הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל עכבר קומבינטורי של הפרעה צירקדית ולחץ תזונתי לחקר פתופיזיולוגיה של הזדקנות מואצת על ידי אורח חיים

254 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70866

⸱

28 באפריל 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chinese Materia Medica, Chengde Medical University, 2School of Pharmacy, Hebei Medical University, 3State Key Laboratory for Innovation and Transformation of Luobing Theory, 4College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Hebei University of Chinese Medicine, 5The Second Clinical Medical College, Heilongjiang University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת מודל עכבר של קצב צירקדי לא מסודר בתוספת תזונה עתירת שומן וסוכר (HFHS), המדמה אורח חיים לא בריא ומעוררת הפרעות מטבוליות ופנוטיפים של הזדקנות.

תקציר

מטרת הפרוטוקול הזה היא להקים מודל עכברים סטנדרטי שמסכם את הנזק הרב-גורמי שנגרם על ידי אורח חיים מודרני ולא בריא. לשם כך, פיתחנו מודל חדש של C57BL/6J המשלב הפרעות קצב צירקדי אקראי ודיאטה עתירת שומן וסוכר (HFHS), עם קבוצות HFHS חד-פקטוריות והפרעות צירקדיות כביקורת. בהשוואה לביקורת, המודל המשולב הראה הפרעות מטבוליות חמורות יותר, כולל עלייה במשקל הגוף, רמות גבוהות של גלוקוז ושומנים בצום, סטאטוזיס כבד בולט, וכן ליקויים קוגניטיביים ומוטוריים ברורים. המודל המורכב גם הציג הזדקנות מואצת משמעותית יותר, כפי שאושר על ידי מדד השבריריות וצביעת המטוקסילין ואאוזין (HE). מודל משולב זה מחקה באופן אמין ירידה מטבולית-קוגניטיבית הקשורה לאורח חיים והזדקנות מוקדמת. פרוטוקול שכפול שלב אחר שלב זה תומך במחקרים מכניים על הזדקנות מתווכת אורח חיים ובהערכת אסטרטגיות טיפוליות ממוקדות.

מבוא

אורח חיים מודרני מואץ חושף יותר ויותר אוכלוסיות להתנהגויות משבשות קצב ותזונה שמנה, עם ראיות משכנעות שמקשרות בין גורמים אלו לירידה תפקודית מערכתית ופתוגנזה כרונית של מחלה1. נתונים אפידמיולוגיים חושפים מחלות נלוות בולטות: עובדי משמרת מראים שכיחות גבוהה של סמנים מטבוליים, בעוד שצריכה ארוכת טווח של דיאטה עשירה בשומן ובסוכר קשורה באופן חזק לסיכון מוגבר לדמנציה 2,3. העלבונות הללו מתכנסים למניעת פתולוגיה רב-איברית — תפקוד מטבולי לקוי לעיתים קרובות מתרחש במקביל לירידה קוגניטיבית מואצת ולשינוי קרדיווסקולרי, מה שמדגים שיח דו-כיווני בין הידרדרות פריפרית למרכזית. למרות סינרגיות קליניות מוכרות, מודלים פרה-קליניים סטנדרטיים הלוכדים את הפתופיזיולוגיה המשולבת של ירידה באיברים הנגרמת מאורח חיים נותרו לא מפותחים.

ברמה המולקולרית, חוסר יישור צירקדי כרוני מתחיל מפל פתולוגי שמקורו בגרעין הסופרכיאזמטי, ומפריע לאיתות גלוטמטרגי להיפותלמוס הפרה-ונטריקולרי ומחליש את הדופק של הורמון משחרר קורטיקוטרופין. דבר זה פוגעבמשוב שלילי בציר ההיפותלמוס-היפופיזה-אדרנל (HPA) 4, וגורם לדה-סנסיטיזציה של קולטני גלוקוקורטיקואידים ולעלייה מתמשכת בקורטיזול. כתוצאה מכך, הפעלת גלוקונאוגנזה כבדית ודיכוי פוספורילציה של קולטני האינסולין בשריר השלד-1 מניעים יחד את עמידות האינסולין ההיקפית, ומקימים בסיס מטבולי להיפרגליקמיה ודיסליפידמיה 5,6. במקביל, חומצות שומן רוויות בתזונה חודרות למחסום הדם-מוח הפגוע באמצעות ירידה ברגולציה של חלבוני החיבור הדוק האנדותליאליים 7,8, ומפעילות איתות מיקרוגליאלי TLR4/NF-κB. זה מפעיל דלקת עצבית בתיווך TNF-α/IL-1β9. הנקודה המרכזית היא ששני גורמי אורח החיים הלא בריאים הללו אינם פועלים באופן עצמאי אלא בסינרגיה. עם זאת, עדיין קיים מחסור משמעותי במחקר שיטתי על החשיפה המשולבת שלהם בספרות הנוכחית. לכן, חשוב לערוך מחקרי מודלים המשלבים הפרעות קצב צירקדי עם דיאטות עשירות בשומן וסוכר כגורמים מורכבים.

למרות התועלת שלהם בחקר מנגנוני הזדקנות מבודדים, מודלים עכבריים עכשוויים אינם מצליחים לשחזר את הפתופיזיולוגיה המשולבת של הידרדרות שנגרמה על ידי אורח החיים. הזדקנות טבעית מציגה שונות בין-אישית בולטת ודורשת לוחות זמנים ממושכים שאינם תואמים ליעילות ניסיונית. סוכנים פרמקולוגיים כמו דוקסורוביצין גורמים בעיקר לנזק ל-DNA ולהזדקנות חריפה מבלי לשחזר את הפרעת המטבוליזםהכרונית 10. מודלים מהונדסים גנטית מכוונים למסלולים מולקולריים בודדים, תוך התעלמות משיחת חלב נוירואנדוקרינית-מטבוליתמערכתית 11,12. מתן D-גלקטוז, אף שהוא מעורר לחץ חמצוני, אינו מחקה באופן מספק את השפעת ההפרעה הצירקדית על קצב גלוקוקורטיקואידים או דלקת עצבית מתווכת ליפידיםתזונתית 13. חשוב לציין שהתערבויות חד-גורמיות אינן יכולות ללכוד דפוסי ירידה סינרגטיים של איברים מרובי איברים הנצפים קלינית. פער תרגומי זה מחייב פלטפורמה קומבינטורית מתקדמת המשלבת בו-זמנית הפרעות צירקדיות כרוניות ולחצים תזונתיים שמנים, כדי להאיץ בנאמנות ניווונות נוירותלית, תפקוד לקוי ופגיעה מטבולית.

כדי להתמודד עם הבעיה הזו, פיתחנו מודל עכבר C57BL/6J המשלב הפרעות צירקדיות סטוכסטיות עם תזונה עתירת שומן וסוכר, כדי לסכם פגיעות סינרגטיות באורח החיים העכשווי. חשיפת עכברים ללוחות זמנים מתחלפים של אור בשילוב עם האכלה ממושכת ואובסוגנית החריפה משמעותית הפרעות מטבוליות, כולל שומן מוגבר, היפרגליקמיה בצום ודיסליפידמיה. הערכות קוגניטיביות חשפו ליקויים בולטים בזיכרון מרחבי ובזיכרון, בעוד שבדיקות תנועה הראו ירידה בסיבולת. חשוב לציין, כימות אורך של מדד השבריריות הראה הצטברות מואצת של ליקויים הקשורים לגיל. פרדיגמת האתגר הכפול שלנו מסכמת באופן משמעותי הזדקנות מואצת רב-פנים, ומספקת פלטפורמה חדשה ומאומתת לחקר פתופיזיולוגיה מונעת אורח חיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הניסיוניים אושרו על ידי ועדת האתיקה למחקר בעלי חיים של מכון המחקר התרופתי ביי יילינג (אישור מס' N2024043). שלושים ושניים עכברים זכרים בני 8 חודשים מסוג C57BL/6J (ראו טבלת חומרים) אוחסנו במתקן ייחודי לבעלי חיים ללא פתוגנים (SPF) המשויך למרכז הערכת התרופות החדש, מכון המחקר התרופתי של חביי יילינג. סביבת הגידול נשמרה בתנאים סטנדרטיים: טמפרטורת הסביבה נעה בין 20–26 מעלות צלזיוס, הלחות היחסית נשלטה ב-40%–70%, והוטמע מחזור אור של 12 שעות ו-12 שעות חושך. לעכברים הייתה גישה חופשית לתזונה סטנדרטית של מכרסמים במעבדה ולמי שתייה מעוקרים.

1. הקמת מודל עכבר קומבינטורי של הפרעות צירקדיות ולחץ תזונתי (איור 1)

הערה: בעלי חיים שמתו באופן בלתי צפוי במהלך הניסוי, הציגו ירידה קשה במשקל או שלא השלימו את תהליך המידול הוצאו מהניתוח הסופי. מספר בעלי החיים ההתחלתי היה 8 לכל קבוצה, וגודל המדגם התקף הסופי היה 5 לכל קבוצה.

  1. הכינו תזונה עתירת שומן/סוכר (HFHS) (ראו טבלת חומרים) וחדר עצמאי המצויד בטיימר מתוכנת לשליטה גמישה במחזור האור-חושך לפני הניסוי.
    הערה: יש לאחסן את הדיאטה בטמפרטורה של 4°C או -20°C כדי למנוע חמצון; הביא אותו לטמפרטורת החדר לפני השימוש כדי למנוע עיבוי שפוגע בהרכבו.
  2. הסתגלות בעלי חיים וקיבוצים אקראיים
    1. הכניסו את כל העכברים בני 8 חודשים בתנאים סטנדרטיים לתקופת האכלה אדפטיבית של 7 ימים לפני תחילת הניסוי.
    2. חלק עכברים באקראי לארבע קבוצות לפי משקל גוף (n = 8 לקבוצה) לאחר תקופת ההסתגלות: קבוצת ביקורת, קבוצת מודל לחץ משולב (Model), קבוצת HFHS, וקבוצת לחץ של הפרעת קצב צירקדי (CR).
  3. מתן התערבות בת 8 חודשים בדיאטת HFHS בשילוב עם הפרעה בקצב הצירקדי לקבוצת מודל הלחץ המשולב. האכילו את קבוצת HFHS בדיאטה של HFHS לבד לאותה תקופה.
  4. חשוף את קבוצת ה-CR להפרעות קצב צירקדי בלבד. האכילו את קבוצת הביקורת בדיאטה סטנדרטית לאורך כל הניסוי. לספק גישה חופשית למי שתייה לכל בעלי החיים.
    הערה: ההתערבות בת 8 חודשים יכולה להיות מושהית זמנית (למשל, לבדיקות בריאות שגרתיות של עכברים) מבלי להשפיע על תוצאת הניסוי, וההתערבות יכולה להתחדש לאחר סיום הבדיקה.
  5. פרוטוקול הפרעת קצב צירקדי (איור 2A,B)
    1. השתמש בטיימר מתוכנת (ראו טבלת חומרים) כדי לשלוט בגמישות במחזור האור-חושך השבועי. הפעילו ארבעה משטרי אור מובחנים: החלפה מהירה בין אור לחושך (החלפת אור וחושך כל 7 דקות במשך שעתיים רצופות ביום), מחזור הפוך של אור-חושך (כיבוי אורות ב-8:00 ודלקים ב-20:00 ביום), אור קבוע (תאורה של 24 שעות), וחושך קבוע (חושך של 24 שעות).
    2. יצר רצף אקראי באמצעות תוכנה סטטיסטית (שפת R, עם זרע אקראי קבוע) בתחילת כל שבוע. הקצו באקראי את ארבעת מצבי התאורה לכל יום בשבוע כדי להבטיח שכל מצב מיושם ברצף במשך 1–2 ימים.
  6. ספקו את דיאטת HFHS לעכברים בחופשיות, ועקוב אחרי צריכת המזון מדי שבוע. ההרכב המפורט של דיאטת HFHS מוצג בטבלה 1.
    הערה: בדיקת אספקת המזון נדרשת כדי למנוע תת-האכלה או חוסר מזון.
  7. שקלו עכברים מדי שבוע בנקודת זמן קבועה (9:00 בבוקר בימי חמישי) באמצעות מאזן אלקטרוני במהלך תקופת ההתערבות בת 8 החודשים. רשמו את כל נתוני משקל הגוף בפירוט.
    הערה: בצע את תהליך השקילה במהירות (כל מפגש מסתיים בפחות מ-30 שניות) כדי למזער לחץ והפרעה לקצב הצירקדי.

2. זיהוי אובייקטים חדשני

  1. הניחו את העכברים בתיבת בדיקה בגודל 60 ס"מ × 60 ס"מ × 40 ס"מ יום לפני האימון, ותנו להם לחקור בחופשיות במשך 5 דקות כדי להסתגל לסביבת הבדיקה.
    הערה: הסר צואה ושתן מהקופסה לאחר כל ניסוי. נגבו את הקופסה עם 75% אתנול כדי להסיר ריחות שנשארו.
  2. הניחו שני צילינדרים זהים (A ו-B) בפינות התחתונה-שמאלית והתחתונה-ימינה של תיבת הבדיקה, בהתאמה. הכניסו כל עכבר לתוך הקופסה כשהיא פונה הרחק מהאובייקטים ותנו לעכבר לחקור בחופשיות במשך 5 דקות.
    1. החליפו באקראי את מיקומי השמאל-ימין של שני הצילינדרים בין הנבדקים כדי למנוע הטיית מיקום.
    2. לאחר אימון חקירה של 5 דקות, עצרו את הניסוי עד 23 שעות, והשלים את שלב החלפת האובייקט החדש (שלב 2.3) בתוך 24 שעות לאחר האימון כדי להבטיח את תקפות מבחן הזיהוי.
  3. החלף את האובייקט A בפינה השמאלית התחתונה בקובייה חדשה (אובייקט C) 24 שעות לאחר האימון. הפעל את המצלמה העליונה. הכניסו את העכבר לקופסה ותקליטו התנהגות במשך 5 דקות.
    הערה: השתמש באובייקט חדש שדומה בגודלו לאובייקטים המוכרים אך שונה באופן מובהק בחומר, בצבע או במרקם, כדי להבטיח שהעכבר יוכל לזהות את החידוש שלו.
  4. נתחו את הסרטונים באמצעות מערכת מעקב הווידאו (ראו טבלת חומרים).
    1. הגדר חקירה כעכבר שמכוון את חוטמו לכיוון או בתוך 2 ס"מ מאובייקט. רשמו את הזמן שהוקדש לחקר האובייקט המוכר (TB) והאובייקט החדש (TC).
    2. חשב מדד זיהוי לפי הנוסחה הבאה: מדד זיהוי = TC / (TB + TC) × 100%.
      הערה: לשמור על האנליסט עיוור לקבוצות הניסוי כדי למנוע הטיה סובייקטיבית; יש להוציא באופן שיטתי התנהגויות שאינן חקרניות כמו טיפוס או נשיכה מרשומות זמן החקירה.

3. מבחן חוזק אחיזה

  1. מדדו את חוזק האחיזה של הגפה הקדמית של העכברים באמצעות מד חוזקאחיזה 14 (ראו טבלת חומרים). סובבו את מד הכוח ב-90 מעלות אנכית וקיבעו אותו היטב למעמד מתכת לפני כל סשן בדיקה כדי להבטיח שיתוק מוחלט של המערכת.
  2. החזק בעדינות את העכבר בבסיס הזנב. תן לכפות הקדמיות לאחוז במוט באופן טבעי. האפס את המד לאחר שהקריאה מתייצבת, ואז משוך את הזנב אופקית אחורה במהירות קבועה ואיטית עד שהעכבר משחרר את האחיזה.
  3. רשום את כוח השיא המרבי (ק"ג) ברגע השחרור ככוח האחיזה. בצע שלושה ניסויים רצופים לעכבר ביום. השתמשו בממוצע של שלוש מדידות לניתוח הבא.
    הערה: שמור על מהירות המשיכה אחידה ואיטית מספיק כדי לאפשר לעכבר ליצור התנגדות מלאה נגד המשיכה.
  4. יש להוציא כל ניסוי מהניתוח אם מתרחש אחד מהבאים: העכבר משתמש רק בכף רגל קדמית אחת, הגפיים האחוריות נוגעות במוט או תורמות לאחיזה, העכבר מסובב את גופו בזמן המשיכה, או שהמוט משתחרר ללא התנגדות פעילה.
    הערה: סמן ניסיונות עמומים או חריגים לצורך בדיקה. חזור על המדידות כשצריך.

4. מדד השבריריות (FI)

הערה: כיייל את כל פרמטרי הציוד להגדרות סטנדרטיות לפני הבדיקה. הגבילו את זמן ההערכה הכולל לכל עכבר לפחות מ-30 דקות כדי למנוע שינויים פנוטיפיים שנגרמו מעייפות. בצע את כל הבדיקות בתוך חלון זמן קבוע בבוקר (9:00–12:00) כדי למזער את השפעות הקצב הצירקדי.

  1. צום את העכברים במשך 12 שעות עם גישה חופשית למים לפני הבדיקה כדי למזער את ההשפעות החריפות של צריכת המזון על מדידות פיזיולוגיות.
  2. העבר את העכברים לסביבת הבדיקה 30 דקות לפני ההערכה כדי להסתגל ולהפחית הפרעות הקשורות ללחץ.
  3. יש להוציא עכברים עם מצבים פתולוגיים קשים כגון גידולים, זיהומים או עיוותים בגפיים כדי למנוע השפעות מבלבלות בהערכת השבריריות.
  4. הערך את מדד השבריריות בהתבסס על 31 אינדיקטורים של חסר פנוטיפיים בחמישה תחומים: תפקוד מוטורי, מצב תזונתי, תפקוד חושי, פעילות והתנהגות ספונטנית, וליקויים פיזיולוגיים15,16.
    הערה: 31 פריטי ההערכה הספציפיים מכסים חמישה תחומים, כוללים: תפקוד מוטורי (7 פריטים כגון ירידה בכוח האחיזה, הליכה לא תקינה ויכולת טיפוס מופחתת), מצב תזונתי (6 פריטים כגון ירידה במשקל, ירידה בציון מצב הגוף והפחתת צריכת מזון), תפקוד חושי (5 פריטים כגון לקות ראייה, לקות שמיעה וקהות מישושית), פעילות והתנהגות ספונטנית (7 פריטים כגון הפחתת פעילות ספונטנית, הפחתה בהתנהגות הטיפוח והפחתת התנהגות חקרנית), וליקויים פיזיולוגיים (6 פריטים כגון ליקויי עיניים, פגמים באוזניים וליקויי עור). כל הפריטים מאמצים שיטת ניקוד בינארית (0 = ללא פגם, 1 = עם פגם), ומדד השבריריות הסופי = סך כל הפריטים הפגומים / 31.
  5. הקצה שני חוקרים עיוורים לקבוצות הניסוי לבצע את כל ההערכות באופן עצמאי.
  6. יש לדרג כל מדד כ-0 (ללא פגיעה) או 1 (חסר) לפי קריטריונים מוגדרים מראש הכוללים כוח אחיזה, מהירות הליכה, שינוי משקל גוף, מצב הפרווה הזו, תגובה חושית, יכולת פעילות ספונטנית וחריגות פיזיות.

5. זיהוי סוכר בדם בצום

הערה: עכברים מהירים במשך 12 שעות עם גישה חופשית למים כדי למזער השפעות אקוטיות הקשורות לאכילה על רמת הגלוקוז בדם. לבצע מדידות בין 9:00 ל-12:00 בצהריים כדי להפחית תנודות צירקדיות. כיולו את הגלוקומטרי עם תמיסת גלוקוז סטנדרטית לפני ניסוי לעקביות בין האצוות.

  1. הרסן בעדינות את העכברים, חטא את קצות הזנב עם 75% אתנול. בצע חתך בעובי 1–2 מ"מ בוורידי הזנב באמצעות לנצט חד-פעמי סטרילי. השליכו את הטיפה הראשונה של הדם כדי למנוע זיהום בנוזל רקמות.
  2. אספו נפח קטן של דם נימי ונתחו אותו מיד באמצעות מד סוכר נייד (ראו טבלת חומרים) עם רצועות בדיקה תואמות. בדוק כל דגימה כפולה כדי להבטיח דיוק נתונים.

6. זיהוי שומן בדם כלל כולסטרול כולל (TC)

הערה: יש להוציא דגימות עם המוליזה חמורה או עכרות מהניתוח. מדידות חוזרות עם מקדם שונות > 10% בין משולשים.

  1. שים דם שנאסף בצינורות שאינם נוגדי קרישה. תן לקרישים באופן טבעי בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. דגימות צנטריפוגה ב-1000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס להפרדת הסרום.
    הערה: ודאו שהצנטריפוגה מאוזנת כראוי לפני ההפעלה וסגרו היטב את המכסה הפנימי הבטיחותי.
  2. שאפו בזהירות את שכבת הסרום העליונה, החלקו אותה, ואחסנו מיד בטמפרטורה של מינוס 80°C כדי למנוע חמצון שומן.
    הערה: לאחר פירוק הסרום ואחסון בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס, ניתן להשהות את הניסוי למספר ימים עד שבועות; זיהוי הכולסטרול הכולל הבא (שלב 6.3) ניתן לבצע כאשר ערכת הבדיקה והציוד מוכנים, כדי להבטיח שהסרום לא יוקפא ויפשר שוב ושוב.
  3. מדדו את רמות הכולסטרול הכוללות בסרום באמצעות ערכת בדיקת TC מסחרית של גרייס (ראו טבלת חומרים) לפי הוראות היצרן. בדוק כל דגימה בשלוש עותקים והריץ דגימות ייחוס סטנדרטיות במקביל לכיול.

7. צביעת המטוקסילין-אאוזין (צביעת HE)

  1. הרדמו עכברים עם נתרן פנטוברביטל (20 מ"ג/ק"ג) לאחר בדיקות התנהגות.
  2. לאסוף דם דרך מקלעת ורידית רטרו-אורביטלית. לנתח רקמות ולקיבע ב-4% פאראפורמלדהיד למשך 48 שעות.
    הערה: לאחר קיבוע רקמה ב-4% פאראפורמלדהיד למשך 48 שעות, ניתן להשהות את הניסוי; ניתן לאחסן רקמות קבועות ב-4% פאראפורמלדהיד בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע לפני שלב ההתייבשות (שלב 7.3).
  3. ייבוש רקמות קבועות באמצעות מעבד אוטומטי באמצעות סדרת אתנול מדורגת (60%, 70%, 90% אתנול לשעה כל אחת; 95%, 100% אתנול ל-2 שעות כל אחת).
    אזהרה: אתנול הוא נוזל דליק עם נקודת הבזק נמוכה. הימנע מלהבות פתוחות, מקורות חום וניצוצות במהלך האחסון והפעולה. יש להשתמש באזור מאוורר היטב, ללבוש כפפות לא סטטיות וחלוק מעבדה. להימנע מאחסון בכמויות גדולות באזור הניסוי; אחסן בארון נוזלים דליק ייעודי.
  4. נקו רקמות מיובשות בקסילן למשך 2 שעות, ואז חדרו עם פרפין בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות (ראו טבלת חומרים). הטמעה רקמות המיועדות למישורים אנטומיים סטנדרטיים.
    הערה: זמן הניקוי לא צריך להיות ארוך מדי כדי למנוע שבירות רקמה; שמירה על טמפרטורת פרפין קבועה במהלך החדירה כדי למנוע התגבשות. לאחר הטמעת הפרפינים, ניתן לאחסן את בלוקי הרקמה המוטמעים בטמפרטורת החדר למשך מספר חודשים, ושלב החתך (שלב 7.5) ניתן לבצע בעת הצורך.
  5. לאחר שבלוקי פרפין מתקשים לחלוטין, חתכו חתכים רציפים של 4 מיקרון עם חותך פרפין (ראו טבלת חומרים), העבירו למחסניות מצופות פולי-אל-ליזין, ייבשו באוויר בטמפרטורת החדר, ואז אטמו לאחסון.
    הערה: לאחר הרכבה בקטע וייבוש באוויר, ניתן לאחסן את המגלשות בטמפרטורת החדר בסביבה נטולת אבק למשך עד חודש לפני המעבר לשלב הצביעה (שלב 7.6).
  6. צבעי חלקים באמצעות מערכת צביעה אוטומטית (ראו טבלת חומרים).
    1. דה-פרפיניז בקסילן I וקסילן II (10 דקות כל אחד).
    2. הידר מחדש באמצעות סדרת אתנול יורדת (100%, 95%, 80%, 2 דקות כל אחת), ואז שטוף במים מזוקקים.
    3. צבעו בהמטוקסילין במשך 3–8 דקות עד שהגרעינים נראים בבירור, שטפו במים זורמים לעידוד הכחול, וצבעו עם אאוזין למשך 1–3 דקות להשגת צבע ורוד ציטופלזמי מספק.
  7. ייבוש קטעים מוכתמים באלכוהול מוחלט, שקופים בקסילן, והרכבו בבלסם ניטרלי לניתוח סורק שקופיות (ראו טבלת חומרים).

8. צביעת O אדום שמן

  1. הטמעת רקמות כבד טריות בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OTC) (ראו טבלת חומרים) בתוך 30 דקות מהאיסוף.
    הערה: לאחר הטמעת רקמות כבד טריות בתרכובת ללא מרשם, ניתן לאחסן את הרקמות המוטמעות, בטמפרטורה של מינוס 80°C למשך עד חודש לפני החתכה (שלב 8.3), תוך הימנעות מהקפאה והפשרה חוזרת.
  2. הניחו רקמות מוטמעות בקריוסטט ותנו להן להקפיא לחלוטין לפני החתכה.
  3. כוונו את טמפרטורת הקריוסטט ל-22 מעלות צלזיוס וחתכו בלוקים קפואים לחלוטין לחתכים עוקבים בעובי 8 מיקרון.
  4. העבר את הקטעים ישירות על מחסניות זכוכית לא מצופות ושטח בעדינות כדי להבטיח הידבקות הדוקה בין הקטעים והמגלשות.
  5. תקבעו שקופיות עם פורמלין ניטרלי בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. מיד לאחר הקיבוע שוטפים חלקים ב-60% איזופרופנול למשך 5 שניות.
  6. הניחו חלקים מטופלים מראש בתא לחות, הוסיפו תמיסת צביעת Oil Red O (ראו טבלת חומרים), ודגרו במשך 20 דקות.
  7. לאחר הצביעה, יש להבדיל חתכים עם 60% איזופרופנול עד שברור שגבולות טיפות הליפידים והרקמות הבין-מקיימות.
    הערה: יש לעקוב מקרוב אחרי החתכים במהלך ההבדלה כדי למנוע הגזרה יתר, שגורמת לכתמים דהויים.
  8. בדקו חתכים מופרזים ומוצבעים תחת מיקרוסקופ אור כדי לצפות בשינויים היסטופתולוגיים הקשורים להצטברות שומנים כבדית.
    הערה: לאחר הצביעה וההבדלה, ניתן לאחסן חתכים בטמפרטורה של 4°C עד 3 ימים לפני בדיקה מיקרוסקופית, כדי להבטיח שהאפקט לא ייפגע.

9. ניתוח סטטיסטי

  1. ביטוי כל נתוני הניסוי כממוצע ±± שגיאת תקן של הממוצע (SEM)
  2. החלו את מבחן שפירו-וילק כדי לוודא אם הנתונים תואמים להתפלגות נורמלית. בצע את מבחן לוון להערכת הומוגניות שונות בין קבוצות אם מאומת נורמליות.
    הערה: יש להחיל בדיקות לא-פרמטריות ישירות אם הנתונים אינם עומדים בהנחת הנורמליות.
  3. השתמש בניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) כדי לבדוק את המשמעות הסטטיסטית של ההבדלים הכוללים בין קבוצות מרובות, ולבצע השוואות זוגיות באמצעות מבחן ההפרש הפחות משמעותי (LSD) של פישר.
    הערה: השתמש ב-Welch ANOVA במקום כאשר ההבדלים הטרוגניים.
  4. השתמשו במבחן t של סטודנט דו-זנבי להשוואות בין שתי קבוצות מדגם עצמאיות.
  5. הגדר מובהקות סטטיסטית כערך p דו-צדדי < 0.05. בצע את כל הניתוחים הסטטיסטיים באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

החמרה סינרגטית של פתולוגיה מטבולית בקבוצות חשיפה כפולה
ניטור משקל גוף לאורך זמן חשף מסלולי גדילה שונים בקרב קבוצות שונות. קבוצת המודל וקבוצת HFHS הציגו עלייה מואצת במשקל בהשוואה לשתי קבוצות הביקורת וקבוצת CR. ראוי לציין כי קבוצת CR הראתה תאוצה מתונה יחסית ל-Control (איור 3A). ראיות נוספות לתפקוד מטבולי לקוי ניתנה על ידי התצפית כי רמות הסוכר בצום בדם ורמות השומן בדם היו גבוהות משמעותית בקבוצות המודל ו-HFHS מאשר בקבוצות הביקורת ו-CR: רמות ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקרים עכשוויים אישרו באופן חד-משמעי כי הפרעה צירקדית ותזונה עתירת שומן וסוכר הם שני גורמים עצמאיים לירידה תפקודית מערכתית באורגניזם. הנתונים שלנו מראים שהנזק הפתולוגי שנגרם מהפעולה המשולבת של שני הגורמים הללו חמור בהרבה מהאפקט המצטבר הפשוט של כל אחד מהם בלבד. בהשוואה לקבוצות ההתערבות בגורם יחיד, קבוצת המודל המורכב לא הראתה הבדל משמעותי בהשומן בהשוואה לקבוצת HFHS, אך הפגינה עלייה משמעותית בהשוואה לקבוצת CR. רמות הסוכר בצום בדם היו הגבוהות ביותר בקבוצת המודלים. ריכוזי הכולסטרול הכולל בסרו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט תוכנית המדע והטכנולוגיה של חביי (246W2501D, 252W7716D), S&T PROGRAM OF HEBEI (24462501D) ופלטפורמת הזהב Yanzhao (A20240022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ANY-mazeScienceSA225
Accu-Chek Active Blood Glucose MonitorSwitzerland, Roche Diagnosticsaccu check active
C75BL/6J miceBEIJING HFK BIOSCIENCE CO.,LTDNo.110324241101250228
Grip strength meterUSA, Columbus Instruments1027CSM-E54
High-fat and high-sucrose dietChina, Xietong Biotechnology Co., Ltd.XT303
HistoCore MULTICUT - Semi-Automated Rotary MicrotomeGermany, LeicaRM2245
Oil Red O solutionChina, Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1260
Optimal cutting temperature compoundJapan, Sakura4583
Programmable Timer SocketChina, GONEOGND-1
Tissue Tech Prisma PlusJapan, Sakura20B2X00014000034
Tissue-Tek TEC 6 Embedding ModuleJapan, SakuraM01-021E-02
Total Cholesterol (TC) Assay KitChina, Suzhou Grace Biotechnology Co., Ltd.G0909W

מקורות

  1. Wang, F., et al. Meta-analysis on night shift work and risk of metabolic syndrome. Obes Rev. 15, 709-720 (2014).
  2. Zhang, S., et al. Associations of sugar intake, high-sugar dietary pattern, and the risk of dementia: a prospective cohort study of 210,832 participants. BMC Med. 22, 298 (2024).
  3. Yeomans, M. R., Armitage, R., Atkinson, R., Francis, H., Stevenson, R. J. Habitual intake of fat and sugar is associated with poorer memory and greater impulsivity in humans. PLoS One. 18, e0290308 (2023).
  4. Sharma, V. K., Singh, T. G. Chronic stress and diabetes mellitus: Interwoven pathologies. Curr Diabetes Rev. 16, 546-556 (2020).
  5. Kaikaew, K., Steenbergen, J., van Dijk, T. H., Grefhorst, A., Visser, J. A. Sex difference in corticosterone-induced insulin resistance in mice. Endocrinology. 160, 2367-2387 (2019).
  6. Guillaume-Gentil, C., Assimacopoulos-Jeannet, F., Jeanrenaud, B. Involvement of non-esterified fatty acid oxidation in glucocorticoid-induced peripheral insulin resistance in vivo in rats. Diabetologia. 36, 899-906 (1993).
  7. Gori, M., et al. Palmitic acid affects intestinal epithelial barrier integrity and permeability in vitro. Antioxidants (Basel). 9 (5), 417 (2020).
  8. Dong, Q., et al. Effects of Tremella fuciformis polysaccharides on intestinal barrier and its functional mechanism. Mycosystema. 44 (03), 104-113 (2025).
  9. Velloso, L. A., Folli, F., Saad, M. J. TLR4 at the crossroads of nutrients, gut microbiota, and metabolic inflammation. Endocr Rev. 36, 245-271 (2015).
  10. Marques, M., et al. Doxorubicin induces a senescent phenotype in murine and human astrocytes. J Neurochem. 169, e70177 (2025).
  11. Krüger, P., et al. Inflammation and fibrosis in progeria: Organ-specific responses in an HGPS mouse model. Int J Mol Sci. 25 (17), 9323 (2024).
  12. Cristòfol, R., et al. Neurons from senescence-accelerated SAMP8 mice are protected against frailty by the sirtuin 1 promoting agents melatonin and resveratrol. J Pineal Res. 52, 271-281 (2012).
  13. Azman, K. F., Safdar, A., Zakaria, R. D-galactose-induced liver aging model: Its underlying mechanisms and potential therapeutic interventions. Exp Gerontol. 150, 111372 (2021).
  14. Takeshita, H., et al. Modified forelimb grip strength test detects aging-associated physiological decline in skeletal muscle function in male mice. Sci Rep. 7, 42323 (2017).
  15. Whitehead, J. C., et al. A clinical frailty index in aging mice: comparisons with frailty index data in humans. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69, 621-632 (2014).
  16. Feridooni, H. A., Sun, M. H., Rockwood, K., Howlett, S. E. Reliability of a frailty index based on the clinical assessment of health deficits in male C57BL/6J mice. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 70, 686-693 (2015).
  17. Zhang, Y., Chu, J. M., Wong, G. T. Cerebral glutamate regulation and receptor changes in perioperative neuroinflammation and cognitive dysfunction. Biomolecules. 12 (4), 597 (2022).
  18. Fujiwara, M., Ferdousi, F., Isoda, H. Investigation into molecular brain aging in senescence-accelerated mouse (SAM) model employing whole transcriptomic analysis in search of potential molecular targets for therapeutic interventions. Int J Mol Sci. 24 (18), 13867 (2023).
  19. Ong, J., et al. Senescence accelerated mouse-prone 8: a model of neuroinflammation and aging with features of sporadic Alzheimer's disease. Stem Cells. 43 (2), sxae091 (2025).
  20. Linders, A. N., et al. A review of the pathophysiological mechanisms of doxorubicin-induced cardiotoxicity and aging. NPJ Aging. 10, 9 (2024).
  21. Sadigh-Eteghad, S., et al. D-galactose-induced brain ageing model: A systematic review and meta-analysis on cognitive outcomes and oxidative stress indices. PLoS One. 12, e0184122 (2017).
  22. Kohsaka, A., et al. High-fat diet disrupts behavioral and molecular circadian rhythms in mice. Cell Metab. 6, 414-421 (2007).
  23. Morris, C. J., Purvis, T. E., Hu, K., Scheer, F. A. Circadian misalignment increases cardiovascular disease risk factors in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, E1402-E1411 (2016).
  24. Latimer, M. N., Rhoads, M. K., Reynolds, L. D., Pollock, D. M. Chronic circadian stress impairs blood pressure and sodium homeostasis in a diet- and sex-specific manner. Am J Physiol Renal Physiol. 330, F186-F198 (2026).
  25. Joo, J., et al. The acute effects of time-of-day-dependent high fat feeding on whole body metabolic flexibility in mice. Int J Obes (Lond). 40, 1444-1451 (2016).
  26. Pati, P., et al. Time-restricted feeding reduces cardiovascular disease risk in obese mice. JCI Insight. 10 (4), e160257 (2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.