מאמר שיטה

מודל אורומוקוסלי תקן של חזיר ex vivo להערכת זרמי פפטידים

378 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70935

⸱

9 ביוני 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1UCD School of Veterinary Medicine and UCD Conway Institute, University College Dublin, 2UCD School of Mechanical and Materials Engineering, University College Dublin

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר פלטפורמת סקר המשתמשת ברירית רקמת אפיתל בוקאלית חזיר מבודדת טרייה להערכת חדירות פפטידים. השיטה משלבת חדירה של GLP-1RA בנוכחות משפר חדירות מתמיסות, תאי Hilltop וסרטים בתאי הדיפוזיה של פרנץ, והכנסות מודפסות בתלת-ממד, בליווי הערכה רירית היסטולוגית.

תקציר

מתן אורומוגוזלי של תרופות בסרטים, טבליות, סוכריות וצורות מינון אחרות מספק נתיב מערכתית נוח למטופלים ילדים וקשישים, וכן למטופלים שאינם יכולים לבלוע קפסולות או טבליות בקלות. פיתוח נוסחאות פפטידים בוקליות ותת-לשונית דורש מודלים פרה-קליניים התואמים את המבנים האפיתליים האורומוקוזיאליים הלא-קרטיניים של בני אדם, כאשר חזירים וכלבים הם המתאימים ביותר. השגנו רקמות אורולקוזיות חזיריות טריות שהושלכו מבית מטבחיים. הריריות נותקו מהשריר החלק שמתחת באמצעות חימום מבוקר ולאחר מכן הורכבו בתאי דיפוזיה פרנץ או בתוספות חדשות ומודפסות בתלת-ממד עם שרף מודפס בנפח נמוך. התווספו שילובי משפרים של פפטידים-חדירות לצד התורם, ומולקולות חדירות נלקחו מצד המקלט ונמדדו באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד (uHPLC). עבור התוספות, ערכי ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתליאלית (TEER) של רירית מותקנת נמדדו באמצעות אלקטרודות אכילת EVOM. היסטולוגיה רקמתית נבדקה לאחר דגירה הן בתאי דיפוזיה פרנץ והן בתאי תלת-ממד. הריכוז האופטימלי של מגביר החדירות נבחר כאשר תערובות מימיות של פפטיד ומגביר יצרו עלייה בחדירה. חדירת פפטידים הגיעה ל-4.3% במשך 3 שעות בהכנסות תלת-ממדיות (3D) ו-1.7% במודלים של Hilltop Chamber, כאשר האחרון מדמה חשיפה ישירה מסרט בוקלי. שכבה אחר שכבה פותחו והופקו על רקמת רירית לצורך מחקרי חדירות באמצעות תאי דיפוזיה. חדירת פפטיד אקס ויבו על פני רירית החזיר הגיעה ל-2% כאשר הריר נחשפו לשילוב האופטימלי של גליקודוקסיכולאט (GDC) המשולב בשכבות הבוקלי. מחקרי סקר אקס ויבו אלו מספקים מסלול להערכה פרמקוקינטית נוספת של נוסחאות סרט טעונות פפטידים, הניתנות דרך מסלול האורומוקוסלי בחזירים ובבני אדם.

מבוא

אורומוקוזה בוקלית ותת-לשונית הן דרכים אטרקטיביות למתן תרופות דרך הפה, משום שהן מציעות אתרים נגישים ישירות ומניעת מטבוליזם במעבר ראשון בכבד, מה שעשוי לשפר את הזמינות הביולוגית ואת קבלת המטופלים בהשוואה לדרכים אחרות, כוללדרך 1,2. פפטידים ניתנים בדרך כלל בהזרקה במקום מתן דרך הפה, בשל חדירות לקויה דרך אפיתל המעיים, בשל משקלם המולקולרי הגבוה, ההידרופיליות שלהם ורגישותם לפירוק אנזימטי3. ה-FDA אישר 102 פפטידים ליישומים טיפוליים, כאשר ~450 פפטידים טיפוליים נמצאים בהערכה בניסויים פרה-קליניים או קליניים4. אלה כוללים טבליות דרך הפה שפותחו עם משפרי חדירה (למשל, סמגלוטיד, רייבלסוס) ופלטפורמות אורומוקוזיות (Minirin Melt ו-Nocdurna תת-לשוני דסמופרסין אצטט) שפותחובאמצעות טכנולוגיית טבליות הפירוק הפוך Zydis (ODT) של Catalent. למרות חקירה מעמיקה של מחקרי חדירות תרופות בוקאליות, ערכי החדירות של מולקולות מראים שחזוריות נמוכה ויכולת השוואה מוגבלת בין המחקרים 7,8. אי-העקביות הללו נובעות בעיקר מהבדלים במודלים הניסיוניים של בעלי החיים ששימשו ומהבדלים בטיפול ובהכנת רירית בוקולמבודדת 9.

בדיקות חדירות ex vivo המשתמשות בריליות רקמת בוקלית ותת-לשונית מבודדות הן כלי חשוב לחיזוי חדירות מולקולות קטנות באורולקוזה בגוף ולסקר קדם-קליני של רכיבי נוסחה הרלוונטיים לצורות מינון 10,11,12; עם זאת, השימוש בהם בסקר פפטידים מוגבל מכיוון שהחדירות הבסיסית זניחה. בשנים האחרונות, רירית החזיר הפכה למודל המועדף משום שהמבנה הלא-קרטיני שלה והמאפיינים הפיזיולוגיים והביוכימיים שלה דומים מאוד לאלו של בני אדם13. דגימות בוקאליות מכלבים אפילו פחות נגישות בהשוואה לרקמת חזיר מבתי מטבחיים, אם כי שני המקורות אינם קרטיניים14. שונות משמעותית בעובי האפיתל ובשיטות העיבוד נמשכת. סטנדרטיזציה של הכנת האורומוקוזה הבוקלית והתת-לשונית היא חיונית. משתנים כמו תנאי אחסון לטווח קצר וארוך, עובי הרקמה ושמירה על הקיימות במהלך ניסויים משפיעים על תוצאות חדירות ex vivo 8. שימור הרקמות הוא קריטי, שכן גם שלמות המבנה וגם הפעילות המטבולית של הרירית משפיעות ישירות על פרופילי הדיפוזיה12,15. אובדן תפקוד המחסום עלול להוביל לשיעורי חדירה מלאכותית16,17. מעבר לאחסון, השיטה המשמשת לניתוח רירית בוקאלית חזיר להתקנה בתאי חדירה מוסיפה שונות נוספת. הבדלים בהסרת רקמת החיבור התת-רירית, בין אם באמצעים מכניים, כימיים או תרמיים, יכולים לשנות חדירות18. למרות שחלק מהדיווחים מציעים כי הפרדת חום לבידוד האפיתל מהשריר החלק שומרת על חדירות19, אין קונצנזוס. נכון להיום, אין שיטה מקובלת באופן אוניברסלי לניתוח והערכת שלמות הריר הבוקלי20 המבודד. הסוכר ההידרופילי פלואורסצאין איזותיוציאנט-דקסטרן (FITC dextran 4000, FD-4) משמש בדרך כלל כסמן שלמות לריר החזיר הבוקלי, משום שרק מולקולות קטנות מתחת ל~500 Da יכולות לחדור באופן פסיבי לרקמה. לעומת זאת, רירית שלמה מגבילה את העברת FD-4, והעברה מתורם למקבל מתחת ל-0.6% נחשבת בדרך כלל מקובלת במשך 2-4 שעות21,22. בנוסף, צביעת רקמות המטוקסילין ואאוזין מספקת הערכה פשוטה של מורפולוגיית האפיתל23.

בעבודה זו, קבענו פרוטוקול סטנדרטי לטיפול רירית בריריות חזיר מבודדות, שנועד למקסם את שלמות וחדירותיות הרירית לאורך תקופה מוגדרת. מטרותינו היו לספק מסגרת ניסיונית לניתוח רקמת אפיתל בוקלית של חזיר חזיר ולשפר את אמינות הערכות החדירות מחוץ לחיים של פפטידים על פני אורומוקוזאות המותקנות בתאי דיפוזיה ובהכנסות. בהתחלה ערכנו ניתוחים ויזואליים כדי לזהות את רירית הבוקול נטולת הנזק מהבית מטבחיים. אופטימיזציה של טכניקות עיבוד רקמות, עובי רירית ושיטות לשמירה על שלמות הרקמה במהלך הניסויים. באמצעות אנלוג יציב ויעיל של אגוניסט קולטני גלוקגון-1 (GLP-1 RA) כמולקולת כלי, ביצענו מחקרי חדירת פפטידים בנוכחות ובהיעדר מגביר חדירת מלח מרה, נתרן גליקודיקסיכולאט (GDC), על רירית בוקלית המותקנת בתאי דיפוזיה של פרנץ וכניסות תלת-ממדיות מותאמות אישית עם הדפסת טרנסוול תלת-ממדית. GDC ו-GLP-1 RA הוצגו לריר בוקלי מתמיסות, תאי Hilltop וסרטים פולימריים דו-שכבתיים עם דבק רירי. השתמשנו בסמני חדירה, היסטולוגיה של רקמות וערכי התנגדות חשמלית טרנס-אפיתליאלית/אנדותליאלית (TEER) כנקודות הסיום העיקריות של ההערכה.

פרוטוקול

לחיי החזיר ששימשו במחקר זה נאספו מבית מטבחיים מקומי; לכן, לא נדרשה אישור אתי.

1. בידוד, הכנה ואחסון של אפיתל בוקאלי חזיר

  1. אוספים רקמות לחיים של חזיר מבית מטבחיים מקומי ומעבירים תוך 90 דקות למעבדה במי מלח פוספט קר (PBS, pH 7.4). בתוך 60 הדקות הבאות, יש להכין את הרקמות לפי המתודולוגיה שתוארה קודם19,24, עם שינויים קלים באתרים שונים של אורומוקוזות כפי שמוצג באיור 1.
  2. באמצעות סכין מנתח, הפרדו את הריר הבוקלי מהרקמה שמתחתית ושטפו את הרקמה שלוש פעמים במי מלח עם בופר פוספט (PBS). להשליך ריר עם נזק על פני השטח הראייתיים.
  3. טבלו ריריות שלמות ב-PBS בטמפרטורה של 65 מעלות למשך 3 דקות והפרדו את האפיתל ואת רקמת החיבור שנותרה מהשריר החלק באמצעות מלקחיים של שען בגודל 5. שיטה זו רלוונטית גם לבידוד ריריות אפיתל תת-לשונית ולשון.
  4. ייבשו בעדינות את האורומוקוזה המנותקת על נייר פילטר תאית והמשיכו לבדיקות חדירה (האפשרות המועדפת) או הקפיאו עד 4 שבועות.
  5. לתהליך ההקפאה לאחר ההפרדה, טבלו אורומוקוזאות למשך שעתיים במכשיר קריופרוטקטנט, 85% גליצרול25, עם ניעור עדין. גליצרול בעל צמיגות גבוהה מחליף מים בין-תאיים כדי למנוע היווצרות גבישי מים, שעלולים לפגוע במבנה הרקמה.
  6. לאחר תקופה זו, החליפו את הגליצרול ב-PBS טרי וב-10% גליצרול. הקפיאו את דגימות הריריות בטמפרטורה של -20°C או -70°C, בהתאם למשך האחסון הנדרש. בצע את הליך ההקפאה בקצב מבוקר של ~-1 °C·min-1.
    הערה: כל הניסויים מתבצעים באמצעות לפחות שלושה דגימות של רקמות מלחיים של בעלי חיים שונים.

2. מחקר חדירה מחוץ לחיים ברירית המותקנת בתאי דיפוזיה של פרנץ ושימוש בתאי Hilltop להצגת GLP-1 RA ו-GDC

הערה: מחקרי חדירות Ex vito מתבצעים תחילה על רירית חזיר מבודדת טרייה באמצעות תאי דיפוזיה פרנץ (FDC).

  1. התקן את רירית הרקמה המפורקת בתאים (שטח החלון 1.2 ס"מרבוע) המוצג באיור 2 והתאזן למשך 30 דקות עם PBS, pH 6.8 (צד התורם, נפח 1 מ"ל) ו-PBS, pH 7.4 (צד המקלט, נפח 10 מ"ל).
  2. לאחר 30 דקות של שיווי משקל, החליפו את תמיסת התורם PBS (pH 6.8) ב-1 מ"ל PBS המכיל יחס 1:1 של GLP-1RA (25 מ"ג/מ"ל) ו-GDC (25 מ"ג/מ"ל).
  3. המשך לערבב את תא המקלט עם 10 מ"ל pH 7.4 של PBS, נשמר על 37 מעלות צלזיוס ב-300 סל"ד. דגימה של 1 מ"ל מתא המקלט כל 60 דקות למשך 180 דקות. קחו דגימות משולשות מתאי התורם בתחילת ובסוף הניסוי. לאחר כל דגימה, מלא מחדש את התאים ב-1 מ"ל PBS.
  4. בסיום הניסוי, יש לאחסן את הרקמה ב-10% פורמלין להיסטולוגיה או להומוגניזציה כדי לכמת את הפפטיד GLP-1RA שנותר ברקמה.
  5. באופן דומה, לבצע את חדירות ה-GLP-1RA באמצעות תאי Hilltop (HTC).
    הערה: מטרת השימוש ב-HTC היא לאשר את השפעת שיפור החדירות האורולקוזית של GDC על ה-GLP-1 RA בתמיסה לפני יצירת שכבת בוקלית דו-שכבתית. ה-HTC הוא תא שנבנה מ-Kraton G-2705, קופולימר בלוק סטירן-אתילן-בוטילן-סטירן (SEBS) ביוקומוניטיבי, בקוטר חיצוני של 19 מ"מ, ומכיל כרית ובריל (קוטר 12.7 מ"מ) המורכבת מסיבי כותנה לא ארוגים ב-100%, המשמשת כחומר סופג ולא נדבק ליישום תמיסה26.
  6. באופן דומה, יש להעריך את החדירות ex vivo של GLP-1RA ו-GDC (יחס 1:1) בשכבות דו-שכבתיות עם דבק רי, על ידי הצבת הסרטים בתאי תורם של FDC או בהכנסות תלת-ממדיות, כפי שמתואר עבור HTC.
  7. כדי לאשר את שלמות רקמת האפיתל הבוקלית של חזיר, השתמשו ב-FD-4 (0.05 מ"מ) כסמן פלואורסצנטי ומוסיפים אותו לצד התורם כדי להעריך דליפה ברקמה.
    הערה: רקמות שמראות דליפה אינן כלולות בחישובי חדירה.
  8. לאחר ניסוי של 3 שעות, כמת את שטף ה-RA המצטבר של GLP-1 באמצעות ניתוח uHPLC של דגימות של 200 מיקרוליטר שנמשכו מהתא הבזולטרלי בשלוש עותקים. חזור על כל ניסויי החדירה שלוש פעמים. כמת את השטף המצטבר של GLP-1RA מעקומת כיול שנוצרת מריכוזי סט של GLP-1RA.

3. הכנת סרטי בוקול הכלולים ב-GLP-1RA ו-GDC

הערה: סרטים דו-שכבתיים בוקאליים המכילים דבק רירי ושכבת גיבוי מיוצרים באמצעות יציקה ממסית עם מצפה חצי-אוטומטי27.

  1. הכינו שכבה דו-שכבתית ללכידת GLP-1RA באמצעות HPMC ו-PVP-K90 כפולימרים ליצירת סרט, ורכיב דבק רירי, Na-CMC.
    הערה: עיין בטבלה 1 לגבי הרכב הדבק הרירי ושכבת התמיכה של שכבת הבוקלי. GDC משולב עם פפטיד GLP-1 RA בסרטי מודלים בכמויות נמוכות של מ"ג כדי לראות את השפעתו על חדירת פפטידים על פני רירית בוקאלית חזיר המותקנת בתאים.
  2. הכינו את שכבת הדבק הרירית על ידי המסה של פולימרים ליצירת סרט, 45 מ"ג HPMC, 10 מ"ג Na-CMC ו-25 מ"ג PVP-K90, במים דה-יוניים המכילים 3% גליצרול ב-400 סל"ד למשך 10 דקות באמצעות ערבוב פלטת חום מגנטית.
    הערה: HPMC מסיס בטמפרטורת החדר, בעוד ש-PVP-K90 דורש חימום ב-40°C למשך 30 דקות כדי להמיס אותו.
  3. מוסיפים 2 מ״ג Aerosil 200 F תחת ערבוב, ואחר כך מוסיפים את GLP-1 RA. אחר כך, מוסיפים GDC ומפזרים את זה ב-600 סל"ד למשך 30 דקות.
  4. יש לאולטרסוניקציה את תמיסת הפולימר הסופית למשך 90 דקות באמצעות אמבטיית אולטרסוניקציה להסרת בועות.
  5. יצוק סרטים על ציפוי פוליאתילן טרפתלאט (PET) וציפו עם להב רופא שמכוון ל-2600 מיקרון במהירות 2 מ"מ/שנייה. ייבשו את הסרטים בתנור אוויר חם בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך ~1 שעה.
  6. לשכבת הגיבוי, יש להמיס 5% אתיל צלולוז (EC) ו-5% פרופילן גליצרול (PG) במים הידרואלכואליים (אתנול:מים), ואז להשיק את התערובת המומסת על ציפוי PET. לבסוף, חתכו את הסרטים היבשים לריבועים בגודל 1 ס"מ × 1 ס"מ, ארוזו בשקיות אלומיניום, ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

4. הדפסה של תוספת תלת-ממדית מותאמת המדמה טרנסוול

הערה: התוספות המותאמות אישית המודפסות בתלת-ממד מיוצרים לפי שיטה שתוארה קודם עם שינויים קלים28.

  1. בקצרה, תכננו את המודל התלת-ממדי באמצעות תוכנת עיצוב בעזרת מחשב (CAD).
  2. שמרו על מידות ההכנסה התלת-ממדית זהות לגוף הצילינדרי הראשי (תא התורם), עם שטח פנים מקסימלי של 1659.06 מ"מ רבוע, וממדים חיצוניים כוללים של 25.20 מ"מ לאורך ציר ה-x, 14.50 מ"מ לאורך ציר ה-y, ו-21.63 מ"מ לאורך ציר ה-z.
  3. בנוסף, יש לעצב טבעת מעגלית נשלפת שתתמוך ברקמת האפיתל. לטבעת קוטר חיצוני של כ-19.90 מ"מ וקוטר פנימי של כ-17.93 מ"מ, התואמים למידות הגוף הצילינדרי הראשי, והיא יכולה להיכנס ללוחות Transwell עם 12 בארות (איור 3).
  4. לייצר את כל הרכיבים באמצעות מדפסת תלת-ממד סטריאוליתוגרפיה שולחנית (SLA) עם שרף שקוף שניתן לריפוי על ידי UV. כל הממדים הם מקורבים וניתן לכוונן לפי הצורך כדי להבטיח התאמה נכונה בטרנסוולים ותאימות ניסיונית.
    הערה: כדי להבטיח הסרת מונומרים לא מגובים וחומרים פוטנציאליים לשטיפה, כל החלקים עברו פרוטוקול עיבוד לאחר תקן, כולל שטיפה של 10 דקות באלכוהול איזופרופיל (IPA) טהור של 99%, ואחריה ייבוש UV בהתאם לדרישות היצרן, כלומר דקה אחת בטמפרטורת הסביבה בטופס Form Cure 2. קובץ סטריאוליתוגרפיה (STL) לעיצוב מודלים תלת-ממדיים ניתן למצוא בקבצי https://doi.org/10.5281/zenodo.19368577 או קבצים משלימים (קובץ משלים 1 וקובץ משלים 2).

5. חדירה על פני רירית המותקנת בתדרים תלת-ממדיים

הערה: חדירות אקס-ויבו של GLP-1RA ו-GDC המשולבים בסרטי בוקול דו-שכבתיים עם רירית דבק יכולה גם להעריך באמצעות תוספות תלת-ממדיות מותאמות אישית (איור 2) בנפח נמוך ומעוצבות בהתאמה אישית (איור 2) כחלופה ל-FDCs. הסיבה לכך היא שצד המקלט בנפח 10 מ"ל של FDCs מדלל את הפפטיד, מה שמאתגר את רגישות הגילוי של uHPLC. לכן, עיצוב ה-FDC אינו חסכוני או מעשי עבור שטפי פפטידים, שכן הוא ידרוש זיהוי שוטף של בדיקות אימונוסורבנט קשורות לאנזים (ELISA) או בדיקת רדיואימונואסיי (RIA).

  1. ייצור/מדפיס את ההכנסות בשרף שניתן לריפוי ב-UV באמצעות מדפסת SLA3D שולחנית 28, ולהתקין אותן בלוחות תרבית רקמה עם 12 בארים.
  2. ממקמים את רירית הבוקול החזירי על פני אזור חלון של 1.4 ס"מ רבוע בין התא האפיקלי לחדר הבזולטרלי, מדדו את ההתנגדות החשמלית הטרנסאפיתלית הבסיסית (TEER) באמצעות וולטוהמטר EVOM 2 עם אלקטרודות STX2 הממוקמות בצדדי התורם והמקבל של התוספות. TEER מחושב לפי חוק אום.
  3. לאחר הנחת הסרט (1.0 × 1.0ס"מ 2) על ראש הרקמה, פיפטה של 0.5 מ"ל PBS (pH 6.8) לתא האפיקלי ו-1.5 מ"ל PBS (pH 7.4) לתא הבזולטרלי.
  4. אספו דגימות (0.2 מ"ל) מצדדי המקלט במרווחים של שעה על פני 3 שעות והחליפו בנפחים שווים של בופר טרי.
  5. כימות את פפטיד GLP-1 RA הזרם באמצעות uHPLC.
    הערה: לא נצפתה ספיחה של GLP-1RA עם הוספות תלת-ממדיות לאחר 3 שעות, כפי שמוצג באיור משלים 1 ובקובץ המשלים 3.
  6. מדדו את ההתנגדות החשמלית הטרנסאפיתלית (TEER) באמצעות וולטוהמטר EVOM 2 עם אלקטרודות צ'ופסטיקס STX2 במרווחים של שעה על פני 3 שעות. TEER מחושב לפי חוק אוהם.
  7. לאימות שלמות רקמת האפיתל של החזיר התת-לשוני, השתמשו ב-FD-4 (0.05 מ"מ) כסמן פלואורסצנטי.
    הערה: כל הניסויים מתבצעים בשלושה עותקים, והתוצאות המדווחות הן ממוצע ± SD של שלושה מערכי נתונים.

6. זיהוי uHPLC של ה-GLP-1 RA

  1. כמת את כמות ה-GLP-1 RA החדירה באורומוקוזאות המותקנות ב-FDCs ובהכנסות, מכל תמיסת צד התורם, HTCs וסרטים על ידי uHPLC באמצעות עמודת CSH C18 (130 Å, 1.7 מיקרון, 2.1 מ"מ × 50 מ"מ) עם פאזה ניידת של 0.1% TFA באצטוניטריל (Eluent A) ו-0.1% TFA במים (Eluent B), שחרור גרדיאנט מעל 8 דקות ב-30 מעלות צלזיוס, עם נפח הזרקה של 20 מיקרוליטר וקצב זרימה של 0.7 מ"ל לדקה, וזיהוי UV ב-214 ננומטר (זמן החזקה: ~4.2 דקות).
  2. בצע מחקר ליניאריות.
    1. תכנן מחקר ליניאריות להערכת התגובה האנליטית של תנאי uHPLC האופטימליים באמצעות תקני כיול GLP-1 בטווח של 2.5–20.0 מיקרוג·מליטר⁻1.
    2. הכנת תקני כיול (n = 6–8 רמות) באופן עצמאי והזרקת דגימות בשלושה עותקים. בצע רגרסיה ליניארית מינימום ריבועים של שטח שיא (mAU) לעומת ריכוז נומינלי, והערכת ליניאריות באמצעות מקדם הקביעה (r2), אחוז ה-y-יירוט, והתפלגות השאריות (תגובה נצפית–חזויה).
      הערה: בדיקה ויזואלית של גרף הכיול ושל גרף השאריות הראתה סטייה זניחה מהליניאריות ברמת הרגישות הנמוכה ביותר (2.5 מיקרוג·מליטר⁻1), כאשר השאריות היו בתוך גבול הקבלה שהוגדר מראש (±3%). טווח הכיול מוגבל לאחר מכן לטווח של 2.5–20.0 מיקרוגר·מליטר⁻1, שבו הרגרסיה הראתה ליניאריות מקובלת (r2 ≥ 0.999, % y-intercept < 2%, וכל השאריות בטווח של ±3%).

7. הערכת GLP-1RA שנשמר ברקמת הבוקול

  1. הסר את רירית האפיתל הבוקלי של החזיר שנחשפה ל-GLP-1 RA ול-GDC מ-FDCs/הכנסות.
  2. שטוף את הרקמה שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר את חומרי הסמים והפילם שנספגו.
  3. לאחר מכן, הומוגניזציה של הרקמה ב-5 מ"ל PBS באמצעות הומוגניזר שולחני עד שהיא מתפרקת לחלוטין.
  4. שמרו את הדגימה ללילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לאפשר איזון בין חלוקת הפפטידים בין רקמה הומוגנית ל-PBS.
  5. לאחר מכן, צנטריפוגות את התערובת בעוצמה של 5000 × גרם למשך 5 דקות כדי להשקיע את השברים ולאסוף את הסופרנטנט לצורך כמות.
  6. סטריליזציה של הסופרנטנט דרך מסנני צנטריפוגה בקוטר 0.22 מיקרון כדי להסיר חלקיקים שאריתיים לפני ניתוח uHPLC.

8. היסטולוגיה של רקמת האורומוקוסלית

הערה: לאחר 3 שעות של חדירה של GLP-1 RA מתערובות, HTCs או סרטים, רירית מעובדת להערכת נזק.

  1. מקבע את הרקמות ב-10% פורמלין במשך 48 שעות, ואז הטמיע את הרקמות הקבועות בפרפין.
  2. חתך את הרקמות בגודל 5 מיקרון באמצעות מיקרוטום.
  3. לאחר מכן צביעת רקמות בהמטוקסילין ואאוזין (HE) כדי לבדוק את שלמות ההיסטולוגיה באמצעות מיקרוסקופ אור בהגדלה של 4×.
  4. השקופיות מצולמות במיקרוסקופ זקוף ומנותחות באמצעות תוכנת ניתוח תמונות.
    הערה: זרימת העבודה הכוללת מסוכמת באיור 4.

תוצאות

בידוד וניתוק של רקמות אפיתל בוקלי חזיר
רירית הבוקול של החזיר משמשת באופן נרחב כרקמה חלופית לאורומוקוסאות אנושיות, משום שהן חולקות תכונות אנטומיותותכונות מחסום פיזיולוגיות דומות. רקמות אפיתל של החזיר מבודדות הן בשיטות ניתוח והן בשיטות חימום, כפי שמוצג באיור 4. בתחילה, סכין מנתח משמשת להסרת שרירים ורקמות חיבור עמוקות יותר מהלחיים. החלקים המבודדים של הרקמה עם שכבות ריריות שלמות ומשולבות ומושלמות מונחים לאחר מכן ב-PBS חמים ומחוממים ל-65 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. הרקמה מוסרת מהחיצון, והאפיתל והלמינה-פרופריה מתחתיו נקלפים באמצעות מלקחיים בגודל 5. חימום מאפשר עובי אחיד ואחיד באפיתל שנחתך ונוצר.

חדירה אקס-ויבו של GLP-1RA על אורומוקוזה בוקלית חזירית המותקנת ב-FDCs ובתוספות מודפסות בתלת-ממד
חדירה חיצונית של GLP-1RA הוערכה באמצעות ריר אפיתל רקמת הבוקלי של חזיר שהותקנה ב-FDCs ובהחדרות. כדי להעריך את יחס הריכוז האופטימלי של GLP-1 RA: GDC, HTCs המכילים כריות כותנה בשטח של 12.7 מ"מ הודבקו לצד התורם של הרירית שהותקנה ב-FDCs, ותערובת המשפרים של הפפטידים הושפכה על משטח הכותנה. החדירה המצטברת של GLP-1 RA הגיעה לכ-4.3% במשך 3 שעות כאשר GDC נכללה ביחס 1:1 (GLP-1RA 25 מ"ג: GDC 25 מ"ג). לעומת זאת, בהיעדר GDC, לא נצפה שטף GLP-1RA שניתן לזהות27. פרמטרי חדירות כמותיים, כוללאפליקציית P, מחושבים באמצעות הנוסחה הבאה:

Papp = figure-results-1

כאשר:
P app: מקדם חדירות נראה (cm/s).
dQ/dt: קצב ההובלה של ה-GLP-1RA במצב יציב, מחושב ככמות הפפטיד שהועברה ליחידת זמן (μg/s).
A: שטח של תוספת תלת-ממדית (ס"מ 2).
Co: הריכוז ההתחלתי של הפפטיד בתא התורם (האפיקלי) (μg/mL).

מקדם החדירות הנראה לכאורה (Papp) של GLP-1RA על פני רירית החזיר מוצג באיור המשלים 2. כאשר יחס GLP-1RA:GDC היה 1:1, אותם ריכוזים כמו ב-HTCs שולבו בסרטים דו-שכבתיים; עם זאת, חדירת GLP-1RA על רקמות בוקאליות חזיריות מבודדות לא הייתה ניתנת לכימות באמצעות מערכת FDC קונבנציונלית, שכן הצגת ה-GLP-1RA מהסרטים לריר איטית יותר מאשר מתערובות בתמיסה או מ-HTCs. כדי להתגבר על מגבלה זו, פותחו תוספות מותאמות אישית במודפס תלת-ממדי בנפח נמוך כדי להפחית את נפח המקלט ל-1.5 מ"ל, ובכך לשפר את רגישות הגילוי. באמצעות הכנסות תלת-ממדיות, החדירה המצטברת של GLP-1RA מסרטי בוקול לאורך 3 שעות הייתה מדידה והגיעה לכ-1.8%, כפי שמוצג באיור 5. ערכי TEER ושטפי FD-4 שימשו להערכת שלמות מחסום אפיתל וחדירות פאראתאלית. נרשמה ירידה תלויה בזמן ב-TEER (איור משלים 3) בקבוצות הטיפול, והיא התאימה לעלייה בחדירת GLP-1RA. PBS ורקמות שטופלו בסרט ריק לא הראה שינויים ב-TEER, מה שמעיד שמטריצת הסרט הדו-שכבתי לא הפריעה למחסום. נתונים אלה מצביעים על GDC כתורם העיקרי להשפעה המשפרת החדירה.

הערכה היסטולוגית של רקמת חזיר
בוצעה הערכה היסטולוגית של רירית החזיר מחוץ לחי כדי להעריך את השפעת שיטות בידוד הרקמות ולבחינת שלמות האפיתל לאחר חשיפה של 3 שעות ל-GLP-1RA ו-GDC. כפי שמוצג באיור 6, רקמות מבודדות טריות שהושגו בשיטת החימום שמרו על ארכיטקטורה פיזיולוגית אפיתל תקינה, עם שכבות שכבתיות שלמות וריר שטחי רציף, ולא הראו סימנים לנזק מבני. לעומת זאת, רקמות שבודדו בהפרדה מכנית או עברו אחסון/הקפאה הראו שינויים קלים במורפולוגיית תאי האפיתל והפחתה בעובי הריר הפני השטח. ריר בוקלי שנחשף ל-25 מ"ג GLP-1RA בנוכחות 25 מ"ג של GDC שמרו על שלמות אפיתל ודמו במידה רבה לביקורת לא מטופלת. נצפו רק בצקת קלה ושחיקה אפיתלית שטחית. חשיפה ל-GLP-1RA בלבד או ל-GLP-1RA: סרטים דו-שכבתיים טעונים ב-GDC לא גרמו לנזק רקמתי גלוי, ותכונות היסטולוגיות היו דומות לאלו של רקמות ביקורת שטופלו ב-PBS.

figure-results-2
איור 1: חלל הפה של חזיר המראה אזורים ריריים בוקאליים ותת-לשוניים. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה רחבה יותר של האיור.

figure-results-3
איור 2: FDCs ורכיבים. שישה תאים מותקנים במערכת משולבת (משמאל). אדם אחד, פרנץ סל, מוצג (באמצע). מערכת ההרכבה לרקמת בוקל בתא בודד (מימין). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 3: רכיבים של תוספות שרף בגודל 1 ס"מ2 מודפסות בתלת-ממד. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 4: זרימת עבודה לבידוד אפיתל בוקאלי חזיר, התקנה, חדירה ותהליכי אפיון היסטולוגי. נוצר ב-BioRender.com. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-6
איור 5: הכמות המצטברת של GLP-1 RA. הכמות המצטברת של GLP-1 RA בצד המקלט של רירית האפיתל הבוקלי של חזיר לאחר 180 דקות של יישום של 25 מ"ג/מ"ל GLP-1RA (אדום), 25 מ"ג/מ"ל GLP-1RA: 25 מ"ג/מ"ל תמיסת GDC (שחורה), ו-25 מ"ג/מ"ל GLP-1RA: 25 מ"ג/מ"ל GDC טעון בשכבות (סגולות) שהוחלו דרך HTC, FDC ותלת-ממד. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-7
איור 6: תמונות מיקרוסקופיות מוצבעות ב-HE של ריר אפיתל בוקלי חזיר בתנאי חשיפה שונים. (א) שכבה ריקה, (ב) תערובת מימית של GLP-1RA: GDC, (ג) סרטים כלואים ב-GLP-1RA:GDC, (ד) ריר מבודד מרקמה טרייה לאחר טיפול בחום (65 מעלות צלזיוס), (ה) אפיתל בוקלי מבודד מרקמה קפואה לאחר טיפול בחום, (F) ריר מבודד בשיטה מכנית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

הרכב שכבת הדבק המוריכלי
רכיביםריכוז (מ"ג)
GLP-1RA12.5 מ"ג
GDC12.5 מ"ג
HPMC45 מ"ג
Na-CMC10 מ"ג
PVP-K9025 מ"ג
גליצרול3 מ"ג
Aerosil 200F2 מ"ג
שכבת גיבוי
אתיל צלולוזה5 מ"ג
פרופילן גליקול5 מ"ג

טבלה 1: הרכב שכבות דבק ריריות ושכבות גיבוי של סרט בוקלי.

איור משלים 1: ספיחה של GLP-1RA לאחר דגירה של 0.5 מ"ג GLP-1RA למשך 6 שעות עם החדרות תלת-ממדיות. הנתונים הם ממוצע ± SD של שלושה ניסויים (n = 3).אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 2: מקדם חדירות לכאורה (Papp) של GLP-1RA לאחר חשיפה של 3 שעות לרקמת רירית הבוקלית של חזיר המותקנת בכניסות תלת-ממדיות. תמיסת GLP של 25 מ"ג/מ"ל (אדום), 25 מ"ג/מ"ל GLP + 25 מ"ג/מ"ל תמיסת GDC מימית (שחורה), ו-25 מ"ג/מ"ל GLP + 25 מ"ג/מ"ל GDC המשולב בשכבות בוקול (סגול). הנתונים המיוצגים הם ממוצע ± SD (n = 3). נצפתה מובהקות סטטיסטית בין קבוצות: p < 0.05. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 3: עמידות טרנסאפיתליאלית (TEER). הפחתה הדרגתית של עמידות טרנס-אפיתל (TEER) מרקמת אפיתל בוקאלית מבודדת של חזיר שנקבעה בהחדרות תלת-ממדיות, לאחר חשיפה לתמיסת GDC של 25 מ"ג/מ"ל GLP-1 + 25 מ"ג/מ"ל (אדום), 25 מ"ג/מ"ל GLP-1 + 25 מ"ג/מ"ל GDC בשכבות בוקליות (ירוק), ו-25 מ"ג/מ"ל GLP-1RA ב-PBS (כחול). אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 4: שלמות ודליפה של הרקמות. שלמות הרקמה ודליפת הרקמה הוערכו על ידי חשיפת רקמות אפיתל בוקאליות חזירים בתלת-ממד ל-0.05 מ"מ FD4 בצד התורם. הדגימות נמשכו במרווחים קבועים של 60 דקות במשך 6 שעות. ממוצע +SD של שלושה ניסויים. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 1: transwell-Oring-v7 (JOVE).stl.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 2: transwell-v9 (JOVE).stl.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 3: פרטים ניסיוניים נוספים.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

מתודולוגיה זו מתארת פרוטוקולים ניסיוניים לבידוד אפיתל בורקלי חזירי ואפיתל אורומוקוזילי אחר, יחד עם בדיקות חדירות לטיפולים מבוססי פפטידים, תוך שימוש באנלוג GLP-1RA יציב בעל עוצמה נמוכה כדוגמה30. פפטידים הם מקרומולקולות הידרופיליות עם חדירות זניחה על פני ממברנות ריריות17. הביצוע המוצלח של הפרוטוקול הנ״ל תלוי בבידוד מדויק ובהרכבה של הרירית הבוקלית והתת-לשונית. בידוד דורש מיומנות מיוחדת ושליטה קפדנית בטמפרטורה; אפילו תנודות תרמיות קלות במהלך תהליך החימום עלולות לגרום לשינויים פיזיולוגיים ומורפולוגיים מזיקים ברקמת האפיתל ולפגוע בשלמות נתוני החדירה. יתרה מזאת, קיבוע הרקמה המבודדת בתוך ההוספות המותאמות בתלת-ממד מהווה שלב קריטי. בהתחשב בעדינות השכבות האפיתליות, קיים סיכון גבוה יותר לקרע רקמתי או דליפה במהלך ההרכבה. כדי לצמצם זאת, השתמשנו בבדיקת דליפה FD4, המשמשת כאמצעי בקרת איכות להבטחת שלמות הממברנה לפני תחילת מחקרי הפלקס. דליפת FD4 הוערכה בתחילה חזותית ונמדדה עוד באמצעות ספקטרוסקופיה נראית UV. הנתונים המתאימים מסופקים בנתונים המשלימים (איור משלים 4 וקובץ משלים 3).

FDC קונבנציונלי, הנחשב לסטנדרט למחקרי אקס ויבו, לעיתים מציב אתגרים במדידת תרופות פפטידיות בשל נפחים גבוהים בתא המקלט, בדרך כלל 10 מ"ל. הנפח הגבוה מוביל לדילול מופרז של הדגימה, ודוחף את ריכוזי הפפטידים החודרים מתחת ל-LOD הנמוך יותר בשיטות אנליטיות סטנדרטיות. כדי להימנע מכך, פיתחנו תוספת חדשה מודפסת בתלת-ממד המדמה את קנה המידה והנפחים של מערכת הטרנסוולים המשמשת לשכבות מונולייריות של תאים אפיתליים, כוללCaco-2 31. ההכנסות יכולות להיות מונחות ישירות בלוחות תרבית רקמה סטנדרטיים של 12 בארים ולהכיל היטב את הריריות האפיתליות האפיתליות מבודדות של חזיר. שינוי זה מפחית משמעותית את נפח תא התורם כמעט פי 7 ל-1.5 מ"ל, ובכך מתמקד באנליט ומתגבר על מגבלות הרגישות של uHPLC. התאמה זו חשובה במיוחד לכימות תרופות פפטידיות יקרות וחדירות נמוכה.

נצפה עלייה בחדירות GLP-1 RA בנוכחות GDC באמצעות מערכת ההכנסה התלת-ממדית. הכמות המצטברת של GLP-1RA הגיעה ל-~55.3 מיקרוגרם ב-3 שעות, המקבילה ל-~4.3% מהריכוז הראשוני שהוחל על צד התורם. לעומת זאת, לא זוהה שטף מדיד של GLP-1 RA כאשר ריכוזים דומים של GLP-1RA ו-GDC הכלואים בשכבות בוקאליות יושמו על רירית בוקאלית שהותקנה ב-FDCs, מה שמרמז כי ייתכן שהתרחשה חדירות פפטידית אך נותרה בלתי ניתנת לזיהוי אנליטית עקב דילול יתר בנפח המקלט הגדול. עם זאת, החדירה המצטברת של GLP-1 RA מנוסחת הסרט הבוקלי הדו-שכבתי הגיעה לכ-1.8% ב-3 שעות בהחדרות תלת-ממדיות מעל 3 שעות, מה שמדגים את היתכנות זיהוי הובלת פפטידים ברמה נמוכה ברקמת הבוקול באמצעות צורות מינון באמצעות מערכת המקלט המוקטנת. החדירה החוצה של GLP-1 RA הוערכה גם היא באמצעות HTCs המכילים כרית כותנה טעונה בפפטיד וב-GDC. זהו אמצעי סינון ראשוני מאוד שימושי להוכחת הרעיון שהצגת פפטיד מסרטים עם מגביר חדירה אפשרית. ניתן לעקוב במהלך הניסוי על שלמות המחסום של אפיתל בוקאל חזיר באמצעות דליפת TEER ו-FD-4. נרשמה ירידה איטית ותלויה בזמן ב-TEER במהלך חשיפה לאגוניסט קולטני GLP-1 (GLP-1 RA), אשר תואם לעלייה בהובלה פארא-תאית הנגרמת ברירית בוקול על ידי מלח המרה32.

מגבלה של טכניקה זו היא הסתמכות על רקמת חזיר טרייה, שלא תמיד זמינה לפי דרישה בבתי מטבחיים, ואיכות הרקמה יכולה להיות משתנה. כדי להתמודד עם המגבלות של השגת רקמה טרייה במרחק סביר מהמעבדה, הערכנו את ההגנה לקריופרוטקציה לאחסון דגימות איכותיות שנוכל להשתמש בהן מאוחר יותר. בעוד ששימוש ברקמה טרייה הוא אופטימלי, השימוש ברקמות ריריות מבודדות ומאוחסנות דורש שימוש זהיר בחומרים קריופרוטקטנים ובקצבי הקפאה כדי למנוע היווצרות גבישי קרח ונזק למחסום בעקבותיו. לפרוטוקול יש את היכולת לגשר על הפער בין מחקרי חדירות בקנה מידה מאקרו סטנדרטיים לניתוח פפטידים ברגישות גבוהה. על ידי אופטימיזציה של תהליך בידוד הרקמות ופרוטוקול החדירה באמצעות החדרות תלת-ממדית, השגנו רמת שחזוריות ורגישות גבוהה יותר מזו שמדווחת בדרך כלל אצל FDCs. יתרה מזאת, השימוש בהכנסות תלת-ממדיות מספק מסגרת לחוקרים לקבוע מגבלות גילוי למולקולות פפטידיות יקרות, מה שמייצג שיפור משמעותי בגמישות ובקצב התנועה של מחקר רירית אקס ויבו.

פרוטוקולים אלו מספקים בסיס למדידה אמינה של חדירות רקמת רירית באמצעות סוגי תרופות מעבר לפפטידים. היכולת ליצור פרופילי חדירה ברזולוציה גבוהה ממודלים אקס ויבו תסייע בניבוי נתוני ספיגה פרה-קלינית שמקורם במודלים של בעלי חיים. חדירות ה-GLP-1 RA ex vivo הוערכה גם באמצעות HTCs המכילים כרית כותנה עמוסה בפפטיד ו-GDC, תמיסת משפרת חדירה. גישה זו הבטיחה מגע אינטימי וניתן לשחזור בין התערובת למשטח הרירי. נצפתה עלייה משמעותית בחדירת GLP-1RA ביחס 1:1 של GDC בהקלטות תלת-ממדיות המחקות טרנסוולס. זהו מכשיר סינון שימושי מאוד להוכחת הרעיון שהצגת פפטיד מסרטים עם מגביר חדירות יכולה להיות אפשרית בעיצוב בנוי המותאם ממונו-שכבות מתורבתות של תאי אפיתל לריר רקמה. ניתן לעקוב במהלך הניסוי על שלמות המחסום של אפיתל החזיר באמצעות מדידת TEER ודליפת FD4.

בסך הכול, חדירות ex vivo וההערכות היסטולוגיות מראות כי הערכה אמינה של העברת פפטידים בוקלית ותת-לשונית בנוכחות משפר חדירה תלויה בהכנת רקמות, פרוטוקולי פלקס ורגישות אנליטית. מבין גישות הבידוד שנבדקו, הפרדה של אפיתל חזיר טרי ואפיתל תת-לשוני באמצעות שיטת חום סיפקה איזון טוב בין שמירה על שלמות האפיתל לבין שחזור הניתוח של הרקמות, כפי שניתן לראות ב-TEER בסיסי יציב, דליפת FD4 מינימלית ומבני תאי רקמה משומרים. חשוב לציין שההוספה המודפסת בתלת-ממד שיפרה משמעותית את אמינות הניסוי על ידי הפחתת דילול תא המקלט, ואפשרה כימות של זרמי פפטיד נמוכים שלא היו ניתנים לזיהוי ב-FDCs. ביחד, ממצאים אלו תומכים בשימוש בריריות אפיתליות בוקאליות מבודדות בחור בתא החדרת רקמה כפלטפורמה אקס ביבו להערכת מתן פפטידים טיפוליים בבוקלי למתן מערכת מערכתית.

גילויים

למחברים אין מעורבות כספית או ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

המחברים מודים לבן שובלין (בית הספר לרפואה וטרינרית באוניברסיטת UCD) על הסיוע הטכני. אנו גם מודים לד"ר הנס אקהארדט (בית הספר לכימיה של UCD) על התמיכה בניתוח uHPLC. הפרויקט הזה קיבל מימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon Europe של האיחוד האירופי במסגרת מענק מספר 101071054. אנו גם מודים לתמיכה מימונית נוספת ממענק מספר 13/RC/2073_P2, ממרכז CURAM למכשירים רפואיים Research Ireland, וקרן הפיתוח האירופית. המחברים רוצים להודות לקנת מקנמרה מ-Rosderra Irish Meats על אספקת לחיים חזיריות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מחשב / מחשב ניידגנריכל מערכת סטנדרטית≥8 GB RAM מומלץ
תסריט רכישת נתוניםמותאם אישיתcollect.pyתסריט רכישה מבוסס Python
אלקטרודות ג'ל חד פעמיותגנריאלקטרודות Ag/AgCl מגולגלות מראשחד פעמיות, דבקות
מודול רכישת EEGUpside Down LabsBioAmp EXG Pillחזית אנלוגית לאותות פוטנציאל ביולוגי
ג'ל אלקטרודות (אם משתמשים באלקטרודות לשימוש חוזר)גנריג'ל מוליךמשפר את מוליכות האות
יישום אינטראקטיבי (משחק)גנריכל משחק פשוט (למשל, מירוץ)ממשק הנשלט באמצעות מקלדת
חוטי מחברגנרימחברים זכר–נקבהחוטי לחם סטנדרטיים
Matplotlib / Seabornקוד פתוחהגרסאות האחרונותספריות ויזואליזציה
לוח בקרה מיקרוArduinoUno / Maker UnoADC של 10 ביט, ממשק USB
סביבת תכנות Pythonקרן תוכנת PythonPython ≥3.8שפת תכנות בקוד פתוח
ספריית PyTorchMeta AIגרסה ≥1.12מסגרת למידת עמוק
Scikit-learnקוד פתוחהגרסה היציבה האחרונהכלי ML
ספריות עיבוד אותותSciPyהגרסה האחרונהסינון, STFT
כבל USBגנריUSB Type-A עד Bכבל העברת נתונים

מקורות

  1. Karki, S., et al. Oromucosal films for peptide delivery: formulation strategies using permeation enhancers and polymers. Drug Deliv Transl Res. , (2025).
  2. Karavasili, C., Eleftheriadis, G. K., Gioumouxouzis, C., Andriotis, E. G., Fatouros, D. G. Mucosal drug delivery and 3d printing technologies: a focus on special patient populations. Adv Drug Deliv Rev. 176, 113858(2021).
  3. Brayden, D. J., Hill, T., Fairlie, D., Maher, S., Mrsny, R. Systemic delivery of peptides by the oral route: formulation and medicinal chemistry approaches. Adv Drug Deliv Rev. 157, 2-36 (2020).
  4. Al Musaimi, O. FDA's stamp of approval: unveiling peptide breakthroughs in cardiovascular diseases, ACE, HIV, CNS, and beyond. J Pept Sci. 30 (11), e3627(2024).
  5. Lewis, A. L., McEntee, N., Holland, J., Patel, A. Development and approval of Rybelsus (oral semaglutide): ushering in a new era in peptide delivery. Drug Deliv Transl Res. 12 (1), 1-6 (2022).
  6. Zhang, Y., Zhang, H., Ghosh, D., Williams, R. O. Just how prevalent are peptide therapeutic products? a critical review. Int J Pharm. 587, 119491(2020).
  7. Wanasathop, A., Patel, P. B., Choi, H. A., Li, S. K. Permeability of buccal mucosa. Pharmaceutics. 13 (11), 1814(2021).
  8. Mazzinelli, E., et al. Oral mucosa models to evaluate drug permeability. Pharmaceutics. 15 (5), 1559(2023).
  9. Djekic, L., Martinovic, M. In vitro, ex vivo and in vivo methods for characterization of bioadhesiveness of drug delivery systems. Bioadhesives Drug Deliv. , (2020).
  10. Mura, P., et al. A preliminary study for the development and optimization by experimental design of an in vitro method for prediction of drug buccal absorption. Int J Pharm. 547 (1-2), 530-536 (2018).
  11. Majid, H., Bartel, A., Burckhardt, B. B. Development, validation and standardization of oromucosal ex-vivo permeation studies for implementation in quality-controlled environments. J Pharm Biomed Anal. 194, 113769(2021).
  12. Wakchaure, R. S., Dhial, K., Pathak, A. Ethical and Safety Considerations in Drug Delivery Systems. Next-Generation Drug Delivery Systems. , Springer, Humana. New York, NY. (2025).
  13. Wang, S., Zuo, A., Guo, J. Types and evaluation of in vitro penetration models for buccal mucosal delivery. J Drug Deliv Sci Technol. 61, 102122(2021).
  14. Sa, G., et al. Histological features of oral epithelium in seven animal species: as a reference for selecting animal models. Eur J Pharm Sci. 81, 10-17 (2016).
  15. Patel, V. F., Liu, F., Brown, M. B. Modeling the oral cavity: in vitro and in vivo evaluations of buccal drug delivery systems. J Control Release. 161 (3), 746-756 (2012).
  16. Tian, Y., et al. Oromucosal films: from patient centricity to production by printing techniques. Expert Opin Drug Deliv. 16 (9), 981-993 (2019).
  17. Malhotra, S., Lijnse, T., O'cearbhaill, E., Brayden, D. J. Devices to overcome the buccal mucosal barrier to administer therapeutic peptides. Adv Drug Deliv Rev. 220, 115572(2025).
  18. De Vries, M. E., et al. Localization of the permeability barrier inside porcine buccal mucosa: a combined in vitro study of drug permeability, electrical resistance and tissue morphology. Int J Pharm. 76 (1-2), 25-35 (1991).
  19. Diaz Del Consuelo, I., Pizzolato, G. P., Falson, F., Guy, R. H., Jacques, Y. Evaluation of pig esophageal mucosa as a permeability barrier model for buccal tissue. J Pharm Sci. 94 (12), 2777-2788 (2005).
  20. Pather, S. I., Rathbone, M. J., Şenel, S. Current status and the future of buccal drug delivery systems. Expert Opin Drug Deliv. 5 (5), 531-542 (2008).
  21. Junginger, H. E., Hoogstraate, J. A., Verhoef, J. C. Recent advances in buccal drug delivery and absorption—in vitro and in vivo studies. J Control Release. 62 (1-2), 149-159 (1999).
  22. Goswami, T., Jasti, B. R., Li, X. Estimation of the theoretical pore sizes of the porcine oral mucosa for permeation of hydrophilic permeants. Arch Oral Biol. 54 (6), 577-582 (2009).
  23. Otali, D., Fredenburgh, J., Oelschlager, D., Grizzle, W. A. Standard tissue as a control for histochemical and immunohistochemical staining. Biotech Histochem. 91 (5), 309-326 (2016).
  24. Franz-Montan, M., et al. Evaluation of different pig oral mucosa sites as permeability barrier models for drug permeation studies. Eur J Pharm Sci. 81, 52-59 (2016).
  25. Pegg, D. E. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. , Springer, Humana. New York, NY. (2014).
  26. Hoogstraate, A., et al. In vivo buccal delivery of fluorescein isothiocyanate-dextran 4400 with glycodeoxycholate as an absorption enhancer in pigs. J Pharm Sci. 85 (5), 457-460 (1996).
  27. Karki, S., et al. A pullulan-based bilayer film for buccal delivery of a GLP-1 peptide analogue. Carbohydr Polym. 380, 125064(2026).
  28. Shu, W., et al. Computational and experimental analysis of drug-coated microneedle skin insertion: the mode of administration matters. Adv Mater Interfaces. 12 (17), 2500202(2025).
  29. Marxen, E., Axelsen, M. C., Pedersen, A. M. L., Jacobsen, J. Effect of cryoprotectants for maintaining drug permeability barriers in porcine buccal mucosa. Int J Pharm. 511 (1), 599-605 (2016).
  30. Rebollo, R., et al. Salcaprozate-based ionic liquids for GLP-1 gastric delivery: a mechanistic understanding of in vivo performance. J Control Release. 377, 267-276 (2025).
  31. Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nat Protoc. 2 (9), 2111-2119 (2007).
  32. Brayden, D. J., Stuettgen, V. Sodium glycodeoxycholate and sodium deoxycholate as epithelial permeation enhancers: in vitro and ex vivo intestinal and buccal bioassays. Eur J Pharm Sci. 159, 105737(2021).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ex vivoperformans
מודל אורומוקוסלי תקן של חזיר ex vivo להערכת זרמי פפטידים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.