הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד וזיקולות חוץ-תאיות קטנות משריר השלד של עכברו וממח עצם באמצעות כרומטוגרפיה של הוצאת גודל

207 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70894

⸱

23 ביוני 2026

 ,  ,  , 
1Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 2McGill Group for Suicide Studies, Douglas Mental Health University Institute, 3Center for Applied Nanomedicine, Research Institute of the McGill University Health Center, 4Department of Psychiatry, McGill University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות משרירי השלד של העכברים וממח עצם באמצעות עיכול אנזימטי וכרומטוגרפיה של הרחקת גודל, ומאפשר שחזור שניתן לשחזור של שברים מועשרים בוסיקולות מרקמות מורכבות מבנית ובעלות תפוקה נמוכה לניתוח מולקולרי במורד הזרם.

תקציר

וזיקולות חוץ-תאיות קטנות (sEVs) הן חלקיקים בגודל ננוזי, הקשורים לליפידים, המתווכים תקשורת בין-תאית באמצעות העברת חלבונים, ליפידים וחומצות ריבונוקלאיות (RNA). בידוד ה-sEVs מרקמות מוצקות כמו שריר השלד (SkM) וממח עצם (BM) נותר מאתגר בשל תפוקה נמוכה וזיהום מרכיבים שאינם וזיקולריים. פרוטוקול זה מתאר תהליך עבודה שניתן לשחזור לבידוד sEVs מ-SkM ו-BM בעכברים. SkM מתעכל אנזימטית, בעוד ש-BM מעובד ישירות ונחשף לצנטריפוגציה דיפרנציאלית וכרומטוגרפיה של הוצאת גודל (SEC). עבור SkM, נפח הריק (~2.5 מ"ל) נזרק, וה-~1.6 מ"ל הבא נאסף כשברים מועשרים ב-EV, בדרך כלל מחולקים ל-400 מיקרו-ליטר שברים סדרתיים (F1–F4). עבור BM, נפח ריק של 700 מיקרוליטר נזרק, ואחריו אוסף של חלקי EV מועשר ~850 מיקרוליטר, שניתן לחלק לחלקי ~170 מיקרוליטר סדרתיים (F1–F5) ולאחד על בסיס העשרת סמן EV. בגישה זו, ניתן לבודד sEVs מנפחי רקמה קטנים (כ-500 מיקרוליטר מארבע ראשי יחיד ו-150 מיקרוליטר מ-BM של עצם הירך והשוק המאוגדים), ומניב ~10 8 חלקיקים·מ"ל−1·מ"ג−1 רקמה עם קוטר חלקיקים בעיקר <200 ננומטר). שלמות וטוהר הווסיקולות מאומתים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים מעבר, ניתוח מעקב אחרי ננו-חלקיקים ו-Western blotting לסמנים קנוניים של EV, עם אפיון נוסף באמצעות זיהוי אינטרפרומטרי חד-חלקיקי לכימות תת-אוכלוסיות של וזיקולות מוגדרות בטטראספנין. שיטה זו מאפשרת בידוד שכפול של sEVs טוהרים מרקמות מורכבות מבניים באמצעות חומר קלט מינימלי, ותומכת בניתוחים מולקולריים ופונקציונליים במורד הזרם של ווסיקולות שמקורם ברקמה.

מבוא

וזיקולות חוץ-תאיות קטנות (sEVs) הן חלקיקים בגודל ננו, קשורים לליפידים, המתווכים תקשורת בין-תאית באמצעות העברת חלבונים, ליפידים וחומצות גרעין1. הם משתחררים מכל סוגי התאים ונמצאים כמעט בכל נוזלים ביולוגיים, שם הם משמשים כנושאים מרכזיים של מטען ביואקטיבי (RNAs), כולל פפטידים וחומצות מיקרו-ריבונוקלאיות (RNAs)2. המטען שלהם ממויין באופן סלקטיבי, מה שמאפשר העברת אותות מדויקים3, ומבנה הוסיקולריות שלהם מאפשר להם לעקוף את המגבלות הטיפוסיות של שיפוע ודילול של גורמים המופרשים בחופשיות על ידי העברת מטענים מולקולריים מרוכזים למרחקים ארוכים4. למרות ש-EVs מנוזלים ביולוגיים (כגון פלזמה, סרום ורוק) מספקים תמונת מצב נוחה של איתות מערכתית, הם מייצגים אוכלוסייה מעורבת מאוד שמקורה ברקמותרבות. זה מקשה לקבוע איזה איבר מפיק אות ביולוגי ספציפי או כיצד תקשורת EV מווסתת ברמת הרקמה. מכיוון ש-EVs במחזור נאספים יחד, ניתן לדלל או להסתיר שינויים ספציפיים לרקמה, מה שמגביל את היכולת לזהות את המקור האמיתי של אותות6.

שריר השלד (SkM) ומח עצם (BM) הם רקמות פעילות מטבולית ותפקודית עיקריות עם הרכבים תאיים ותפקידי איתות מובחנים 7,8. שתי הרקמות עשויות לשחרר אוכלוסיות EV המועשרות במטען ייחודי וייחודי לרקמות; עם זאת, אותות אלו יכולים להידחק בקלות בפלזמה על ידי EVs מרקמות עם תחלופה גבוהה כמו תאי חיסון 8,9. בידוד ישיר של ה-EVs מהשריר או מהשריר מגביר את הרגישות ומאפשר זיהוי התאמות עדינות ספציפיות לרקמה שאינן נראות במחזור הדם. לפיכך, EVs שמקורם ברקמה מספקים מידע משלים חיוני, החושף מתי איבר מסוים משחרר EVs, כמה זמן האותות הללו נמשכים, ואילו התאמות הן חריפות לעומת כרוניות. למרות העניין הגובר ב-EVs, רוב שיטות הבידוד המבוססות פותחו עבור נוזלים ביולוגיים (כגון פלזמה וסרום) או מערכות תרביות תאים. בהקשרים אלו, ניתן להשיג רכבים חשמליים עם תפוקה יחסית גבוהה והפרעה מבנית מינימלית. עם זאת, בידוד רכבים חשמליים ישירות מרקמות מוצקות כמו SkM ו-BM מציב אתגרים טכניים בולטים. רקמות אלו מורכבות מבנית והטרוגניות, ודורשות שלבי דיסוציאציה מכניים או אנזימטיים שיכולים להכניס ארטיפקטים, כולל רמות גבוהות של חלבונים מסיסים, שברי אברונים וננו-חלקיקים לא-וזיקולריים, מה שמקשה על השגת הכנות EV טוהרות.

אתגר מרכזי נוסף בבידוד EV שמקורו ברקמה הוא היעדר תהליכי עבודה סטנדרטיים להגדרת והפרדה של שברים10. צנטריפוגציה דיפרנציאלית לבדה גורמת לעיתים קרובות לבידוד משותף של אגרגטים חלבונים ווסיקולות גדולות, בעוד ששיטות מבוססות אולטרה-צנטריפוגה, אף שהן בשימוש נרחב, עלולות להוביל להצטברות וזיקולות, עיוות והתאוששות משתנה בהתאם לסוג הרוטור ולתנאי הניסוי. גישות גרדיאנט צפיפות משפרות את הטוהר אך הן דורשות זמן, תפוקה נמוכה וקשות לסטנדרטיזציה בין מעבדות11. כתוצאה מכך, כיום אין שיטה מאומצת באופן נרחב וניתנת לשחזור המותאמת לבידוד חשמליים קטנים מרקמות מוצקות עם טוהר גבוה ותפוקה עקבית10.

כרומטוגרפיית הדרת גודל (SEC) הפכה לחלופה מבטיחה לבידוד EV משום שהיא מפרידה חלקיקים לפי גודל מבלי לחשוף את הוזיקולות לכוחות צנטריפוגליים גבוהים. SEC מאפשרת הפרדה יעילה של EVs קטנים מחלבונים מסיסים ומזהמים בעלי משקל מולקולר נמוך, תוך שמירה על שלמות ופעילות ביולוגית של השלפונית. חשוב לציין, ש-SEC מאפשר הגדרה ברורה של חלקי ההלוט, ומאפשר זיהוי שחזורי של שברים מועשרים ב-EV ושיפור העקביות בין הניסויים12. עם זאת, תהליכי SEC דורשים אופטימיזציה קפדנית לדגימות שמקורן ברקמה, במיוחד בעיבוד רקמות במעלה הזרם, הסרת פסולת ואיסוף חלקיקים. כדי להתמודד עם מגבלות אלו, פיתחנו פרוטוקול שכפול וסטנדרטי לבידוד sEVs מ-SkM ו-BM. שיטה זו משלבת עיכול אנזימטי מבוקר לרקמות סיביות, צנטריפוגה דיפרנציאלית להסרת פסולת, וטיהור מבוסס SEC לבידוד ווסיקולות בעלות טוהר גבוה. תהליך העבודה מותאם במיוחד כדי למזער זיהום מרכיבים תוך-תאיים, תוך שמירה על שלמות הווסיקולות ואפשרות התאוששות עקבית מרקמות בעלות תפוקה נמוכה.

פרוטוקול זה ממלא פער מתודולוגי קריטי בכך שהוא מספק גישה מעשית וניתנת להרחבה לבידוד sEVs שמקורם ברקמה עם פרקציה מוגדרת וטוהר מאומת, המושגת באמצעות ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (NTA), ווסטרן בלוט של סמני EV קנוניים, מיקרוסקופיית אלקטרונים להערכה מורפולוגית, וניתוח EV חד-חלקיקי באמצעות לכידת נוגדנים, גודל אינטרפרומטרי ודימות פלואורסצנציה רב-ערוצי. הוא מתאים במיוחד למחקרים הדורשים ניתוח EV ספציפי לרקמה, שבהם וזיקולות שמקורן בנוזל ביולוגי אינן מספקות לזיהוי המקור התאי של אותות. חוקרים צריכים להשתמש בשיטה זו כאשר המטרה היא להשיג sEVs טוהרים מרקמות מוצקות עם זיהום מינימלי ושלמות שלמות של השלפוחיות השמירה. לעומת זאת, שיטות מבוססות אולטרה-צנטריפוגציה עשויות להיות מועדפות ליישומים בעלי תפוקה גבוהה שבהם הטוהר פחות קריטי, וניתן לבחור בגישות גרדיאנט צפיפות כאשר מבודדים תת-אוכלוסיות ספציפיות של EV למרות תפוקה נמוכה יותר. ביחד, פרוטוקול זה מספק מסגרת סטנדרטית לבידוד ואפיון של sEVs שמקורם ברקמות, ומאפשר ניתוחים מולקוליים, ביוכימיים ותפקודיים ניתנים לשחזור במורד הזרם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים לבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת מקגיל (DOUG10029) ובוצעו בהתאם להנחיות המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים.

1. פרוטוקול בידוד sEV (SkM-sEV) שמקורו ב-SkM

  1. איסוף דגימות ופירוק רקמות
    1. איסוף ושימור רקמות
      1. הקפיאו מיד לאחר הכריתה על ידי הטבילה במתילבוטאן מקורר מראש.
        הערה: להכנת מתילבוטאן מקורר מראש, הניחו מיכל מתילבוטאן באמבט קרח יבש והוסיפו בהדרגה חתיכות קטנות של קרח יבש ישירות לנוזל. אם נותנים לתמיסה להתקרר, הטמפרטורה בדרך כלל בטווח של −70°C עד −80°C. שמרו את המתילבוטאן באמבט קרח יבש במהלך השימוש כדי לשמור על הטמפרטורה. טבלו את הרקמה למשך כ-3–4 שניות עד שהיא קפואה לחלוטין, כפי שמעיד התקשות מלאה של הרקמה ואובדן גמישות.
      2. העבר את הרקמה לקריוביאלים.
      3. הנח את הדגימות על קרח יבש.
        הערה: אחסן את הדגימות בטמפרטורה של −80°C עד לעיבוד נוסף. הימנעו ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים. הקפאה מהירה במהירות משמרת למעשה רכבים חשמליים כאשר הדגימות אטומות כראוי. התייבשות או נזק לוסיקולות עלולות להתרחש אם הרקמות נשארות חשופות או עוברות מספר מחזורי הקפאה-הפשרה13.
    2. דיסוציאציה של רקמות
      הערה: בצע את כל השלבים בארון בטיחות ביולוגית באמצעות כלים סטריליים וכפפות כדי למנוע זיהום, שעלול לפגוע בטוהר הרכב החשמלי.
      1. רקמת משקל
        1. חטא פינצטה עם 70% אתנול ואפשר להם להתייבש באוויר.
        2. העבר את הרקמה הקפואה לצלחת תרבית השעיה שנשקלה מראש.
        3. שקלו את הרקמה באמצעות איזון מיליגרם (בדרך כלל ~80–120 מ"ג לדגימה, תלוי בגיל ובמין העכבר).
          הערה: הפרוטוקול מאומת עבור מסות רקמה נכנסות של ~80–120 מ"ג. לדגימות בטווח זה, השתמשו בנפחי המגיב המפורטים בשלבים 1.2.3.1, 1.3.1.3 ו-1.3.2.1 ללא שינוי. לדגימות מחוץ לטווח זה, יש להגדיל את כל נפחי התגובה באופן פרופורציונלי למסת הרקמה תוך שמירה על היחס המאומת בין RPMI-1640, קולגנאז D ו-DNase I (1000:40:4 מיקרוליטר ל-100 מ"ג רקמה). זה מתאים לכ-10 מיקרוליטר RPMI-1640, 0.4 מיקרוליטר קולגנאז D (מלאי 100 מ"ג/מ"ל), ו-0.04 מיקרוליטר DNase I (מלאי 20,000 U/mL) לכל מ"ג רקמה. שמור על פרופורציות אלו כדי לשמור על ריכוזי האנזים הסופיים בתגובה. יעילות העיכול ותפוקת ה-EV צריכות להיות מאומתות אמפירית כאשר עובדים מחוץ לטווח של 80–120 מ"ג.
        4. החזירו את הדגימה לצינור מקורר מראש ושמרו אותה על קרח.
      2. הכין אנזימים
        1. הפשרה של אליקוטים של קולגנאז D (מלאי 100 מ"ג/מ"ל) ו-DNase I (מלאי 20,000 U/mL) על קרח (ראו קובץ משלים 1, שלב 1.4 להכנת מלאי אנזימים). אנזימים אלו מתווספים בשלב 1.3.2.1 להשגת ריכוזי תגובה סופיים של 3.8 מ"ג/מ"ל קולגנאז D ו-77 U/mL DNase I. נפח העיכול הסופי הוא 1.044 מ"ל.
        2. ערבב DNase I בעדינות על ידי היפוך. אל תעשי מערבולת.
      3. הכנת רקמות לעיכול
        1. הוסיפו 800 מיקרוליטר RPMI-1640 לתבנית תרבית מתלים סטרילית המונחת על קרח.
        2. העבר את הרקמה למנה.
        3. חתכו את הרקמה ל-6–8 חתיכות בגודל אחיד בערך (2–3 מ"מ לכל צד) באמצעות סכין סטרילית חד-פעמית. ייצוב את הרקמה עם מלקחיים סטריליים במהלך החיתוך כדי להבטיח פיצול אחיד. השלים את השלב תוך דקה לדגימה כדי לשמור על עקביות בין הדגימות.
        4. השאירו את המנה על הקרח לאורך כל התהליך כדי למזער את ההתדרדרות.
    3. העברת רקמות ועיכול אנזימטי
      1. העברת רקמות
        1. גזום קצה פיפטת P1000 סטרילית באמצעות להב סטרילי ליצירת פתח בקוטר 2–3 מ"מ, מספיק למעבר חופשי של שברי הרקמה שנוצרו בשלב 1.2.3.3.
          הערה: לחלופין, יש להשתמש בקצות פיפטה רחבים (פתח רחב) בנפח 1 מ"ל הזמינים מסחרית, המספקים פתיחה סטנדרטית (בדרך כלל ~2–3 מ"מ קוטר פנימי) ומבטלים שונות הכרוכה בחיתוך ידני.
        2. העבר את שברי הרקמה ומדיום RPMI-1640 לצינורות 1.5 מ"ל מסומנים מראש באמצעות פיפטת P1000 המצוידת בקצה המותאם. בצע 2–3 שאיפות עוקבות כדי לשחזר שברים ומדיום שנותרו. בדקו ויזואלית את הצלחת ואת קצה הפיפטה לאחר ההעברה והשתמשו במלקחיים סטריליים כדי להעביר את השברים שנותרו כדי לוודא שאין רקמה נראית לעין.
        3. הוסף 200 מיקרוליטר RPMI-1640 לכל צינור.
      2. עיכול אנזימטי
        1. הוסף 40 מיקרוליטר של מלאי קולגנאז D (100 מ"ג/מ"ל) ו-4 מיקרוליטר של מלאי DNase I (20,000 U/mL) לכל צינור מאליקווטים שהופשרו על הקרח. זה מניב ריכוזים סופיים בתגובה של 3.8 מ"ג/מ"ל קולגנאז D ו-77 U/mL DNase I. לדגימות מחוץ לטווח של 80–120 מ"ג רקמה, יש להתאים את נפחי האנזימים באופן פרופורציונלי כפי שמתואר בהערה לאחר שלב 1.2.1.3.
          הערה: נפחים אלו מכוילים לגושי רקמה בטווח הטיפוסי של 80–120 מ"ג. עבור מסות רקמה מחוץ לטווח זה, יש להגדיל את כל נפחי התגובה באופן פרופורציונלי כפי שמתואר בהערה לאחר שלב 1.2.1.3 (מלאי של 0.4 מיקרוליטר קולגנאז D ו-0.04 מיקרוליטר DNase I לכל מ"ג רקמה), מה ששומר על אותם ריכוזי אנזימים סופיים בתגובה ללא קשר למסת הרקמה.
        2. הוסיפו את האנזימים לכל הדגימות בו-זמנית בעת עיבוד מספר דגימות שונות.
        3. השאירו את הצינורות על קרח בזמן הוספת האנזים.
        4. הפוך בעדינות את הצינורות כדי לערבב. אל תעשי מערבולת.
        5. דגרו את הצינורות בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות על מיקסר נוטים (24 סל"ד, זווית הטיה של 20°; ראו טבלת חומרים). ודאו ערבוב אחיד במהלך הדגירה.
          הערה: לעכל כל דגימה בנפח כולל של 1.044 מ"ל (1000 מיקרוL RPMI-1640, 40 מיקרוליטר קולגנאז D, ו-4 מיקרוליטר DNase I לכל דגימה; שקול ליחס ~25:1 של בופר-לקולגנאז).
    4. הסרת פסולת
      הערה: התחל איזון עמודת SEC בתחילת הצנטריפוגה הראשונה (שלב 1.4.1.1). עמודת ה-SEC דורשת 20–25 דקות לשטיפה ואיזון. שיווי משקל התחלתי בנקודה זו מבטיח שהעמודה מוכנה לטעינת דגימה מיד לאחר סיום שלב הסינון (שלב 1.4.3).
      1. הצנטריפוגה הראשונה
        1. צנטריפוגה את הדגימות בטמפרטורה של 300 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C כדי לשחרר פסולת לא מעוכלת, תאים שלמים ושברי רקמה שנותרו.
        2. העבר בזהירות את הסופרנטנט לצינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים חדשים בנפח 1.5 מ"ל מבלי להפריע לכדור.
      2. צנטריפוגה שנייה
        1. צנטריפוגה את הדגימות ב-2,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C כדי לפנות פסולת גדולה, תאים מתים, גופים אפופטוטיים ווזיקולות גדולות.
        2. העבר בזהירות את הסופרנטנט לצינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים חדשים בנפח 1.5 מ"ל מבלי להפריע לכדור.
          הערה: הצנטריפוגה השנייה היא אופציונלית ויש לכלול אותה כאשר נדרשת הסרת פסולת נוספת. בצע שלב זה אם הסופרנטנט נראה עכור לעין או מכיל שאריות חלקיקים לאחר הצנטריפוגה הראשונה. שלב זה מומלץ גם אם ההכנות הקודמות הראו זיהום מסמנים תוך-תאיים (כגון Calnexin או BiP) בחלקי SEC מועשרים ב-EV או נוכחות חלקיקים לא-וזיקולריים במיקרוסקופ אלקטרוני מעבר. הצורך בשלב זה צריך להיות מאומת במהלך אופטימיזציה ראשונית של הפרוטוקול לכל סוג רקמה.
      3. סינון
        1. מסנני תאים סטריליים של 30 מיקרון שהיו רטובים מראש על ידי שטיפתם ב-RPMI-1640 כדי לאזן את הממברנה ולמזער אובדן דגימה. זרוק את השטיפה.
        2. סיננו כל דגימה דרך מסננת תאים רטובה מראש בנפח 30 מיקרומטר לצינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים ובעלי קישור חלבון נמוך בנפח 1.5 מ"ל, כדי להסיר פסולת תאית וחלקיקים גדולים לפני SEC.
        3. אפשר לדגימות לעבור דרך המסנן באמצעות כוח הכבידה.
        4. יש לאפשר 10–15 דקות לכל דגימה לסינון.
          הערה: הסינון מסתיים כאשר לא נותר נוזל נראה לעין מעל ממברנת המסנן ונפח הסינון בצינור האיסוף התייצב. אם הסינון איטי יותר או נעצר, הדבר עשוי להעיד על סתימה עקב שאריות לכלוך; במקרים כאלה, שקול לחזור על שלב ההבהרה או להפחית את עומס הדגימה.
        5. אסוף 550–600 מיקרוליטר של סופרנטנט מסונן לטעינה נוספת על עמודת ה-SEC. לעקביות בין הדגימות, נרמול נפח הטעינה ל-500 מיקרוליטר לכל עמודה (ראה שלב 2.2.1), ללא קשר לנפח הכולל שנשבר.
  2. כרומטוגרפיה של הוצאת גודל (SEC)
    1. איזון עמודת ה-SEC
      הערה: בצע את השלב הזה במהלך הצנטריפוגציה אם אפשר.
      1. שטוף את עמודת ה-SEC ב-17 מ"ל של 1× PBS (0.22 מיקרון).
      2. אפשר לכל הנפח לעבור דרך העמודה בכוח הכבידה בקצב זרימה צפוי של 0.75 מ"ל/דקה (סה"כ 20–25 דקות לנפח השטיפה של 17 מ"ל). קצבי זרימה מהירים או איטיים יותר עשויים להעיד על איזון או חסימה לא תקינה בעמודה.
      3. שמרו על העמודה ו-PBS בטמפרטורת החדר (RT, 21°C ±-2°C) במהלך שיווי המשקל כדי להבטיח קצב זרימה עקבי וביצועים מיטביים של העמודה.
      4. הכינו צינורות מיקרוצנטריפוגה בקוטר 1.5 מ"ל עם חיבור חלבון נמוך לאיסוף כל החלקים.
      5. הכינו צינור נוסף לאיסוף נפח הריק במידת הצורך.
    2. טעינת דגימה והלושן
      1. טעין 500 מיקרוליטר של סופרנטנט מסונן על עמודת ה-SEC.
      2. אפשר לדגימה להיכנס במלואה לשרף. הנקודה הסופית מגיעה כאשר המניסקוס הנוזלי מגיע לפני משטח מיטת השרף, כאשר לא נשאר נוזל נראה לעין מעל השרף בעוד שהשרף נשאר רטוב לעין.
      3. אין לתת למניסקוס ליפול מתחת לפני השרף או לעמוד להתייבש, שכן זה מכניס אוויר למשטח השרף ומפריע לשחרור. כאשר המניסקוס הנוזלי מגיע למשטח השרף (כפי שמוגדר בשלב 2.2.2), יש להמשיך מיד לשלב 2.2.4 ללא דיחוי.
      4. מיד הוסיפו 2 מ"ל PBS כדי להתחיל את ההסרה.
      5. אסוף את נפח הריק (~2.5 מ"ל).
      6. השליכו את נפח הריק או שמרו עליו כשבר שאינו EV.
      7. התחל לאסוף את החלק המועשר ב-EV מיד לאחר שנפח הריק של 2.5 מ"ל התפוגג.
      8. אספו סך של 1.6 מ"ל של אלואט מועשר ב-EV לאחר נפח הריק, בין אם כשבר רציף יחיד בצינור אחד או כשברים סדרתיים שמאוגדים לאחר מכן.
      9. חלופה נוספת היא לאסוף שברים סדרתיים של 0.4 מ"ל כדי למקסם טוהר לעומת תפוקה. נפחי חלקיקים קטנים יותר מומלצים כאשר נדרש טוהר גבוה יותר (למשל, לניתוחים פרוטאומיים או יישומים רגישים במורד הזרם), בעוד ששברים גדולים יותר עשויים לשמש למקסום תפוקת EV הכוללת.
      10. העריך שברים להעשרת EV באמצעות שיטות אפיון (למשל, Western blot לסמנים ומזהמים של EV, ו-NTA), ואגד שברים מועשרים ב-EV כפי שהוגדרו בסעיף האפיון.
        הערה: שמרו על זרימת הטור באופן רציף. כאשר חלק אחד מסתיים, הוסיפו PBS כדי לשמור על נוזל קבוע מעל משטח השרף ולמנוע מהעמודה להתייבש. השתמשו בחצוצרות דלות חלבון וללא נוקלאז לאיסוף.
    3. ריכוז
      1. ריכזו דגימות EV באמצעות מסננים צנטריפוגליים (חיתוך משקל מולקולרי של 100 kDa [MWCO]) ליישומים במורד הזרם (למשל, ריצוף RNA, פרוטאומיקה או ווסטרן בלוט).
      2. שטוף מראש את המסננים עם PBS לפני השימוש.
      3. צנטריפוגה את הדגימות בטמפרטורה של 4,000 × גרם בטמפרטורה של 4°C, תוך בדיקה כל 2–3 דקות עד שמגיעים לנפח הסופי הרצוי (בדרך כלל 50–100 מיקרוליטר). השתמש בנפחים סופיים נמוכים יותר (למשל, ~50 מיקרוליטר) ליישומים הדורשים ריכוז גבוה ונפחים גבוהים יותר (למשל, ~100 מיקרוליטר) כאשר מועדף למקסם את ההתאוששות.
        זהירות: הימנעו מריכוז יתר על ידי הפסקת הצנטריפוגה לאחר השגת נפח היעד.
      4. החזר את הרנטאט באמצעות פיפטינג עדין.
      5. רשמו נפחי דגימות לפני ואחרי הריכוז כדי להעריך את ההתאוששות, במידת הצורך. ניתן להשתמש ב-NTA להערכת ריכוז חלקיקים לפני ואחרי ריכוז, אם קיים.
    4. אחסון
      1. שמרו את החלקים המועשרים ב-EV על הקרח או בטמפרטורה של 4°C לבדיקות מיידיות (למשל, NTA ומיקרוסקופיית אלקטרונים שידור [TEM]) ועבדו תוך 24 שעות עבור TEM ובתוך 48 שעות עבור NTA.
      2. דגימות Aliquot EV לצינורות קושרים חלבונים לצורך אחסון.
      3. אחסן דגימות בטמפרטורה של −80°C לשימוש ארוך טווח.
      4. הימנעו ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים.

2. פרוטוקול בידוד sEV שמקורו ב-BM (BM-sEV)

  1. איסוף דגימות ופירוק רקמות
    1. איסוף ושימור רקמות
      1. אין להקפיא את העצמות מיד לאחר הכריתה, שכן זה מקשיח את מח העצם ומקשה על ההוצאה בשיטת הצינור הדקיר. במקום זאת, שמרו את העצמות על קרח או בטמפרטורה של 4°C במהלך תקופות טיפול קצרות לפני עיבוד או הקפאה כפי שמתואר בשלב 3.1.1.4 (הנחת קרח יבש לפני אחסון של −80°C).
      2. הסר את השרירים והרקמות המחברות מסביב מעצמות שנחתכו.
      3. העבר את העצמות לקריוביאלים.
      4. הנח את הדגימות על קרח יבש.
        הערה: אחסן את הדגימות בטמפרטורה של −80°C עד לעיבוד נוסף.
    2. עיבוד BM
      הערה: בצע את כל השלבים בארון בטיחות ביולוגית באמצעות כלים סטריליים וכפפות כדי למנוע זיהום, שעלול לפגוע בטוהר הרכב החשמלי.
      1. שקול מראש ותוייג צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"ל לפני הוספת חומר כלשהו. חשב את מסת ה-BM על ידי השוואת משקלים של הצינורות לפני ואחרי החילוץ.
      2. הכינו את מערכת הצינור הדקור על ידי הכנסת צינור PCR בנפח 0.2 מ"ל (הפקק שלם) לתוך צינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל עם התאמה הדוקה היטב. נקב את תחתית צינור ה-0.2 מ"ל פעם אחת עם מחט סטרילית של 16 גרם המוחזקת בניצב לבסיס, ויוצר חור אחיד בקוטר~1.6 מ"מ. הכן מערכת אחת לכל רגל לכל עכבר.
      3. הניחו את הרגל, שננקתה מכל השרירים והרקמות הסובבות, בצלחת פטרי סטרילית.
      4. הפריד את עצם הירך והטיביה על ידי חיתוך דרך מרחב המפרק.
      5. חתוך את שני קצות הירך והשוק כדי לחשוף את מח העצם האדום. הכניסו את העצמות לצינור ה-PCR המנוקב הממוקם בתוך צינור ה-1.5 מ"ל ואטום את ההרכבה בפארפילם כדי להבטיח התקנה בטוחה במהלך הצנטריפוגה.
      6. צנטריפוגה את הדגימות למשך 10 שניות במיקרוצנטריפוגה על שולחן בטמפרטורה של כ-8,000 × גרם, או ההגדרה הקרובה ביותר האפשרית במכשיר, בטמפרטורת החדר.
      7. יש לאמת חילוץ מוצלח של מח עצם באמצעות שלושה קריטריונים: (i) העצמות נראות לבנות לעין ללא מח עצם אדום שארתי, (ii) הכדור בצינור התחתון נראה אדום כהה ודחוס, בדרך כלל ממלא את קצה החרוט של צינור ה-1.5 מ"ל, ו-(iii) מסת מח העצם הנמדדת (שלב 3.1.2.9) נמצאת בטווח הצפוי של ~15–30 מ"ג לעכבר.
      8. ממקמים מחדש או חתכו מחדש את העצמות וחזרו על הסיבוב הקצר אם מח עצם אדום נראים לעין בתוך העצם.
      9. שקלו שוב את החצוצרות כדי לקבוע את מסת מח העצם המופק (בדרך כלל ~15–30 מ"ג לדגימה, בהתאם לגיל העכבר, מין ויעילות החילוץ).
        הערה: הפרוטוקול מאומת לתפוקות מח עצם של ~15–30 מ"ג לדגימה. מכיוון שנפח ההשעיה מחדש של RPMI-1640 נשמר קבוע ב-250 מיקרוליטר ללא קשר למסת מח העצם (שלב 3.1.2.10), תפוקת ה-EV מנורמלת למסת מח העצם ההתחלתי הנמדדת במהלך ניתוח הזרם (חלקיקים·מ"ל−1·מ"ג−1 רקמה). לדגימות מתחת ל-15 מ"ג בהרבה, אסוף מח עצם מעכברים תואמים (באותו גיל, מין ועצם) לפני ההשעיה מחדש כדי לשמור על קלט מספק לאפיון בהמשך הזרם. לדגימות מעל 30 מ"ג, יש לפצל את מח העצם לשני תליות נפרדות של 250 מיקרוליטר כל אחת או להגדיל את נפח RPMI-1640 באופן יחסי (~12.5 מיקרוליטר למ"ג מח עצם) כדי למנוע השעיה מחדש לא שלמה; בכל מקרה, יש להחיל את אותה נרמול לפי מסה במהלך הניתוח.
      10. הוסף 250 מיקרוליטר RPMI-1640 לכל שפופרת. שמור על נפח קבוע בין דגימות ללא קשר למסת מח העצם כדי לאפשר נרמול של תפוקת EV למסת מח עצם התחלתית. תשאירו את הדגימות על הקרח.
      11. החזירו את מח העצם על ידי פיפטה עדינה למעלה ולמטה 10–15 פעמים באמצעות פיפטת P1000 עד שההשעיה נראית הומוגנית ויזואלית, ללא גושים נראים או שברי רקמה שלמים שנותרו. הימנע מפיפטינג חזק או יצירת בועות, שעלולות לפגוע בשלמות הווסיקולות.
  2. הסרת פסולת
    1. הצנטריפוגה הראשונה
      1. צנטריפוגה את הדגימות בטמפרטורה של 300 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C כדי לשחרר פסולת לא מעוכלת, תאים שלמים ושברי רקמה שנותרו.
      2. העבר בזהירות את הסופרנטנט לצינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים חדשים בנפח 1.5 מ"ל מבלי להפריע לכדור.
    2. צנטריפוגה שנייה
      1. צנטריפוגה את הדגימות ב-2,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C כדי להסיר פסולת גדולה.
      2. העבר בזהירות את הסופרנטנט לצינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים חדשים בנפח 1.5 מ"ל מבלי להפריע לכדור.
    3. צנטריפוגציה שלישית
      1. צנטריפוגה את הדגימות בעוצמה של 10,000 × גרם למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C כדי להסיר גופים אפופטוטיים ווסיקולות גדולות.
      2. העבר בזהירות את הסופרנטנט לצינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים חדשים בנפח 1.5 מ"ל מבלי להפריע לכדור.
      3. ודא שמתקבל נפח סופי של 200 מיקרוליטר סופרנטנט.
  3. כרומטוגרפיה של הוצאת גודל (SEC)
    1. הכנת עמודה
      1. איזון עמודת ה-SEC על ידי שטיפה של 6 מ"ל של 1× PBS (0.22 מיקרומטר מסונן).
        הערה: נפח האיזון הוא ספציפי לעמודה וצריך להתאים לסוג העמודה המופיע בטבלת החומרים. עמודה זו דורשת נפח איזון של 6 מ"ל, השונה מהעמודה המשמשת לדגימות SkM.
      2. אפשר לכל הנפח לעבור דרך כוח הכבידה.
      3. שמרו על עמודה ו-PBS ב-RT במהלך שיווי המשקל כדי להבטיח קצב זרימה אופטימלי וביצועי עמודה.
    2. טעינת דגימה והלושן
      1. העמיס 150 מיקרוליטר של סופרנטנט מסונן על עמודת ה-SEC.
      2. אפשר לדגימה להיכנס במלואה לשרף. נקודת הסיום מושגת כאשר המניסקוס הנוזלי מגיע לפני שטח מיטת השרף, ללא נוזל נראה לעין מעל השרף, בעוד שהשרף נשאר רטוב (כפי שמתואר בשלב 2.2.2).
      3. אין לאפשר למניסקוס לרדת מתחת לפני השרף או לעמוד להתייבש (ראו נקודת קצה מוגדרת בשלב 3.3.2.2), שכן זה מכניס אוויר למיטת השרף ומפריע לשחרור. כאשר המניסקוס הנוזלי מגיע לפני השרף, יש להמשיך מיד לשלב 3.3.2.4 ללא דיחוי.
      4. מיד הוסיפו 550 מיקרוליטר PBS כדי להתחיל את השחרור.
      5. אסוף את נפח הריק (700 מיקרוליטר).
      6. השליכו את נפח הריק או שמרו עליו כשבר שאינו EV.
      7. התחל לאסוף את החלק המועשר ב-EV מיד לאחר שנפח הריק של 700 מיקרוליטר התפרץ.
      8. אסוף 850 מיקרוליטר של אלואט מועשר ב-EV לאחר נפח החלל של 700 מיקרוליטר.
      9. חלופה נוספת היא לאסוף שברים רציפים של כ-170 מיקרוליטר כדי למקסם את הטוהר לעומת התפוקה.
        הערה: מומלץ להשתמש בנפחי חלקים קטנים יותר כאשר נדרש טוהר גבוה יותר (למשל, לניתוחים פרוטאומיים או יישומים רגישים במורד הזרם), בעוד שברים גדולים יותר עשויים לשמש למקסום תפוקת ה-EV הכוללת.
      10. הערכו שברים עבור סמנים חשמליים ואספו שברים מועשרים ברכבים חשמליים לפי הצורך.
        הערה: שמרו על זרימת הטור באופן רציף. כאשר חלק אחד מסתיים, הוסיפו PBS כדי לשמור על נוזל קבוע מעל משטח השרף ולמנוע מהעמודה להתייבש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להעריך את יעילות הפרוטוקול הזה לבידוד sEVs שמקורם ברקמה, מוצגות תוצאות מייצגות מדגימות SkM ו-BM. בידוד מוצלח הוגדר על ידי (i) העשרה של סמני EV קנוניים (TSG101, CD63, CD81 ו-CD9) בשברים מוקדמים של SEC, (ii) זיהוי מינימלי של מזהמים תוך-תאיים (למשל, Calnexin ו-BiP), (iii) התפלגות גודל חלקיקים חד-מודלית עם רוב החלקיקים <200 ננומטר), (iv) הדמיה של וזיקולות שלמות וקשורות לממברנה באמצעות TEM, ו-(v) ריכוז חלקיקים גבוה יותר בחלקיקים מועשרים-EV לעומת שברים עשירים בחלבון מאוחרים יותר. אפיון נוס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר גישה חזקה וניתנת לשחזור לבידוד תכשירים מועשרים ב-sEV ישירות מ-SkM ו-BM, שתי רקמות בעלות תפוקה נמוכה והטרוגניות מאוד. בעוד שבידוד EV מבוסס היטב עבור נוזלים ביולוגיים ומערכות תרבית תאים, שיטות סטנדרטיות לנוזלים חשמליים שמקורם ברקמה נותרו מוגבלים בשל אתגרים הקשורים לפירוק רקמות, זיהום מחומר תוך-תאי ושונות בתפוקה. כאן, נפרט צעדים קריטיים, אסטרטגיות פתרון תקלות ומגבלות המשפיעות על טוהר רכבים חשמליים, תפוקה ויכולת שחזור, עם שיקולים ספציפיים להכנות ל-SkM ו-BM. החלקים המועשרים ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

אנו מודים לג'ני יאנג, דריוש ז'וראווק וולודימיר ירקו על הסיוע הטכני והדיונים המועילים. אנו מודים לפלטפורמת מרכז הננו-רפואה היישומית, במיוחד נדים טאוויל ולורה מונטרמיני, על התמיכה באפיון ואיסוף נתונים של שלפוחיות חוץ-תאיות. אנו מודים גם לצוות מתקן החיות, גייליין גדורי וטארה תומסון, על עזרתם בטיפול בעכברים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1.5 mL צינור צנטריפוגהSarstedt72.690.300צינור מיקרו-צנטריפוגה כללי המשמש לאורך הפרוטוקול
צינור בעל קישור חלבון נמוך 1.5 מ"לSarstedt72.706.600משמש לטיפול ב-EV, איסוף שבר SEC ואחסון
צינור PCR 0.2 מ"לFisher Scientific14-222-262משמש להתקנת חילוץ מח העצם בצינור מחורר
מחט 16 GBD305197משמש לנקב צינור ה-PCR 0.2 מ"ל
מסנן תאים 30 µmMiltenyi Biotec 130-098-458משמש לסינון דגימות שרירים שלד
70% אתנולSigma-Aldrich1.11727משמש לעיקור פינצטה
ארון בטיחות ביולוגיתNANAמשמש לטיפול רקמות סטרילי
כלי חיתוך עצםFisher Scientific10-001-976משמש להפרדת עצם הירך והשוקה וחשיפת המח
אלבומין בקט פרה (BSA)BioShopALB001משמש לחסימת Western blot ודילול נוגדנים
כלוריד סידן די-הידרט (CaCl2·2H2O)BioShopCCL302משמש להכנת מאגר HEPES
סורג נחושת מצופה פחמן, 200-meshSigma-Aldrich930342משמש להכנת דגימות TEM
מסנן צנטריפוגלי, 100 kDa MWCOMilliporeSigmaUFC810096משמש לריכוז EV
קולאגנאז DRoche11088858001משמש לעיכול אנזימטי של שרירים שלד
CryovialSarstedt72.690.300משמש לאחסון רקמות ועצמות
מים דיוניזים (טהורים במיוחד)NANAמשמש להכנת מאגר ושלבי שטיפת TEM
DNase IRoche11284932001משמש לעיכול אנזימטי של שרירים שלד
קרח יבשNANAמשמש לקירור דגימות והובלה
תשעה אורגני מוגבר לזיהוי כימילומינסנציהBiorad1705061משמש לזיהוי Western blot
יחידת סינון, 0.22 µmSarstedt83.3941.501משמש לסינון PBS במידת הצורך
מלקט / פינצטהMilliporeSigmaF3892משמש לטיפול ברקמות
גלוטראלדהידNANAמשמש לקיבוע TEM
גליציןNANAמשמש בשלבי שטיפת סורג TEM
תמיסת מלח מאוזנת של HankGibco14175-095משמש להכנת מלאי DNase I
HEPESBioShopHEP001.500משמש להכנת מאגר HEPES-NaOH
סטרפטאבידין מחובר לחומצה פראוקסידאזThermo FisherS911משמש לזיהוי Western blot
מערכת הדמיה לכימילומינסנציהBiorad12003153משמש להדמיית ממברנות Western blot
KClBioShopPOC308משמש להכנת מאגר HEPES
כלוריד מגנזיום (MgCl2)BioShopMAG510.500משמש להכנת מאגר HEPES
2-מתיל-בוטאןThermo Fisher78-78-4משמש להקפאה מהירה של שרירים שלד
מאזני מיליגרםMilliporeSigmaZ741359משמש לשקלול רקמות ומח
NaClBioShopSOD004.1משמש להכנת מאגר HEPES
מכשיר לניתוח עקיבה של ננו-חלקיקיםMalvern PanalyticalNanoSight NS300NanoSight NS300 המשמש לגודל וספירת חלקיקים
NaOHBioShopSHY500.500משמש לכיול pH
ממברנת נייר נייטרוצלולוזהBioRad1704271משמש להעברת Western blot
מתנדןLabnet S0500משמש במהלך העיכול האנזימטי
פיפטה P1000MilliporeSigmaFA10006M-1EAמשמש להעברת רקמות
קצה פיפטה, 1 מ"לSarstedt70.3050.275הקצה מקוצץ כדי להרחיב את הפתח להעברת שברי רקמות
פוספט באפ סולין (PBS)WisentINC 811.012-FLמשמש לאורך הפרוטוקול; משמש גם להשוואת SEC והזרמה
מעכב פוספטאזMilliporeSigma4906845001משמש להכנת לייזה ל-Western blot
כלי פטריMilliporeSigmaCLS351146משמש להכנת מח העצם
ג'ל פוליאקרילאמיד, 4–20% מדרגת חינם מכתיםBioRad4561094משמש להפרדה של Western blot
מעכ

מקורות

  1. Whitham, M., et al. Extracellular vesicles provide a means for tissue crosstalk during exercise. Cell Metab. 27 (1), 237-251.e4 (2018).
  2. Kumar, M. A., et al. Extracellular vesicles as tools and targets in therapy for diseases. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 27 (2024).
  3. Fonseka, P., Mathivanan, S. Extracellular vesicles biogenesis, cargo sorting and implications in disease conditions. Cells. 12 (2), (2023).
  4. Taraboletti, G., et al. Bioavailability of VEGF in tumor-shed vesicles depends on vesicle burst induced by acidic pH. Neoplasia. 8 (2), 96-103 (2006).
  5. Dakup, P. P., et al. Challenges and opportunities in state-of-the-art proteomics analysis for biomarker development from plasma extracellular vesicles. Proteomics. , (2025).
  6. Li, Y., et al. EV-origin: Enumerating the tissue-cellular origin of circulating extracellular vesicles using exLR profile. Comput Struct Biotechnol J. 18, 2851-2859 (2020).
  7. Shero, J. A., Lindholm, M. E., Sandri, M., Stanford, K. I. Skeletal muscle as a mediator of interorgan crosstalk during exercise: Implications for aging and obesity. Circ Res. 136 (11), 1407-1432 (2025).
  8. Vanhie, J. J., et al. The role of exercise- and high-fat diet-induced bone marrow extracellular vesicles in stress hematopoiesis. Front Physiol. 13, 1054463 (2022).
  9. Pinto, A. C., et al. Exploiting the therapeutic potential of contracting skeletal muscle-released extracellular vesicles in cancer: Current insights and future directions. J Mol Med (Berl). 102 (5), 617-628 (2024).
  10. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404 (2024).
  11. De Sousa, K. P., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles and future directions in diagnosis and therapy. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 15 (1), e1835 (2023).
  12. Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. J Extracell Vesicles. 10 (11), e12145 (2021).
  13. Ahmadian, S., et al. Different storage and freezing protocols for extracellular vesicles: A systematic review. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 453 (2024).
  14. Watanabe, S., et al. Skeletal muscle releases extracellular vesicles with distinct protein and microRNA signatures that function in the muscle microenvironment. PNAS Nexus. 1 (4), pgac173 (2022).
  15. Magalhaes-Gama, F., et al. Exploring cell-derived extracellular vesicles in peripheral blood and bone marrow of B-cell acute lymphoblastic leukemia pediatric patients: Proof-of-concept study. Front Immunol. 15, 1421036 (2024).
  16. Potter, D. R., et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles attenuate pulmonary vascular permeability and lung injury induced by hemorrhagic shock and trauma. J Trauma Acute Care Surg. 84 (2), 245-256 (2018).
  17. Osteikoetxea, X., et al. Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations. Org Biomol Chem. 13 (38), 9775-9782 (2015).
  18. Kim, T., Hong, J. W., Lee, L. P. Efficient methods of isolation and purification of extracellular vesicles. Nano Converg. 12 (1), 45 (2025).
  19. Bracht, J. W. P., et al. Choice of size-exclusion chromatography column affects recovery, purity, and miRNA cargo analysis of extracellular vesicles from human plasma. Extracell Vesicles Circ Nucl Acids. 5 (3), 497-508 (2024).
  20. Mo, W., et al. Extracellular vesicle-mediated bidirectional communication between the liver and other organs: Mechanistic exploration and prospects for clinical applications. J Nanobiotechnology. 23 (1), 190 (2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Western Blotting
בידוד וזיקולות חוץ-תאיות קטנות משריר השלד של עכברו וממח עצם באמצעות כרומטוגרפיה של הוצאת גודל
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.