הדמיה וכימות של זיווג בסיסי RNA בין-מולקולריים באשכולות RNA במבחנה באמצעות דיווחי RNA ברוקולי מפוצל

Summary

פרוטוקול זה מתאר בדיקה ויזואלית באמצעות דיווחי RNA ברוקולי מפוצלים לזיהוי וכימות של זיווג בסיסים בין-מולקולריים באשכולות RNA במבחנה.

Abstract

הצטברות RNA, המונעת על ידי אינטראקציות רב-מולקולריות בין RNA ל-RNA, יכולה להתרחש במבחנה בהיעדר חלבונים. בעוד שבדיקות כימיות וסימולציות חישוביות שימשו לחיזוי אינטראקציות אלו, שיטות להערכת זיווג בסיסים בין-מולקולריים באשכולות RNA עדיין מוגבלות. מחקר זה מציג בדיקה חזותית המבוססת על דיווחי RNA ברוקולי מפוצלים שמחודדים ל-RNA מסומנים פלואורסצנטית שמעניינים אותם. הבדיקה מאפשרת זיהוי וכימות של זיווג בסיסים בין-מולקולריים באשכולות RNA. מערכת הברוקולי המפוצלת מכילה רצפי דיווח משלימים שמתפוגגים ליצירת האפטמר של RNA הברוקולית. מבנה ה-RNA הדימרי שנוצר נקשר ל-DFHBI-1T, פלואורופור שפולט פלואורסצנציה ירוקה בעת הקשר. בעת התקבצות RNA, הופעת הפלואורסצנציה הירוקה מדווחת על זיווג בסיסים המתווך על ידי רצפי המדווח המשלימים בין ה-RNA הרלוונטיים. מדידת פלואורסצנציה של DFHBI-1T מאפשרת הערכה כמותית של האופן שבו תנאי אשכולות RNA במבחנה משפיעים על זיווג בסיסים בין-מולקולריים בין רצפי המדווחים הללו.

Introduction

RNA מתועתקים במבחנה יכולים להרכיב את עצמם לאשכולות נראים על ידי הוספת מלחים ותגובות צפיפות מולקולריות 1,2,3,4,5. ראוי לציין כי אשכולות RNA אלו יכולים להיווצר בהיעדר רכיבים תאיים אחרים, כולל חלבונים, מה שמעיד שבתנאים מסוימים, אינטראקציות בין-מולקולריות בין RNA ל-RNA מספיקות כדי להניע עיבוי RNA במבחנה.

מבין סוגי האינטראקציות הבין-מולקולריות RNA–RNA, זיווג בסיסים בין-מולקולריים זכה לתשומת לב רבה בשדה העיבוי 1,2,4,6,7,8,9,10. אינטראקציות אלו יכולות להיות מונעות על ידי רצפים משלימים חשופים ("מיקודים") בין תמלולים, כפי שמודגם על ידי קי-אשכולות של mRNA BNI1 ו-SPA2 בפטרייה הסיבית Ashbya gossypii² או על ידי אוליגומריזציה של mRNA אוסקר בדרוזופילה מלנוגסטר ^6,7. חלופה לכך היא קידום זיווג בסיסים בין-מולקולריים על ידי עיצוב מחדש של מבני RNA משניים, תוך חשיפת רצפים משלימים שמוטמעים מבנית אחרת. מנגנון זה נצפה ב-RNA חוזר בסיליקו⁹ וריבוסצ'ים גואנידין במבחנה¹⁰. ניתן למדוד גם רצפים משלימים חשופים וגם עיצוב מבני RNA באמצעות חקירה כימית^11,12 או גישות סימולציה ^4,9,13,14. עם זאת, שיטות המדגימות ישירות זיווג בסיסים בין-מולקולריים במבחני אשכולות RNA במבחנה נותרות מוגבלות.

בדיקות RNA משיכה למטה באמצעות קישורי בסיס 15,16,17 ואלקטרופורזה ג'ל ^4,6,7 משמשות לעיתים קרובות לחקר זיווג בסיסי RNA בין-מולקולרתי במבחנה. עם זאת, שיטות אלו חסרות את הרזולוציה המרחבית להבחין בין זוגות בסיסים בתוך אשכולות לאלו שמחוץ להם. יתרה מזאת, בידוד אשכולות RNA לניתוח במורד הזרם הוא אתגר טכני, שכן הוא דורש שמירה על יציבות האשכול תוך הבטחת תאימות לבופר עם הבדיקות הבאות.

בדיקה ויזואלית המבוססת על דיווחי RNA ברוקולי^{מפוצלים 18} עם RNA מסומנים פלואורסצנטית, שימשה בעבר כדי לאפשר זיהוי ישיר של זיווג בסיסים בין-מולקולריים במהלך עיבוי RNA במבחנה⁴. בהקשר זה, מערכת הברוקולי המפוצלת מדווחת על הסבירות לאינטראקציות בין-מולקולריות בין מדווחים או בין RNA הנושאים אותם בתנאי אשכולות מוגדרים במבחנה . לפיכך, הבדיקה בוחנת כיצד הקשר הרצף וגורמים סביבתיים משפיעים על הנטייה לזיווג בסיסים בין-מולקולריים בסביבה דמוית אשכול RNA.

מערכת הברוקולי המפוצלת מורכבת משני רצפי RNA משלימים, למעלה ולמטה, שמתמעכמים כדי לשחזר את אפטמר ה-RNA של הברוקולי (איורים 1A–C)¹⁸. לאחר דימריזציה, האפטמר נקשר לפלואורופור DFHBI-1T, מה שמוביל לפלואורסצנציה ירוקה (איורים 1A–C)¹⁸. באמצעות מערכת זו, היקף ההתאמה הבין-מולקולרית של הבסיסים בין רצפים משלימים מדווחים בתוך אשכולות RNA הוכח כתלוי בקיפול ה-RNA. על ידי השוואת היחס בין פלואורסצנציה של DFHBI-1T לרמות RNA בתנאים ניסיוניים שונים, ניתן להעריך באופן כמותי את השפעת תנאי ה-in vitro על זיווג בסיסים בין-מולקולריים בתיווך מדווח בתוך אשכולות RNA.

מבחן זה משלים את גישות משיכת RNA למטה ולאלקטרופורזה ג'ל לחקר זיווג בסיסים בין-מולקולריים באשכולות RNA. עם זאת, זיהוי אותות עמיד עשוי לדרוש תגובות צפיפות מולקולריות, והרגישות מוגבלת על ידי יעילות הדימריזציה והקיפול של RNA הברוקולי העליון והתחתון המפוצלים.

Protocol

פרוטוקול זה מספק שיטה שלב אחר שלב ליישום הבדיקה ודן ביישומיו. הריאגנטים והציוד בהם השתמשו מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת תבניות DNA לשעתוק RNA במבחנה

1. להוסיף רצף פרומוטר T7 לקצה 5′ של כל תבנית DNA המכילה את רצפי האפטמר הברוקולי המפוצלים לשעתוק RNA במבחנה. השתמשו ברצפי האפטמר של ברוקולי מפוצלים (למעלה ובתחתון) בלבד, או הכניסו אותם בכל מיקום במורד הזרם של פרומוטר T7, עם או בלי רצף RNA נוסף שמעניין אותו.
   הערה: הרצפים של פרומוטר T7, כתבי ברוקולי מפוצלים ופריימרים המשמשים להגברת תבניות ה-DNA מפורטים בטבלה 1.
   הערה: פולימראז RNA של T7 מעדיף מאוד להתחיל שעתוק עם "G" במיקום +1. נוכחות של G נוספים מיד במורד הזרם במיקומים +2 ו-+3 יכולה להגדיל את תפוקת השעתוק^ב-19. עם זאת, כאשר רצף הזרם התחתון מתחיל ב-G, כמו במבנים העליונים והתחתונים שמתחילים בשני G, ניתן להתחיל את השעתוק במיקומים שונים²⁰. כתוצאה מכך, תמלולים עשויים לשאת אחד, שניים או שלושה G בקצה 5′ (למשל, GATCC, GGATCC או GGGATCC), מה שעשוי להשפיע על פרשנות הזיווג הבסיסי במבנים המתוכננים.
2. השתמשו בלוקי גנים מסונתזים, פלסמידים או קטעי DNA מסחריים כתבניות ל-PCR. אם התבנית המקורית אינה מכילה פרומוטר T7, השתמש בפריימר קדמי עם פרומטר T7 בקוטר 5′ יחד עם פריימר הפוך מתאים.
3. הכינו תגובת PCR של 50 מיקרוליטר בצינור PCR בנפח 200 מיקרוליטר המכיל 2.5 מיקרוליטר כל אחד עם 10 מיקרומום פריימרים קדמיים ואחוריים, תבנית DNA של 20 נ"גרם, 25 מיקרוליטר 2× מאסטר באיכות גבוהה, ומים ללא נוקליאז. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה וצנטריפוגה ב-2,000 × גרם למשך 2 שניות.
4. הרץ את תגובת ה-PCR במחזור תרמי באמצעות התוכנה הבאה: 98 °C למשך 30 שניות (מחזור אחד); 98 מעלות צלזיוס ל-10 שניות, טמפרטורת חישוש אופטימלית ל-30 שניות, ו-72 מעלות צלזיוס ל-30 שניות לכל קילובסיס (35 מחזורים); 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות (מחזור אחד).
   הערה: קבעו את טמפרטורת האנילינג האופטימלית באמצעות כלי מקוון כמו מחשבון TM. מוצרי PCR עשויים להיאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לאחר השלמתם.
5. מערבבים 2 מיקרוליטר מוצר PCR עם 8 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז ו-2 מיקרוליטר צבע טעינה 6×. העמיסו את התערובת על ג'ל אגרוז 1% לאלקטרופורזה.
   הערה: מוצר ה-PCR צריך להופיע כרצועה אחת. אם נצפים מספר רצועים, הסרת הרצועה הנכונה וטיהרה באמצעות ערכת חילוץ ג'ל לפני הממשיכים.
6. לטהר את מוצר ה-PCR או ה-DNA המופק בג'ל באמצעות ערכת טיהור DNA ולשחרר מים ללא נוקלאז של 20–30 מיקרולטר לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
7. למדוד ריכוז וטוהר DNA באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח. ודא ש-A260/A280 הוא בערך 1.8 ו-A260/A230 גדול מ-2.0.
   הערה: אם A260/A230 מתחת ל-2.0, בצע שלב טיהור נוסף.
8. אחסן את תבנית ה-DNA בטמפרטורה של −20°C עד לשימוש.

2. הכנת תגובת שעתוק RNA במבחנה

1. נגב את משטח העבודה, מדפי הצינורות והפיפטות עם תמיסת ניקוי RNase. השתמש בקצוות מסוננים וללא RNase.
2. בופר תגובת הפשרה ותמיסות נוקלאוטידים (ATP, CTP, GTP, UTP) שסופקו עם ערכת השעתוק T7, יחד עם UTP-Cy5, על קרח. צנטריפוגה את כל הצינורות ב-2,000 × גרם למשך 2 שניות לפני השימוש.
   הערה: הגן על UTP-Cy5 מאור.
3. חשב את מספר בסיסי התימין בתבנית ה-DNA (למעט פרומוטר T7) וקבע את הנפחים הנדרשים של UTP ו-UTP-Cy5 לתגובה שעתוק של 20 מיקרוליטר. שמרו על צפיפות תיוג עקבית בין מיני RNA.
   הערה: לדוגמה, כדי לסמן RNA המכיל 100 בסיסי אורציל עם כשלושה אורסילים מסומנים ב-Cy5, הוסף 4.5 מיקרוליטר של 1 mM UTP-Cy5 ו-1.9 מיקרוליטר של 75 mM UTP.
4. הכינו תגובת שעתוק של 20 מיקרוליטר על ידי שילוב של 2 מיקרוליטר של ATP, CTP ו-GTP, נפחים מחושבים של UTP (כולם סופקו עם הערכה) ו-UTP-Cy5, 2 מיקרוליטר 10× בופר תגובה, תערובת אנזימים של 2 מיקרוליטר, תבנית DNA של 200 נגרם ומים ללא נוקליאז. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה וצנטריפוגה ב-2,000 × גרם למשך 2 שניות.
5. דגרו את התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות.
6. הוסף 1 מיקרוליטר DNase שסופק עם הערכה. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה וצנטריפוגה ב-2,000 × גרם למשך 2 שניות.
7. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות נוספות.
8. העבר את התגובה (~20 מיקרוליטר) לצינור בנפח 1.5 מ"ל. הוסף 115 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז ו-15 מיקרוליטר תמיסת עצירה אצטט אמוניום המסופקת עם הערכה. ערבב היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה וצנטריפוגה ב-2,000 × גרם למשך 2 שניות.
   הערה: ניתן להשתמש בערכת טיהור RNA מסחרית במקום שלבים 2.9–3.7.
9. הוסיפו 150 מיקרוליטר פנול/כלורופורם וערבבו בעדינות.
   אזהרה: לטפל בפנול/כלורופורם בתוך מכסה אדים כימיקלי.
10. צנטריפוגה ב-16,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
11. העבר את הפאזה המימית העליונה לצינור חדש.
    הערה: הימנעו מהפרעה לאינטרפאזה; השכבה התחתונה עשויה להיראות כחולה עקב צבע לא משולב.
12. הוסיפו נפח שווה של כלורופורם וערבבו היטב.
    אזהרה: לטפל בכלורופורם במכסה אדים כימי.
13. צנטריפוגה ב-16,000 × גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
14. חזור על שלבים 2.11–2.13.
15. העבר את השכבה המימית (~100–150 מיקרוליטר) לצינור חדש. הוסיפו 900 מיקרול איזופרופנול וערבבו היטב.
16. אליקווט לשלושה נפחים שווים בצינורות נפרדים.
    הערה: כל אליקוט מספיק לתגובות אשכולות RNA מרובות.
17. אחסן בטמפרטורה של −20°C במהלך הלילה או עד חודש.

3. טיהור RNA שעבר תמלול חוץ גופני

1. צנטריפוגה את דגימת ה-RNA באיזופרופנול ב-16,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
2. הסר בזהירות את האיזופרופנול מבלי להפריע לגלגלת ה-RNA.
3. הוסיפו 1 מ"ל של 70% אתנול שהוכן במים נטולי נוקלאז.
4. צנטריפוגה ב-16,000 × גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
5. הסר את האתנול וחזור על שלבים 3.3–3.4.
6. במהלך שטיפת האתנול הסופית, יש להסיר את רוב האתנול באמצעות פיפט של 1000 מיקרוליטר. צנטריפוגה קצרה ב-2,000 × גרם למשך 2 שניות במיניצנטריפוגה על שולחן והסרת כל אתנול שנותר באמצעות פיפטה של 20 מיקרוליטר.
7. ייבשו את כדור ה-RNA באוויר למשך 1–2 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
8. החזירו את כדור ה-RNA למים נטולי נוקליאז של 20 מיקרוליטר. שמור את הדגימה על הקרח והגן עליה מאור.
9. למדוד ריכוז וטוהר RNA באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח. ודא ש-A260/A280 הוא בערך 2.0 ו-A260/A230 גדול מ-2.0.

4. הכנת תגובת אשכולות RNA במבחנה

הערה: בפרוטוקול זה, השראת אשכולות RNA דורשת ספרמין ו-PEG 8000, בהתבסס על מחקרים קודמים ^2,4,5. באופן ספציפי, תמיסת מלאי תפרמון טטרהידהידרוכלוריד בנפח 100 מ"מ שהוכנה במים נטולי נוקלאז הוכנסה למספר צינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל ואוחסן בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס.

1. הפשיר צינור עם תמיסת תפירמין 100 מ"מ ו-50% PEG 8000 על קרח.
   הערה: לאחר הפתיחה, יש להשתמש ב-50% PEG 8000 למשך לא יותר מחודשיים עקב התדרדרות פוטנציאלית.
2. להכנת בופר קיפול מחדש של 500 מיקרוליטר טרי ב-10× RNA, יש לשלב 50 מיקרוליטר 2M KCl, 50 מיקרוליטר 1M MgCl₂, 50 מיקרוליטר 1M טריס (pH 7.0), ו-350 מיקרוליטר מים ללא גרעין. ערבבו היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. צנטריפוגה ב-2,000 × גרם ל-2 שניות במיניצנטריפוגה על שולחן.
   הערה: יש להכין את בופר הקיפול מחדש ביום ניסוי אשכולות ה-RNA.
   הערה: שלבים 4.3-4.4 תלויים בתנאי הניסוי וניתן להתאים אותם לפי הצורך. שני דוגמאות לתנאים לאשכול RNA ששימשו במחקר זה מתוארים להלן. תנאי הקיפול המשולב מותאם משיטה המשמשת לחישוש אוליגונוקלאוטידים אנטיסנסיים ל-RNA². בשיטה זו, RNA מעורבבים בבופר מלח ומחממים יחד כדי לקדם זיווג בסיסים בין-מולקולריים בין RNA הנושאים רצפים משלימים. לעומת זאת, בתנאי קיפול נפרד, כל RNA מקופל בנפרד לפני הערבוב. תנאי זה נועד להתקרב לתרחיש תאי שבו RNA מקופל לפני האינטראקציה.
3. קו-פולד
   הערה: תנאי זה מקדם זיווג בסיסים בין-מולקולריים בין RNA המכילים את הרצפים העליונים והתחתונים . הוא משמש כבקרה חיובית לזוגות בסיסים בין-מולקולריים מונחה על ידי מדווח בתנאי אשכולות RNA.
   1. בצינור PCR בנפח 200 מיקרוליטר, יש לשלב 16 pmol מכל RNA מתועתק במבחנה הנושא רצף עליון או תחתון , 2 מיקרוליטר של 10× בופר RNA מתקפל מחדש, ומים ללא נוקלאז לנפח סופי של 14 מיקרוליטר. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. צנטריפוגה ב-2,000 × גרם ל-2 שניות במיני-צנטריפוגה על שולחן.
      הערה: לחשב את מסת ה-RNA המתאימה ל-16 pmol.
   2. חממו את דגימת ה-RNA בטמפרטורה של 90 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
   3. העבר מיד את הדגימה ל-RT והגן עליה מאור. דגרו את התגובה ב-RT למשך שעה.
4. קיפול נפרד
   1. חממו את דגימת ה-RNA בטמפרטורה של 90 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ואז הניחו אותה מיד על קרח לפחות 15 דקות.
   2. בצינור PCR בנפח 200 מיקרוליטר, יש לשלב 16 pmol של RNA מועתק במבחנה הנושא רצף עליון או תחתון , 1 מיקרוליטר של 10× בופר RNA מתקפל מחדש, ומים ללא נוקלאז לנפח סופי של 7 מיקרוליטר.
      הערה: לחשב את מסת ה-RNA המתאימה ל-16 pmol.
   3. דגר את התגובה ב-RT למשך 30 דקות, מוגן מאור.
   4. משלבים את דגימות ה-RNA המכילות את הרצפים העליונים והתחתונים לצינור PCR אחד. ערבבו היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. צנטריפוגה ב-2,000 × גרם ל-2 שניות במיני-צנטריפוגה על שולחן. תדגר ב-RT למשך 30 דקות.
5. הוסיפו 6 מיקרוליטר מתערובת 1:2 (v/v) של 100 מ"מ ספרמין ו-50% PEG 8000. ערבבו היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. צנטריפוגה ב-2,000 × גרם ל-2 שניות במיניצנטריפוגה על שולחן.
   הערה: 50% PEG 8000 הוא צמיגי מאוד. פיפט לאט ובזהירות.
6. הוסף 2 מיקרוליטר של 1 mM DFHBI-1T לתגובה. ערבבו היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. צנטריפוגה ב-2,000 × גרם ל-2 שניות במיניצנטריפוגה על שולחן. התגובה צריכה להיראות צהובה-ירוק.
   הערה: להכנת תמיסת DFHBI-1T בנפח 20 מ"ג מצבע ליופילי DFHBI-1T (מגה-ואט: 320.21), הוסף 156 מיקרוליטר של DMSO אנהידר בדרגת ביולוגיה מולקולרית. עליקו את המלאי בכמויות קטנות במספר צינורות מיקרוצנטריפוגות ואחסנו בטמפרטורה של מינוס 20°C. הימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים לצבע. הכינו תמיסת עבודה מדוללת טרייה בנפח 1 מ"מ DFHBI-1T על ידי דילול מלאי 20 מ"מ מ' במים ללא נוקליאז ואחסון על קרח.
7. טען את התגובה לזכוכית כיסוי עם תא זכוכית.
8. דגרו את התא ב-RT במשך 4 שעות בחושך עם הכיסוי פתוח כדי למזער אידוי.

5. הכנה להדמיה

1. לצלם תמונות תלת-ממדיות באמצעות מיקרוסקופ תאורה מובנה או מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בלייזרים ומטרות מתאימים.
   הערה: מיקרוסקופיה קונפוקלית נדרשת כדי למזער אור לא מפוקוס.
2. הגדר את המיקרוסקופ כך שיצלם כל אזור עניין (ROI) עם ערוץ Cy5 תחילה בכל מישור z, ולאחר מכן הדמיה את אותו ROI באמצעות ערוץ GFP.
3. הגדר את זמן החשיפה ל-500 מילישניות לכל הערוצים. הגדר את עוצמת הלייזר ל-80% ל-GFP ו-40% ל-Cy5.
4. דמיינו אזור כיסוי מחוץ לטיפה התגובה ב-RT באמצעות גודל z-step של 150 ננומטר.

6. כימות של זיווג בסיסים בין-מולקולריים

1. ייבוא תמונות לתוכנת ניתוח תמונות²¹. זהה ערוצי GFP (DFHBI-1T) ו-Cy5 (RNA).
2. שרטט ROI של 5 × 5 פיקסלים בתוך אשכול RNA ומדוד צפיפות משולבת לשני הערוצים באותו מישור z. בחר 5–8 ROI מאשכולות RNA שונים בכל תמונה.
   הערה: כוון את גודל התשואה בהתאם להגדרת המצלמה, אבל שמור על עקביות בין הניסויים.
3. בחרו 5–8 ROIs מחוץ לטיפה התגובה למדידת רקע וחישבו את הצפיפות המשולבת הממוצעת לשני הערוצים.
4. חישב עוצמת DFHBI-1T מנורמלת לכל ROI באמצעות:
   

7. בעיות נפוצות ופתרון תקלות

1. אם לא נצפה כדור RNA לאחר הצנטריפוגה, יש לשקול פירוק RNA, זמן שעתוק לא מספק, פולימראז לא פעיל, מלחים שאריתיים או ריכוז RNA נמוך. השתמשו במגבים ללא RNase, הארכו את זמן השעתוק, השתמשו באנזים חדש, וטוהרו תבניות.
2. אם לא נצפים אשכולות RNA מסומנים ב-Cy5, יש לשקול פירוק RNA או PEG 8000 או UTP-Cy5 שהתפרקו. השתמש בחומרים טריים ובתנאים ללא RNase.
3. אם לא נצפה אות DFHBI-1T בתנאי קו-פולד, יש לשקול איכות צבע ירודה, היעדר היווצרות מבנה ברוקולי או תמלולים מקוצרים. השתמשו בצבע טרי, וודאו הרכב בופר תקין, ואמדו את גודל התמלול באמצעות ניתוח ג'ל.
4. אם אותות פלואורסצנציה מבהירים, יש להפחית את עוצמת הלייזר וזמן החשיפה, לצמצם את שלבי ההדמיה ולהגן על דגימות מאור במהלך הדגירה.

Results

בניסוי ההדגמה זה, היכולת של מדווחי ה-RNA העליון והתחתון לבדם לזוג בסיסים וליצור את מבנה הברוקולי הוערכה תחילה באמצעות פרוטוקול אשכולות RNA במבחנה ⁴ שתואר קודם לכן. זיווג בסיסים בין למעלה לתחתית יוצר שתי זרועות ברוקלי, שכל אחת מהן מסוגלת לשלב מולקולת DFHBI-1T אחת (איורים 1A–C)^18,22.

עם השראת אשכולות RNA עם ספרמין ו-PEG 8000, שני ה-RNA יצרו אשכולות בנפרד או יחד (איורים 1D–Eii). כאשר נבדקו RNA עליון או תחתון בבידוד, פלואורסצנציה DFHBI-1T בתוך אשכולות RNA הייתה נמוכה משמעותית מאשר במצב קו-פולד, שבו שני ה-RNA שולבו לפני דנאטורציה וקיפול מחדש (איור 1F). בתנאי הקיפול, היחס המולרי של DFHBI-1T (0.1 מ"מ) למעלה (0.8 מיקרומטר) ולתחתית (0.8 מיקרומון) הוערך ב-125:1:1. זה מתאים לעודף של כ-62.5 פעמים של DFHBI-1T ביחס למספר המרבי של מבני ברוקולי פוטנציאליים.

אות DFHBI-1T נמוך אך לא אפס שנצפה רק למעלה ולתחתית תואם לדיווחים קודמים שהראו פלואורסצנציה מינימלית של DFHBI-1T כאשר כל מדווח מבוטא בנפרד¹⁸. DFHBI-1T גם הראה פלואורסצנציה רקע נמוכה מאוד אך ניתנת לזיהוי בהיעדר RNA (איור 1F). יחד, תוצאות אלו מראות כי DFHBI-1T תואם למבחן אשכולות RNA במבחנה , וכי קו-פולינג משפר את הזיווג בין הבסיסים הבין-מולקולריים בין RNA העליון והתחתון .

לאחר הנורמליזציה לעוצמת RNA, עוצמת הפלואורסצנציה המנורמלת של DFHBI-1T במצב הקיפול המשולב הגיעה ל-1.03, שהיה גבוה משמעותית מזו של החלק העליון והתחתון בלבד (0.054 ו-0.023, בהתאמה) (איור 1D, איור 1Ei, ואיור 1F). אשכולות RNA שנוצרו מערבוב RNA עליון ותחתון שהיו מקופלים בנפרד לפני האשכול נבדקו (איור 1D, איור 1Eii, ואיור 1F). בתנאי קיפול נפרד זה, אות DFHBI-1T המנורמל היה 0.031, דומה לרמות הבסיס שנצפו בבקרות השליליות (רק למעלה או למטה) (איור 1F). תוצאות אלו מצביעות על כך שקו-פולד מקדם זיווג בסיסים בין-מולקולריים בין RNA העליון והתחתון, בעוד שקיפול נפרד מגביל אינטראקציות כאלה.

הרצפים העליונים והתחתונים הוכנסו לאחר מכן לאזור הלא מתורגם 3′ (UTR) של כיבוי Drosophila melanogaster (shu), mRNA גרגירי נבט ^4,23,24, והמקביל האנטי-sense שלו (shu^anti). ה-UTR של shu 3′ נבחר משום שעבודות קודמות הראו כי RNA זה קיים בעיקר כמונומר ב-Drosophila melanogaster ואינו מתמזג אפילו בריכוזים מולריים גבוהים בבדיקות ג'ל RNA ^4,24. בנוסף, שו-טופ ושו-בוטום אינם יוצרים הומודימרים בג'לים RNA⁴, מה שמאפשר הערכה ישירה יותר של אינטראקציות בין-מולקולריות בין החלק העליון לתחתון והשפעת רצפי הצדדים שמקורם בשו.
תבניות ה-DNA של שו-טופ, שובוטום, ^{שו אנטי-טופ} ושו^{אנטי-בוטום} מפורטות בטבלה 2. הרצפים העליונים והתחתונים הוכנסו למרכז ה-SHU ^{או shu anti-3}′ UTR, מה שדרש שיפוץ מבני כדי להקל על האינטראקציה ולדמות טוב יותר אינטראקציות פיזיולוגיות בין RNA-RNA, שבהן האזורים האינטראקטיביים מוטמעים בדרך כלל בתמלילים⁴.

בעת השראה של קיבוץ RNA, shu-top, shu-bottom, shu^{anti-top ו-shu} anti-bottom הראו כל אחד פלואורסצנציה מינימלית של DFHBI-1T, בדומה לחלק העליון והתחתון בלבד (איורים 2A ו-2B). באופן עקבי, קיפול משותף של shu-top עם shu-bottom או ^{shu anti-top} עם shu^anti-bottom יצר אות DFHBI-1T גבוה יותר מאשר קיפול נפרד (איורים 2Ci ו-Cii). לאחר נורמליזציה לעוצמת RNA ובקרות שליליות (מוגדרת כאות DFHBI-1T המנורמל הממוצע מכל RNA בלבד), קיפול משותף של shu-top ו-shu-bottom הביא לעלייה של פי 5.63 בפלואורסצנציה DFHBI-1T המנורמל (איורים 2Di ו-2Dii). לעומת זאת, קיפול נפרד הראה עלייה של פי 1.04 בלבד, בדומה לרמות הבסיסיות שנצפו עבור שו-טופ ושו-בוטום בנפרד. מגמות דומות נצפו עבור שו^{אנטי-טופ} ושו אנטי-תחתית בתנאי קיפול משותף וקיפול נפרד (איורים 2Di ו-2Dii). תוצאות אלו מצביעות על כך שקיפול נפרד אינו מקדם זיווג בסיסים בין-מולקולריים בין שו-טופ לשו-בוטום או ^{שו אנטי-טופ} ואנטי-בוטום שו, בעוד שקו-פולד משפר אינטראקציות אלו, ככל הנראה בשל רצפי המדווח שהוכנסו.

כדי לבדוק האם שו ^{ושו אנטי-קאן} זוג בסיס, שו-טופ מעורבב עם ^{שו אנטי-בוטום}, ושו-אנטי-טופ שו עם שו-בוטום. שני השילובים הציגו פלואורסצנציה גבוהה יותר של DFHBI-1T גם בתנאי קיפול משולב וגם בתנאי קיפול נפרדים, לעומת שו-טופ עם שו-בוטום או ^{אנטי-טופ} עם שו^{אנטי-בוטום} (איורים 2Ci ו-2Cii). לאחר הנורמליזציה, קיפול משותף של שו-טופ עם ^{שו אנטי-בוטום} ו-שו^{אנטי-טופ} עם שו-בוטום הביא לעליות של 61.86 ו-82.60 פעמים בפלואורסצנציה של DFHBI-1T, בהתאמה (איורים 2Di ו-2Dii). לעומת זאת, קיפול נפרד הניב רק עליות של 2.69 ו-4.94 קיפולים, בהתאמה (איורים 2Di ו-2Dii). למרות שהיו נמוכים משמעותית לעומת תנאי קו-פולד, ערכים אלו היו גבוהים יותר מאלו שנצפו עבור שו-טופ עם שו-בוטום או שו^{אנטי-טופ} עם שו^{אנטי-בוטום} (1.04 ו-1.16, בהתאמה).

יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך שמדווחים הנושאים רצפים משלימים נוספים בעלי יכולת גבוהה יותר לזוג בסיסים מאשר אלו שאין להם רצפים כאלה. אפקט זה מתעצם עוד יותר בתנאי הקיפול המשותף, המעודד אינטראקציות בין-מולקולריות.

איור 1: מבנים משניים חזויים של RNA עליון ותחתון וכימות של זיווג הבסיסים הבין-מולקולריים שלהם באשכולות RNA במבחנה . (A–B) דוגמאות למבנים משניים של מבנים עליונים (A) ותחתונים (B) מקופלים בנפרד, כפי שחזה RNAfold²⁵. כאשר מקופלים בנפרד, החלק העליון והתחתון אינם משחזרים את אפטמר הברוקולית, ו-DFHBI-1T (כוכב אפור) מייצר פלואורסצנציה מינימלית. (ג) דוגמה למבנה המשני של RNA עליון ותחתון מזווגים בבסיס, כפי שחזה RNAcofold²⁵. הזיווג בין הבסיסים הבין-מולקולריים בין שני ה-RNA מחדש שני זרועות ברוקולי¹⁸, ומאפשר קישור ל-DFHBI-1T ומוביל לפלואורסצנציה ירוקה חזקה (כוכבים ירוקים). (D) תמונות של DFHBI-1T בלבד (בקרה על צביעה בלבד) ואשכולות RNA במבחנה (מג'נטה) שנוצרו על ידי RNA עליון ותחתון בנוכחות DFHBI-1T (ירוק). (Ei, ii) אשכולות RNA במבחנה (מג'נטה) הנוצרים על ידי RNA עליון ותחתון בתנאי קיפול משותף (i) וקיפול נפרד (ii) בנוכחות DFHBI-1T (ירוק). בפאנלים D ו-E, RNA סומנו ב-Cy5 כך שבממוצע, כשליש מה-RNA מכיל אורציל אחד מסומן ב-Cy5, בעוד ששני השלישים הנותרים אינם מסומנים. התמונות מייצגות הקרנות Z ממוצעות של 27 פרוסות שנרכשו עם גודל צעד של 150 ננומטר, תוך שימוש באותה חשיפה ועוצמת לייזר לכל ערוץ בכל התנאים. פלואורסצנציה של DFHBI-1T נורמל לאותו טווח עוצמות בין מצבים. פסי סולם: 2 מיקרומטר. (F) עוצמת DFHBI-1T נורמלה לשפע RNA, כפי שנמדדה על ידי פלואורסצנציה Cy5. הנתונים מוצגים כממוצעים ± SEM. ערכי P עבור מבחן t דו-זנבי (**** לעומת קיפול משותף): 1.0 × 10⁻²² (רק צבע), 2.3 × 10⁻²² (למעלה), 4.9 × 10⁻²³ (למטה), ו-7.0 × 10⁻²³ (קיפול נפרד). n = 30 אזורים לתנאי צביעה בלבד ו-30–31 אשכולות RNA לכל שאר המצבים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: תמונות מייצגות וכמותיות של זיווג בסיסים בין-מולקולריים עבור דיווחים מובילים ותחתונים של שו ^ונגד שו.(א) תמונות של DFHBI-1T בלבד (בקרה על צבע בלבד) ואשכולות RNA במבחנה (מג'נטה) שנוצרו על ידי RNA של shu-top, shu-bottom, ^{shu אנטי-טופ ו-shu נגד} תחתית בנוכחות DFHBI-1T (ירוק). RNA סומנו עם Cy5 כך שבממוצע שולבו שלושה אורצילים UTP-Cy5 במהלך שעתוק במבחנה. התמונות מייצגות הקרנות Z ממוצעות של 27 פרוסות שנרכשו עם גודל צעד של 150 ננומטר, תוך שימוש באותה חשיפה ועוצמת לייזר לכל ערוץ בכל התנאים. פלואורסצנציה של DFHBI-1T נורמל לאותו טווח עוצמות בין מצבים. פסי סולם: 2 מיקרומטר. (B) עוצמת DFHBI-1T נורמלה לשפע RNA, כפי שנמדדה על ידי פלואורסצנציה של Cy5. הנתונים מוצגים כממוצעים ± SEM. n.s., לא משמעותיים. ערכי P למבחן t דו-זנבי (לעומת צבע בלבד): 3.1 × 10⁻³ (**; Shu-top), 1.7 × 10⁻¹ (n.S.; שו-בוטום), 2.9 × 10⁻³⁵ (***; שו אנטי-טופ), ו-2.2 × 10⁻² (; שו^{אנטי-בוטום}). n = 30 אזורים לתנאי צביעה בלבד ו-30–32 אשכולות RNA לכל שאר המצבים. (Ci, ii) תמונות של אשכולות RNA במבחנה (מג'נטה) שנוצרו על ידי ערבוב שו-טופ עם שו-בוטום, ^{שו-אנטי-טופ} עם שו^{אנטי-בוטום}, שו-טופ עם ^{שו-אנטי-בוטום}, ו-shu^{אנטי-טופ} עם שו-בוטום בנוכחות DFHBI-1T (ירוק) תחת קו-פולד (i) וקיפול נפרד ( ii) תנאים. התמונות מייצגות הקרנות Z ממוצעות של 27 פרוסות שנרכשו עם גודל צעד של 150 ננומטר, תוך שימוש באותה חשיפה ועוצמת לייזר לכל ערוץ בכל התנאים. בטווח הנמוך, פלואורסצנציה DFHBI-1T נורמלה לאותו טווח עוצמה כמו איור 1D–Eii ואיור 2A. לטווח הגבוה, פלואורסצנציה DFHBI-1T נורמל לטווח עוצמה גבוה אך עקבי בכל התנאים בפאנלים Ci ו-Cii. פסי סולם: 2 מיקרומטר. (Di, ii) עוצמת DFHBI-1T נורמלה תחילה לעוצמת RNA ולאחר מכן לביקורת שלילית, שהוגדרה כאות DFHBI-1T המנורמל הממוצע מכל RNA בלבד. הנתונים מוצגים כממוצעים ± SEM. n.s., לא משמעותיים. (i) ערכי P למבחן t דו-זנבי (**** לעומת שו-טופ + שו-בוטום): 1.1 × 10⁻³¹ (שו^{אנטי-טופ} + שו^{אנטי-בוטום}), 1.1 × 10⁻²² (שו-טופ + ^{שו אנטי-בוטום}), ו-4.3 × 10⁻²⁷ (שו^{אנטי-טופ} + שו-בוטום). (ii) ערכי P למבחן t דו-זנבי (לעומת shu-top + shu-bottom): 2.2 × 10⁻¹ (n.s.; שו אנטי-טופ + שו^{אנטי-בוטום}), 1.9 × 10⁻9 (; שו-טופ + שו^{אנטי-בוטום}), ו-1.3 × 10⁻¹⁵ (; שו^{אנטי-טופ} + שו-בוטום). n = 29–32 אשכולות RNA לכל התנאים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

שם	רצפים (5′-3′)
מקדם T7	TAATACGACTCACTATAG
טופ	GGATGATGGAGACGGTCGGGTC CAGGATCATCATGGCAAGAGAC GGTCGGGGCCAGATGATGGGGAT
תחתית	GGATCCGCATCATCTGTCGAGTAG AGTGTGGGCTCTTGCCATGTGTAT GTGGGTCAACCCAACTACTGAT GATCCTGTGAGTAGAGTGTGGGC TCCATCATCC
חלוץ טופ-T7	TAATACGACTCACTATAG GGATGATGGAGACGGTCG
טופ-רוורס	ATCCGCATCATCTGGACCC
תחתית-T7 קדימה	TAATACGACTCACTATAGG GATCCGCATCTGTCGA
תחתון-הפוך	GGATGATGGAGקקט
הפריימרים הקדמיים מכילים בליטת רצף פרומוטר T7 (מודגש), ואחריה רצפים המכוונים לקצה 5′ של ה-RNA.

טבלה 1: רצפים של פרומטר T7, דיווחי ברוקולי מפוצלים, ופריימרים ששימשו להעצמת תבניות DNA לשעתוק T7. הפריימרים הרשומים שימשו ליצירת תבניות DNA לשעתוק חוץ-גופי של ה-RNA העליון והתחתון , אשר שימשו לאחר מכן בבדיקות אשכולות RNA שתוארו במחקר זה.

שם	רצפים (5′-3′)
שו-טופ	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTATATTTCATATATATTCTTACTCAAAAAGGATGATGGAG ACGGTCGGGGCCAGGATCATTCATGGCAAGAGACGGTCGGGTCCAGATGATGCGGA TAAAAACATACCAACATGAAGGTAATTAGTTCCAAGTTAGAAGAGCAGTATCATT AGTTATTCGATATTAGCAACATGAATATATCGTAAGCCCAGACGAATGTTAACGTTTTTGT TATTTAGAGCAACGTAGACCTTAAGTTGTTAAAAACCACAATAAAGTAATGCACGGCAGCTACAT
שו-בוטום	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTATATCATATCATATATCATTACTCAAAAAAGGATCCGCATCATC TGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCTTGCATGTGTGTGTGTGTCAACCCACATACTGTG ATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCCATCATCCAAAAAACATCAACATGAAGGTAAT TTAGTTCCAAGTTCTAGAAGAGAGTATCATTAGTTATCGATATATTAGCAACATGAATATATCG TAAGCCCAGACGAATGTTAACGTTTTTTTTTTTTATAGCAACGTAGACCTTAAGTTGTTAA AAACCACAATAAAAGTAATGCACGGCAGCTACAT
שואנטי-טופ	ATGTAGCTGCCGTGCATTACTTTTTTTGTGGTTTAACACTTAAGGTCTACGTGCTCTAA ATAACAAAACGTTAACATCGTGTGGGCTTACGATATATTCATGTTGCTAATATATATAC TAATGATACTGCTCTCTAGAACTTGGAACTAAATTACCTTCATGTGTGTATGTTTTGGA TGATGGAGGGTCGGGTCCAGGATCATTCATGGCAAGAGACGGTCGGGGGTCCAGATGAT GCGGATTTTTGAGTAAGATATGAAATGAAATACTGGGGCTTTAGTAAGC
שואנטי-בוטום	ATGTAGCTGCCGTGCATTACTTTTATTGTGGTTTTTAACACTTAAGGTCTACGTGCTCTA AATAACAAAAACGTTAACATCGTGGGCTTACGATATTCATGTGCTAATATCGAATA ACTAATGATACTGCTCTTCTAGAACTTGGAACTAAATTACCTTCATGTGTGTATGTTTTTTTTT GGATCCGCATCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCTTGCATGTGTGTGTGTGTGTGTGGGTCAAC CCACATACTCTGATGATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCATCATCCTTTTGAGT GATATGAATATGAAATACTGGGGCTTCTTAGTAAGC
שו-טופ או שו-בוטום-T7 קדימה	TAATACGACTCACTATAGGGCTTACTAAGAAGCCAGT
שו-טופ או שו-בוטום-הפוך	ATGTAGCTGCCGTGCATTAC
Shuאנטי-טופ או שואנטי-תחתון-T7 קדימה	TAATACGACTCACTATAGGGATGTAGCTGCCGTGCATTA
שואנטי-טופ או שואנטי-בוטום-הפוך	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTA
הפריימרים הקדמיים מכילים בליטת רצף פרומוטר T7 (מודגש), ואחריה רצפים המכוונים לקצה 5′ של ה-RNA. הוגשו G נוסף אחד או שניים בין המקדם של T7 לבין ה-Shu-top ו-shu-bottom או shuanti-top ו-shuanti-bottom, בהתאמה. הסיבה לכך היא שמיקום G במיקומים +2 ו-+3 יכול להגדיל משמעותית את תפוקת השעתוקב-19. עם זאת, ה-G הנוספים הללו עשויים להשפיע על פרשנות הזיווג הבסיסי במבנים המתוכננים. ראו הערה בשלב 1.1.

טבלה 2: רצפים של שו-טופ, שו-בוטום, ^שו אנטי-טופ, שו^{אנטי-בוטום}, ופריימרים המשמשים להגברת תבניות DNA לשעתוק T7. הפריימרים הרשומים שימשו ליצירת תבניות DNA לשעתוק חוץ-גופי של RNA נגד שו ושו הנושאים את המדווחים העליונים והתחתונים, אשר שימשו לאחר מכן בבדיקות אשכולות RNA שתוארו במחקר זה.

Discussion

במחקר זה, מערכת האפטמר המפוצלת של ברוקולי¹⁸ הותאמה לוויזואליזציה ישירה וכימות של זיווג בסיסים בין-מולקולריים בתנאי אשכול RNA במבחנה. גישה זו מאפשרת הערכה של זוגות בסיסים בין-מולקולריים בתנאים שונים במבחנה ומשלימה בדיקות ביוכימיות במורד הזרם, כגון ניסויי RNA משיכה למטה באמצעות מקשרי בסיס 15,16,17 ואלקטרופורזה ג'ל ^4,6,7. בניגוד לשיטות ביוכימיות אלו, שחסרות רזולוציה מרחבית להבחין בין זיווג בסיסים בתוך אשכולות RNA לבין זה שמתרחש מחוץ להם, גישה זו מאפשרת הדמיה מרחבית ישירה של אינטראקציות אלו בתוך אשכולות. באופן ספציפי, הוא מאפשר ניטור של זיווג בסיסים בין RNA עליון ותחתון, או RNA הנושאים את המדווחים הללו, תחת תנאי אשכולות RNA מוגדרים. בנוסף, הוא מספק קריאה כמותית בזמן אמת של זיווג בסיסים בין RNA מדווח ללא צורך בקישור צולב או חילוץ RNA, ובכך ממזער אובדן דגימה ואי-תאימות בבופר.

באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, נמדדה כמותית זיווג בסיסים בין-מולקולריים בין רצפי האפטמרים של ברוקולי מפוצלים באמצעות אות DFHBI-1T, שהראה תאימות של DFHBI-1T לפרוטוקול אשכולות RNA במבחנה . היקף הזיווג בין הבסיסים הבין-מולקולרי השתנה בהתאם לתנאי קיפול ה-RNA, כפי שנצפה בתנאי קיפול משותף וקיפול נפרד (איור 1F ואיור 2Di–2Dii). ממצאים אלו מצביעים על כך שתנאי קיפול RNA משפיעים באופן קריטי על אינטראקציות RNA בין-מולקולריות ויש לשקולם בקפידה בעת פירוש תוצאות ניסוי.

בדיקה זו גם מספקת פלטפורמה להערכת האם רצפים המקיפים את המדווחים העליון והתחתון משפרים את הזוגיות בין הבסיסים הבין-מולקולריים, כפי שהודגם באמצעות shu. הפלואורסצנציה של DFHBI-1T הייתה גבוהה יותר עבור שו-טופ עם שו-אנטי-בוטום ושו אנטי-טופ עם שו-בוטום מאשר בשו-טופ עם שו-בוטום או ^{שו אנטי-טופ} עם שו^{אנטי-בוטום}, מה שמעיד על אינטראקציות בין-מולקולריות עם שו ^{ושו אנטי} עוד יותר משפרים את אות הברוקלי. תצפיות אלו מצביעות על כך שאות הפלואורסצנציה של DFHBI-1T המתקבל מקיפול משותף של הכתבים העליונים והתחתונים לבדו אינו מייצג את הגבול העליון של הבדיקה.

פלואורסצנציה של DFHBI-1T שנמדדה בניסויים אלו נמדדה על פני טווח דינמי רחב, החל מעלייה של פי 1.04 (שו-טופ עם שו-בוטום תחת קיפול נפרד) ועד עלייה של 82.60 פעמים (^{שו אנטי-טופ} עם שו-בוטום בתנאי קיפול משותף). טווח דינמי זה מאפשר זיהוי הבדלים באינטראקציות RNA בין-מולקולריות בין RNA הנושאים את המדווחים הללו.

מספר שלבים בפרוטוקול זה קריטיים לזיהוי מוצלח של זיווג בסיסי RNA בין-מולקולריים בין RNA פרוקולי מפוצל מעל ותחתון באשכולות RNA. יש להשתמש באליקווטים חדשים של PEG 8000 כדי לגרום לאשכול RNA באופן אמין, ויש למזער מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים עקב חוסר יציבות מגובה. יש להפריש ולאחסן את DFHBI-1T בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס כדי לשמור על תכונות הפלואורסצנציה. יש לנתח מוצרי שעתוק חוץ-גופי על ג'ל RNA דנטור לפני האשכול כדי לאשר את גודל התמלול הנכון. בנוסף, שמירה על תנאים נטולי RNase, כולל סביבת עבודה נקייה ותא הדמיה, היא חיונית כי טיפות ה-RNA מודגרות בטמפרטורת החדר לפרקי זמן ממושכים לפני ההדמיה.

מגבלה אחת של בדיקה זו היא ש-DFHBI-1T מדווח במפורש על זיווג בסיסים בין-מולקולריים המתווך על ידי הרצפים העליונים והתחתונים . אירועי זיווג בסיסים בין-מולקולריים אחרים המתרחשים באזורים שונים של RNA אינם ניתנים לזיהוי. בנוסף, מבנה הברוקולי שנוצר על ידי זיווג בסיסים בין הגדילים העליונים והתחתונים הוא יציב תרמודינמי²⁶ ועלול לא לשקף באופן מלא אינטראקציות חלשות או חולפות, כמו אלו שנוצרות מבסיסים מפוזרים וחשופים למשטח, כפי שנצפה בצבירי mRNA גרגרי נבט של דרוזופילה ⁴.

יתרה מזאת, אינטראקציות בין-מולקולריות בין RNA ל-RNA יכולות להיות פרומיסקואיות ולא ספציפיות, ורצפים המקיפים את המדווחים העליונים והתחתונים עשויים להשפיע על פלואורסצנציה של DFHBI-1T. אזורים משני הצדדים הללו עשויים לקיים אינטראקציה ישירה עם רצפי הדיווח, לעכב את היווצרות ברוקולי או לשנות את מבנה ה-RNA, ובכך להשפיע על אינטראקציות בין RNA הנושאים את הדיווחים. בהתאם לכך, המבחן משקף את ההשפעות המשולבות של מבנה ה-RNA, זיווג בסיסים עליונים-תחתונים, אינטראקציות בין רצפי הצד והאינטראקציות בין רצפי הצד לבין הדיווחים.

מבחן זה מספק הזדמנויות לחקירה עתידית. לדוגמה, שינוי רצפי RNA משני צידי הדיווחים, הכנסת הליקזים או צ'פרונים של RNA, או שינוי תנאי מלח עשויים להשפיע על זיווג בסיסים בין-מולקולריים באשכולות RNA. השפעות אלו ניתנות להערכה על ידי מדידת אות DFHBI-1T בתנאי קיפול משותף וקיפול נפרד. בהינתן שאפטמרים דומים של RNA שימשו בתאים, חיידקים ושמרים 26,27,28,29,30, גישה זו עשויה להיות מורחבת גם במערכות תאיות או אורגניזמים מודליים לבחינת זיווג בסיסים בין-מולקולריים באשכולות mRNA.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1M MgCl2	מיליפור סיגמא	M1028	משמש להכנת 10× בופר קיפול מחדש של RNA.
2M KCl	תרמו פישר סיינטיפיק	AM9640G	משמש להכנת 10× בופר קיפול מחדש של RNA.
50% PEG 8000	NEB	M0204S	רכיב בערכת ליגאזות RNA של T4; משמש כתגובת צפיפות מולקולרית ליצירת אשכולות RNA.
אתנול מוחלט, 200 proof	תרמו פישר סיינטיפיק	T038181000CS	משמש להכנת בופר שטיפת RNA.
פנול חומצי: כלורופורם, pH 4.5 (עם IAA, 125:24:1)	תרמו פישר סיינטיפיק	AM9722	משמש לטיהור RNA.
אמינואליל-UTP-Cy5	ג'נה ביוסיינס	NU-821-CY5	משמש לתיוג RNA במהלך שעתוק במבחנה.
זכוכית כיסוי עם תאים	תרמו פישר סיינטיפיק	155409PK	תא הדמיה לתגובות התקבצות RNA.
כלורופורם	תרמו פישר סיינטיפיק	C298-500	משמש לטיהור RNA.
DFHBI-1T	לוצ'רנה	410	משמש כפלואורופור לגילוי רטב RNA של ברוקולי באדמה.
DMSO	תרמו פישר סיינטיפיק	D12345	אנהידרוס; דרגת ביולוגיה מולקולרית; שימש להכנת DFHBI-1T.
ניקוי DNA & ערכת ריכוז	זימו	D4014	משמש לניקוי מוצרי DNA לפני שעתוק T7.
ערכת חילוץ ג'ל DNA	NEB	T1020L	משמש למיצוי ג'ל.
אמבטיה יבשה	Benchmark Scientific	BSH1001	משמש לחימום דגימות RNA בצינורות מיקרוצנטריפוגות.
פיג'י/ImageJ	NIH (המכונים הלאומיים לבריאות)	לא זמין	תוכנת ניתוח תמונות בקוד פתוח; משמש לכימות של עוצמת פלואורסצנציה וניתוח ROI.
מערכת אלקטרופורזה ג'ל	תרמו פישר סיינטיפיק	B2-BP	משמש להפעלת אלקטרופורזה בג'ל DNA.
צבע טעינת ג'ל, סגול (6&00;)	NEB	B7024S	משמש כצבע טעינה לאלקטרופורזה בג'ל DNA.
מיקרוסקופ תאורה מובנה מיידי	ויז-טק אינטרנשיונל	VT-iSIM	מיקרוסקופ קונפוקלי המסוגל לדמות פלואורסצנציה של GFP ו-Cy5.
איזופרופנול	תרמו פישר סיינטיפיק	327272500	משמש לטיהור RNA.
ערכת תמלול MEGAscript T7	תרמו פישר סיינטיפיק	AM1334	משמש לתמלול Invitro T7. הערכה כוללת תמיסות נוקלאוטידים (ATP, CTP, GTP, UTP) ו-DNase.
צינורות מיקרוצנטריפוגה	ג'נסי סיינטיפיק	22-284	צינור 1.5 מ"ל; משמש לאחסון תבניות DNA לשעתוק במבחנה, מוצרי RNA ואליקאוטים של תאי תפירם ו-DFHBI-1T.
מיני-צנטריפוגה	Benchmark Scientific	Z763845	משמש לצנטריפוגה קצרה.
ספקטרופוטומטר Nanodrop One	תרמו פישר סיינטיפיק	13-400-518	ספקטרופוטומטר מיקרוווליום למדידת ריכוז ואיכותם של DNA ו-RNA.
מים ללא נוקלאז	תרמו פישר סיינטיפיק	AM9937	משמש להשעיה מחדש של כדורי RNA, הכנת בופרים לשטיפת RNA וקיפול מחדש, ודילול ספרמין ו-DFHBI-1T.
מחשבון מסה מולרית מקוון	ניו אינגלנד ביולאבס (NEB)	לא זמין	כלי מקוון המשמש לחישוב מסת RNA מכמות מולרית (למשל, pmol).
צינורות PCR מפוליפרופילן	קורנינג	3745	200 & mu; צינורות L PCR המשמשים ל-PCR, שעתוק חוץ-גופי ותגובות אשכולות RNA
ספק כוח בסיסי של PowerPac	ביו-רד	1645050	משמש להפעלת אלקטרופורזה בג'ל DNA.
מחזור תרמי Proflex PCR	תרמו פישר סיינטיפיק	44-840-73	משמש ל-PCR, שעתוק חוץ-גופי וחימום דגימות RNA בצינורות PCR.
רבעון 5 High-Fidelity 2× מאסטר מיקס	NEB	M0492S	משמש כ-2× מיקס מאסטר באיכות גבוהה.
צנטריפוגה מקוררת	אפנדורף	5424R	משמש לטיהור RNA ופלטינג.
תמיסת ניקוי זיהום RNase	תרמו פישר סיינטיפיק	AM9782	משמש לניקוי ספסלי מעבדה ומשטחים כדי למזער זיהום RNase.
Spermine  טטרהידרוקלוריד	סיגמא-אלדריץ'	S1141-1G	משמש להשראת אשכולות RNA.
בסיס טריס	מיליפור סיגמא	T1503-1KG	משמש להכנת בופר טריס (pH 7.0).
אגרוז אולטרטהור	תרמו פישר סיינטיפיק	16500500	משמש לאלקטרופורזה של ג'ל DNA.