הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פרוטוקול יעיל למיקרוסקופיית מיקום מולקולה בודדת בגרעעיני ארבידופסיס

348 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70891

⸱

8 במאי 2026

 ,  ,  , 
1Institut de Biologie Structurale, CEA, CNRS, Université Grenoble Alpes, 2Plant and Cell Physiology Lab (LPCV), Bioscience and Biotechnology Institute of Grenoble, Grenoble Alpes University - CNRS - INRAE - CEA, 3Integrated Structural Biology Grenoble (ISBG) CNRS, CEA, Université Grenoble Alpes

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מציע תהליך עבודה יעיל להדמיית מיקרוסקופיה בלוקליזציה בודדת של גרעיני ארבידופסיס מבודדים, תוך שימוש בבידוד, קיבוע ותיוג אופטימליים להשגת ויזואליזציה ננומטרית אמינה של כרומטין ו-RNA פולימראז II. גישה זו ניתנת להתאמה קלה לחלבונים אחרים הקשורים לכרומטין או לשינויים בהיסטונים להדמיה ברזולוציה גבוהה.

תקציר

בעוד שמיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית סיפקה תובנות חשובות על ארגון הכרומטין בגרעינים של צמחים, הרזולוציה המוגבלת שלה מגבילה את חקר ארכיטקטורת הכרומטין, ומניעה שימוש בטכניקות סופר-רזולוציה כמו מיקרוסקופיית מיקום מולקולה בודדת (SMLM). מבין הגישות הללו, מיקרוסקופ שחזור אופטי ישיר (dSTORM) מספק רזולוציה ננומטרית בתאים בודדים, ומאפשר הדמיה מדויקת של תחומי כרומטין, שינויים בהיסטונים וארגון גרעיני. בעוד ששיטות כאלה מיושמות יותר ויותר במערכות יונקים, השימוש בהן בביולוגיה של צמחים נותר מוגבל, בעיקר בשל אתגרים טכניים בהכנת דגימות.

כאן אנו מציגים תהליך עבודה יעיל וניתן לשחזור עבור הדמיית SMLM של גרעינים שבודדו מ-Arabidopsis thaliana. פרוטוקול זה מתחיל בקיבוע שתילים לשימור מורפולוגיה גרעינית, ואחריו חיתוך עדין של רקמות וצנטריפוגה להעשיר גרעינים שלמים. גרעינים מבודדים מתויגים בפלואורופור בתווך נוזלי ומותקעים על פדים עם התכה נמוכה, אסטרטגיה המשפרת את היציבות במהלך סשנים ממושכים של דימות מולקולה יחידה. צעדים אלו מצמצמים יחד פלואורסצנציה ברקע, משפרים את עקביות התיוג ומגבירים את השכפול בין שכפולים ביולוגיים.

ההכנות שנוצרו מספקות בהירות מוגברת להמחשת שינויים בכרומטין ובארכיטקטורה גרעינית בצמחים. על ידי הפחתת המחסומים הטכניים ליישום הדמיית SMLM ב-Arabidopsis, פרוטוקול זה מספק אמצעי גמיש לחקר ויסות אפיגנטי, ארגון כרומטין ושינויים טופולוגיים גרעיניים בקנה מידה ננומלי. עבודה זו יוצרת בסיס מתודולוגי ליישום SMLM על צמחים, מגשרת על הפער עם ביולוגיית תאי יונקים ופותחת הזדמנויות חדשות לחקר כיצד אדריכלות גרעינית תורמת לוויסות הגנום בתגובה לרמזים התפתחותיים וסביבתיים במערכות צמחים.

מבוא

מיקרוסקופיה הייתה מאז ומתמיד אבן יסוד לחקר ארגון הכרומטין והארכיטקטורה הגרעינית, וחושפת כיצד DNA וחלבונים הקשורים להיסטונים מתארגנים במרחב הגרעיני התלת-ממדי ומשפיעים על ויסות גנים 1,2. מיקרוסקופיה פלואורסצנצית קונבנציונלית סיפקה תובנות חשובות לגבי תחומי כרומטין בקנה מידה גדול כגון טריטוריות כרומוזומים, כרומוסנטים וגופים גרעיניים 3,4, האפשריים במקום, במיוחד ברקמות שורש של צמחים 3,5,6. עם זאת, טכניקות אלו מוגבלות באופן יסודי על ידי מחסום הדיפרקציה של האור, ומגביל את הרזולוציה המרחבית לכ-200 ננומטר לרוחב וכ-500 ננומטר ציר7. מגבלה זו מטשטשת פרטים בקנה מידה ננומטרי של קיפול כרומטינים, דפוסי שינוי היסטונים ותחום שעתוק שמאחורי ויסות אפיגנטי. כדי להתגבר על מחסום זה, פותחו גישות מיקרוסקופיה ברזולוציה על-אנושית (SRM) כגון מיקרוסקופ תאורה מובנית (SIM)8, מיקרוסקופיית פליטה מעוררת (STED)9,10, ומיקרוסקופיית מיקום מולקולה בודדת (SMLM)11,12, להשגת רזולוציות הנעות מ-100 ננומטר ועד כמה ננומטר13.

מבין טכניקות SRM, SMLM — כולל מיקרוסקופ לוקליזציה PhotoActivated (PALM)13 ומיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי ישיר (dSTORM) — מציע רזולוציה מרחבית יוצאת דופן בשילוב עם ספציפיות מולקולרית14. על ידי זיהוי מיקומי פלואורופורים בודדים לאורך זמן, SMLM משחזר תמונות ננומטריות מדויקות של תחומי כרומטין, סימני היסטון ומבנים גרעיניים בתאים בודדים15,16. יכולת זו שינתה את מחקר הכרומטין במערכות יונקים, שם SMLM יושם להמחשת התקבצות נוקלאוזומים, דחיסת כרומטין ודפוסי שינוי היסטונים בפירוט חסר תקדים 15,16,17. לעומת זאת, יישום SMLM על גרעיני צמחים נותר מוגבל, בעיקר בשל אתגרים טכניים הקשורים לתכונות רקמת הצמח — כגון אוטופלואורסצנציה גבוהה, קשיחות דופן התא, ונוכחות תרכובות מפזרות אור כמו עמילן וכלורופיל18. יתרה מזאת, הטבע העדין של הגרעינים במהלך בידוד ותיוג דורש תהליכי עבודה אופטימליים לשמירה על שלמות מבנית ולהפחתת פלואורסצנציה ברקע במהלך סשנים ממושכים של דימות.

הפרוטוקול המתואר כאן פותח במקור על ידי אליזבת קראצ'יק-דייר וסליה ברו למיקרוסקופיה של דלוק פליטה מגורה (STED)19. בהמשך הוא אופטימיזציה והותאם כדי לעמוד בדרישות הספציפיות של דימות STORM עם שילוב הידע שמקורו ביישומי מיקרוביולוגיהשפורסמו 20,21,22. המטרה הכוללת היא לספק זרימת עבודה יעילה וניתנת לשחזור עבור הדמיית SMLM של גרעיני Arabidopsis thaliana מבודדים. על ידי שילוב קיבוע אופטימלי, הפרעות מכניות עדינות וסימון פלואורופור בתלוי, שיטה זו שומרת על המורפולוגיה הגרעינית תוך הסרת מזהמים ציטופלזמיים ביעילות שלעיתים פוגעים באיכות הדימות. קיבוע גרעינים מסומנים על כריות אגרוז בעלות התכה נמוכה מבטיח יציבות מכנית במהלך הרכישה, ומאפשר הדמיה ארוכת טווח של מולקולה אחת בדיוק ננומטר. בהשוואה לפרוטוקולי SRM שתוארו קודם לכן לגרעינים של צמחים — במיוחד אלה המבוססים על מיקרוסקופיה STED19,23 — תהליך זה משתמש בפלואורופורים ניתנים לפוטו-סוויץ' (למשל, AF647, JF549), ומפחית פלואורסצנציה רקע בזכות שלבי שטיפה שמשליכים כלורופיל ופסולת רקמה, ומשפר את הומוגניות התיוג על ידי הוספת מולקולות התיוג ישירות לגרעינים הקבועים והחדירים. כתוצאה מכך, הוא מאפשר הדמיה עקבית של שינויים בכרומטין, תאים גרעיניים ודפוסים אפיגנטיים בגרעינים בודדים. על ידי הורדת המחסומים הטכניים ליישום SMLM בצמחים, שיטה זו מרחיבה את הנגישות להדמיה ננומטרית ומספקת בסיס לחקר כיצד ארגון כרומטין וארכיטקטורה גרעינית תורמים לויסוי גנים בתגובה לרמזים התפתחותיים וסביבתיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: המידע המפורט על החומרים והכלים המשמשים בפרוטוקול זה זמין בטבלת החומרים. אלא אם צוין אחרת, הבופרים מנוקים במסננים אפירוקניים של 0.2 מיקרון. H2 O טהור מאוד מזוקק כפול (ddH2O) משמש לאורך כל הפרוטוקול הזה. שלבי הצנטריפוגה מתבצעים במיקרופופרות בנפח 1.5 מ"ל באמצעות רוטור בזווית קבועה.

1. קיבוע הנבטים ושחרור הגרעינים

  1. הניחו צלחת תרבית עם 6 בארות על קרח מתחת למכסה האדים, ואז הוסיפו לכל באר כ-4 מ"ל של תמיסת קיבוע קרח שהוכנה באופן ספונטני מתחת למכסה אדים (פורמלדהיד מייצב מתנול 4% (v/v), 0.1% טריטון X-100 ב-1× מלח מפושט פוספט [PBS]).
  2. באמצעות מלקחיים נקיים, הסר את השתילים (בין 8 ל-15 ימים לאחר הנביטה) שגודלו על מלחים מוצקים (0.8% אגר) של Murashige חצי חוזק ומלח Skoog Medium של 2.2 גרם לליטר MS, 1% סוכרוז (עם חוץ), pH 5.7, כפי שמתואר עבור שתילי MS בהפניה24, וטבול אותם מיד בתמיסת הקיבע. יש להשתמש בבאר אחת לכ-20 שתילים (נדרשו 3 בארות לקבלת חומר מספק לכל דגימה).
  3. הכניסו את הפלטה לתא הוואקום המלא בקרח והפעילו ואקום בלחצים שמתחילים בין 0.2 בר ל-0.8 בר למשך 15 דקות כדי להסיר אוויר לכוד ולאפשר חדירה עמוקה של הקיבוע לרקמות הצמח. שחרר לאט את השואב, ערבב את הדגימה, ואז מרח את הוואקום לעוד 15 דקות.
  4. מתחת למכסה האדים, הסר את תמיסת הקיבוע עם פיפטה, ושוטף כל באר 3 פעמים במשך 10 דקות תחת ערבוב עדין, עם 5 מ"ל של PBS קר כקרח.
  5. הסר PBS והשתמש במלקחיים כדי להעביר את הרקמה הקבועה לצלחת פטרי בגודל 120 מ"מ × 120 מ"מ. הוסיפו לשתילים הקבועים 50 מיקרו-ליטר של בופר בידוד גרעינים (NIB), שהוכן כפי שתואר על ידי Kracik-Dyer ו-Baroux (45 mM MgCl2, 20 mM MOPS, 30 mM sodium citrate, 0.3% Triton X-100). כוון ל-pH 7 עם 1 N HCl)19. צ'יפ עם להב.
    הערה: להבי מיקרוטום התגלו כיעילים יותר מלהבי גילוח רגילים למשימה זו.
  6. גרדו טישו קצוצים לקצה אחד של צלחת הפטרי עם אותו להב והוסיפו 600 מיקרול של NIB, תוך הקפדה לשטוף כל רקמה שנדבקה ללהב.
  7. העבר תערובת רקמה לצינור ההומוגניזר Dounce בקוטר 2 מ"ל וליטף 5–10 פעמים עם העלי הקטן, ואז עם העלי הגדול עד שהוא נע בצורה חלקה בתוך הצינור (זה דורש בדרך כלל 5–10 משיכות).
  8. סינן את הדגימה ההומוגנית המתקבלת דרך מסנן רשת של 30 מיקרון למיקרוצינור בנפח 1.5 מ"ל.
  9. צנטריפוגה את המתלים למשך 10 דקות ב-800 × גרם באמצעות הרמפה הנמוכה ביותר גם להאצה וגם להאטה. כדור קטן לבן נראה בין שברי הרקמה הירוקה.
  10. זרוק את הסופרנטנט ותשהה את הכדור ב-150 מיקרוליטר של NIB.
  11. צנטריפוגה שוב 10 דקות ב-800 × גרם והסרת הסופרנטנט. אם יש פסולת ירוקה נראית לעין, שטוף בפעם השנייה. תלייה מחודשת ב-50 מיקרו-ליטר עד 150 מיקרו-ליטר של NIB, בהתאם לגודל הכדור.
  12. אחסן את תליית הגרעינים המבודדת המתקבלת בטמפרטורה של 4°C למשך מקסימום של שבוע לפני ביצוע הצביעה. עם זאת, מומלץ להמשיך מיד.

2. צביעת (חיסונית)

הערה: בשלבים הבאים, הפרוטוקול מיושם על נפח של 50 מיקרו-ליטר של תליית גרעינים, המתאים בדרך כלל ל-20 שתילים. אלא אם צוין, השלבים הבאים מתבצעים בטמפרטורת החדר.

  1. צנטריפוגה את התמיסה במשך 10 דקות ב-800 × גרם וזרוק את הסופרנטנט. היזהר לא לגעת בכדור.
  2. החזירו את הגרעינים על ידי פיפטינג עדין ב-50 מיקרוליטר של בופר חוסם (143 mM NaCl, 4% BSA ב-PBS, מאוחסן ב-4 מעלות צלזיוס). דגרו במשך 30 דקות תחת ערבוב עדין.
  3. צנטריפוגה את התמיסה ל-10 דקות ב-800 × גרם וזרוק את הסופרנטנט מבלי לגעת בכדור הגרעין.
  4. החזירו את הגרעינים על ידי פיפטינג עדין ב-50 מיקרו-ליטר של 1× PBS. צנטריפוגה שוב ל-10 דקות ב-800 × גרם. השליכו את הסופרנטנט כפי שציינתי.
  5. החזירו את הגרעינים ל-50 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית שהוכנה בבופר חיסון המורכב מ-143 mM NaCl, 1% BSA, 0.05% Tween 20 ב-PBS (נוגדנים ודילול עבודה מפורטים בטבלת החומרים). דגרו את הדגימות למשך 60 דקות תחת ערבוב עדין.
  6. המשך עם 2 שטיפות (חזור על שלבים 2.3 ו-2.4).
  7. החזירו את הגרעינים ל-50 מיקרוליטר של נוגדן משני אנטי-ארנב AF647 ב-1/200 דילול26. עטוף את הצינורות בנייר אלומיניום כדי להגן על הפלואורופור מאור. דגר את הצינורות למשך 60 דקות תחת ערבוב עדין.
  8. המשך עם 2 שטיפות (חזור על שלבים 2.3 ו-2.4).
  9. תלה מחדש את הכדור ב-50 מיקרוליטר של NIB. אחסן את המתלה במיקרו-צינורות 1.5 מ"ל עטופים בנייר אלומיניום. הסימון יציב במשך מספר שבועות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

3. הרכבה

  1. להדמיית STORM, יש להכין תמיסת אגרוז בעלת התכה נמוכה (LMA 1.5% w/v) על ידי המסה באבקה בבופר B של 1.25× המורכב מ-50 מ"מ טריס pH 8, 10 מ"מ מ' NaCl, 10% גלוקוז. הכינו תמיסת מלאי 1.25× ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  2. חמם ב-90 מעלות צלזיוס למשך דקה כדי להמיס את האבקה ולקבל תמיסה שקופה. לקרר ולשמור על תמיסת ה-LMA המומסת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני שממשיכים לשלב הבא כדי להימנע מפירוק חום של בופר גלוקוז אוקסידאז (GLOX) (הכינו תמיסת מלאי פי 10 מאוחסנת בטמפרטורה של -20°C המורכבת מ-100 מ"מ טריס pH 7.5, 25 מ"מ KCl, 1 מ"מ TCEP pH 7.0, 5 מ"ג/מ"ל גלוקוז אוקסידאז, 0.4 מ"ג/מ"ל קטלאז, 50% v/v גליצרול).
  3. לאחר שתמיסת ה-LMA מגיעה ל-37 מעלות צלזיוס, יש להכין את בופר ה-STORM על ידי הוספת 100 מ"מ מרקפטואתילאמין (MEA) ו-GLOX לתמיסת ה-LMA החמה להשגת ריכוז סופי של 1×. יש לאחסן את תמיסת המלאי של MEA 1M עד חודש בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, אך מומלץ להשתמש בתמיסה טרייה ומוכנה. ערבב בעדינות.
    הערה: לצורך תיוג DNA אופציונלי, הוסף 1.5 ננומטר (ריכוז סופי, תמיסת מלאי של 1 mM ב-DMSO) של ה-Hoechst הצמוד JF549. שמור על המתלה ב-37 מעלות צלזיוס עד השימוש.
  4. מערבבים בעדינות את תליית הגרעינים עם ננו-יהלומים בדילול של 1/1500. דגרו אותם עם הדגימה למשך 5 דקות.
    הערה: ננו-יהלומים משמשים כסמנים פידוציאליים לתיקון סטיית הדגימה.
  5. הפקדו 10 מיקרוליטר מהתערובת על כיסוי 1.5H מטופל באוזון (20 דקות במערכת ניקוי האוזון אולטרה סגולה) והמתינו 3 דקות עד שהגרעינים ישקעו על הכיסוי.
  6. הסר את עודף הנוזל, חכה 2 דקות. הוסף 10 מיקרוליטר מה-LMA שהוכנה בשלב 3.3 לכיסוי הכיסוי ומכסה מיד עם סלייד מיקרוסקופ.
  7. אוטום את הכיסוי באמצעות איטום סיליקון. מערבבים כמויות שוות של תמיסה A ו-B בצלחת פטרי קטנה באמצעות קצה מיקרופיפטה. מרחו את התערובת על קצוות הכיסוי כדי לאטום את הדגימה. איטום סיליקון מתקשה תוך 5 דקות.
  8. לאחר ההרכבה, יש לבצע הדמיה של מחסניות ללא דיחוי, ולבסוף ב-4–5 שעות הבאות, כדי למנוע אובדן תכונות איסוף החמצן של משטח ההרכבה.

4. דימות

הערה: יש לאופטם את פרמטרי ההדמיה בקפידה בהתאם לאופי הדגימה, לתכונות הפוטופיזיקליות של הפלואורופורים ולקונפיגורציה האופטית של המיקרוסקופ. חשוב להבטיח יחס אות לרעש גבוה לכל פלואורופור תוך מזעור הדליפה והגירוי הספקטרלי בין ערוצי פלואורסצנט. הדגימות נצפו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך המצויד במטרת טבילה בשמן 100x NA גבוהה, יחידת שמירת מיקוד ונורית LED לבנה להדמיית שדה בהיר. תוויות פלואורסצנטיות AlexaFluor647 (AF647) הוערכו ב-640 ננומטר ו-JF549-Hoechst ב-561 ננומטר. האור שנפלט סינן באמצעות מראה דיכרואית ומסנן פס תואמים, ולבסוף נאספו תמונות באמצעות מצלמת מתכת-תחמוצה-סמיקונדקטור (sCMOS) מדעית.

  1. התקן את סלייד הדוגמה ומצא פוקוס. הפעל מודול לשמירת פוקוס אם יש כזה במערכת (מומלץ מאוד לרכישות ארוכות).
  2. מצא והתמקד בגרעין. עדיף שיהיה אחד או כמה ננו-יהלום קרוב לגרעין הרצוי כדי לתקן את הסטייה ביעילות רבה יותר במהלך השחזור.
  3. (אופציונלי) ללכוד תמונות מצב מוגבלות של דיפרקציה של שדה בהיר וכל ערוץ פלואורסצנטי בעוצמת לייזר נמוכה.
  4. בעת ביצוע הדמיה דו-צבעית, התחל ברכישת ערוץ אורך גל ארוך יותר ואז עבור לערוץ אורך גל קצר יותר (כלומר, רכישת ערוץ AF647 לפני JF549).
    הערה: דוגמה לפרמטרי רכישה בעבודה זו:
    ערוץ A - תיוג אפיטופה - AF647
    זמן חשיפה: 20 מילישניות
    עוצמת לייזר: 640 ננומטר – 2.2 קילוואט/ס"מ 2
    מצב התרגשות: HiLo27
    ערוץ B - סימון DNA - JF549-Hoechst
    זמן חשיפה: 50 מילישניות
    עוצמת לייזר: 561 ננומטר - 1 קילוואט/ס"מ 2
    מצב גירוי: אפינפרין
    מספר התמונות המוקלטות: 10,000-30,000 לכל ערוץ, מה שמבטיח שצפיפות הפלואורופורים לכל פריים תישאר דלילה מספיק למיקום מדויק של מולקולה בודדת, בעוד שמספר הלוקליזציות המצטבר נקבע אמפירית באמצעות דירוג תמונה כמותי סופר-רזולוציה ודיווח על מיקומי שגיאה (SQUIRREL)28, שגם הוא מצביע על מספר מספיק של פריימים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפרוטוקול שתואר לעיל מאפשר הכנת גרעיני Arabidopsis thaliana איכותיים המתאימים ל-SMLM. בוצעו מספר סבבי אופטימיזציה לשיפור שלמות הגרעין ולהפחתת פסולת ציטופלזמית ותאית הפוגעת באיכות התמונה. לאחר כל שלב אופטימיזציה, איכות ההכנות הגרעיניות הוערכה באמצעות הדמיה קונפוקלית באמצעות מיקרוסקופ דיסק מסתובב Olympus IX81 לפני המשך לרכישת רזולוציית על.

הדמיה קונפוקלית
ההליך שתואר לעיל אכן תואם להדמיה קונפוקלית. למטרה זו, פתרון ה-LMA המשמש בשלב 3....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הכנת גרעיני Arabidopsis thaliana למיקרוסקופיית מיקום מולקולה אחת (SMLM) דורשת מספר שלבים קריטיים המשפיעים מאוד על איכות הדגימה הסופית. כפי שתואר קודם 19,35, חיתוך רקמות יסודי ועקבי הוא חיוני למקסום התאוששות גרעינים שלמים. שימוש בלהבי מיקרוטום במקום להבי גילוח סטנדרטיים יוצר פיצול רקמות נקי ואחיד יותר, ובכך משפר את שחרור הגרעינים. שלבי השטיפה והצנטריפוגה הבאים חשובים לא פחות להפחתת פסולת. שלבים אלו מתבצעים בזהירות, כאשר ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

אנו מודים למעבדת Lavis ולצוות הכימיה הפתוחה ב-Janelia על הנדיבות שסיפקו בנדיבות את צבעי JF ו-JFX. אנו גם מודים לאליזבת קראצ'יק-דייר וסליה ברוקס על שיתוף הפרוטוקול שלהם, וכן לאלין פרובסט וגיירמו אורסי על עצות מעמיקות. ההדמיה האופטית בוצעה על פלטפורמת ההדמיה M4D של מרכז גרנובל Instruct-ERIC (ISBG; UAR 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) במסגרת שותפות גרנובל לביולוגיה מבנית, בתמיכת התשתית הצרפתית לביולוגיה מבנית משולבת (ANR-10-INBS-0005-02) והברית של גרנובל לביולוגיה מבנית ותאית משולבת Labex, פרויקט של בית הספר לתארים מתקדמים של אוניברסיטת גרנובל אלפים (Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR- 17-EURE- 0003). אנו מודים לטיפ Ten Brink עבור חבילת AnalyzeFRC Python שפותחה במחלקה לפיזיקת דימות (ImPhys), הפקולטה למדעים יישומיים, TU Delft.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S2) antibodyAbcamab5095Primary antibody used at 1/200 dilution in immunostaining buffer to visualize the active form of the polymerase (Polyclonal antibody raised in rabbit )
Acquisition softwareAbbelightNEO LiveImaging v2.18
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA7906  
CatalaseSigma-AldrichC40
Certified Low Melting AgaroseBio-Rad1613111
Coverslips thickness 1.5H roundMarienfeld117640Ø: 24 mm
D-(+)-Glucose, anhydrous, 99%Thermo ScientificA16828-36 
Dichroic mirrorSemrockDi03-R405/488/561/635-t1Dichroic mirror for excitation/emission separation
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 10´biowestX0515 - 500 Work in sterile conditions
Epredia Ultra Disposable Microtome BladesFisherScientific12191830Low profile, single use
Falcon 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid Falcon353046
Formaldehyde solution 37%Carl Roth7398Work under the fume hood
Glucose oxidaseSigma-AldrichG2133
GlycerolVWR24388.295
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647Thermo ScientificA32733TRUsed at 1/200 as secondary antibody coupled to AF647
Hoechst 33258 solutionSigma-Aldrich94403Used at 1/500 to counterstain the DNA, added to the agarose pad
Hydrochloric Acid SolutionChem-LabCL05.0311.1000 
JF549-HoechstLavis lab and Open Chemistry team (Janelia)JF549-HoechstUsed to counterstain DNA, added to the agarose pad at 1.5 nM final concentration
KIMBLE Dounce tissue grinder setSigma-AldrichD89382 mL tube with both large (0.0030-0.0050 inch) and small (0.0005-0.0025 inch) clearance pestles
Lasers unitOxxiusL6CcEquipped with six lasers: 405 nm - 100 mW, 488 nm - 200 mW, 532 nm - 500 mW, 561 nm - 300 mW, 640 nm - 500 mW and 730 nm - 30 mW
Magnesium chloride hexahydrateCarl RothHN03
Mercaptoethylamine (MEA)Sigma-Aldrich30070
MOPS sodium salt 98%Fisher Scientific SAS352590010
Multiband emission filterSemrockFF01-446/523/600/677Multiband emission filtration to block laser scatter light
NanodiamondsAdamas NanotechnologiesNDNV100nmHiWGA2mlStock 1 mg/mL
ORCA-Fusion Digital CMOS cameraHamamatsuC14440-20UP 
Petri dish, 100/20 mm, PS, clear, with vents, sterileGreiner Bio-One664161Used to grow plants on 1/2 MS medium
Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterileGreiner Bio-One688161Used when chopping the plant seedlings
pluriStrainer Mini cell strainerpluriSelect43-10030-50Mesh size 30 µm, suitable for 1.5 mL Eppendorf tube
Potassium ChlorideSigma-AldrichP9333
Single band emission filterSemrockFF01-698/70Specific emission filter for AF647 channel
Single band emission filterChromaET600/50mSpecific emission filter for JF549 channel
Sodium chloride (99,5%) Euromedex1112-A
Star-Frost slides 76 x 26 mmKnittel VS112711FKB.01
Sterile syringe filterø 33 mm porosity 0.2 µm Luer Lock coneClearLine146560
Super-resolution systemAbbelightSAFe360Olympus IX83 equipped with 100x NA1.5 oil-immersion objective
Tri-Sodium Citrate 2H2O Gen-Apex BiomoleProlaboPRO-33615.268
Tris Base Molecular Biology GradePromegaH5135
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)Thermo Scientific20491
Triton X-100Euromedex2000-B
Tween 20Euromedex2001-B
Twinsil SpeedPicodent13001002Silicone sealant
Ultraviolet Ozone cleaning system UVOCS ovenUVOCS Inc.T10X1020 min exposure for coverslip cleaning 
Vacuum pumpVacuubrandVP 100C
Heraeus Megafuge 16R CentrifugeThermo ScientificRotor TX-400 75003629. Centrifugation performed with Eppendorf tubes.

מקורות

  1. Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128 (4), 787-800 (2007).
  2. Rowley, M. J., Corces, V. G. Organizational principles of 3D genome architecture. Nat Rev Genet. 19 (12), 789-800 (2018).
  3. Fransz, P., de Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (22), 14584-14589 (2002).
  4. Tessadori, F., Chupeau, M. C., Chupeau, Y., Knip, M., Germann, S. Large-scale dissociation and sequential reassembly of pericentric heterochromatin in dedifferentiated Arabidopsis cells. J Cell Sci. 120 (7), 1200-1208 (2007).
  5. Caballero, L., Pasternak, T., Riyazuddin, R., Pérez-Pérez, J. M. Connecting high-resolution 3D chromatin maps with cell division and cell differentiation at the root apical meristem. Plant Cell Rep. 43 (10), 232 (2024).
  6. Pavlova, P., van Zanten, M., Snoek, B. L., de Jong, H., Fransz, P. 2D morphometric analysis of Arabidopsis thaliana nuclei reveals characteristic profiles of different cell types and accessions. Chromosome Res. 30 (1), 5-24 (2022).
  7. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
  8. Gustafsson, M. G. L. Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
  9. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett, OL. 19 (11), 780-782 (1994).
  10. Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt Lett, OL. 24 (14), 954-956 (1999).
  11. Hugelier, S., Colosi, P. L., Lakadamyali, M. Quantitative Single-Molecule Localization Microscopy. Annu Rev Biophys. 52, 139-160 (2023).
  12. Schermelleh, L., Ferrand, A., Huser, T., Eggeling, C., Sauer, M. Super-resolution microscopy demystified. Nat Cell Biol. 21 (1), 72-84 (2019).
  13. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  14. Heilemann, M., van de Linde, S., Schüttpelz, M., Kasper, R., Seefeldt, B. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  15. Ricci, M. A., Manzo, C., García-Parajo, M. F., Lakadamyali, M., Cosma, M. P. Chromatin fibers are formed by heterogeneous groups of nucleosomes in vivo. Cell. 160 (6), 1145-1158 (2015).
  16. Xu, J., Ma, H., Jin, J., Uttam, S., Fu, R. Super-resolution imaging of higher-order chromatin structures at different epigenomic states in single mammalian cells. Cell Rep. 24 (4), 873-882 (2018).
  17. Nozaki, T., Imai, R., Tanbo, M., Nagashima, R., Tamura, S. Dynamic organization of chromatin domains revealed by super-resolution live-cell imaging. Molecular Cell. 67 (2), 282-293.e7 (2017).
  18. Komis, G., Šamajová, O., Ovečka, M., Šamaj, J. Super-resolution microscopy in plant cell imaging. Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).
  19. Kracik-Dyer, E., Baroux, C. 3D STED Imaging of isolated Arabidopsis thaliana nuclei. Methods Mol Biol. 2873, 263-280 (2025).
  20. Gaifas, L., et al. Combining live fluorescence imaging with in situ cryoelectron tomography sheds light on the septation process in Deinococcus radiodurans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 122 (19), e2425047122 (2025).
  21. de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated time-lapse microscopy. J Vis Exp. (53), e3145 (2011).
  22. Vauclare, P., Wulffelé, J., Lacroix, F., Servant, P., Canfalonieri, F., et al. Stress-induced nucleoid remodeling in Deinococcus radiodurans is associated with major changes in Heat Unstable (HU) protein dynamics. Nucleic Acids Res. 52 (11), 6406-6423 (2024).
  23. Schubert, V. Super-resolution microscopy – Applications in plant cell research. Front Plant Sci. 8, 531 (2017).
  24. Carles, C. C., Ha, C. M., Jun, J. H., Fiume, E., Fletcher, J. C., Hennig, L., Köhler, C. Analyzing Shoot Apical Meristem Development. Plant Developmental Biology: Methods and Protocols. , 105-129 (2010).
  25. Chincinska, I. A. Leaf infiltration in plant science: old method, new possibilities. Plant Methods. 17 (1), 83 (2021).
  26. Tse-Kang, S. Y., et al. Intestinal immunity in C. elegans is activated by pathogen effector-triggered aggregation of the guard protein TIR-1 on lysosome-related organelles. Immunity. 57 (10), 2280-2295.e6 (2024).
  27. Lim, D., Ford, T. N., Chu, K. K., Mertz, J. Optically sectioned in vivo imaging with speckle illumination HiLo microscopy. J Biomed Opt. 16 (1), 016014 (2011).
  28. Culley, S., et al. Quantitative mapping and minimization of super-resolution optical imaging artifacts. Nat Methods. 15 (4), 263-266 (2018).
  29. Xue, M., et al. Single amino acid mutations in histone H3.3 illuminate the functional significance of H3K4 methylation in plants. Nat Commun. 16 (1), 4408 (2025).
  30. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18, 529 (2017).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plugin for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  33. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  34. Van Heel, M. Similarity measures between images. Ultramicroscopy. 21 (1), 95-100 (1987).
  35. Loureiro, J., et al. Isolation of plant nuclei for estimation of nuclear DNA content: Overview and best practices. Cytometry Part A. 99 (4), 318-327 (2021).
  36. Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).
  37. Duncan, S., Olsson, T. S. G., Hartley, M., Dean, C., Rosa, S. A method for detecting single mRNA molecules in Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 12, 13 (2016).
  38. Gutzat, R., Mittelsten Scheid, O. Preparing chromatin and RNA from rare cell types with fluorescence-activated nuclear sorting (FANS). Methods Mol Biol. 2093, 95-105 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ארגון כרומטיןמיקרוסקופיה ברזולוציה-עלדימוי dSTORMארכיטקטורה גרעיניתמודיפיקציות של כרומטיןסימון פלואורופוריבידוד גרעיניםרגולציה אפיגנטית
פרוטוקול יעיל למיקרוסקופיית מיקום מולקולה בודדת בגרעעיני ארבידופסיס
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.