מאמר שיטה

תיוג פלואורסצנטי אנדוגני בתיווך CRISPR/Cas9 של גנים ספציפיים לקו הנבט ב-Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/70879

⸱

29 במאי 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1MOE Key Laboratory of Cell Proliferation and Regulation Biology, College of Life Sciences, Beijing Normal University, 2Key Laboratory of Cell Structure and Dynamic Resolution of Functions, School of Biology and Food Engineering, Fuyang Normal University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תהליך הזרקה מיקרו-CRISPR/Cas9 לתיוג פלואורסצנטי אנדוגני בקו הנבט Caenorhabditis elegans לקבלת קווי הדחיפה הומוזיגוטיים לניתוח מיקום חלבונים בחיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקום חלבונים בקו הנבט Caenorhabditis elegans (C. elegans) הוא מרכזי לפרשנות תפקוד הגנים במהלך הגמטוגנזה, אך גישות טרנסגני קונבנציונליות לעיתים מניבות ביטוי משתנה וניתן להשתיק אותן בתאי נבט. כאן, מתוארת זרימת עבודה מעשית של CRISPR/Cas9 הכוללת תג פלואורסצנטי ללוקוס אנדוגני, המאפשרת יצירת אללים יציבים של נק-אין המדווחים על התפלגות חלבונים תחת ויסות טבעי. הפרוטוקול מכסה שלבים מרכזיים של ההליך: בחירת אסטרטגיית תיוג מתאימה לחלבון היעד, העברת תגובות CRISPR באמצעות מיקרוהזרקה גונדלית להרמפרודיטים צעירים, והחזרת בעלי חיים שהוזרקו לצורך סקר. מועמדי הדחיפה מזוהים באמצעות גנוטיפינג מבוסס PCR בשני דורות, כדי לבודד תולעים הומוזיגוטיות ולאימות האלל הערוך. לבסוף, מיקרוסקופיה קונפוקלית משמשת לאימות פלואורסצנציה של קו הנבט ולהערכת מיקום תת-תאים ב-vivo. זרימת העבודה מתוכננת להיות ניתנת לשחזור ולהיות רחבה ליישום לגנים מועשרים בקו הנבט, ומספקת דרך פשוטה ליצירת זנים מתויגים הומוזיגוטיים לניתוחים התפתחותיים וביולוגיים תאיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans (C. elegans) הוא מודל מבוסס היטב לחקר התפתחות רבייה וגמטוגנזה, בשל מחזור החיים הקצר, גופו השקוף ויכולת הניהול הגנטית הגבוהה1. C. elegans קיימת בעיקר כהרמפרודיטים המפרים את עצמם, שהגונדה שלהם עוברת תחילה תאי זרע ואז עוברת לאוגנזה. מצב רבייה זה מפשט את תחזוקת העיוות ומקל על השגת קווים הומוזיגוטיים2. טרנסקריפטומיקה מרחבית עדכנית הרחיבה משמעותית את רשימת הגנים המועשרים בגונד וחשפה דפוסי ביטוי ייחודיים למין במערכת הרבייה ב-C. elegans3. בשנים האחרונות, ריצוף RNA חד-תאי אפשר שחזור מסלולי התפתחות תאי הנבט והסקת רשתות רגולציה גנטית השולטות בזרע4. יחד, מאגרי הנתונים הללו מייצרים רשימות מועמדים עשירות, אך פרשנות פונקציונלית לעיתים דורשת לעיתים קרובות התבוננות בהתנהגות חלבונים בחיים – במיוחד הגדרת מתי והיכן החלבונים המתאימים מתמקמים וכיצד הדפוסים שלהם משתנים לאורך התפתחות קו הנבט.

טרנסגנזה קונבנציונלית ב-C. elegans מתבססת לעיתים קרובות על הזרקת DNA פלסמידית מיקרו-הורדית, שמייצרת בקלות מערכים חוץ-כרומוזומליים רב-עותקים5. עם זאת, בקו הנבט, מערכים אלו לעיתים קרובות מושתקים בחוזקה, מנגנון שנחשב כמסייע בשמירה על שלמות קו הנבט על ידי הגבלת ביטוי מ-DNA שחוזר על עצמו, ובכך שומר על תפקוד קו הנבט ויציבות המידע הגנטי לאורך הדורות 6,7. כתוצאה מכך, מבני ביטוי טרנסגני המתבטאים בקלות ברקמות סומטיות עלולים להיות חלשים או לא עקביים בקו הנבט. גם כאשר הביטוי ניתן לזיהוי, השפעות מספר ההעתקות ואלמנטים רגולטוריים מהונדסים עלולים לשנות את מינון החלבון ותזמון, מה שעלול לבלבל מסקנות לגבי לוקליזציה ודינמיקה טבעית. כדי להתמודד עם מגבלות אלו, הפצצת מיקרו-חלקיקים והכנסת עותק יחיד (MosSCI) בתיווך Mos1 משמשים באופן נרחב ליצירת קווים טרנסגניים משולבים עם עותק נמוך/יחיד 8,9,10. גישות אלו יכולות לשפר את הביטוי בקו הנבט, אך הן שונות בעלות, בתפוקה ובאיכות היכולת שלהן לשחזר ויסות אנדוגני. עריכת הגנום ב-CRISPR/Cas9 מציעה מסלול ישיר יותר על ידי הכנסת תג פלואורסצנטי בלוקוס האנדוגני באמצעות תיקון מונחה הומולוגיה, ויצירת אללים יציבים של נוק-אין המדווחים על מיקום חלבונים ודינמיקה תחת שליטה רגולטוריתטבעית 11,12,13,14.

כאן מתוארת זרימת עבודה מעשית לתיוג פלואורסצנטי אנדוגני בתיווך CRISPR/Cas9 ב-C. elegans , המיושמת על גנים שנבחרו בהתבסס על דפוסי ביטוי מועשרים בקו הנבט המדווחים. הפרוטוקול מפרט את בחירת המטרה, תבנית תורם ועיצוב RNA מנחה, מיקרו-הזרקה לגונדה, וסריקת המשך לבידוד קווי הדחיפה הומוזיגוטיים, ואחריה אימות באמצעות גנוטיפינג. גישה זו מתאימה באופן רחב לגנים המובעים בקו הנבט בשלבי התפתחות ומאפשרת ניתוחים כמותיים של מיקום דינמיקת חלבונים ב-vivo. תהליך עבודה זה מספק אסטרטגיה מעשית לתיוג גנים המובע בקו הנבט ולניתוח מיקום ודינמיקה של חלבונים ב-vivo תחת שליטה רגולטורית טבעית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים שכללו את Caenorhabditis elegans בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות לטיפול ושימוש באורגניזמים במעבדה באוניברסיטת בייג'ינג נורמל.

figure-protocol-1
איור 1: סקירה של תיוג פלואורסצנטי אנדוגני בתיווך CRISPR/Cas9 ב-C. elegans. תהליך עבודה סכמטי הממחיש את השלבים העיקריים של יצירת ואימות פלואורסצנטי אנדוגני נוק-אין. בשלב התכנון והבנייה, נבחרים גן מטרה מועשר בקו הנבט ואתר החדרה, pDD162 משמש כפלסמיד CRISPR/Cas9 לביטוי RNA מנחה, ו-pPD95.75 משמש כעמוד השדרה של התורם שבו משוכפלים תג הפלואורסצנטי (למשל, GFP) וזרועות ההומולוגיה השמאלית והימנית. בשלב המיקרו-הזרקה, תערובת הזרקת CRISPR/Cas9 (כולל פלסמיד gRNA/Cas9, תבנית תורם וסמני הזרקה משותפת) מועברת לגונדה של הרמפרודיטים צעירים בוגרים, ואחריה התאוששות על פלטות זרועים. בשלב האימות, נבחרים צאצאים חיוביים לסמן לצורך גנוטיפינג בהמשך הזרם, כולל זיהוי מבוסס PCR של אירועי הכניסה ואישור באמצעות ריצוף DNA, וקווי ההכנה מוצלחים נבדקים לאחר מכן במיקרוסקופיית פלואורסצנציה כדי להעריך את ביטוי קו הנבט והמיקום התת-תאי של החלבון המתויג. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

1. בחר גן מטרה מועשר בקו הנבט

  1. זהה גנים מועמדים עם ביטוי דומיננטי בגונדה או בתאי הנבט באמצעות מאגרי מידע ציבוריים וספרות שפורסמה.
  2. בחר אתר תיוג מתאים בהתבסס על תכונות החלבון. רשמו את האיזופורם הנבחר ואת מיקום ההכנסת התג לעיצוב RNA ותבנית תורם במורד הזרם (איור 1).

2. עצב את תבנית המדריך RNA והתורם

  1. זהה רצף RNA מדריך (gRNA) של 20 NT במעלה הזרם של מוטיב פרוטוספייסר סמוך (PAM; NGG), הרצף הנדרש לזיהוי Cas9, וממקם אותו קרוב ככל האפשר לאתר הכנסת התג המיועד.
  2. העריכו gRNA מועמדים באמצעות כלי עיצוב מקוון (למשל, כלי עיצוב IDT CRISPR) עם הגנום של C. elegans נבחר. בחר מדריך עם יעילות חיתוך חזויה חזקה במטרה וללא אתרים חזויים בסיכון גבוה מחוץ ליעד.
  3. שכפל את רצף ה-gRNA לאזור שבין פרומוטר ה-U6 לבין הפיגום של ה-gRNA בתוך עמוד השדרה של הפלסמיד בביטוי CRISPR.
    הערה: פריימרים עיצוביים הכוללים את רצף ה-gRNA כבליטות בולטות. בצע הגברה של PCR ואחריו הרכבה מבוססת רקומבינציה הומולוגית, שיטת שיבוט בלתי תלויה בליגציה שמבטלת את עיכול האנזים בהגבלה ומאפשרת שיבוט חד-שלבי ישירות לוקטור הביטוי15.
  4. אשר החדרה נכונה באמצעות רצף סנגר.
  5. בנו את הפלסמיד התורם באמצעות תג פלואורסצנטי המוקף בזרועות ההומולוגיה של כ-1,000 bp שמאל ו-1,000 bp ימין שמקורם במיקום המטרה.
    הערה: הגבר זרועות הומולוגיה מ-DNA גנומי N2 שהוכן כליזאט תולעת באמצעות עיכול פרוטאינאז K. פריימרים עיצוביים עם 15–20 bp חופפים לווקטור הלינארי ולתג הפלואורסצנטי. הרכיבו את זרועות ההומולוגיה והתייגו אל עמוד השדרה באמצעות רקומבינציה הומולוגית בתגובה אחת. הכנס את התג הפלואורסצנטי מיד לאחר קודון ההתחלה של ATG לתיוג N-טרמינל או לפני קודון העצירה לתיוג C-טרמינל. כלול רצף קישור בין הגן היעד לתג הפלואורסצנטי כדי לשמור על קיפול ותפקוד חלבונים תקין. השתמש בקישור כדי להפחית הפרעות סטריות בין שותפי המיזוג, ולוודא שגם המקשר וגם התג מוכנסים במסגרת עם רצף הקידוד. בחר את אתר ההכנסה בקפידה כדי להימנע מהפרעה לתחומים פונקציונליים ידועים או צפויים, פפטידי אות או אזורים טרנסממברניים (קובץ משלים 1).
  6. הכנסת החלפות שקטות לרצף התבנית ההומולוגית של התורם כדי לשבש את רצף ה-PAM או הקישור המדריך מבלי לשנות את רצף החלבון ולמנוע חיתוך חוזר של Cas9 לאחר האינטגרציה.
    הערה: שלבו מוטציות נקודתיות נרדפות בפריימרים המשמשים להגברת זרוע הומולוגיה, תוך התמקדות בקודונים באזור PAM.
  7. אשר שלמות רצף התורמים בין שתי זרועות ההומולוגיה ובין צמתי התגים באמצעות רצף סנגר.
    הערה: יש לאחסן פלסמידים מאומתים בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס לאחסון קצר טווח או בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס לאחסון ארוך טווח.

3. הכינו את תערובת ההזרקה

  1. הרכיבו את תערובת ההזרקה על ידי שילוב פלסמיד ביטוי CRISPR, פלסמיד התורם (שנבנה על פי pPD95.75), וסמני הזרקה משותפים ב-ddH₂O סטרילי לנפח סופי של 10 מיקרוליטר בריכוזים המפורטים בטבלה 1.
    הערה: אופטימיזציה אמפירית של ריכוזים כדי לאזן בין קריאות הסמן, התאוששות המועמדים והישרדות לאחר ההזרקה.
  2. יש לצנטריפוגה את תערובת ההזרקה ב-10,000 × גרם למשך 10–20 דקות כדי להפיל חלקיקים ולמנוע סתימה של נימי המיקרו-הזריקה.
רכיבתפקידריכוז עבודה (ng/μL)
pDD162פלסמיד CRISPR/Cas9 (ביטוי Cas9 ו-gRNA)50-100
פלסמיד תורם (עמוד שדרה pPD95.75)תבנית תורם HDR הנושאת תג פלואורסצנטי מוקפת בזרועות הומולוגיה של ~1 קילו-בייט50-100
pRF4סמן הזרקה משותפת (פנוטיפ רולר)50-100
pPD122.11סמן הזרקה משולבת (ביטוי GFP)5-10
סטריל ddH2Oהביאו לכרך הסופי–

טבלה 1: הרכב תערובת הזרקה ופונקציות הפלסמיד. תערובת ההזרקה מכילה פלסמיד ביטוי CRISPR, פלסמיד תורם, pRF4 ו-pPD122.11 בריכוזים המיומנים, לנפח כולל של 10 מיקרוליטר.

4. טעין והכין את מחט ההזרקה

  1. משכו את נימי הזכוכית לתוך מחטי מיקרו-הזרקה באמצעות מושך מחטים שהוגדר ליצירת חידוך ארוך עם קצה חד המתאים להזרקת גונדה.
    הערה: אופטימיזציה אמפירית של פרמטרי הפולרים. דוגמאות לפרמטרי התחלה: חום = 540, משיכה = 20, מהירות = 100.
    זהירות: טפל במחטים שנמשכו בזהירות כדי למנוע פציעות דקירות. השתמשו במלקחיים בעת טיפול במחטים והשליכו אותן במיכל חדים.
  2. חממו פיפטה מיקרוקפילרית וחברו אותה לשני חלקים כדי ליצור כלי טעינה.
    הערה: ניתן להשתמש בקצוות טעינה מסחריים כחלופה.
  3. חבר נורה משפרית גומי לקצה הרחב של הפיפטה המיקרוקפילרית המקוצרת.
  4. שואף כ-1 מיקרו ליטר של תערובת הזרקה מובהקת לתוך המעמיס.
    הערה: הווליום המדויק אינו קריטי. ודא שהתמיסה ממלאת את קצה המחט.
  5. הכנס את המעמיס לקצה האחורי של מחט ההזרקה ומשחרר בעדינות את תערובת ההזרקה.
  6. הנח את המחט הטעונה אופקית למשך 10 דקות כדי לאפשר לתמיסה לשקוע לכיוון הקצה ולאשר עמודה רציפה.
  7. התקן את המחט על מיקרוסקופ ההזרקה והביא את הקצה לפוקוס באמצעות אופטיקת שדה בהיר.
  8. פתח את קצה המחט על ידי מגע עדין עם קצה הכיסוי בשמן הלוקרבון ובדקו את הזרימה.
    הערה: כוונן את לחץ ההזרקה (30–80 psi) כדי ליצור בועה בערך השווה לקוטר הגונדות בתוך 1 שנייהו-16.

5. הכנת תולעים להזרקה

הערה: הכינו לוחות מדיום גידול נמטודות (NGM) ובופר M9 כפי שתואר קודם17. לשמור על תולעים על לוחות שזרעו ב-Escherichia coli OP50 (להלן OP50) וביצוע הזרקות ברקע של N2.

  1. בחרו הרמפרודיטים L4 מצלחת בריאה ודגרו בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס במשך 10 שעות כדי להשיג צעירים עם קווי נבט מפותחים היטב.
  2. העבר את התולעים לצלחת לא מזורזת כדי להפחית את העברת החיידקים.
  3. הכינו כרית אגרוז יבשה עם 2% על מגלדת זכוכית ומרחו טיפה של שמן הלוקרבון.
  4. העבר תולעת על כרית האגרוז באמצעות מקטף ריסים.
  5. משתק את התולעת וכיוון את הגונאד להזרקה.
    זהירות: הזרקות מלאות תוך 20–30 דקות כדי למנוע ייבוש.

6. ביצוע מיקרו-הזרקת גונדה

figure-protocol-2
איור 2: מיקום הסינקסיטיום הדיסטלי של הגונדות למיקרוהזרקה בהרמפרודיטים צעירים של C. elegans . (A) תמונת שדה בהיר בהגדלה נמוכה של הרמפרודיט צעיר בוגר רכוב. שתי זרועות הגונדות נראות; אתר ההזרקה מצוין עבור זרוע אחת (חץ) כדוגמה מייצגת. האזור הקופסה מסמן את השטח המוצג בהגדלה גבוהה יותר בפאנל B. (B) תצוגת DIC בהגדלה גבוהה יותר של הגונד הדיסטלי המתאים לאזור הקופסה בפאנל A. החץ מציין את מיקום ההזרקה בתוך הסינקיטיום הגונדלי הדיסטלי, שם מועברת תערובת ההזרקה. פסי סולם: 100 מיקרון (A) ו-20 מיקרון (B). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

  1. אתר תולעת משותקת וזהה את הגונד באמצעות מטרה בהגדלה נמוכה.
  2. מקם את המחט באמצעות בקרות מיקרומניפולטור.
  3. כוון את התולעת בזווית של 20–40° יחסית למחט.
  4. תתמקד בקו הנבט הדיסטלי באמצעות הגדלה גבוהה יותר.
  5. קדם את התולעת לכיוון המחט ומקם את הקצה בתוך הסינציציה הגונדלית (איור 2).
  6. הזריקו את התמיסה ואשמרו על ידי נפיחות נראית לעין.
    הערה: אופטימיזציה של לחץ הזרקה (30–80 psi), לחץ פיצוי (0.1–0.5 psi) ומשך הזרקה (0.1–0.3 שניות).
    זהירות: לחץ או נפח מופרזים עלולים לגרום לקרע תולעים.
  7. הוציא את המחט ומקם מחדש להזרקות הבאות.
    הערה: לבצע הזרקה חד-צדדית כדי למקסם את ההישרדות, או הזרקה דו-צדדית לשיפור יעילות העריכה.
  8. הוסיפו בופר M9 לשחרור תולעים והעבירו כל תולעת ללוח התאוששות נפרד.
  9. הזרקות חוזרות ל-20–25 תולעים.
    הערה: החלף את המחט אם היא נסתמת או ניזוקת.
  10. דגרו תולעים מוזרקות בטמפרטורה של 20°C למשך 2–3 ימים כדי לאפשר התאוששות.

7. סינון מועמדים לפורמולה 1 כדי לזהות קווים חיוביים

  1. סקר את צאצאי F1 לסימני הזרקה משותפים ובחירת בעלי חיים חיוביים לסמן.
    הערה: דוגמאות לסימני הזרקה משותפת פלואורסצנטיים חלופיים עם ספציפיות רקמה ותכונות ספקטרליות שונות מוצגות בטבלה משלימה 1.
    הערה: בחרו בעלי חיים שמביעים את שני הסימנים לאמינות גבוהה יותר. תעדף גידולים עם תדירות סימנים גבוהה ("צאצאים של ג'קפוט").
  2. העבר כל תולעת F1 לצלחת נפרדת ומאפשר להטיל ביצים במשך יום–יומיים.
  3. לעבור לכל תולעת F1 בבופר K פרוטאינאז להכנת תבניות PCR.
    הערה: יש לאחסן ליזטים בטמפרטורה של −80°C אם לא מעובד מיד.
  4. בצע PCR חיבור באמצעות פריימר גנומי אחד מחוץ לזרוע ההומולוגיה ופריימר תג פנימי אחד.
    הערה: לשמור על לוחות תואמים מבעלי חיים חיוביים ל-PCR F1.

8. סקר את צאצאי F2 לבידוד קווי הדחיפה הומוזיגוטיים ואישור אינטגרציה

  1. לבודד צאצאי F2 מקווים חיוביים ל-PCR על לוחות בודדים.
  2. לאפשר לתולעי F2 לייצר צאצאים ולפרז בוגרים לצורך גנוטיפינג.
    הערה: יש לאחסן ליזאטים בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס במידת הצורך.
  3. לבצע PCR באמצעות פריימרים משני צידי זרועות ההומולוגיה כדי להבחין בין אללים מסוג פראי ואללים מסוג נוק-אינ לפי גודל המוצר.
  4. אשר אינטגרציה נכונה על ידי רצף סנגר בין שני מחברי ההכנסה.
  5. אימות ביטוי פלואורסצנציה ומיקום של קו הנבט באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנטית.
  6. הרחיב קווים הומוזיגוטיים מאושרים ושמור מלאים.
    הערה: CRYOPRESERVE אימת קווים לאחסון ארוך טווח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בהתאם לפרוטוקול, הרמפרודיטים צעירים הוזרקו במיקרו לגונדלית פלסמיד CRISPR/Cas9 (pDD162), תורם פלסמיד המקודד תג דחיפה של GFP מוקף בזרועות הומולוגיה של כ-1 קילוברק (pPD95.75), וסמני הזרקה משותפת (pRF4 ו-pPD122.11). גן יעד מועשר בקו הנבט שימש כדוגמה מייצגת ליצירת אלל יציב והומוזיגוטי של נק-אין, המדווח על מיקום חלבונים תחת שליטה רגולטורית טבעית.

במהלך שני מפגשי הזרקה, הוזרקו 30 הרמפרודיטים מסוג P0, ו-20 בעלי חיים מסוג F1 עברו גנוטיפ, מה שהוביל לזיהוי שני קווים חיוב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרימת עבודה זו נועדה ליצור קווי נוק-אין יציבים והומוזיגוטיים שבהם תווית פלואורסצנטית מוכנסת ללוקוס האנדוגני כדי לדווח על מיקום חלבונים תחת שליטה רגולטוריתטבעית 5,6,7,8,9,10. בפועל, ההצלחה נמדדת בצורה הטובה ביותר באמצעות שרשרת אימות סדרתית ולא על ידי קריאה אחת: זיהוי מועמדים שנכנסים באמצעות סק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה במענקים מתוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2023YFA1801100 ל-L.M.), קרן המדע הטבעי של סין (32400698 ל-P.W., 32270774 ל-L.M.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אגרBeijing Lablead Biotech Co., Ltd.QZ02מרכיב להכנת צלחות אגר NGM
אגרוזNOVONZZ14011הכנת רפידות אגרוז 2%
Caenorhabditis elegans זן N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)זן רקע להזרקה
צנטריפוגהEppendorf5425בירור תערובת ההזרקה
כולסטרולBeijing Chemical Reagents Company57-88-5מרכיב להכנת צלחות אגר NGM
פלסמיד מרכיב משותף לזריקה rol-6 (su1006) (pRF4)Guangshuo Ou Labמרכיב משותף לזריקה תגית גלגול להעשרת מועמדים
מיקרוסקופ קונפוקליZEISSLSM880 + Airyscanאימות ביטוי/מיקום GFP
די-אשלגן מימן פוספט (K2HPO4)SinapharmCAS: 7758-11-4מרכיב להכנת צלחות אגר NGM
די-נתרן מימן פוספט (Na2HPO4)SinapharmCAS: 7558-79-4מרכיב להכנת מאגר M9
סולם DNAMei5 Biotechnology, Co., Ltd.MF288-01עמדת התייחסות לגדלים עבור ג'לים של אגרוז
רקע פלסמיד תורם (pPD95.75)Addgene1494רקע לבנייה של תורם HDR
מערכת אלקטרופורזה Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.112-0630הפרדה של אמפליקונים PCR על ג'לים של אגרוז לבדיקת צומת וגירוטיפים של הומוזיגוטיות
Escherichia coli זן OP50Caenorhabditis Genetics Center (CGC)מקור מזון לתולעים
פלסמיד מרכיב משותף לזריקה פלורסנטי (pPD122.11)Fire Labמרכיב משותף לזריקה פלורסנטי תגית GFP להעשרת מועמדים
מיקרוסקופ סטריאוסקופי פלורסנטיSOPTOPSZX12-HTסינון תולעים חיות למרכיבים משותפים פלורסנטיים לזריקה
GelRed צביעת ג'ל של חומצות גרעיןMei5 Biotechnology, Co., Ltd.MF079-plus-01ויזואליזציה של רצועות DNA
קפילרות זכוכיתWorld Precision Instruments1B100F-4משמש עם מושך מחטים ליצירת מחטי הזרקה
שמן Halocarbon 700Sigma-AldrichH8898-50MLמניעת התייבשות במהלך הזרקה
חממהWuhan Ruihua Instrument & Equipment Co., Ltd.HP400Sשמירה על תולעים בטמפרטורה סטנדרטית
סולפט מגנזיום (MgSO4)SinapharmCAS: 7487-88-9מרכיב להכנת צלחות אגר NGM ומאגר M9
פיפטות מיקרו-קפילריותKIMBLE71900-50חומם והופרד כדי ליצור כלי טעינה
יחידת מיקרו-הזרקהEppendorfFemtoJet 4iמסירה של פולסים מבוקרים של לחץ הזרקה לגונדה המרוחקת דרך מחט הזרקה מיקרוסקופית (מופעלת על ידי דוושה)
זכוכית מכסה למיקרוסקופFisherbrand12545A 22×30-1הכנת רפידות אגרוז 2% להרכבה ואימובליזציה של תולעים במהלך מיקרו-הזרקה; פתיחת קצות מחטי הזרקה מול קצה הזכוכית המכסה
מיקרוסקופ להזרקה מיקרוסקופיתZEISSAxio Observer.A1מיקרוסקופ הזרקה
מושך מחטיםSutter Instrument CompanyModel P97משיכת קפילרות זכוכית למחטי הזרקה
תרמו-ציקלר PCRBio-RadC1000 Touch Thermal Cyclerהגברה ב-PCR
pDD162 (Peft-3::Cas9 + sgRNA ריק)Addgene47549ביטוי Cas9 + sgRNA
פפטוןGibco308723מרכיב להכנת צלחות אגר NGM
אשלגן די-מימן פוספט (KH2PO4) SinapharmCAS: 7778-77-0מרכיב להכנת צלחות אגר NGM ומאגר M9
נתרן כלוריד (NaCl)SinapharmCAS: 7647-14-5מרכיב להכנת צלחות אגר NGM ומאגר M9
מיקרוסקופ סטריאוסקופיMoticK400Lהפרדה והצמדה של תולעים על רפידות אגרוז וביצוע שלבי התאוששות לאחר הזרקה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  2. Pazdernik, N., Schedl, T. Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans. Adv Exp Med Biol. 757, 1-16 (2013).
  3. Ebbing, A., et al. Spatial transcriptomics of C. elegans males and hermaphrodites identifies sex-specific differences in gene expression patterns. Dev Cell. 47 (6), 801-813.e6 (2018).
  4. Li, L., et al. Spatiotemporal single-cell architecture of gene expression in Caenorhabditis elegans germ cells. Cell Discov. 11 (1), 26 (2025).
  5. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).
  6. Kelly, W. G., Fire, A. Chromatin silencing and the maintenance of a functional germline in Caenorhabditis elegans. Development. 125 (13), 2451-2456 (1998).
  7. Robert, V. J., Sijen, T., van Wolfswinkel, J., Plasterk, R. H. A. Chromatin and RNAi factors protect the C. elegans germline against repetitive sequences. Genes Dev. 19 (7), 782-787 (2005).
  8. Merritt, C., Seydoux, G. Transgenic solutions for the germline. WormBook. , 1-21 (2010).
  9. Frøkjær-Jensen, C., et al. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).
  10. Vallin, E., et al. A genome-wide collection of Mos1 transposon insertion mutants for the C. elegans research community. PLoS One. 7 (2), e30482 (2012).
  11. Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
  12. Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nat Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
  13. Nance, J., Frøkjær-Jensen, C. The Caenorhabditis elegans transgenic toolbox. Genetics. 212 (4), 959-990 (2019).
  14. Wang, P., et al. Protocol for CRISPR-Cas9-mediated genome editing to study spermatogenesis in Caenorhabditis elegans. STAR Protoc. 4 (4), 102720 (2023).
  15. Khan, A. A., et al. A highly efficient ligation-independent cloning system for CRISPR/Cas9-based genome editing in plants. Plant Methods. 13, 86 (2017).
  16. Ghanta, K. S., Ishidate, T., Mello, C. C. Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans. STAR Protoc. 2 (3), 100748 (2021).
  17. Rieckher, M., Tavernarakis, N. Caenorhabditis elegans microinjection. Bio Protoc. 7 (19), e2584 (2017).
  18. Medley, J. C., Hebbar, S., Sydzyik, J. T., Zinovyeva, A. Y. Single nucleotide substitutions effectively block Cas9 and allow for scarless genome editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 220 (1), iyab199 (2022).
  19. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), e833 (2008).
  20. Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nat Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
  21. Bajar, B. T., et al. Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting. Sci Rep. 6, 20889 (2016).
  22. Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
  23. He, S., Cuentas-Condori, A., Miller, D. M. NATF (native and tissue-specific fluorescence): a strategy for bright, tissue-specific GFP labeling of native proteins in Caenorhabditis elegans. Genetics. 212 (2), 387-395 (2019).
  24. Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. 121-122, 86-93 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Knock InPCR

מאמרים קשורים