פרוטוקול יעיל למיקרוסקופיית מיקום מולקולה בודדת בגרעעיני ארבידופסיס

Summary

פרוטוקול זה מציע תהליך עבודה יעיל להדמיית מיקרוסקופיה בלוקליזציה בודדת של גרעיני ארבידופסיס מבודדים, תוך שימוש בבידוד, קיבוע ותיוג אופטימליים להשגת ויזואליזציה ננומטרית אמינה של כרומטין ו-RNA פולימראז II. גישה זו ניתנת להתאמה קלה לחלבונים אחרים הקשורים לכרומטין או לשינויים בהיסטונים להדמיה ברזולוציה גבוהה.

Abstract

בעוד שמיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית סיפקה תובנות חשובות על ארגון הכרומטין בגרעינים של צמחים, הרזולוציה המוגבלת שלה מגבילה את חקר ארכיטקטורת הכרומטין, ומניעה שימוש בטכניקות סופר-רזולוציה כמו מיקרוסקופיית מיקום מולקולה בודדת (SMLM). מבין הגישות הללו, מיקרוסקופ שחזור אופטי ישיר (dSTORM) מספק רזולוציה ננומטרית בתאים בודדים, ומאפשר הדמיה מדויקת של תחומי כרומטין, שינויים בהיסטונים וארגון גרעיני. בעוד ששיטות כאלה מיושמות יותר ויותר במערכות יונקים, השימוש בהן בביולוגיה של צמחים נותר מוגבל, בעיקר בשל אתגרים טכניים בהכנת דגימות.

כאן אנו מציגים תהליך עבודה יעיל וניתן לשחזור עבור הדמיית SMLM של גרעינים שבודדו מ-Arabidopsis thaliana. פרוטוקול זה מתחיל בקיבוע שתילים לשימור מורפולוגיה גרעינית, ואחריו חיתוך עדין של רקמות וצנטריפוגה להעשיר גרעינים שלמים. גרעינים מבודדים מתויגים בפלואורופור בתווך נוזלי ומותקעים על פדים עם התכה נמוכה, אסטרטגיה המשפרת את היציבות במהלך סשנים ממושכים של דימות מולקולה יחידה. צעדים אלו מצמצמים יחד פלואורסצנציה ברקע, משפרים את עקביות התיוג ומגבירים את השכפול בין שכפולים ביולוגיים.

ההכנות שנוצרו מספקות בהירות מוגברת להמחשת שינויים בכרומטין ובארכיטקטורה גרעינית בצמחים. על ידי הפחתת המחסומים הטכניים ליישום הדמיית SMLM ב-Arabidopsis, פרוטוקול זה מספק אמצעי גמיש לחקר ויסות אפיגנטי, ארגון כרומטין ושינויים טופולוגיים גרעיניים בקנה מידה ננומלי. עבודה זו יוצרת בסיס מתודולוגי ליישום SMLM על צמחים, מגשרת על הפער עם ביולוגיית תאי יונקים ופותחת הזדמנויות חדשות לחקר כיצד אדריכלות גרעינית תורמת לוויסות הגנום בתגובה לרמזים התפתחותיים וסביבתיים במערכות צמחים.

Introduction

מיקרוסקופיה הייתה מאז ומתמיד אבן יסוד לחקר ארגון הכרומטין והארכיטקטורה הגרעינית, וחושפת כיצד DNA וחלבונים הקשורים להיסטונים מתארגנים במרחב הגרעיני התלת-ממדי ומשפיעים על ויסות גנים ^1,2. מיקרוסקופיה פלואורסצנצית קונבנציונלית סיפקה תובנות חשובות לגבי תחומי כרומטין בקנה מידה גדול כגון טריטוריות כרומוזומים, כרומוסנטים וגופים גרעיניים ^3,4, האפשריים במקום, במיוחד ברקמות שורש של צמחים ^3,5,6. עם זאת, טכניקות אלו מוגבלות באופן יסודי על ידי מחסום הדיפרקציה של האור, ומגביל את הרזולוציה המרחבית לכ-200 ננומטר לרוחב וכ-500 ננומטר ציר⁷. מגבלה זו מטשטשת פרטים בקנה מידה ננומטרי של קיפול כרומטינים, דפוסי שינוי היסטונים ותחום שעתוק שמאחורי ויסות אפיגנטי. כדי להתגבר על מחסום זה, פותחו גישות מיקרוסקופיה ברזולוציה על-אנושית (SRM) כגון מיקרוסקופ תאורה מובנית (SIM)⁸, מיקרוסקופיית פליטה מעוררת (STED)^9,10, ומיקרוסקופיית מיקום מולקולה בודדת (SMLM)^11,12, להשגת רזולוציות הנעות מ-100 ננומטר ועד כמה ננומטר¹³.

מבין טכניקות SRM, SMLM — כולל מיקרוסקופ לוקליזציה PhotoActivated (PALM)¹³ ומיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי ישיר (dSTORM) — מציע רזולוציה מרחבית יוצאת דופן בשילוב עם ספציפיות מולקולרית¹⁴. על ידי זיהוי מיקומי פלואורופורים בודדים לאורך זמן, SMLM משחזר תמונות ננומטריות מדויקות של תחומי כרומטין, סימני היסטון ומבנים גרעיניים בתאים בודדים^15,16. יכולת זו שינתה את מחקר הכרומטין במערכות יונקים, שם SMLM יושם להמחשת התקבצות נוקלאוזומים, דחיסת כרומטין ודפוסי שינוי היסטונים בפירוט חסר תקדים 15,16,17. לעומת זאת, יישום SMLM על גרעיני צמחים נותר מוגבל, בעיקר בשל אתגרים טכניים הקשורים לתכונות רקמת הצמח — כגון אוטופלואורסצנציה גבוהה, קשיחות דופן התא, ונוכחות תרכובות מפזרות אור כמו עמילן וכלורופיל¹⁸. יתרה מזאת, הטבע העדין של הגרעינים במהלך בידוד ותיוג דורש תהליכי עבודה אופטימליים לשמירה על שלמות מבנית ולהפחתת פלואורסצנציה ברקע במהלך סשנים ממושכים של דימות.

הפרוטוקול המתואר כאן פותח במקור על ידי אליזבת קראצ'יק-דייר וסליה ברו למיקרוסקופיה של דלוק פליטה מגורה (STED)¹⁹. בהמשך הוא אופטימיזציה והותאם כדי לעמוד בדרישות הספציפיות של דימות STORM עם שילוב הידע שמקורו ביישומי מיקרוביולוגיה^{שפורסמו 20,21,22}. המטרה הכוללת היא לספק זרימת עבודה יעילה וניתנת לשחזור עבור הדמיית SMLM של גרעיני Arabidopsis thaliana מבודדים. על ידי שילוב קיבוע אופטימלי, הפרעות מכניות עדינות וסימון פלואורופור בתלוי, שיטה זו שומרת על המורפולוגיה הגרעינית תוך הסרת מזהמים ציטופלזמיים ביעילות שלעיתים פוגעים באיכות הדימות. קיבוע גרעינים מסומנים על כריות אגרוז בעלות התכה נמוכה מבטיח יציבות מכנית במהלך הרכישה, ומאפשר הדמיה ארוכת טווח של מולקולה אחת בדיוק ננומטר. בהשוואה לפרוטוקולי SRM שתוארו קודם לכן לגרעינים של צמחים — במיוחד אלה המבוססים על מיקרוסקופיה STED^19,23 — תהליך זה משתמש בפלואורופורים ניתנים לפוטו-סוויץ' (למשל, AF647, JF549), ומפחית פלואורסצנציה רקע בזכות שלבי שטיפה שמשליכים כלורופיל ופסולת רקמה, ומשפר את הומוגניות התיוג על ידי הוספת מולקולות התיוג ישירות לגרעינים הקבועים והחדירים. כתוצאה מכך, הוא מאפשר הדמיה עקבית של שינויים בכרומטין, תאים גרעיניים ודפוסים אפיגנטיים בגרעינים בודדים. על ידי הורדת המחסומים הטכניים ליישום SMLM בצמחים, שיטה זו מרחיבה את הנגישות להדמיה ננומטרית ומספקת בסיס לחקר כיצד ארגון כרומטין וארכיטקטורה גרעינית תורמים לויסוי גנים בתגובה לרמזים התפתחותיים וסביבתיים.

Protocol

הערה: המידע המפורט על החומרים והכלים המשמשים בפרוטוקול זה זמין בטבלת החומרים. אלא אם צוין אחרת, הבופרים מנוקים במסננים אפירוקניים של 0.2 מיקרון. H2 O טהור מאוד מזוקק כפול (ddH₂O) משמש לאורך כל הפרוטוקול הזה. שלבי הצנטריפוגה מתבצעים במיקרופופרות בנפח 1.5 מ"ל באמצעות רוטור בזווית קבועה.

1. קיבוע הנבטים ושחרור הגרעינים

1. הניחו צלחת תרבית עם 6 בארות על קרח מתחת למכסה האדים, ואז הוסיפו לכל באר כ-4 מ"ל של תמיסת קיבוע קרח שהוכנה באופן ספונטני מתחת למכסה אדים (פורמלדהיד מייצב מתנול 4% (v/v), 0.1% טריטון X-100 ב-1× מלח מפושט פוספט [PBS]).
2. באמצעות מלקחיים נקיים, הסר את השתילים (בין 8 ל-15 ימים לאחר הנביטה) שגודלו על מלחים מוצקים (0.8% אגר) של Murashige חצי חוזק ומלח Skoog Medium של 2.2 גרם לליטר MS, 1% סוכרוז (עם חוץ), pH 5.7, כפי שמתואר עבור שתילי MS בהפניה²⁴, וטבול אותם מיד בתמיסת הקיבע. יש להשתמש בבאר אחת לכ-20 שתילים (נדרשו 3 בארות לקבלת חומר מספק לכל דגימה).
3. הכניסו את הפלטה לתא הוואקום המלא בקרח והפעילו ואקום בלחצים שמתחילים בין 0.2 בר ל-0.8 בר למשך 15 דקות כדי להסיר אוויר לכוד ולאפשר חדירה עמוקה של הקיבוע לרקמות הצמח^. שחרר לאט את השואב, ערבב את הדגימה, ואז מרח את הוואקום לעוד 15 דקות.
4. מתחת למכסה האדים, הסר את תמיסת הקיבוע עם פיפטה, ושוטף כל באר 3 פעמים במשך 10 דקות תחת ערבוב עדין, עם 5 מ"ל של PBS קר כקרח.
5. הסר PBS והשתמש במלקחיים כדי להעביר את הרקמה הקבועה לצלחת פטרי בגודל 120 מ"מ × 120 מ"מ. הוסיפו לשתילים הקבועים 50 מיקרו-ליטר של בופר בידוד גרעינים (NIB), שהוכן כפי שתואר על ידי Kracik-Dyer ו-Baroux (45 mM MgCl₂, 20 mM MOPS, 30 mM sodium citrate, 0.3% Triton X-100). כוון ל-pH 7 עם 1 N ^HCl)19. צ'יפ עם להב.
   הערה: להבי מיקרוטום התגלו כיעילים יותר מלהבי גילוח רגילים למשימה זו.
6. גרדו טישו קצוצים לקצה אחד של צלחת הפטרי עם אותו להב והוסיפו 600 מיקרול של NIB, תוך הקפדה לשטוף כל רקמה שנדבקה ללהב.
7. העבר תערובת רקמה לצינור ההומוגניזר Dounce בקוטר 2 מ"ל וליטף 5–10 פעמים עם העלי הקטן, ואז עם העלי הגדול עד שהוא נע בצורה חלקה בתוך הצינור (זה דורש בדרך כלל 5–10 משיכות).
8. סינן את הדגימה ההומוגנית המתקבלת דרך מסנן רשת של 30 מיקרון למיקרוצינור בנפח 1.5 מ"ל.
9. צנטריפוגה את המתלים למשך 10 דקות ב-800 × גרם באמצעות הרמפה הנמוכה ביותר גם להאצה וגם להאטה. כדור קטן לבן נראה בין שברי הרקמה הירוקה.
10. זרוק את הסופרנטנט ותשהה את הכדור ב-150 מיקרוליטר של NIB.
11. צנטריפוגה שוב 10 דקות ב-800 × גרם והסרת הסופרנטנט. אם יש פסולת ירוקה נראית לעין, שטוף בפעם השנייה. תלייה מחודשת ב-50 מיקרו-ליטר עד 150 מיקרו-ליטר של NIB, בהתאם לגודל הכדור.
12. אחסן את תליית הגרעינים המבודדת המתקבלת בטמפרטורה של 4°C למשך מקסימום של שבוע לפני ביצוע הצביעה. עם זאת, מומלץ להמשיך מיד.

2. צביעת (חיסונית)

הערה: בשלבים הבאים, הפרוטוקול מיושם על נפח של 50 מיקרו-ליטר של תליית גרעינים, המתאים בדרך כלל ל-20 שתילים. אלא אם צוין, השלבים הבאים מתבצעים בטמפרטורת החדר.

1. צנטריפוגה את התמיסה במשך 10 דקות ב-800 × גרם וזרוק את הסופרנטנט. היזהר לא לגעת בכדור.
2. החזירו את הגרעינים על ידי פיפטינג עדין ב-50 מיקרוליטר של בופר חוסם (143 mM NaCl, 4% BSA ב-PBS, מאוחסן ב-4 מעלות צלזיוס). דגרו במשך 30 דקות תחת ערבוב עדין.
3. צנטריפוגה את התמיסה ל-10 דקות ב-800 × גרם וזרוק את הסופרנטנט מבלי לגעת בכדור הגרעין.
4. החזירו את הגרעינים על ידי פיפטינג עדין ב-50 מיקרו-ליטר של 1× PBS. צנטריפוגה שוב ל-10 דקות ב-800 × גרם. השליכו את הסופרנטנט כפי שציינתי.
5. החזירו את הגרעינים ל-50 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית שהוכנה בבופר חיסון המורכב מ-143 mM NaCl, 1% BSA, 0.05% Tween 20 ב-PBS (נוגדנים ודילול עבודה מפורטים בטבלת החומרים). דגרו את הדגימות למשך 60 דקות תחת ערבוב עדין.
6. המשך עם 2 שטיפות (חזור על שלבים 2.3 ו-2.4).
7. החזירו את הגרעינים ל-50 מיקרוליטר של נוגדן משני אנטי-ארנב AF647 ב-1/200 דילול²⁶. עטוף את הצינורות בנייר אלומיניום כדי להגן על הפלואורופור מאור. דגר את הצינורות למשך 60 דקות תחת ערבוב עדין.
8. המשך עם 2 שטיפות (חזור על שלבים 2.3 ו-2.4).
9. תלה מחדש את הכדור ב-50 מיקרוליטר של NIB. אחסן את המתלה במיקרו-צינורות 1.5 מ"ל עטופים בנייר אלומיניום. הסימון יציב במשך מספר שבועות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

3. הרכבה

1. להדמיית STORM, יש להכין תמיסת אגרוז בעלת התכה נמוכה (LMA 1.5% w/v) על ידי המסה באבקה בבופר B של 1.25× המורכב מ-50 מ"מ טריס pH 8, 10 מ"מ מ' NaCl, 10% גלוקוז. הכינו תמיסת מלאי 1.25× ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
2. חמם ב-90 מעלות צלזיוס למשך דקה כדי להמיס את האבקה ולקבל תמיסה שקופה. לקרר ולשמור על תמיסת ה-LMA המומסת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני שממשיכים לשלב הבא כדי להימנע מפירוק חום של בופר גלוקוז אוקסידאז (GLOX) (הכינו תמיסת מלאי פי 10 מאוחסנת בטמפרטורה של -20°C המורכבת מ-100 מ"מ טריס pH 7.5, 25 מ"מ KCl, 1 מ"מ TCEP pH 7.0, 5 מ"ג/מ"ל גלוקוז אוקסידאז, 0.4 מ"ג/מ"ל קטלאז, 50% v/v גליצרול).
3. לאחר שתמיסת ה-LMA מגיעה ל-37 מעלות צלזיוס, יש להכין את בופר ה-STORM על ידי הוספת 100 מ"מ מרקפטואתילאמין (MEA) ו-GLOX לתמיסת ה-LMA החמה להשגת ריכוז סופי של 1×. יש לאחסן את תמיסת המלאי של MEA 1M עד חודש בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, אך מומלץ להשתמש בתמיסה טרייה ומוכנה. ערבב בעדינות.
   הערה: לצורך תיוג DNA אופציונלי, הוסף 1.5 ננומטר (ריכוז סופי, תמיסת מלאי של 1 mM ב-DMSO) של ה-Hoechst הצמוד JF549. שמור על המתלה ב-37 מעלות צלזיוס עד השימוש.
4. מערבבים בעדינות את תליית הגרעינים עם ננו-יהלומים בדילול של 1/1500. דגרו אותם עם הדגימה למשך 5 דקות.
   הערה: ננו-יהלומים משמשים כסמנים פידוציאליים לתיקון סטיית הדגימה.
5. הפקדו 10 מיקרוליטר מהתערובת על כיסוי 1.5H מטופל באוזון (20 דקות במערכת ניקוי האוזון אולטרה סגולה) והמתינו 3 דקות עד שהגרעינים ישקעו על הכיסוי.
6. הסר את עודף הנוזל, חכה 2 דקות. הוסף 10 מיקרוליטר מה-LMA שהוכנה בשלב 3.3 לכיסוי הכיסוי ומכסה מיד עם סלייד מיקרוסקופ.
7. אוטום את הכיסוי באמצעות איטום סיליקון. מערבבים כמויות שוות של תמיסה A ו-B בצלחת פטרי קטנה באמצעות קצה מיקרופיפטה. מרחו את התערובת על קצוות הכיסוי כדי לאטום את הדגימה. איטום סיליקון מתקשה תוך 5 דקות.
8. לאחר ההרכבה, יש לבצע הדמיה של מחסניות ללא דיחוי, ולבסוף ב-4–5 שעות הבאות, כדי למנוע אובדן תכונות איסוף החמצן של משטח ההרכבה.

4. דימות

הערה: יש לאופטם את פרמטרי ההדמיה בקפידה בהתאם לאופי הדגימה, לתכונות הפוטופיזיקליות של הפלואורופורים ולקונפיגורציה האופטית של המיקרוסקופ. חשוב להבטיח יחס אות לרעש גבוה לכל פלואורופור תוך מזעור הדליפה והגירוי הספקטרלי בין ערוצי פלואורסצנט. הדגימות נצפו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך המצויד במטרת טבילה בשמן 100x NA גבוהה, יחידת שמירת מיקוד ונורית LED לבנה להדמיית שדה בהיר. תוויות פלואורסצנטיות AlexaFluor647 (AF647) הוערכו ב-640 ננומטר ו-JF549-Hoechst ב-561 ננומטר. האור שנפלט סינן באמצעות מראה דיכרואית ומסנן פס תואמים, ולבסוף נאספו תמונות באמצעות מצלמת מתכת-תחמוצה-סמיקונדקטור (sCMOS) מדעית.

1. התקן את סלייד הדוגמה ומצא פוקוס. הפעל מודול לשמירת פוקוס אם יש כזה במערכת (מומלץ מאוד לרכישות ארוכות).
2. מצא והתמקד בגרעין. עדיף שיהיה אחד או כמה ננו-יהלום קרוב לגרעין הרצוי כדי לתקן את הסטייה ביעילות רבה יותר במהלך השחזור.
3. (אופציונלי) ללכוד תמונות מצב מוגבלות של דיפרקציה של שדה בהיר וכל ערוץ פלואורסצנטי בעוצמת לייזר נמוכה.
4. בעת ביצוע הדמיה דו-צבעית, התחל ברכישת ערוץ אורך גל ארוך יותר ואז עבור לערוץ אורך גל קצר יותר (כלומר, רכישת ערוץ AF647 לפני JF549).
   הערה: דוגמה לפרמטרי רכישה בעבודה זו:
   ערוץ A - תיוג אפיטופה - AF647
   זמן חשיפה: 20 מילישניות
   עוצמת לייזר: 640 ננומטר – 2.2 קילוואט/ס"^{מ 2}
   מצב התרגשות: HiLo²⁷
   ערוץ B - סימון DNA - JF549-Hoechst
   זמן חשיפה: 50 מילישניות
   עוצמת לייזר: 561 ננומטר - 1 קילוואט/ס"^{מ 2}
   מצב גירוי: אפינפרין
   מספר התמונות המוקלטות: 10,000-30,000 לכל ערוץ, מה שמבטיח שצפיפות הפלואורופורים לכל פריים תישאר דלילה מספיק למיקום מדויק של מולקולה בודדת, בעוד שמספר הלוקליזציות המצטבר נקבע אמפירית באמצעות דירוג תמונה כמותי סופר-רזולוציה ודיווח על מיקומי שגיאה (SQUIRREL)²⁸, שגם הוא מצביע על מספר מספיק של פריימים.

Results

הפרוטוקול שתואר לעיל מאפשר הכנת גרעיני Arabidopsis thaliana איכותיים המתאימים ל-SMLM. בוצעו מספר סבבי אופטימיזציה לשיפור שלמות הגרעין ולהפחתת פסולת ציטופלזמית ותאית הפוגעת באיכות התמונה. לאחר כל שלב אופטימיזציה, איכות ההכנות הגרעיניות הוערכה באמצעות הדמיה קונפוקלית באמצעות מיקרוסקופ דיסק מסתובב Olympus IX81 לפני המשך לרכישת רזולוציית על.

הדמיה קונפוקלית
ההליך שתואר לעיל אכן תואם להדמיה קונפוקלית. למטרה זו, פתרון ה-LMA המשמש בשלב 3.1 יכול להתבסס על PBS (או כל בופר נ...

Discussion

הכנת גרעיני Arabidopsis thaliana למיקרוסקופיית מיקום מולקולה אחת (SMLM) דורשת מספר שלבים קריטיים המשפיעים מאוד על איכות הדגימה הסופית. כפי שתואר קודם ^19,35, חיתוך רקמות יסודי ועקבי הוא חיוני למקסום התאוששות גרעינים שלמים. שימוש בלהבי מיקרוטום במקום להבי גילוח סטנדרטיים יוצר פיצול רקמות נקי ואחיד יותר, ובכך משפר את שחרור הגרעינים. שלבי השטיפה והצנטריפוגה הבאים חשובים לא פחות להפחתת פסולת. שלבים אלו מתבצעים בזהירות, כאשר ה...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S2) antibody	Abcam	ab5095	Primary antibody used at 1/200 dilution in immunostaining buffer to visualize the active form of the polymerase (Polyclonal antibody raised in rabbit )
Acquisition software	Abbelight	NEO LiveImaging v2.18
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
Certified Low Melting Agarose	Bio-Rad	1613111
Coverslips thickness 1.5H round	Marienfeld	117640	Ø: 24 mm
D-(+)-Glucose, anhydrous, 99%	Thermo Scientific	A16828-36
Dichroic mirror	Semrock	Di03-R405/488/561/635-t1	Dichroic mirror for excitation/emission separation
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 10´	biowest	X0515 - 500	Work in sterile conditions
Epredia Ultra Disposable Microtome Blades	FisherScientific	12191830	Low profile, single use
Falcon 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid	Falcon	353046
Formaldehyde solution 37%	Carl Roth	7398	Work under the fume hood
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G2133
Glycerol	VWR	24388.295
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647	Thermo Scientific	A32733TR	Used at 1/200 as secondary antibody coupled to AF647
Hoechst 33258 solution	Sigma-Aldrich	94403	Used at 1/500 to counterstain the DNA, added to the agarose pad
Hydrochloric Acid Solution	Chem-Lab	CL05.0311.1000
JF549-Hoechst	Lavis lab and Open Chemistry team (Janelia)	JF549-Hoechst	Used to counterstain DNA, added to the agarose pad at 1.5 nM final concentration
KIMBLE Dounce tissue grinder set	Sigma-Aldrich	D8938	2 mL tube with both large (0.0030-0.0050 inch) and small (0.0005-0.0025 inch) clearance pestles
Lasers unit	Oxxius	L6Cc	Equipped with six lasers: 405 nm - 100 mW, 488 nm - 200 mW, 532 nm - 500 mW, 561 nm - 300 mW, 640 nm - 500 mW and 730 nm - 30 mW
Magnesium chloride hexahydrate	Carl Roth	HN03
Mercaptoethylamine (MEA)	Sigma-Aldrich	30070
MOPS sodium salt 98%	Fisher Scientific SAS	352590010
Multiband emission filter	Semrock	FF01-446/523/600/677	Multiband emission filtration to block laser scatter light
Nanodiamonds	Adamas Nanotechnologies	NDNV100nmHiWGA2ml	Stock 1 mg/mL
ORCA-Fusion Digital CMOS camera	Hamamatsu	C14440-20UP
Petri dish, 100/20 mm, PS, clear, with vents, sterile	Greiner Bio-One	664161	Used to grow plants on 1/2 MS medium
Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile	Greiner Bio-One	688161	Used when chopping the plant seedlings
pluriStrainer Mini cell strainer	pluriSelect	43-10030-50	Mesh size 30 µm, suitable for 1.5 mL Eppendorf tube
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Single band emission filter	Semrock	FF01-698/70	Specific emission filter for AF647 channel
Single band emission filter	Chroma	ET600/50m	Specific emission filter for JF549 channel
Sodium chloride (99,5%)	Euromedex	1112-A
Star-Frost slides 76 x 26 mm	Knittel	VS112711FKB.01
Sterile syringe filterø 33 mm porosity 0.2 µm Luer Lock cone	ClearLine	146560
Super-resolution system	Abbelight	SAFe360	Olympus IX83 equipped with 100x NA1.5 oil-immersion objective
Tri-Sodium Citrate 2H2O Gen-Apex Biomole	Prolabo	PRO-33615.268
Tris Base Molecular Biology Grade	Promega	H5135
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)	Thermo Scientific	20491
Triton X-100	Euromedex	2000-B
Tween 20	Euromedex	2001-B
Twinsil Speed	Picodent	13001002	Silicone sealant
Ultraviolet Ozone cleaning system UVOCS oven	UVOCS Inc.	T10X10	20 min exposure for coverslip cleaning
Vacuum pump	Vacuubrand	VP 100C
Heraeus Megafuge 16R Centrifuge	Thermo Scientific		Rotor TX-400 75003629. Centrifugation performed with Eppendorf tubes.