זיהוי גני Hub, פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים ומטרות תרופתיות פוטנציאליות בסרטן השד באמצעות ניתוח טרנסקריפטומי

Summary

מחקר זה חקר גנים הקשורים ללחץ חמצוני מיטוכונדריאלי הקשורים לעמידות טיפולית בסרטן השד החיובי ל-HER2. באמצעות מערכי נתונים טרנסקריפטומיים, ביואינפורמטיקה משולבת ונתונים קליניים (n = 4,929), זיהו המחברים את MTHFD2 ו-PRDX3 כגנים מרכזיים המובעים באופן דיפרנציאלי עם ערך פרוגנוסטי פוטנציאלי. בסיליקו. ניתוחים מצביעים על השפעות פונקציונליות של וריאנטים גנטיים.

Abstract

סרטן השד ^{HER2-חיובי} (HER2+) מפתח לעיתים עמידות לטיפולים כמו לפטיניב, שעשוי לכלול תכנות מחדש מטבולי וחימצון חיזוקי של המיטוכונדריה. מחקר זה נועד לזהות גנים הקשורים ללחץ חמצוני מיטוכונדריאלי (MOS-DEGs) כסמנים ביולוגיים של עמידות ולאפיין את ה-nsSNPים הפונקציונליים שלהם ואת ההשפעות המבניות שלהם. מערכי נתונים של RNA-seq (GSE231524, GSE231525) נותחו באמצעות DESeq2 לזיהוי DEGs, אשר נחתכו עם גנים של לחץ חמצוני מיטוכונדריאלי לקבלת MOS-DEGs. בוצעו העשרה פונקציונלית, ניתוח PPI, ניתוח ROC, פרופיל ביטויים וניתוח הישרדות. nsSNPs הוערכו באמצעות כלים חיזויים מרובים, וההשפעות המבניות הוערכו באמצעות מודלים משניים ותלת-ממדיים. ניתוח טרנסקריפטומי וקליני משולב זיהה את MTHFD2 ו-PRDX3 כ-MOS-DEGs מרכזיים המציגים תפקידים רגולטוריים מנוגדים במטבוליזם רדוקס מיטוכונדריאלי. MTHFD2 היה מוסדר משמעותית והיה קשור לתחזית לקויה (HR = 1.53, p = 1.1 × 10⁻¹⁶), בעוד PRDX3 הראה דפוסי ביטוי מגנים (HR = 0.73, p = 7.7×10⁻¹⁰). ניתוח ROC הציע את הפוטנציאל שלהם כמנבאים לתגובה טיפולית. ניתוח nsSNP חשף חמישה וריאנטים מזיקים ב-MTHFD2 וארבעה וריאנטים מזיקים ב-PRDX3, כאשר rs1471336772 (MTHFD2) ו-rs747786383 (PRDX3) זוהו כפתוגניים ביותר. וריאנטים אלו צפויים להיות מזיקים בהתבסס על מספר מערכות ניקוד חישובית, כולל SIFT ≤ 0.05, PolyPhen-2 ≥ 0.85, ציוני CADD מזיקים וציוני REVEL גבוהים, והיו ממוקמים בתוך דומיינים קטליטיים או פעילים לחמצון רדוקס. מודלים מבניים הציעו כי החלפות אלו עשויות לערער את הקונפורמציה, לשבש אתרי קישור למתכת ולקו-פקטורים, ולהשפיע על התחדשות NADPH או על פעילות פרוקסידאז התלויה בתיורדוקסין. תחזיות דינמיקה מולקולרית הצביעו על אובדן פוטנציאלי של יציבות מבנית וגמישות משתנה, מה שמרמז על פגיעה תפקודית אפשרית בשליטה על רדוקס במיטוכונדריה. מחקר זה מזהה את MTHFD2 ו-PRDX3 כרגולטורים של לחץ חמצוני מיטוכונדריאלי בסרטן השד ^HER2+ . nsSNPs מזיקים בגנים אלו עשויים לתרום לשינוי באיזון החמצון האדום, מה שעלול להשפיע על הסתגלות מטבולית (MTHFD2) והגנה נוגדי חמצון (PRDX3).

Introduction

סרטן השד הוא הסרטן המאובחן ביותר בנשים ברחבי העולם וגורם מרכזי לתמותה הקשורה לסרטן, למרות התקדמות משמעותית בגילוי מוקדם ובטיפולים ממוקדים ^1,2,3. הטרוגניות מולקולרית בגידולי השד מהווה בסיס לתוצאות קליניות מגוונות ותגובות טיפוליות, ומציבה אתגרים מתמשכים לאונקולוגיה מדויקת ^4,5. מבין תתי-הסוגים המולקולריים המוכרים, סרטן השד החיובי של פקטור גדילה אפידרמלי 2 (HER2) האנושי אחראי לכ-15–20% מכלל סוגי סרטן השד ומאופיין בהגברה וביטוי יתר של קולטן HER2 טירוזין קינאז ^6,7. למרות שטיפולים ממוקדי HER2, כגון טרסטוזומאב ולפטיניב, שיפרו משמעותית את הפרוגנוזה של המטופלים, עמידות ראשונית ונרכשת לתרופות אלו מופיעה לעיתים קרובות, מה שמוביל להישנות הגידול ולהתקדמות המחלה^. הבנת המנגנונים המולקולריים שמניעים עמידות לטיפול HER2 נותרה צורך מרכזי שטרם נענה באונקולוגיה הקלינית.

ראיות מתפתחות מצביעות על כך שתפקוד לקוי של המיטוכונדריה ולחץ חמצוני ממלאים תפקידים קריטיים בתיווך עמידות לתרופות בסרטן השד. מיטוכונדריה, מעבר לתפקידן הקנוני בייצור ATP, הן רגולטורים מרכזיים של אפופטוזיס, איתות רדוקס ופלסטיות מטבולית — כל התהליכים שתאי סרטן מנצלים כדי לשרוד לחץ טיפולי. במיוחד, תאי סרטן HER2⁺ עמידים מראים שינוי מטבולי לכיוון פוספורילציה חמצונית (OXPHOS), חיפוץ מוגבר של מיני חמצן תגובתי (ROS), ושינוי ביוגנזה מיטוכונדריאלית. התאמות אלו מאפשרות לתאים לשמור על איתות הישרדות ולהתחמק מאפופטוזיס למרות עיכוב ממושך של מסלולי איתות HER2. גנים המקודדים תת-יחידות מורכבות של מיטוכונדריה ואנזימים המווסתים חמצון אדום הם לכן סמנים ביולוגיים פוטנציאליים ומטרות טיפוליות להתגברות על העמידות.

במקביל, פולימורפיזמים חד-נוקלאוטידיים (nsSNPs) לא נרדפים בגנים הקשורים ללחץ מיטוכונדריאלי או חמצוני יכולים לשנות את מבנה ותפקוד החלבון, ולהשפיע על פעילות האנזים, תגובת התרופות ורגישות למחלה¹⁰. חיזוי חישובי של ההשפעות המזיקות של nsSNPs באמצעות סיליקו.כלים כמו SIFT, PolyPhen-2 ו-CADD מספקים אמצעי מהיר לזיהוי וריאנטים פונקציונליים שעשויים לתרום להטרוגניות לסרטן ולעמידות טיפולית. שילוב נתונים טרנסקריפטומיים ומוטציונליים מציע אפוא מבט רב-ממדי על חוסר ויסות גנים ושינויים מבניים הן ברמות השעתוק והן ברמות הגנומיות.

התקדמות אחרונה בביואינפורמטיקה ובביולוגיה מערכתית אפשרה זיהוי מהיר של גנים פוטנציאליים למניעים באמצעות פרופיל ביטוי בקנה מידה גדול וניתוח מבוסס רשת. מאגרים ציבוריים כמו Gene Expression Omnibus (GEO) מספקים מאגרי נתונים יקרי ערך של ריצוף RNA הלוכדים שינויים מולקולריים במודלים ניסיוניים ובקבוצות מטופלים. בשילוב עם כלים אנליטיים כמו DESeq2, clusterProfiler וניתוח רשת STRING–Cytoscape, משאבים אלו מאפשרים אפיון מקיף של גנים מבוטאים באופן שונה (DEGs), העשרת מסלולים וגילוי גנים מרכזיים. חשוב לציין, שילוב חתימות גנים של לחץ חמצוני מיטוכונדריאלי עם DEGs יכול להאיר מנגנונים מולקולריים חדשים העומדים בבסיס עמידות טיפולית ממוקדת HER2 ולזהות סמנים ביולוגיים מועמדים להתערבות טיפולית.

ציר ההתנגדות המונע על ידי HER3 זכה לאחרונה לתשומת לב כמסלול פיצוי מרכזי לאחר עיכוב HER2. הפעלת HER3 משחזרת את איתות PI3K/AKT במורד הזרם, ומקדמת הישרדות תאית וסבילות לתרופות (איור 1). ה-DUSP6 (פוספטאז 6 עם ספציפיות כפולה), רגולטור שלילי של איתות ERK, נחשב למעורב בוויסות תגובה אדפטיבית זו. עיכוב DUSP6 מפעיל מחדש את איתות ERK ועשוי לנטרל את ההתנגדות המתווכת על ידי HER3, אך האינטראקציה שלו עם לחץ חמצוני מיטוכונדריאלי והסתגלות מטבולית עדיין לא מובנים מספיק. לכן, ניתוחים השוואתיים של קווי תאים HER2⁺ (BT474 ו-MDA-MB-453) תחת עיכוב DUSP6 וחשיפה כרונית ללפטיניב מהווים מודל אידיאלי לפירוק הגורמים המולקולריים של עמידות תרופתית.

איור 1. ייצוג סכמטי של הנוף המולקולרי המקשר בין תפקוד לקוי של מיטוכונדריה, לחץ חמצוני והתקדמות סרטן השד. מנגנונים מולקולריים אלו שילבו מאחורי אונקוגנזה המופעלת על ידי לחץ חמצוני מיטוכונדריאלי בסרטן השד. קומפלקסים של שרשרת העברת אלקטרונים במיטוכונדריאה, במיוחד הכוללים DUFS3, UQCRC1, COX4I1, SDHA ו-ATP5PO. מובילים לייצור יתר של מיני חמצן תגובתי (ROS), מה שמוביל לנזק חמצוני DNA, חמצון ליפידים ופגיעה בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית. הפרעות חמצוניות אלו מפעילות מסלולי איתות אונקוגניים כגון PI3K/AKT, MAPK ו-NF-κB, תוך דיכוי רגולטורים אפופטוטיים כמו p53 ו-BAX, ובכך מקדמות הישרדות תאי הגידול, התרבות והתחמקות חיסונית. הדיאגרמה מדגישה גם את ההשפעה הכפולה של לחץ חמצוני מיטוכונדריאלי על מטבוליזם הסרטן ועל מיקרו-סביבת הגידול, ומדגיש את תרומתו לעמידות לטיפול ולמודולציה חיסונית במצבי סרטן השד HER2+. מודל אינטגרטיבי זה מהווה את הבסיס המכניסטי לניתוחים טרנסקריפטומיים ומבוססי SNP מאוחרים יותר, שמטרתם לזהות גנים של מניעי מיטוכונדריה ומטרות טיפוליות פוטנציאליות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

המחקר הנוכחי נועד לזהות באופן שיטתי גני האב, nsSNPs פונקציונליים, ומטרות תרופתיות פוטנציאליות הקשורות לעקוץ חמצוני מיטוכונדריאלי בסרטן השד HER2⁺ . על ידי שילוב נתונים טרנסקריפטומיים מ-GSE231524 ו-GSE231525 עם סטים של גנים מיטוכונדריאליים ומחמצניים הקשורים למתח חמצוני, המחקר הנוכחי נועד להגדיר גנים מבוטאים באופן דיפרנציאלי (MOS-DEGs) הקשורים ללחץ חמצוני מיטוכונדריאלי התורמים לעמידות לטיפול. ניתוחים במורד הדרך כללו העשרת מסלולי GO (GO) ו-KEGG, בניית רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI), עדיפות גנים מרכזיים וניתוח קורלציה הישרדותית באמצעות מאגר האימונותרפיה קפלן–מאייר. יתרה מזאת, גנים מרכזיים נחקרו לעומק עבור שונות ב-nsSNP והשפעה מבנית פוטנציאלית לזיהוי השלכות פונקציונליות מונעות מוטציה.

על ידי שילוב פרופיל טרנסקריפטומי, ביולוגיית רשת וניתוח מוטציות בסיליקו, מחקר זה מספק מסגרת משולבת לגילוי סמנים ביולוגיים מיטוכונדריאליים פוטנציאליים ומטרות טיפוליות בסרטן השד HER2⁺ . זיהוי גני המרכז הקשורים לזרחון חמצוני ו-SNPים פונקציונליים עשוי לסלול את הדרך לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות מדויקות להתמודדות עם עמידות לתרופות ממוקדות HER2 ולשיפור תוצאות המטופלים.

Protocol

שליפת נתונים ועיבוד מוקדם

מחקר זה נערך באמצעות נתונים טרנסקריפטומיים וגנטיים זמינים לציבור; לא היו מעורבים ישירות בבני אדם או בעלי חיים. מערכי נתונים טרנסקריפטומיים הרלוונטיים לעמידות לטיפול בסרטן HER2⁺ נאספו ממאגר NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)¹¹. שני מערכי נתונים של RNA-seq, GSE231524 ו-GSE231525, נבחרו בשל המיקוד הספציפי שלהם בעמידות מונעת HER3 ובעיכוב DUSP6 בקווי תאי סרטן השד HER2+ (BT474 ו-MDA-MB-453). מערכי הנתונים הללו כללו פנוטיפים הוריים, עמידים לתרופות ועמידים לתרופות שמקורם בחשיפה ללפטיניב (1 מיקרומול) והפלת DUSP6. מטריצות הספירה הגולמיות וקבצי המטא-דאטה המתאימים ניגשו באמצעות חבילות GEOquery (v2.70.0) ו-Biobase (v2.62.0) ב-RStudio (v4.3.2)¹². המטא-דאטה נאספו כדי להגדיר שני הבדלים עיקריים לכל מאגר נתונים: GSE231524 השוו את הביקורת (BT474 הורה, יום 0) עם מדגמים עמידים לתרופות ועמידות לתרופות (יום 9–חודש 9), בעוד GSE231525 השוו את הביקורת (Scrambled siRNA) עם DUSP6 knockdown (DUSP6-KD). בקרת איכות ונירמול נתונים בוצעו באמצעות מסגרת DESeq2 (v1.42.0), המיישמת טרנספורמציה מייצבת שונות (VST) להפחתת הטרוסקאדסטיות ולהבטיח השוואה בין דגמים. התפלגות הנתונים ודפוסי אשכולות הוערכו ויזואלית באמצעות ggplot2 (v3.5.0) ו-pheatmap (v1.0.12) כדי לאשר אחידות נתונים ולזהות חריגים פוטנציאליים לפני ניתוח ביטויים דיפרנציאליים^13,14.

במחקר זה נשמרה הבחנה ברורה בין ממצאים שמקורם במאגרי נתונים של קו תאים לבין אלו שהתקבלו ממאגרי נתונים קליניים שמקורם במטופלים. נתוני קו התאים שימשו בעיקר לניתוח חקר, כולל זיהוי גנים המובעים באופן שונה ויצירת תובנות מכניות ראשוניות במודלים ניסיוניים מבוקריים. לעומת זאת, מאגרי נתונים שמקורם במטופלים שימשו לאימות חיצוני של דפוסי ביטוי גנים ולהערכת הרלוונטיות הקלינית, כולל הערכה פרוגנוסטית. בהתאם לכך, תוצאות ממודלים של קווי תאים ומקבוצות קליניות מפורשות בנפרד כדי למנוע הכללה מוגזמת ולהבטיח הקשר תרגומי מתאים לכל הממצאים.

ניתוח ביטוי גנים שונה

בוצע ניתוח ביטוי שונה לזיהוי גנים שהוסתו באופן מובהק בין תנאי הביקורת לתנאי הטיפול. ספירות מנורמלות עובדו באמצעות מודל רגרסיה מותאם (ARM) המשולב ב-DESeq2 להערכת שינויים מדויקים ב-log₂ והמובהקות הסטטיסטית. נוסחת העיצוב הוגדרה כ-~תנאי, המייצגת את קבוצת הביקורת מול קבוצות מטופלות. גנים עם ערך p מותאם (FDR) < 0.05 ושינוי קפל אבסולוטי של log₂ ≥ 1 נחשבו כביטויים באופן שונה באופן משמעותי. התכווצות שינוי קיפול בוג₂ בוצעה באמצעות שיטת apeglm לשיפור החוסן בהערכת גודל האפקט. תוצאות הניתוח הוצגו באמצעות EnhancedVolcano (v1.22.0)¹⁵ ו-ggplot2¹⁶, שיצרו גרפים של הרי געש וגרפים MA המציגים את הקשר בין גודל הביטוי לביטחון סטטיסטי. הערכות פיזור הוערכו גם בתוך DESeq2 כדי להבטיח מידול שונות מדויק ונרמול עקבי בין שכפולים ביולוגיים¹⁷.

שליפת וזיהוי גנים המובענים בהפרעות (MOS-DEGs) הקשורים ללחץ חמצוני מיטוכונדריאלי

כדי לחקור את הקשר בין מטבוליזם אנרגטי, לחץ חמצוני ועמידות לתרופות, נאספה רשימה מקיפה של גנים הקשורים למתח מיטוכונדריאלי וחמצוני ממספר מאגרי נתונים, כולל Human MitoCarta3.0¹⁸ (https://personal.broadinstitute.org/scalvo/MitoCarta3.0/human.mitocarta3.0.html), Gene Ontology (GO:0006979, תגובה ללחץ חמצוני) (http://geneontology.org/), מסלול הזרחון החמצוני של אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) (https://www.genome.jp/kegg/), ומאגר הגנים של לחץ חמצוני אנושי (HOSGDB) (http://hosgdb.com/). כל הגנים שנאספו תוקנו לסמלי גנים מאושרים על ידי HGNC באמצעות אורג. Hs.eg.db (v3.18.0) ו-AnnotationDbi (v1.64.0), בעוד שרשומות כפולות, פסאודוגנים ו-RNA לא מקודדים הוסרו כדי להבטיח דיוק ההערות. פאנל הגנים ללחץ חמצוני מיטוכונדריאלי שנבחר (MOS genes) שימש לאחר מכן כמערך ייחוס לאינטגרציה עם הגנים המובעים באופן שונה שזוהו משני מערכי הנתונים הטרנסקריפטומיים.

החיתוך בין רשימת הגנים המאוצרת של MOS עם ה-DEGs שהתקבלו מ-GSE231524 ו-GSE231525 בוצע ב-R באמצעות פונקציות dplyr (v1.1.3)¹⁹ ו-base R intersect(). גישה אינטגרטיבית זו אפשרה זיהוי MOS-DEGs, המייצגים גנים הקשורים פונקציונלית למטבוליזם מיטוכונדריאלי, ויסות רדוקס, והסתגלות ללחץ חמצוני. החפיפה בין מערכי הנתונים הוצגה באמצעות חבילת VennDiagram (v1.7.3) ב-R כדי להמחיש גנים משותפים וייחודיים במודלים הניסיוניים²⁰. הרשימה המשופרת של MOS-DEGs שימשה לניתוחים במורד הזרם, וסיפקה תובנות מכניות לגבי התכנות מחדש השעתוק והמטבולי שמאחורי ההתנגדות לטיפול ממוקד HER2.

פרופיל ביטויים והדמיה של MOS-DEGs

פרופיל ביטוי של MOS-DEGs שזוהו בוצע באמצעות חבילות ComplexHeatmap (v2.18.0)²¹ ו-pheatmap (v1.0.12) ב-RStudio כדי להמחיש דפוסי ביטוי גלובליים במצבים הוריים, עמידים לתרופות ועמידות. נתוני ספירה מנורמלים עברו שינוי באמצעות קנה מידה של ציון z כדי לתקן את מטריצת ביטוי הגנים בין דגמים. האשכולות בוצעו באמצעות שיטות מרחק אוקלידיות וקישוריות מלאות לזיהוי דפוסי הבעה משותפים ולהבחין בין פרופילים תעתוק ספציפיים למצב. מפות חום וגרפים של אשכולות נוצרו באמצעות ggplot2 כדי להבטיח הבדל חזותי ברור בין התנאים. גישה זו של ויזואליזציה אפשרה זיהוי קבוצות גנים הקשורות לפעילות מיטוכונדריאלית, ויסות לחץ חמצוני ותכנות מחדש מטבולי במצבים עמידים לתרופות.

העשרה פונקציונלית והערת מסלולים

כדי לחקור את המשמעות הביולוגית והמנגנונים הרגולטוריים של MOS-DEGs שזוהו, נערכו ניתוחי העשרה של Gene Ontology (GO) ואנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) באמצעות R Studio (גרסה 4.3.1). הניתוחים בוצעו בסביבת tidyverse תוך שימוש בחבילות Bioconductor מרובות לחישוב והמחשה ניתנים לשחזור. הערות גנים ומיפוי מזהים בוצעו באמצעות הארגון. Hs.eg.db מסד נתונים (https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db/) המבוסס על גנום ההתייחסות של הומו סאפיינס (GRCh38). ניתוח העשרת GO בוצע באמצעות חבילת clusterProfiler (גרסה 4.8.1; https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/), שמסווגת גנים לשלוש אונטולוגיות עיקריות—תהליך ביולוגי (BP), רכיב תאי (CC) ותפקוד מולקולרי (MF). פונקציית enrichGO²² שימשה עם פרמטרים שהוגדרו לערך p < 0.05 וערך p מותאם. (FDR) < 0.05, תוך יישום שיטת תיקון בנג'מיני–הוכברג. ויזואליזציות, כולל גרפי בר, גרף נקודות ודיאגרמות אקורד, נוצרו באמצעות enrichplot (https://bioconductor.org/packages/enrichplot/), ggplot2¹³ (https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/) ו-GOplot (https://cran.r-project.org/web/packages/GOplot/). כלים אלו סיפקו מבט מובנה על מונחי GO המועשרים והקשרים הגנים שלהם.

העשרת מסלולי KEGG בוצעה באמצעות פונקציית enrichKEGG() בתוך חבילת clusterProfiler, בהתייחסות למסד הנתונים האנושי של KEGG (https://www.genome.jp/kegg/). חבילת KEGGREST (https://bioconductor.org/packages/KEGGREST/) שימשה לשליפת נתוני מסלולים והערות על הערות. מסלולים עם ערך p מתוקן. (q-value) < 0.05 נחשבו משמעותיים. ויזואליזציה ומיפוי מסלולים בוצעו באמצעות PathView (https://bioconductor.org/packages/pathview/), ggplot2 ו-enrichplot, בעוד ש-igraph ו-ggraph שימשו לייצוג רשת²³. כל ניתוחי ההעשרה והוויזואליזציות יושמו ב-R Studio (v4.3.1) באמצעות קוד שכפול ותהליכי עבודה סטנדרטיים של Bioconductor, מה שהבטיח זיהוי אמין של קטגוריות פונקציונליות מועשירות ונתיבים ביולוגיים הקשורים ל-MOS-DEGs.

אימות מבוסס ROC של סמנים ביולוגיים חזויים בסרטן השד

כדי לאמת את כוח החיזוי הקליני של MOS-DEGs, בוצע ניתוח עקומת מאפיין תפעול מקלט (ROC) באמצעות כלי ROCplotter מקוון (https://www.rocplot.org/)²⁴. ROCplotter היא פלטפורמה משולבת מבוססת רשת המשלבת נתוני ביטוי גנים עם מערכי תגובה טיפולית עם הערות קליניות מ-3,104 מטופלות סרטן השד, כולל אלו שטופלו בכימותרפיה, טיפול הורמונלי או תרופות אנטי-HER2.

הניתוח בוצע באמצעות הפרמטרים "תגובה פתולוגית מלאה" כמשתנה התוצאה ו"כל כימותרפיה" כקטגוריית הטיפול. ערכי ביטוי גנים שנגזרו ממאגרי הנתונים של Affymetrix microarray חולקו אוטומטית לקבוצות מגיבים ולא-מגיבים בהתבסס על הערות קליניות בתוך הפלטפורמה.

עקומת מאפיין הפעולה של המקלט (ROC) (AUC), מבחן Mann–Whitney U, שינוי קיפול ובדיקת כי-ריבוע יושמו כדי להעריך את יכולת כל גן להבחין בין מגיבים שאינם מגיבים. השטח מתחת לעקומה (AUC) שימש כמדד עיקרי להערכת ביצועים מבחנים. ערכי AUC מעל 0.55 וערכי ROC-p < 0.05 נחשבו משמעותיים, המייצגים ביצועים חיזויים מתונים האופייניים לסמנים ביולוגיים טרנסקריפטומיים, בעוד תיקון קצב גילוי שגוי (FDR) יושם לשמירה על קפדנות אנליטית.

כל MOS-DEGs שנבחרו נשאלו באמצעות מזהי פרוב Affymetrix המתאימים להם. הפוטנציאל ההבחנה של כל גן הוערך בין קבוצות קליניות לסרטן השד, שבהן נתוני הביטוי חולקו לקבוצות מגיבים ולא-מגיבים. עקומות ROC, קופסאות גרפיות ופלטים סטטיסטיים נלווים נוצרו ישירות על ידי פלטפורמת ROCplotter ויוצאו לצורך ויזואליזציה והשוואה במורד הזרם. הניתוח כמת את הערך החיזוי של רדוקס ורגולטורים מטבוליים המעורבים בלחץ חמצוני מיטוכונדריאלי. גנים שהראו משמעות חיזוי עקבית בין דגימות קליניות נשמרו להכללה בפאנל החיזוי הסופי.

ניתוח ביטוי שונה ברקמות גידול, תקינות וגרורתיות (ניתוח TNMplot)

דפוסי הביטוי של MOS-DEGs המובילים נותחו ברקמות שד תקינות, גידוליות וגרורתיות באמצעות כלי האינטרנט TNMplot v2 (https://tnmplot.com/analysis/)²⁵. נבדקו גם RNA-Seq (TCGA + GTEx + MET500) וגם מערכי נתוני שבב גנים כדי להבטיח אימות חוצה פלטפורמות. מודול "ניתוח גנים מרובים" שימש יחד עם קרצינומה פולשנית לשד כסוג^{רקמה נבחר 26}. ערכי הביטוי עברו לוריתם-טרנספורמציה והושוו בין קבוצות גידול לעומת נורמלי (TvsN), גרורתי מול גידול (MvsT), וגרורתי מול נורמלי (MvsN). TNMplot חישב אוטומטית את שינוי הקיפול (FC) וערכי p באמצעות מבחן Mann–Whitney U להערכת מובהקות סטטיסטית. התפלגויות הביטוי הוצגו כגרפי קופסה וגרף צפיפות שנוצרו ישירות מממשק TNMplot, כאשר ירוק, אדום ואפור ייצגו רקמות תקינות, גידול וגרורתיות, בהתאמה. כל הנתונים יוצאו ברזולוציה גבוהה לשילוב במדור התוצאות. ניתוח דו-פלטפורמי זה אפשר זיהוי ואימות חזקים של רגולטורים מרכזיים של רדוקס-מטבוליזם במיטוכונדריה הקשורים להתקדמות סרטן השד²⁷.

הישרדות וניתוח פרוגנוסטי באמצעות פלטר קפלן–מאייר

כדי להעריך את הרלוונטיות הפרוגנוסטית של MOS-DEGs בסרטן השד, בוצע ניתוח הישרדות באמצעות כלי Kaplan–Meier Plotter המקוון (https://kmplot.com/analysis/)²⁸. מאגר זה משלב נתוני ביטוי גנים והישרדות מיותר מ-4,900 מטופלות סרטן השד, שמקורם במספר מאגרי נתונים של GEO, EGA ו-TCGA. הניתוח בוצע עבור הישרדות ללא הישנות (RFS) באמצעות מזהי פרוב Affymetrix בודדים התואמים לגנים העדיפויים: 225609_at (GSR), 201761_at (MTHFD2), 201619_at (PRDX3/AOP1) ו-201128_s_at (ACLY). המטופלים חולקו לקבוצות ביטוי גבוה ונמוך בהתבסס על סף הביטוי החציוני, והסתברויות ההישרדות הוערכו באמצעות שיטת קפלן–מאייר. מבחן ה-log-rank שימש להערכת מובהקות סטטיסטית בין עקומות הישרדות, ויחסי סיכון (HRs) עם רווחי ביטחון של 95% (CIs) חושבו אוטומטית על ידי הכלי. כל הניתוחים בוצעו באמצעות נקודת קצה RFS, ללא הגבלה המבוססת על קולטני ההורמון או מצב HER2 (ER, PR, HER2 = כל). דגימות מיותרות הוסרו, והנחות הסיכונים הפרופורציונליות אושרו כדי להבטיח עמידות סטטיסטית. מסנני בקרת האיכות שללו מיקרו-מערכים מוטים. לא הוחל בחירת גלאי ידנית או תיקון ערך p עבור בדיקות מרובות, בהתאם להגדרות ברירת המחדל של KM Plotter. המובהקות הסטטיסטית הוגדרה כ-p. < 0.05. גרפים של הישרדות הוצגו והורדו ברזולוציה גבוהה לפרשנות נוספת, תוך השוואת תוצאות בין מבטאים גבוהים ונמוכים של כל גן MOS מועמד^29,30.

הניתוח הנוכחי החל באמצעות מאגרי נתונים הכוללים אך ורק דגימות סרטן השד HER2⁺ לזיהוי גנים מבוטאים באופן שונה (DEGs) וגנים מרכזיים. לאחר מכן, ניתוח הישרדות בוצע ללא הגבלה לסטטוס HER2 (ER, PR, HER2 = כל) כדי להעריך את הרלוונטיות הפרוגנוסטית הרחבה יותר וההכללה של הגנים שזוהו. גישה זו שימשה כשלב אימות משני ולא כדי להגדיר מחדש את מוקד המחקר. לכן, ההשלכות הפרוגנוסטיות של גני המרכז שזוהו מפורשות בזהירות, כאשר המסקנות הראשוניות נשארות ספציפיות לסרטן השד HER2⁺ .

רצפי התמלול הקנוניים של MTHFD2-201 (ENST00000394053.7) ו-PRDX3-201 (ENST00000298510.4) נאספו מ-Ensembl Genome Browser (https://www.ensembl.org)^31,32. הערות וסיווג הווריאנטים בוצעו באמצעות Ensembl Variant Effect Predictor (VEP) (https://www.ensembl.org/vep), שסיפק הקשר גנומי מפורט, שינויים בקודונים והחלפות חומצות אמינו לכל וריאנט שזוהה. רק וריאנטים של missense (SNPs לא נרדפים) נבחרו לניתוח במורד הזרם.

חיזוי פתוגניות ותעדוף וריאנטים

ההשלכות הפונקציונליות של כל nsSNP הוערכו באמצעות שילוב של כלי חיזוי חישוביים. SIFT (https://sift.bii.a-star.edu.sg) יושם להערכת שימור חומצות אמינו, וסיווג וריאנטים עם ציון ≤ 0.05^כ-33 מזיקי. PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2) העריך את ההשפעה המבנית והאבולוציונית של החלפות, כאשר ציונים ≥ 0.85 הצביעו על נזק סביר³⁴. CADD (https://cadd.gs.washington.edu) סיפק ציון נזק מורכב ששילב מספר הערות, כאשר ערכים ≥ 20 מסמנים פוטנציאל פתוגני^{גבוה 35}. מדדים משלימים מ-MetaLR³⁶, Mutation Assessor ו-REVEL שולבו מממשק ה-VEP לשיפור אמינות החיזוי³⁷. וריאנטים שעמדו בסף MetaLR ≥ 0.70, מעריך מוטציות ≥ 3.5 ו-REVEL ≥ 0.75 קיבלו עדיפות כפתוגניות סבירות.

חיזוי השפעה מבנית ומכניסטית

כדי להעריך כיצד החלפות חומצות אמינו משפיעות על שלמות המבנה והתפקוד הביוכימי, כל nsSNP המדורג ראשון נותח בהמשך באמצעות MutPred2 (http://mutpred.mutdb.org)³⁸ ו-DynaMut (http://biosig.unimelb.edu.au/dynamut)³⁹. MutPred2 העריך את ההסתברות להפרעה תפקודית, כולל שינויי פעילות קטליטית, עלייה או אובדן של שאריות קישור למתכת, שינויים בנגישות לממסים ומודולציה אלוסטרית, עם ציונים ≥ 0.80 שסווגו כפתוגניים מאוד. DynaMut חישבה את שינוי האנרגיה החופשית של גיבס (ΔΔG) בין חלבונים מסוג פראי לחלבונים מוטנטיים, תוך הערכת כיוון וגודל שינוי היציבות, ויצרה ויזואליות של הזזות אטומיות וסידורי קשרי מימן.

מידול מבני משני ותלת-ממדי ופרופיל נגישות לממסים

מבני הגבישים שנפתרו ניסויים של MTHFD2 ו-PRDX3 התקבלו מבנק נתוני החלבונים (PDB) ועובדו באמצעות PyMOL V:3.1 (https://pymol.org)⁴⁰ כדי להמחיש את ההתפלגות המרחבית של שאריות מזיקות. מודלים מוטנטיים נוצרו על ידי הכנסת תחליפי חומצות האמינו המתאימים, ולאחר מכן עיקול מבני ומזעור אנרגיה. בדיקה תלת-ממדית השוואתית הדגישה שינויים ביסודות משניים, מגעים בין-אטומיים משתנים, והקרבה המרחבית של nsSNPs לתחומי קשירה קטליטיים וקואפקטורים, וחשפה שיבושים פוטנציאליים ב-Redox ובפונקציות מטבוליות.

ניתוחי מבנה משניים וחשיפה לממסים בוצעו באמצעות PSIPRED V: 3.2 (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)^41,42 ו-NetSurfP 3.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetSurfP-2.0)⁴³. כלים אלו חזו α-הליקסים, β-חוטים, סלילים ואזורים לא מסודרים יחד עם ציוני נגישות יחסית לממס (RSA). שאריות המציגות ערכי RSA בינוניים עד גבוהים וסדר מבני מופו לזיהוי מיקומים חשופים לממס ומיקומים קריטיים פונקציונלית. האתרים המושפעים הוצגו בדיאגרמות טופולוגיה דו-ממדיות כדי לקבוע האם מוטציות מזיקות התרחשו בליבות קטליטיות קשיחות או באזורים גמישים בלולאות, ובכך לחזות את השפעתם הסבירות על דינמיקת קיפול החלבונים ויעילות אנזימטית.

אימות הדדי של מסדי נתונים, אינטגרציה פונקציונלית ואימות יציבות

כל nsSNP שקיבל עדיפות הושוו מול מאגרי מידע גנומיים ברמת האוכלוסייה כולל dbSNP, 1000 Genomes, ExAC ו-gnomAD לאישור תדירות הווריאנטים, התפלגות אללית גלובלית וקשרים קליניים שדווחו בעבר. שילוב שימור אבולוציוני, מידול מבני וחיזוי פונקציונלי מבוסס למידת מכונה אפשר זיהוי וריאנטים מזיקים בעלי ביטחון גבוה ב-MTHFD2 ו-PRDX3. מוטציות בעלות השפעה גבוהה אלו מופו לאחר מכן לתחומים פונקציונליים כדי להבהיר את תפקידן הפוטנציאלי בחוסר איזון של לחץ חמצוני מיטוכונדריאלי, שינוי באיתות מטבולי ועמידות טיפולית בסרטן השד. כדי לאשר עוד יותר את ההשלכות התרמודינמיות של כל החלפה מזיקה, iMutant 3.0 (https://folding.biofold.org/i-mutant/i-mutant3.0.html)⁴⁴ שימש לחיזוי השפעות המוטציות על יציבות החלבונים באמצעות נתוני רצף ומבנה. הניתוח חישב ערכי ΔΔG (קקלור/מולה) המייצגים את השינוי באנרגיה החופשית בין חלבונים מסוג פרא לחלבונים מוטנטיים. וריאנטים שהראו ערכי ΔΔG שליליים סווגו כמוטציות מערערות, מה שמעיד על ירידה ביציבות חלבון ועלייה בהסתברות להתפתחות. אינטגרציה של תחזיות iMutant עם תוצאות DynaMut ו-MutPred2 סיפקה אימות הדדי לזיהוי שאריות קריטיות מבנית שעלולות להשפיע על תפקוד החמצון האדום, שלמות הקטליטיקה ויציבות הקונפורמציה הכוללת של חלבונים.

פרשנות פונקציונלית משולבת ורלוונטיות טיפולית

כל ה-nsSNPים המזיקים שזוהו אומתו באמצעות הצלבה עם מאגרי נתונים של dbSNP, gnomAD ו-ExAC כדי לאמת תדירויות אללים מינוריות וקשרים שדווחו בעבר עם פנוטיפים של סרטן. פרשנות אינטגרטיבית של שימור אבולוציוני, מודלים מבניים ונתוני יציבות הראתה כי המוטציות בעלות ההשפעה הגבוהה rs1471336772 (MTHFD2) ו-rs747786383 (PRDX3) מפעילות את ההשפעות המזיקות החזקות ביותר על מבנה החלבונים והיעילות הקטליטית. התוצאות החישוביות מצביעות יחד על כך שמוטציות ב-MTHFD2 מערערות את המטבוליזם של רדוקס התלוי ב-NADPH, בעוד שמוטציות ב-PRDX3 פוגעות בהגנה על לחץ חמצוני המתווכת על ידי פרוקסידאז, ותורמות לתפקוד לקוי של מיטוכונדריה ולאגרסיביות גידולית. ניתוח מבני ופונקציונלי מבוסס nsSNP זה מספק בסיס חישובי לסינון טיפולי עתידי ולאימות מוטציה, ומדגיש את MTHFD2 ו-PRDX3 כסמנים ביולוגיים מדויקים לטיפול בסרטן השד הממוקד ב-redox. כדי לשפר את הבהירות ולספק סקירה מקיפה של האסטרטגיה האנליטית, מוצג באיור 2 תהליך עבודה סכמטי המסכם את השלבים העיקריים של המחקר. תהליך העבודה משלב ניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי, סינון גנים מיטוכונדריאליים, בניית רשת אינטראקציה בין חלבונים, אימות קליני באמצעות ניתוח ROC ואפיון מבני מבוסס nsSNP. מסגרת זו מדגישה את ההתקדמות הלוגית מעיבוד נתונים טרנסקריפטומיים לזיהוי ביומרקרים ופרשנות פונקציונלית.

איור 2. תהליך עבודה אינטגרטיבי רב-שלבי לזיהוי ואימות של סמנים ביולוגיים הקשורים ללחץ חמצוני מיטוכונדריאלי בסרטן השד ^HER2+ . סכמת זו מסכמת את הצינור האנליטי שנעשה בו שימוש במחקר. ראשית, בוצע ניתוח ביטוי גנים שונה (DEG) על מערכי נתונים של RNA-seq (GSE231524 ו-GSE231525) לזיהוי גנים ששונו באופן משמעותי. DEGs אלו הצטלבו עם גנים הקשורים ללחץ חמצוני מיטוכונדריאלי שנבחרו כדי לקבל MOS-DEGs. לאחר מכן בוצע ניתוח רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI) באמצעות STRING ו-Cytoscape לזיהוי גנים מרכזיים ומודולים פונקציונליים. בהמשך, ניתוח עקומת תכונות הפעלה של מקלט (ROC) יושם באמצעות פלטפורמת ROCplotter להערכת הביצועים החיזויים של גנים נבחרים בקבוצות קליניות. לבסוף, בוצעו ניתוח SNP לא-נרדף (nsSNP) ומודלים מבניים כדי להעריך את ההשפעה הפונקציונלית והמבנית הפוטנציאלית של וריאנטים מרכזיים בגנים מועדפים (MTHFD2 ו-PRDX3). תהליך עבודה אינטגרטיבי זה מקשר בין ניתוחים טרנסקריפטומיים, רשתיים, קליניים ומבניים כדי לזהות סמנים ביולוגיים פוטנציאליים ומטרות טיפוליות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

Results

ניתוח ביטוי גנים שונה

בוצעה פרופיילינג ביטוי שונה כדי לחקור שינויים שעתוק הקשורים להתקדמות סרטן השד ^HER2+ ולעמידות בטיפול באמצעות שני מערכי נתונים עצמאיים של RNA-seq, GSE231524 ו-GSE231525. במאגר הנתונים הראשון (GSE231524), סך הכל 19,727 גנים נמדדו בתחילה. לאחר נורמליזציה, סינון ויישום מודל הרגרסיה המתוקן (ARM) לביטוי שונה, נשמרו 6,604 גנים כביטוי משמעותי (טבלה משלימה S1). לאחר סטנדרטיזציה של סמלי גנים, הסרת כפילויות ושיפור ההערות, 6,300 גנים ייחודי...

Discussion

לחץ חמצוני מיטוכונדריאלי הוא סימן היכר של הסתגלות גידול, השולט בהישרדות התאים, פלסטיות מטבולית ועמידות לטיפול. המחקר הנוכחי חקר באופן שיטתי גנים מבוטאים באופן שונה (MOS-DEGs) הקשורים ללחץ חמצוני מיטוכונדריאלי בסרטן ^HER2+ על ידי שילוב נתונים טרנסקריפטומיים, העשרה פונקציונלית, אימות קליני, וניתוחים מוטציוניים ומבניים של סילקו . השילוב של ביטוי שונה עם פרופיל מוטציות סיפק הבנה רב-ממדית של האופן שבו ויסות רדוקס-מטבולי מצטלב עם חוסר יציבות גנומית. מבין MOS-DEGs שזוהו, MTHF...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnnotationDbi	Bioconductor	v1.64.0	חבילת אנוטציה של R המשמשת לתקן סימון גנים של HGNC ולאנוטציה.
apeglm	Bioconductor	שיטה ב-DESeq2	שיטה המשמשת לצמצום שינוי log2 באנליזת ביטוי דיפרנציאלי.
Biobase	Bioconductor	v2.62.0	חבילת R המשמשת לגישה ולניהול אובייקטי ביטוי ומטא-נתונים שמקורם ב-GEO.
CADD	אוניברסיטת וושינגטון / מעבדת Kircher	כלי אינטרנט	ציון Combined Annotation Dependent Depletion המשמש לחיזוי פתוגניות של nsSNP.
clusterProfiler	Bioconductor	v4.8.1	חבילת R המשמשת לניתוח העשרה של GO ו-KEGG.
ComplexHeatmap	Bioconductor	v2.18.0	חבילת R המשמשת לייצור מפות חום וליצירת אשכולות ביטוי.
Cytoscape	Cytoscape Consortium	תוכנה	פלטפורמת הדמיית רשת המשמשת עם רשתות PPI שמקורן ב-STRING ומיון CytoHubba.
dbSNP	NCBI	מסד נתונים	מסד נתונים של וריאנטים אוכלוסייה המשמש לאימות צולב של nsSNP מועדפים.
DESeq2	Bioconductor	v1.42.0	חבילת R המשמשת לנורמליזציה, מידול שונות ואנליזת ביטוי דיפרנציאלי.
dplyr	CRAN / tidyverse	v1.1.3	חבילת R המשמשת למניפולציה של נתונים ולחיתוך של קבוצות גנים.
DynaMut	אוניברסיטת מלבורן / BioSig	שרת אינטרנט	כלי המשמש להערכת שינויים הקשורים למוטציה ביציבות וגמישות של חלבונים.
EnhancedVolcano	Bioconductor	v1.22.0	חבילת R המשמשת לויזואליזציה של תוצאות ביטוי דיפרנציאלי כגרפים וולקניים.
Ensembl Genome Browser	EMBL-EBI / Ensembl	מסד נתונים	מקור לרצפים של טרנסקריפטים קנוניים עבור MTHFD2 ו-PRDX3.
Ensembl Variant Effect Predictor (VEP)	EMBL-EBI / Ensembl	כלי אינטרנט	כלי המשמש לסימון וריאציות חסרות משמעות ולשילוב ציונים חיזויים.
ExAC	המכון הבריטי	מסד נתונים	מסד נתונים ברמת אוכלוסייה של אקסומים המשמש לאימות צולב של nsSNP.
Gene Expression Omnibus (GEO)	NCBI	מסד נתונים	מאגר המשמש לשליפת מערכי נתונים טרנסקריפטומיים לניתוח סרטן שד HER2-חיובי.
Gene Ontology	Gene Ontology Consortium	GO:0006979	מקור אונטולוגיה המשמש לשליפת גנים הקשורים למתח חמצוני ולניתוח העשרה.
GEOquery	Bioconductor	v2.70.0	חבילת R המשמשת לגישה למטריצות ספירה ואובייקטי מטא-נתונים של GEO.
ggplot2	CRAN / tidyverse	v3.5.0	חבילת R המשמשת לויזואליזציה של נתונים, אשכולות ויציאות גרפיות.
ggraph	CRAN	חבילת R	חבילת R המשמשת לויזואליזציה של גרף ורשת במהלך ייצוג העשרה והמסלול.
gnomAD	המכון הבריטי	מסד נתונים	מסד נתונים של וריאנטים אוכלוסייה המשמש לבדיקת תדירות והפצה של nsSNP מועדפים.
GOplot	CRAN	חבילת R	חבילת R המשמשת לויזואליזציה של העשרה של GO כולל דיגרמות ותקצירים.
GSE231524	NCBI GEO	מספר רשומה	ערכת נתוני RNA-seq המשמשת לניתוח של פנוטיפים של BT474 הורים, סובלניים לתרופות ועמידים.
GSE231525	NCBI GEO	מספר רשומה	ערכת נתוני RNA-seq המשמשת לניתוח של קידום DUSP6 בתאי סרטן שד HER2-חיובי.
Human MitoCarta3.0	המכון הבריטי	מסד נתונים	משאב גנים מיטוכונדריאלי מאוחד המשמש להגדרת קבוצות גנים מיטוכונדריאליים.
Human Oxidative Stress Gene Database (HOSGDB)	HOSGDB	מסד נתונים	מאגר המשמש לשליפת גנים הקשורים למתח חמצוני.
igraph	CRAN	חבילת R	חבילת R המשמשת לייצוג רשת והדמיית מסלול.
iMutant 3.0	אוניברסיטת בולוניה / Biofold	שרת אינטרנט	כלי המשמש לחיזוי השפעות מוטציה על יציבות חלבון.
Kaplan–Meier Plotter	KMplot	כלי אינטרנט	פלטפורמה מקוונת המשמשת לניתוח הישרדות ללא הישנות בקבוצות חולי סרטן שד.
KEGG	אוניברסיטת קיוטו	מסד נתונים	מאגר מסלולים המשמש לניתוח זרחון חמצוני וניתוח העשרה של מסלולים.
KEGGREST	Bioconductor	חבילת R	חבילה המשמשת לשליפה וסימון מידע על מסלולי KEGG.
Lapatinib	לא צוין במאמר	מצב טיפול של 1 μM