Method Article

פרוטוקול יעיל למיקרוסקופיית מיקום מולקולה בודדת בגרעעיני ארבידופסיס

DOI:

10.3791/70891

⸱

May 8th, 2026

 ,  ,  , 
1Institut de Biologie Structurale, CEA, CNRS, Université Grenoble Alpes, 2Plant and Cell Physiology Lab (LPCV), Bioscience and Biotechnology Institute of Grenoble, Grenoble Alpes University - CNRS - INRAE - CEA, 3Integrated Structural Biology Grenoble (ISBG) CNRS, CEA, Université Grenoble Alpes

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציע תהליך עבודה יעיל להדמיית מיקרוסקופיה בלוקליזציה בודדת של גרעיני ארבידופסיס מבודדים, תוך שימוש בבידוד, קיבוע ותיוג אופטימליים להשגת ויזואליזציה ננומטרית אמינה של כרומטין ו-RNA פולימראז II. גישה זו ניתנת להתאמה קלה לחלבונים אחרים הקשורים לכרומטין או לשינויים בהיסטונים להדמיה ברזולוציה גבוהה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעוד שמיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית סיפקה תובנות חשובות על ארגון הכרומטין בגרעינים של צמחים, הרזולוציה המוגבלת שלה מגבילה את חקר ארכיטקטורת הכרומטין, ומניעה שימוש בטכניקות סופר-רזולוציה כמו מיקרוסקופיית מיקום מולקולה בודדת (SMLM). מבין הגישות הללו, מיקרוסקופ שחזור אופטי ישיר (dSTORM) מספק רזולוציה ננומטרית בתאים בודדים, ומאפשר הדמיה מדויקת של תחומי כרומטין, שינויים בהיסטונים וארגון גרעיני. בעוד ששיטות כאלה מיושמות יותר ויותר במערכות יונקים, השימוש בהן בביולוגיה של צמחים נותר מוגבל, בעיקר בשל אתגרים טכניים בהכנת דגימות.

כאן אנו מציגים תהליך עבודה יעיל וניתן לשחזור עבור הדמיית SMLM של גרעינים שבודדו מ-Arabidopsis thaliana. פרוטוקול זה מתחיל בקיבוע שתילים לשימור מורפולוגיה גרעינית, ואחריו חיתוך עדין של רקמות וצנטריפוגה להעשיר גרעינים שלמים. גרעינים מבודדים מתויגים בפלואורופור בתווך נוזלי ומותקעים על פדים עם התכה נמוכה, אסטרטגיה המשפרת את היציבות במהלך סשנים ממושכים של דימות מולקולה יחידה. צעדים אלו מצמצמים יחד פלואורסצנציה ברקע, משפרים את עקביות התיוג ומגבירים את השכפול בין שכפולים ביולוגיים.

ההכנות שנוצרו מספקות בהירות מוגברת להמחשת שינויים בכרומטין ובארכיטקטורה גרעינית בצמחים. על ידי הפחתת המחסומים הטכניים ליישום הדמיית SMLM ב-Arabidopsis, פרוטוקול זה מספק אמצעי גמיש לחקר ויסות אפיגנטי, ארגון כרומטין ושינויים טופולוגיים גרעיניים בקנה מידה ננומלי. עבודה זו יוצרת בסיס מתודולוגי ליישום SMLM על צמחים, מגשרת על הפער עם ביולוגיית תאי יונקים ופותחת הזדמנויות חדשות לחקר כיצד אדריכלות גרעינית תורמת לוויסות הגנום בתגובה לרמזים התפתחותיים וסביבתיים במערכות צמחים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופיה הייתה מאז ומתמיד אבן יסוד לחקר ארגון הכרומטין והארכיטקטורה הגרעינית, וחושפת כיצד DNA וחלבונים הקשורים להיסטונים מתארגנים במרחב הגרעיני התלת-ממדי ומשפיעים על ויסות גנים 1,2. מיקרוסקופיה פלואורסצנצית קונבנציונלית סיפקה תובנות חשובות לגבי תחומי כרומטין בקנה מידה גדול כגון טריטוריות כרומוזומים, כרומוסנטים וגופים גרעיניים 3,4, האפשריים במקום, במיוחד ברקמות שורש של צמחים 3,5,6. עם זאת, טכניקות אלו מוגבלות באופן ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: המידע המפורט על החומרים והכלים המשמשים בפרוטוקול זה זמין בטבלת החומרים. אלא אם צוין אחרת, הבופרים מנוקים במסננים אפירוקניים של 0.2 מיקרון. H2 O טהור מאוד מזוקק כפול (ddH2O) משמש לאורך כל הפרוטוקול הזה. שלבי הצנטריפוגה מתבצעים במיקרופופרות בנפח 1.5 מ"ל באמצעות רוטור בזווית קבועה.

1. קיבוע הנבטים ושחרור הגרעינים

  1. הניחו צלחת תרבית עם 6 בארות על קרח מתחת למכסה האדים, ואז הוסיפו לכל באר כ-4 מ"ל של תמיסת קיבוע קרח שהוכנה באופן ספונטני מתחת למכסה אדים (פורמלדהיד מייצב מתנול 4% (v/v), 0.1% טריטון X-100 ב-1× מלח מפושט פוספט [PBS]).
  2. בא....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול שתואר לעיל מאפשר הכנת גרעיני Arabidopsis thaliana איכותיים המתאימים ל-SMLM. בוצעו מספר סבבי אופטימיזציה לשיפור שלמות הגרעין ולהפחתת פסולת ציטופלזמית ותאית הפוגעת באיכות התמונה. לאחר כל שלב אופטימיזציה, איכות ההכנות הגרעיניות הוערכה באמצעות הדמיה קונפוקלית באמצעות מיקרוסקופ דיסק מסתובב Olympus IX81 לפני המשך לרכישת רזולוציית על.

הדמיה קונפוקלית
ההליך שתואר לעיל אכן תואם להדמיה קונפוקלית. למטרה זו, פתרון ה-LMA המשמש בשלב 3........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכנת גרעיני Arabidopsis thaliana למיקרוסקופיית מיקום מולקולה אחת (SMLM) דורשת מספר שלבים קריטיים המשפיעים מאוד על איכות הדגימה הסופית. כפי שתואר קודם 19,35, חיתוך רקמות יסודי ועקבי הוא חיוני למקסום התאוששות גרעינים שלמים. שימוש בלהבי מיקרוטום במקום להבי גילוח סטנדרטיים יוצר פיצול רקמות נקי ואחיד יותר, ובכך משפר את שחרור הגרעינים. שלבי השטיפה והצנטריפוגה הבאים חשובים לא פחות להפחתת פסולת. שלבים אלו מתבצעים בזהירות, כאשר ה.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למעבדת Lavis ולצוות הכימיה הפתוחה ב-Janelia על הנדיבות שסיפקו בנדיבות את צבעי JF ו-JFX. אנו גם מודים לאליזבת קראצ'יק-דייר וסליה ברוקס על שיתוף הפרוטוקול שלהם, וכן לאלין פרובסט וגיירמו אורסי על עצות מעמיקות. ההדמיה האופטית בוצעה על פלטפורמת ההדמיה M4D של מרכז גרנובל Instruct-ERIC (ISBG; UAR 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) במסגרת שותפות גרנובל לביולוגיה מבנית, בתמיכת התשתית הצרפתית לביולוגיה מבנית משולבת (ANR-10-INBS-0005-02) והברית של גרנובל לביולוגיה מבנית ותאית משולבת Labex, פרויקט של בית הספר לתארים מתקדמים של אוניברסיטת גרנובל אלפים (Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR- 17-EURE- 0003). אנו מודים לטיפ Ten Brink עבו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
נוגדן אנטי-RNA פולימראז II CTD חוזר YSPTSPS (פוספו S2)אבקאםab5095נוגדן ראשוני בשימוש בדילול של 1/200 בבופר צביעת חיסון כדי להמחיש את הצורה הפעילה של הפולימראז (נוגדן פוליקלונלי שגדל בארנב)
תוכנת רכישהאבילייטNEO LiveImaging v2.18
אלבומין סרום בקרסיגמא-אלדריץ'A7906   
קטלאזסיגמא-אלדריץ'C40
אגורוז מוסמך עם התכה נמוכהביו-ראד1613111
עובי כדורי כיסוי 1.5Hמריאנפלד117640Ø: 24 מ"מ
D-(+)-גלוקוז, חסר מים, 99%תרמו-סיינטיפיקA16828-36 
מראה דיכרואיתסמרוקDi03-R405/488/561/635-t1מראה דיכרואית להפרדת גירור/פליטה
דולבקו' s מלח עם בופר עם פוספט 10´ביוווסטX0515 - 500 עבודה בתנאים סטריליים
להבי מיקרוטום חד-פעמיים של Epredia Ultraפישר-סיינטיפיק12191830פרופיל נמוך, לשימוש חד-פעמי
פלקון 6-באר עם תחתית שטוחה שקופה עם טיפול TC, עם מכסה  פלקון353046
תמיסת פורמלדהיד 37%קארל רות'7398לעבוד מתחת למכסה האדים
גלוקוז אוקסידאזסיגמא-אלדריץ'G2133
גליצרולVWR24388.295
נוגדן משני עם ספיגת צולב גבוהה של עז אנטי-ארנב IgG (H+L), Alexa Fluor Plus 647תרמו-סיינטיפיקA32733TRשימש ב-1/200 כנוגדן משני שמקושר ל-AF647
פתרון Hoechst 33258סיגמא-אלדריץ'94403שימש ב-1/500 כדי להצביע את ה-DNA, נוסף למשטח האגרוז
תמיסת חומצה כלוריתכימ-לאבCL05.0311.1000 
JF549-הוכסטמעבדת לויס וצוות הכימיה הפתוחה (ג'נליה)JF549-הוכסטמשמש לצביעת DNA, נוסף למשטח האגרוז בריכוז סופי של 1.5 ננומטר
סט מטחנת רקמות KIMBLE Dounceסיגמא-אלדריץ'D8938צינור 2 מ"ל עם עלי מרווח גדולים (0.0030-0.0050 אינץ') וקטנים (0.0005-0.0025 אינץ')
יחידת לייזריםאוקססיוסL6Ccמצויד בשישה לייזרים: 405 מייל ימי - 100 מיליוואט, 488 מייל ימי - 200 מיליוואט, 532 מייל ימי - 500 מיליוואט, 561 מייל ימי - 300 מיליוואט, 640 מייל ימי - 500 מיליוואט ו-730 מייל ימי - 30 מיליוואט
מגנזיום כלוריד הקסיהידרטקארל רות'HN03
מרקפטואתילאמין (MEA)סיגמא-אלדריץ'30070
MOPS מלח נתרן 98%פישר סיינטיפיק SAS352590010
מסנן פליטה רב-פססמרוקFF01-446/523/600/677סינון פליטה רב-פס לחסימת אור פיזור לייזר
ננו-יהלומיםאדמאס ננוטכנולוגיותNDNV100nmHiWGA2mlמלאי 1 מ"ג/מ"ל
מצלמת ORCA-Fusion Digital CMOSהמאמאצוC14440-20UP 
צלחת פטרי, 100/20 מ"מ, PS, שקופה, עם פתחי אוורור, סטריליתגריינר ביו-וואן664161שימש לגידול צמחים על מדיום 1/2 MS
צלחת פטרי, מרובעת, PS, שקופה, 120/120/17 מ"מ, סטריליתגריינר ביו-וואן688161משמש לקיצוץ שתילי הצמח
pluriStrainer מסננת תאי מיניpluriSelect43-10030-50גודל רשת 30 ומיקרו; m, מתאים לצינור אפנדורף בנפח 1.5 מ"ל
כלוריד אשלגןסיגמא-אלדריץ'P9333
מסנן פליטה ברצועה אחתסמרוקFF01-698/70מסנן פליטה ספציפי לערוץ AF647
מסנן פליטה ברצועה אחתכרומהET600/50mמסנן פליטה ספציפי לערוץ JF549
נתרן כלוריד (99.5%) יורומדקס1112-A
סליידי סטאר-פרוסט בגודל 76 על 26 מ"מקניטל  VS112711FKB.01
פילטר מזרק סטרילי ואוסלאש; נקבוביות 33 מ"מ 0.2 ומיקרו; חרוט מנעול לוארקלירליין146560
מערכת רזולוציית עלאבילייטSAFe360אולימפוס IX83 מצויד במטרת טבילה בשמן של 100x NA1.5
טרי-סודיום ציטראט 2H2O Gen-Apex BiomolפרולאבוPRO-33615.268
ציון טריס בסיס לביולוגיה מולקולריתפרומגהH5135
טריס(2-קרבוקסיאתיל)פוספין הידרוכלוריד (TCEP)תרמו-סיינטיפיק20491
טריטון X-100יורומדקס2000-B
גיל 20יורומדקס2001-B
טווינסיל ספידפיקודנט13001002איטום סיליקון
מערכת ניקוי אוזון אולטרה-סגול תנור UVOCSUVOCS Inc.T10X10חשיפה של 20 דקות לניקוי הכיסוי  
משאבת ואקוםואקוברנדVP 100C
צנטריפוגה Heraeus Megafuge 16Rתרמו-סיינטיפיקרוטור TX-400 75003629. צנטריפוגציה בוצעה באמצעות שפופרות אפנדורף.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule LocalizationArabidopsis NucleiChromatin OrganizationSuper Resolution MicroscopydSTORM ImagingNuclear ArchitectureChromatin ModificationsFluorophore LabelingNuclei IsolationEpigenetic Regulation

Related Articles