הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שילוב חדש של נוגדי חמצון לשיקום תקשורת בין-תאית בריאה במודל חוץ גופי באמצעות מדיום מותנה מתאים זקנים

214 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70923

⸱

24 באפריל 2026

 , 
1Biotechnology Unit, Mesoestetic Pharma Group

במאמר זה

סיכום

שיטה זו חוקרת כיצד פיברובלסטים של עור מזדקנים משפיעים על הבריאים. הזדקנות מושרה מחשיפה ל-UVB, והמדיום המותאם מיושם על פיברובלסטים רגילים. היא מסייעת להעריך תרכובות ביואקטיביות המיועדות לשינוי בתקשורת תא לתא בהזדקנות העור.

תקציר

הזדקנות העור היא תהליך רב-גורמי המונע על ידי שינויים ברמה המולקולרית והתאית, הידועים גם כסימני ההזדקנות. אחד מהשינויים הללו כולל שינוי בתקשורת בין-תאית, התורם לתפקוד לקוי של רקמת העור ולנזק מבני. כאן מוצג מודל במבחנה לחיקוי תכונות הזדקנות העור הללו על ידי דגירה של פיברובלסטים בריאים עם מדיום מותאם מפיברובלסטים מזדקנים. ראשית, ניתן לנתח פיברובלסטים מוארים מ-UVB לשינויים בביטוי גנים הקשורים לפוטו-אייג'ינג. שנית, מדיום מותאם מפיברובלסטים זקנים המושרים על ידי UVB יכול להיאסף ולהעביר לפיברובלסטים בריאים, מה שמוביל להורדת ויסות חלבוני מטריצה חוץ-תאיים ולהגברת ביטוי גנים פרו-דלקתיים של ציטוקינים. שינויים אלו מנוטרלים באמצעות שילוב חדש של נוגדי חמצון (ויטמין C + אידבנון). תוצאות אלו מראות כי ניתן להשתמש במודל ה-in vitro להערכת היעילות של תרכובות חדשות על תכונות הזדקנות תאי עור בעור, וכך לבחירת תרכובות שעשויות לווסת תהליכים תאיים של התחדשות והתחדשות העור.

מבוא

הזדקנות העור היא תהליך טבעי של ירידה בתפקוד ובתכונות העור, כולל אובדן קשיחות ואלסטיות והגברת השקיעה. הדבר מואץ על ידי גורמים חיצוניים, כגון חשיפה לאולטרה סגול (UV) וזיהום, הפוגעים בתאים וגורמים לשינויים ברמההמולקולרית 1. שינויים אלו תוארו היטב במחקרים עדכניים וזוהו כסימני היכר של הזדקנות, כולל חוסר יציבות גנומית, שחיקה טלומרית, שינויים אפיגנטיים, אובדן פרוטאוסטזיס, מקרואוטופגיה פגומה, חוסר ויסות של חישה מזינתית, תפקוד לקוי של מיטוכונדריה, הזדקנות תאית, תשישות תאי גזע, שינוי בתקשורת בין-תאית, דלקת כרונית ודיסביוזה2. תכונות אלו מסבירות כיצד נזק תת-תאי מתורגם לתפקוד לקוי של הרקמות, ובכך תורם לתהליך ההזדקנות. מעניין לציין ששינויים אלו אינם פועלים באופן עצמאי אלא יוצרים חתימת רשת תלויה זו בזו. נזק ראשוני, כגון נזק גנומי או שינויים אפיגנטיים, מצטבר ולבסוף גורם להזדקנות תאית. במקרה של העור, זה נגרם בעיקר מנזק UV, כאשר פוטו-אייג'ינג הוא הגורם העיקרי לתכונות הזדקנות העור3. תאים מזדקנים מראים ייצור מוגבר של ציטוקינים פרו-דלקתיים, מטלופרוטינאזים מטריציוניים וגורמי גדילה, הידועים גם כפנוטיפ הפרשה הקשור להזדקנות (SASP) וכוללים את IL6, IL8, MMP1, MMP3, TNFA או IL1A, בין היתר 4,5,6. גורמים מופרשים אלה לא רק משפיעים על התכונות המבניות של העור, כגון המטריצה החוץ-תאית הדרמלית, אלא גם משבשים את תפקוד התאים הסובבים. זה כולל שחרור ציטוקינים המעודדים הפעלת מלנוציטים כדי לעורר היפרפיגמנטציה עורית הקשורה לגיל (כגון גורם תאי גזע או IL18) או חלבונים מזיקים אחרים שמשנים את תפקוד הפיברובלסטים הבריאים הסובבים, פוגעים בתפקודם ותורמים להגברה מוגברת של הפנוטיפ המזדקן 7,8,9,10,11. כתוצאה מכך, דלקת כרונית ותקשורת בין-תאית משתנה הם גורמים מרכזיים למצב המזיק שמתרגם שינויים מולקולריים אלה לסימנים ויזואליים של הזדקנות העור, כגון קמטים, שקיעה, כתמי גיל או אובדן נוקשות.

החלבונים הספציפיים התורמים להשפעות המזיקות של SASP ניתנים לחקור באמצעות טכניקות מוכרות כגון בדיקת אימונוסורבנט מקושרת באנזים (ELISA), Luminex, תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qRT-PCR) או Western Blot, בין היתר 5,12. עם זאת, גישה זו שימושית לזיהוי חלבונים ספציפיים מנקודת מבט אישית ולאפיון מנגנון פעולה מסוים, אך אינה מתחשבת בהשפעות ה-SASP המלא על תאים שכנים. כאן מוצע פרוטוקול במבחנה לחקר השפעת ה-SASP שנוצר על ידי פיברובלסטים דרמליים זקנים המושרים על ידי UVB על פיברובלסטים סמוכים בריאים, המדמה את סימן התקשורת הבין-תאית המשתנה של ההזדקנות. כאמור קודם, UV הוא הגורם העיקרי להזדקנות התאים בעור. לכן, נזקי UV נבחרים כמקור נזק על פני הזדקנות שכפולה או מונעת אונקוגן כדי לבנות את מודל3 הנוכחי. לשם כך, משתמשים במדיום המכיל את הגורמים המופרשים על ידי פיברובלסטים זקנים (מדיום מותן), וסמני תפקוד התא מוערכים בפיברובלסטים בריאים שדוגרו עם מדיום זה. על פי פרוטוקול זה, לאחר שהתחום המותנה הועבר מתאים זקנים לתאים בריאים, נאספים פיברובלסטים זקנים המושרים על ידי UVB כדי לכמת תכונות מולקולריות, כגון גנים המעורבים באיתות פרו-דלקתי ופראקריני. שנית, פיברובלסטים בריאים שטופלו במדיום מותאם מפיברובלסטים מזדקנים נקצרים כדי לאפיין את השפעת ה-SASP על תאים סמוכים, ולכמת גנים המעורבים במטריקס חוץ-תאי, גורמי גדילה והפעלת פיברובלסטים. לכן, השפעת התרכובות המעניינות (COI) מנותחת הן בתחילה בפיברובלסטים מזדקנים והן בפיברובלסטים בריאים שטופלו במדיה המותנית. לגבי תרכובות אלו, מחקרים קודמים הראו כי נוגדי חמצון יעילים בהגנה ותיקון סימנים של הזדקנות עור הנגרמת מפוטו-אייג'ינג. כתוצאה מכך, השילוב של שני נוגדי חמצון (ויטמין C ואיידבנון) משמש להחזרת חלק מהשינויים שנגרמו על ידי UVB, הן בתאים מזדקנים והן בתאים בריאים שמודגרים במדיום מותנה מתאים זקנים 13,14,15

בסך הכול, פרוטוקול זה נועד לחקור את השפעות SASP על תאי עור ולזהות מולקולות/התערבויות חדשות שמחזירות תקשורת בין-תאית שהשתנתה, ובכך להתאים למוצרים רגנרטיביים וביו-גירויים ברפואה אסתטית ובדרמטולוגיה רגנרטיבית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פיברובלסטים עורמיים אנושיים ששימשו במחקר זה התקבלו מספק מסחרי של קווי תאים. מכיוון שלא היו מעורבים דגימות ראשוניות אנושיות, נתוני מטופלים או ניסויים ב-invivo , לא נדרשו אישור ועדת הביקורת המוסדית (IRB) והסכמה מדעת למחקר זה.

1. השראת הזדקנות בפיברובלסטים דרמליים באמצעות UVB

  1. פיברובלסטים דרמליים אנושיים בצפיפות של 6 × 10תאים לבאר בלוח עם 6 בארות באמצעות Modified Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco, בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS).
  2. לאחר 24 שעות, הסר את מדיום תרבית התאים והחלף אותו ב-1 מ"ל של מלח מפוזר פוספט (PBS) לכל באר.
  3. הקרינו את התאים באור UVB בעוצמה של 25 mJ/cm.
    הערה: אנרגיה זו מותאמת למכשיר הקרינה UVB המשמש בפרוטוקול זה (ראו טבלת חומרים) כדי לגרום לנזק מספק כדי לגרום להזדקנות תוך הימנעות מנזק מופרז שעלול להוביל לאפופטוזיס. בעת שימוש במכשירים אחרים, כוון את אנרגיית ההקרנה בהתאם.
    זהירות: קרינת UVB מסוכנת. השתמשו בציוד מגן מתאים ובמיגון כדי להימנע מחשיפה.
  4. הסר את PBS והוסיף 2 מ"ל מדיום תרבית תאים טרי לכל באר.
  5. לאחר 72 שעות, הסרת מדיום תרבית התאים, הוספת 1 מ"ל PBS לכל באר, וחזרה על הקרנת UVB כפי שמתואר בשלב 1.3.
  6. לאחר 72 שעות, הסר את מדיום תרבית התאים והוסיף 0.5 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA לכל באר. דגר למשך 1–2 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ואז קצור את התאים באמצעות 1.5 מ"ל של מדיום תרבית תאים טרייה.
  7. הצלחתי את התאים בצפיפות של 8 × 10תאים בארבעה תאים בכל באר בלוח עם 6 בארות באמצעות מדיום תרבית תאים (DMEM בתוספת 10% FBS). הזדקנות תאית מושרה לאחר שלב זה.

2. טיפול בתאים מזדקנים עם תרכובות מעניינות

  1. לאחר 24 שעות, הסר את מדיום תרבית התאים והוסף 2 מ"ל מדיום תרבית תאים המכיל תרכובות מעניינות.
  2. לאחר 24 שעות נוספות, מצופים אצווה נפרדת של פיברובלסטים דרמליים אנושיים (כפי שמתואר בשלב 1.1) בלוחות בעלי 6 בארות. תאים אלו ישמשו כפיברובלסטים דרמליים בריאים להעברת מדיום מותא.

3. העברת תווך מותנה מתאים זקנים לתאים בריאים

  1. לאחר 48 שעות לאחר טיפול מורכב בתאים זקנים ו-24 שעות לאחר ציפוי פיברובלסטים בריאים, אספו 2 מ"ל של מדיום מותאם בכל באר מתאים מזדקנים והעבירו לפיברובלסטים הבריאים.
    הערה: הסר את מדיום התרבית מפיברובלסטים בריאים מיד לפני הוספת המדיום המותאם כדי להבטיח העברה יעילה.
  2. הוסף 1 מ"ל PBS לתאים המזדקנים וקצור אותם באמצעות טריפסין כפי שמתואר בשלב 1.6. השתמש בתאים אלו לניתוח סמנים של הזדקנות או דלקת באמצעות ערכת ELISA או qPCR.
    הערה: כדורי תאים עשויים להיאחסן בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס אם לא מתבצעות בדיקות במורד הזרם מיד.
  3. דגרו פיברובלסטים בריאים המקבלים מדיום מותנה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ למשך 24 שעות.

4. תאים בריאים אוספים לניתוח הפעלה של פיברובלסטים באמצעות ניתוח ביטוי גנים

  1. לאחר 24 שעות דגירה עם מדיום מותא, קצרו פיברובלסטים בריאים באמצעות טריפסין כפי שמתואר בשלב 1.6. ניתחו ביטוי גנים במטריקס חוץ-תאי באמצעות qPCR.
  2. בצע ניתוח qPCR.
    1. חלץ RNA מכדורי תאים לפי הוראות היצרן (ערכת חילוץ RNA).
    2. בצע שעתוק הפוך של RNA בעומק 200 ng לפי הוראות היצרן (ערכת שעתוק הפוך).
    3. הגברת cDNA לפי הוראות היצרן (qPCR master mix). ביצוע qPCR בתנאים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ואחריהן 40 מחזורים של 95 מעלות ל-5 שניות ו-60 מעלות ל-30 שניות. הפריימרים המשמשים מפורטים בטבלה 1.
ג'יןרצף קדימהרצף הפוך
CDKN2A5'-GGCATTGTGAGCAACCACTG-3'5'-CCTGTAGGACCTTCGGTGAC-3'
CDKN1A5'-CTGGAGACTCAGGGTCGAA-3'5'-CCAGGACTGCAGGCTTCCT-3'
SCF5'-AATCCTCTCGTCAAAACTGAAGG-3'5'-CCATCTCGCTTATCCAACAATGA-3'
IL-185'-TGCAGTCTACACCTTCGG-3'5'-GTTTGTTGCGAGAGGAAGCG-3'
ELN5'-GCAGGAGTTAAGCCCAAGG-3'5'-TGTAGGGCAGTCCATAGCCA-3'
FBN15'-GGTGAATGTACAACACAGTCAGCAG-3'5'-ATAGGAACAGAGCACAGCTTGTTGA-3'
IL-65'-AGCCCTGAGAAAGGAGACATGTA-3'5'-TCTGCCAGTGCCTCTTTGC-3'
IL-85'-ATTTCTGCAGCTGTGTGTGAAGGT-3'5'-TTTTATATGAATTCTCAGCCCT-3'
CTGF5'-GGAAATGCTGTGAGGAGTGTGT-3'5'-TGTCTTCCAGTCGGTAGGCAGCTA-3
IGF15'-CAGAGCAGATAGAGCCTGCG-3'5'-CAGGTAACTCGTGGCAGAGCA-3'

טבלה 1: רשימת פריימרים המשמשים לבדיקות qPCR. סופקו רצפים קדימה ואחוריים לכל פריימר התואם לגנים שנחקרו וכמותו במודל זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לסימולציה של סימן התקשורת הבין-תאית המשתנה של הזדקנות במבחנה. איור 1 מציג סכמטיקה גרפית הממחישה את השלבים העיקריים של הפרוטוקול, כולל השראה של הזדקנות, כימות סימנים וניתוח תקשורת בין-תאית משתנה בתאי עור במבחנה.

figure-results-1
איור 1: סיכום גרפי של ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הבנת תהליך ההזדקנות ברמה המולקולרית היא מפתח לעיצוב גישות והתערבויות חדשניות שמעכבות תכונות הקשורות להזדקנות ומאריכות את אורך החיים והתפקוד של תאים ורקמות. הגדרה וזיהוי סימני ההזדקנות היו חיוניים להקמת מסגרת מדעית לפיתוח התערבויות אלו 2,16. מבין המאפיינים המוכרים של ההזדקנות, תקשורת בין-תאית משתנה מהווה תכונה יסודית, המאופיינת באיתות פגום ותפקודי לקוי בין תאים, הגורם לניוון רקמתי הקשור לגיל. בעור מזדקן, הצטברות תאים מזדקנים מקדמת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

כל המחברים הועסקו בקבוצת Mesoestetic Pharma, S.L.

תודות

המחברים רוצים להודות לשותפים על עזרתם ועצותיהם בפרויקט זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
6-well platesFisher Scientific10578911Cell culture multiwell plates to use during the assay (senescence induction and compound treatment)
Bio-LINK Crosslinker BLX-312/36 (UVB irradiation device)Vilber LourmatVL-6111-1090-1Device used to produce damage by UVB irradiation and consequently induce senescence
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Merck Life scienceD6046-500MLStandard cell culture medium for dermal fibroblasts
Fetal bovine serum (FBS)Fisher Scientific17593595Nutrient supplement used a a source of growth factors, hormones, proteins and essential micronutrients for cell growth
H3K27me3 ELISA kitEpigentekP-3014T-096A specific immunoassay to detect the epigenetic modification of H3K27me3 in biological simples
Human dermal fibroblastsPromocellC-12302Main skin cell in the dermis and regulator of skin photoaging
Phosphate buffered saline (PBS)Merck Life scienceD8537-500MLBuffer solution that mimicks physiological environment. Used to wash cells without inducing strss or reducing cell viability
PrimeScript RT reagent kit (reverse transcription kit)Takara BioRR037A The kit to obtain cDNA from RNA isolated from cells. 2nd step for qPCR assay after RNA purification.
TB Green Premix Ex Taq  (qPCR master mix)Takara BioRR420AThe kit to produce the polymerase chain reaction from cDNA to quantify gene expression levels. 3rd step for qPCR assay after reverse transcription.
Total RNA Purification Kit (RNA extraction kit)Norgen17200The kit to obtain RNA from harvested cells. 1st step for qPCR assay after cell harvesting.
Trypsin/EDTA 0.05% Merck Life scienceT2601-100MLEnzyme solution used in harvesting/passaging steps for cell detachment from cell culture plates

מקורות

  1. Chaudhary, M., Khan, A., Gupta, M. Skin ageing: Pathophysiology and current market treatment approaches. Curr Aging Sci. 13 (1), 22-30 (2020).
  2. López-Otín, C., et al. Hallmarks of aging: An expanding universe. Cell. 186 (2), 243-278 (2023).
  3. Razzaghi, Z., Ahmadzadeh, A. Examination of the biological effects of sunlight on the skin: a review. J Lasers Med Sci. 16, e52 (2025).
  4. He, R., et al. Hallmarks of the aging skin microenvironment: components and mechanisms. J Cell Physiol. 240 (11), e70111 (2025).
  5. Karras, A., et al. Measuring the senescence-associated secretory phenotype. Biomedicines. 13 (9), 2451 (2025).
  6. Chin, T., et al. The role of cellular senescence in skin aging and age-related skin pathologies. Front Physiol. 14, 1297637 (2023).
  7. Yuan, X. H., Jin, Z. H. Paracrine regulation of melanogenesis. Br J Dermatol. 178 (3), 632-639 (2018).
  8. Fullard, N., et al. Cell senescence-independent changes of human skin fibroblasts with age. Cells. 13 (8), 662 (2024).
  9. Hachiya, A., et al. The paracrine role of stem cell factor/c-kit signaling in the activation of human melanocytes in ultraviolet-B-induced pigmentation. J Invest Dermatol. 116 (4), 578-586 (2001).
  10. Kovacs, D., et al. Role of fibroblast-derived growth factors in regulating hyperpigmentation of solar lentigo. Br J Dermatol. 163 (5), 1020-1027 (2010).
  11. Kim, M., et al. Ultraviolet-irradiated endothelial cells secrete stem cell factor and induce epidermal pigmentation. Sci Rep. 8 (1), 4235 (2018).
  12. Lee, Y. H., et al. Identification of senescence rejuvenation mechanism of Magnolia officinalis extract including honokiol as a core ingredient. Aging. 17 (2), 497-523 (2025).
  13. Pandel, R., Poljšak, B., Godic, A., Dahmane, R. Skin photoaging and the role of antioxidants in its prevention. ISRN Dermatol. 2013, 1-11 (2013).
  14. McDaniel, D. H., et al. Clinical efficacy assessment in photodamaged skin of 0.5% and 1.0% idebenone. J Cosmet Dermatol. 4 (3), 167-173 (2005).
  15. Farris, P. K. Topical vitamin C: a useful agent for treating photoaging and other dermatologic conditions. Dermatol Surg. 31 (7 Pt 2), 814-817 (2005).
  16. López-Otín, C., et al. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  17. Sjerobabski-Masnec, I., Situm, M. Skin aging. Acta Clin Croat. 49 (4), 515-518 (2010).
  18. Ganguly, B., Hota, M., Pradhan, J. Skin aging: implications of UV radiation, reactive oxygen species and natural antioxidants. Skin Aging. , (2022).
  19. Ito, T., et al. Regulation of cellular senescence by polycomb chromatin modifiers through distinct DNA damage- and histone methylation-dependent pathways. Cell Rep. 22 (13), 3480-3492 (2018).
  20. Sen, P., Shah, P. P., Nativio, R., Berger, S. L. Epigenetic mechanisms of longevity and aging. Cell. 166 (4), 822-839 (2016).
  21. Cencioni, C., et al. Aging Triggers H3K27 Trimethylation Hoarding in the Chromatin of Nothobranchius furzeri Skeletal Muscle. Cells. 8 (10), 1269 (2019).
  22. Ma, Z., et al. Epigenetic drift of H3K27me3 in aging links glycolysis to healthy longevity in Drosophila. eLife. 7, e35368 (2018).
  23. Martinez-Gutierrez, A., et al. Hyaluronic and Succinic Acid: new biostimulating combination to counteract dermal and subcutaneous aging. Int J Mol Sci. 26 (15), 7548 (2025).
  24. Park, S., et al. Senotherapeutic potential of araliadiol in senescent human dermal fibroblasts: an in vitro study using three senescence models. Pharmaceutics. 17 (12), 1560 (2025).
  25. Waldera Lupa, D. M., et al. Characterization of skin aging–associated secreted proteins (SAASP) produced by dermal fibroblasts isolated from intrinsically aged human skin. J Invest Dermatol. 135 (8), 1954-1968 (2015).
  26. Boismal, F., et al. Proteomic and secretomic comparison of young and aged dermal fibroblasts highlights cytoskeleton as a key component during aging. Aging. 16 (16), 11776-11795 (2024).
  27. Abdul Ghani, N. I., et al. Effect of different collection times of dermal fibroblast conditioned medium (DFCM) on in vitro re-epithelialisation process. Biomedicines. 10 (12), 3203 (2022).
  28. Chowdhury, S. R., Aminuddin, B. S., Ruszymah, B. H. I. Effect of supplementation of dermal fibroblasts conditioned medium on expansion of keratinocytes through enhancing attachment. Indian J Exp Biol. 50 (5), 332-339 (2012).
  29. Ohgo, S., et al. Senescent dermal fibroblasts enhance stem cell migration through CCL2/CCR2 axis. Exp Dermatol. 24 (7), 552-554 (2015).
  30. Malaquin, N., et al. Senescent fibroblasts enhance early skin carcinogenic events via a paracrine MMP-PAR-1 axis. PLoS One. 8 (5), e63607 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

UVB
שילוב חדש של נוגדי חמצון לשיקום תקשורת בין-תאית בריאה במודל חוץ גופי באמצעות מדיום מותנה מתאים זקנים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.