זה כולל יישומים בנוירו-מדעי ההתנהגות, נוירופרמקולוגיה ומחקר הזדקנות. הוא גם מועיל לתרכובות שמגיבות עם חומרי הרדמה או מציגות יציבות ירודה בסביבות מימיות. למרות שהודגם כאן בדגי זברה בוגרים, הגישה ניתנת להתאמה בקלות לאורגניזמים אחרים של מודלים ימיים. בסך הכול, טכניקה זו משפרת את דיוק המינון, רווחת בעלי החיים והגמישות המתודולוגית, ומרחיבה את השימושיות של מודלים לדגים במחקר ביו-רפואי.
גילויים
פרוטוקול זה מבוסס על עבודה שפורסמה בעבר ב-Journal of Experimental Biology, Ochocki AJ, Kenney JW, 202311. המאמר הנוכחי מספק הנחיות מתודולוגיות מפורטות ומורחבות לשחזוריות.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (R35GM142566) ל-J.W.K.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| (+) MK-801 hydrogen maleate powder | SIGMA-ALDRICH | M107-5MG | |
| Gelatin From porcine skin powder | SIGMA-ALDRICH | G1890-100G | עוצמת ג'ל ~300 גרם בלום, סוג A, ביוריאגנט |
| Mikro Fine Dried Brine shrimp | Brine Shrimp Direct | https://www.brineshrimpdirect.com/mikro-fine-dried-brine-shrimp-16-ounce | Fine < 400 מיקרון |
| Spirulina powder | Brine Shrimp Direct | https://www.brineshrimpdirect.com/spirulina-powder-spirulina-powder-2-oz | 99% Pure blue green algae |
מקורות
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish emergence of a new model vertebrate. Nat Rev Genet. 3 (9), 717-724 (2002).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics. BMC Neurosci. 11 (1), 90 (2010).
- Gerlai, R. Evolutionary conservation translational relevance and cognitive function the future of zebrafish in behavioral neuroscience. Neurosci Biobehav Rev. 116, 426-435 (2020).
- Sneddon, L. U., Halsey, L. G., Bury, N. R. Considering aspects of the 3Rs principles within experimental animal biology. J Exp Biol. 220 (17), 3007-3016 (2017).
- Levin, E. D., Limpuangthip, J., Rachakonda, T., Peterson, M. Timing of nicotine effects on learning in zebrafish. Psychopharmacology (Berl). 184 (3-4), 547-552 (2006).
- Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. J Comp Neurol. 518 (6), 800-814 (2010).
- Sison, M., Gerlai, R. Behavioral performance altering effects of MK-801 in zebrafish (Danio rerio). Behav Brain Res. 220 (2), 331-337 (2011).
- Neely, M. N., Pfeifer, J. D., Caparon, M. Streptococcus zebrafish model of bacterial pathogenesis. Infect Immun. 70 (7), 3904-3914 (2002).
- Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal injection into adult zebrafish. J Vis Exp. (42), e2126 (2010).
- Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging adult zebrafish. J Vis Exp. (78), e50691 (2013).
- Ochocki, A. J., Kenney, J. W. A gelatin-based feed for precise and non-invasive drug delivery to adult zebrafish. J Exp Biol. 226 (2), jeb245186 (2023).
- Sciarra, J. B., Tyler, A., Kolb, A. A gelatin-based diet for oral dosing juvenile to adult zebrafish. Lab Anim Sci Prof. 32, 35 (2014).
- Chang, C. T., Doerr, K. M., Whipps, C. M. Antibiotic treatment of zebrafish mycobacteriosis tolerance and efficacy of treatments with tigecycline and clarithromycin. J Fish Dis. 40 (10), 1473-1485 (2017).
- Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel protocol for the oral administration of test chemicals to adult zebrafish. Zebrafish. 8 (4), 203-210 (2011).
- Atiratana, T., Goldson, A. R., Samosorn, S., Rajput, N., Praphairaksit, N., et al. The effects of Arabian jasmine on zebrafish behavior depends on strain sex and personality. PLoS One. 20 (9), e0332642 (2025).
- Beigloo, F., Davidson, C. J., Gjonaj, J., Perrine, S. A., Kenney, J. W. Individual differences in the boldness of female zebrafish are associated with alterations in serotonin function. bioRxiv. , (2024).
- Benvenutti, R., Gallas-Lopes, M., Marcon, M., Reschke, C. R., Herrmann, A. P., et al. Glutamate NMDA receptor antagonists with relevance to schizophrenia a review of zebrafish behavioral studies. Curr Neuropharmacol. 20 (3), 494-509 (2022).
- Fowler, L. A., Williams, M. B., Dennis-Cornelius, L. N., Farmer, S., Barry, R. J., et al. Influence of commercial and laboratory diets on growth body composition and reproduction in the zebrafish Danio rerio. Zebrafish. 16 (6), 508-521 (2019).
- Siccardi, A. J., Garris, H. W., Jones, W. T., Moseley, D. B., D’Abramo, L. R., et al. Growth and survival of zebrafish Danio rerio fed different commercial and laboratory diets. Zebrafish. 6 (3), 275-280 (2009).
- Oswald, M., Robison, B. D. Strain-specific alteration of zebrafish feeding behavior in response to aversive stimuli. Can J Zool. 86 (10), 1085-1094 (2008).
- Lu, Y., Patton, E. E. Long-term non-invasive drug treatments in adult zebrafish that lead to melanoma drug resistance. Dis Model Mech. 15 (5), dmm049401 (2022).
הדפסות חוזרות והרשאות
