שיטה אופטימלית לבידוד אפיתל שופכה של נקבות עכבר לניתוח תא יחיד ואימונופלואורסצנציה

סיכום

פרוטוקול זה מציג שיטה אופטימלית לבידוד רירית האפיתל של שופכת השופכה של נקבת העכבר הבוגרת לניתוחים במורד הזרם, כולל ציטומטריית זרימה, צביעת חיסון ותרבות אורגנואידים. השיטות הניבו תאי אפיתל שופכה מעשירים ובריאים, כפי שמעידים ניתוח ציטומטריית זרימה, הדמיה שלמה ויצירת אורגנידים יעילה.

תקציר

השופכה, המצופה בתאי אפיתל, משמשת כצינור לזרימת השתן מהגוף. הרירית האפיתלית של השופכה מורכבת מסוגי תאים מובחנים עם חתימות גנטיות המעידות על תפקיד בהגנה אנטימיקרוביאלית וחיסונית. מקרופאגים תושבים המוטמעים בשכבת האפיתל של השופכה מייצגים תת-סוג מובחן מבחינה שעתוקית עם תפקידים לכאורה במעקב חיסוני ובהצגת אנטיגן. פתוגנים בדרכי השתן עולים בשופכה כדי להגיע לשלפוחית השתן. מחקר על ריריית האפיתל של השופכה ותאי החיסון הנלווים יאיר את מנגנוני ההגנה של המארח במערכת השתן התחתונה. מטרה מרכזית של פרוטוקול זה היא לספק שיטות אופטימליות לניתוח שופכת השופכה של הנקבה ולבידוד רירית האפיתל לניתוחים במורד הזרם. הפרוטוקול מתאר שיטה אופטימלית לבידוד רקמת אפיתל מהשופכה של הנקבה בעכבר באמצעות הפרדה עדינה אנזימטית ומכנית. לאחר בידוד אפיתלי, מתוארות שיטות לעיכול אנזימטי עדין של אפיתל שופכה מבודד ותאי חיסון נלווים להשגת תליות תא בודד בעל יכולת חי גבוהה. הפרוטוקול מפרט גם שיטות לניתוח ציטומטריית זרימה של תאי אפיתל שופכה מבודדים ותאי מערכת החיסון הקשורים לאפיתל. בנוסף, מוצגות כאן שיטות ליצירת אורגנואידים אפיתליים תלת-ממדיים של השופכה מבודדים בתאי אפיתל מבודדים. הפרוטוקול מפרט גם שיטה אופטימלית לצביעה חיסונית מלאה של דפי אפיתל בשופכה, שניתן להשתמש בה לצפייה במורפולוגיה ובמבנים המולקולריים של אפיתל שופכה בעכברים ותאי חיסון נלווים. בסך הכל, השיטות המתוארות כאן לבידוד ועיכול תאים בודדים של תאי אפיתל שופכה בעכבר מאפשרות ניתוחים בהמשך הזרם, כולל צביעת חיסונים, ציטומטריית זרימה, יצירת אורגנואידים וריצוף RNA חד-תאים.

מבוא

מערכת השתן התחתונה של העכבר (LUT) מורכבת משני חלקים: שלפוחית השתן והשופכה. במהלך שלבי העובר, מבני ה-LUT מתפתחים מהקלואקה, מבנה חולף שמקורו באנדודרם הממוקם במעי האחורי הזנב. החלק התחתוני של הקלואקה, הסינוס האורוגניטלי, יוצר את שלפוחית השתן מקדימה ואת השופכה האחורית¹. הרירית של שלפוחית השתן נחקרה היטב. הוא יוצר מחסום הדוק נגד רכיבי השתן באמצעות פלאקים גבישיים אפיקליים המורכבים מחלבוני אורופלאקין ^2,3,4. בעוד שרירית שלפוחית השתן היא אפיתל מעבר, השופכה מראה הבדלים במבנה האפיתל מצוואר השלפוחית לפתח השופכה הדיסטלי. בנוסף, השופכה מראה דימורפיזם מיני במבני האפיתל ובמבנה התאים. שופכת השופכה של העכבר הזכר מורכבת מאפיתל מעבר בצוואר שלפוחית השתן, ואחריו אפיתל עמודי ושכבתי. השופכה של נקבת העכבר מצופה באפיתל מעבר בצוואר שלפוחית השתן ובאפיתל שכבתי רב-שכבתי לא קשקשי, מנוקד בצינורות קטנים המסתיימים בבלוטות הפרשה לכיוון הקצה המרוחק⁵.

נקבות רגישות יותר לזיהומים בדרכי השתן (UTIs), הנגרמים בעיקר על ידי חיידקים אורופתוגנים העולים מהמעי דרך השופכה ומדביקים את שלפוחית השתן^. השופכה היא המשטח הראשון ב-LUT שבא במגע עם פתוגנים עולים בשתן. תפקידם של תאי האפיתל בשופכה, ובמיוחד תפקידם כמחסום חיסוני פעיל, נחקר באופן מועט. מחקר עדכני מאותה קבוצה סיפק מפה מרחבית ברזולוציה תאית אחת של שופכת השתן 5 של נקבת העכבר הבוגרת^. הוא זיהה רירית שופכה משולשת שכבתית עם תאים בסיסיים, ביניים ואפיקליים. בתוך רירית האפיתל נמצאים תאים נוירואנדוקריניים נדירים ^5,7. לקראת אמצע השופכה, תעלות קטנות מתפצלות מהגזע הראשי של השופכה, ומסתיימות באשכולות של בלוטות הפרשה, המשובצות בתא הסטרומלי של השופכה. נתוני טרנסקריפטומיה הראו שתאי האפיתל בשופכה מבטאים גנים אימונומודולטוריים ואנטימיקרוביאליים שעשויים לעצב את הגנת המארח⁵. חקר התכונות והתכונות של תאי אפיתל השופכה הקשורים לפוטנציאל ההגנה שלהם ולפונקציות האימונומודולטוריות שלהם עשוי לספק אסטרטגיות חדשות למאבק בזיהומים בדרכי השתן.

שימוש בעכבר ללימוד אפיתל השופכה מאפשר מחקרים זמניים וחקירת דימורפיזם מיני. בהינתן הדמיון בין העכבר לאדם מבחינת מבנה התאים של שלפוחית השתן^{והשופכה 1}, העכבר שימש רבות לחקר התפתחות עוברית של דרכי השתן התחתונה ^1,8,9. עכברים שימשו גם במודלים של החדרה דרך השופכה לחקר זיהום בדרכי השתן הנגרם על ידי פתוגנים בדרכי השתן 10,11,12. רקמת דרכי השתן התחתונה קשה לגישה אצל מטופלים אלא אם כן עוברים כריתה בשל סרטן או הפרעות אחרות. מקור לרקמה אנושית בריאה ועקבית קשה להשגה, והעכבר מספק מודל שימושי לחקר רקמות במערכת השתן התחתונה למחקרים על הומאוסטזיס רקמות, תיקון ותגובה לפגיעות דלקתיות. הרירית השופכה של נקבת העכבר והאדם מורכבות מאפיתל מעבר בצוואר השלפוחית ואפיתל שכבתי שאינו קשקשי ולא קרטיני לקראת הקצה המרוחק. אפיתל קשקשי נצפה בקצה הדיסטלי של שופכת השופכה הנקבית האנושית, אם כי נצפה שונות ברירית השופכה של הנשים בגיל ^5,13. למרות שהשוואות של רירית השופכה ברמת הטרנסקריפטום לא בוצעו בין השופכה האנושית לעכבר, העכבר מהווה מודל שימושי ללכידת דפוסי אפיתל, אינטראקציות אפיתליאליות-חיסונית ותגובה לזיהומים בשופכה.

במחקר זה, המחברים מתארים שיטות לניתוח השופכה של הנקבה הבוגרת באורך מלא, בידוד אפיתל השופכה, ועיכול אנזימטי עדין להכנת תלייה חד-תאית. זהו הפרוטוקול המפורט הראשון לבידוד ועיכול רקמת אפיתל שופכה של נקבות בעכבר. הפרוטוקול האופטימלי מניב אוכלוסיית תאים בודדים מועשרת של תאי אפיתל שניתן להשתמש בה לניתוחים שונים במורד הזרם. כפי שהוצג במחקר, המחברים ביצעו ציטומטריית זרימה על תלות תא בודד של מבודדי תאי אפיתל בשופכה, מה שמדגים נוכחות של תאים בודדים ברי קיימא, בעיקר בעלי אופי אפיתלי. יתרה מזאת, תאי אפיתל אלו מסוגלים לייצר אורגנואידים בתרבות תלת-ממדית, הדומים לרירית השופכה השכבתית של העכברים. המחברים גם מדגימו צביעה שלמה של דפי אפיתל שופכה כדי לחקור את הקשר בין תאי חיסון הקשורים לאפיתל, במיוחד מקרופאגים, לתאי אפיתל שופכה. השיטות המתוארות במאמר זה יסייעו במחקר על רירית השופכה ותפקידה בהגנה חיסונית.

פרוטוקול

כל המחקרים על עכברים בוצעו באישור ועדת האתיקה המוסדית לבעלי חיים (INS-IAE 2022/01(R 1 M2)) והוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית (inStem/G-141(3)-22/DBJ) במכון BRIC למדעי תאי גזע ורפואה רגנרטיבית, בנגלור. עכברים נקבות CD-1 או C57BL6/J בגילאי 6-12 שבועות, שהיו מאוחסנות במרכז לטיפול ומשאבי בעלי חיים (ACRC) במרכז הלאומי למדעי החיים (NCBS), אשכול מדעי החיים של בנגלור (BLiSC) שימשו למחקר זה. העכברים הוחזקו בתנאים מסוימים ללא פתוגנים במחזור של 12 שעות אור-חושך עם מזון ומים אד ליביטום.

כל החומרים בהם השתמשו מופיעים בטבלת החומרים.

1. ניתוח ואיסוף שופכה של נקבת עכבר בוגרת

1. הורד את העכבר באמצעות CO₂ עד שהעכבר מפסיק לנשום. לבצע פריקה צווארית כמצב של המתת חסד משנית.
2. הנח את העכבר בשכיבה ורסס 70% אתנול כדי להרטיב את השיער בבטן (איור 1A).
3. הרם את העור בבטן עם זוג מלקחיים ובצע חתך אנכי לכיוון פלג הגוף התחתון, שמסתיים בפתח השופכה החיצוני (איור 1B ו-1C).
4. זהה את שלפוחית השתן והרימו אותה בעדינות עם מלקחיים. במקרים מסוימים, הוא עשוי להיות מלא בשתן. לחצו בעדינות על השלפוחית בין המלקחיים כדי לרוקן אותה.
   הערה: השלפוחית תיראה כמבנה תפוח.
5. גזום שומן ורקמת חיבור סביב שלפוחית השתן באמצעות מספריים קפיציים קטנים כדי לחשוף את המבנה בצורת פרפר במקום שבו שתי עצמות הערווה מתחברות בסימפיזיזה הערווה (איור 1D). השופכה עוברת מתחת לסימפיזיס הערווה.
6. חתכו את הסימפיזיס הערווה על ידי הרמתה עם מלקחיים וחיתוך באמצעות מספריים קפיציים קטנים (איור 1E). הסר את שברי עצם הערווה כך שניתן לראות את השופכה זורמת כלפי מטה מהשלפוחית (איור 1F).
   הערה: השופכה תיראה כצינור אדום דק המונח על פני השטח הגחוני של דופן הנרתיק (איור 1G).
7. משכו בעדינות את שלפוחית השתן כלפי מעלה מחלל הגוף באמצעות מלקחיים דקים והעבירו מספריים קפיץ קטנים בין השופכה לדופן הנרתיק כדי להפריד בין דרכי השתן והרבייה.
8. שמרי על מתח קל על שלפוחית השתן תוך חיתוך לאורך גב השופכה כדי להפריד אותה מדופן הנרתיק (איור 1H–J). חותכים עד פתח השופכה הדיסטלי כדי לקבל את שופכת השופכה העכברית באורך מלא (1.2–1.5 ס"מ) (איור 1K ו-1L).
9. הפריד את השופכה מהשלפוחית על ידי חתך יחיד בצוואר השלפוחית.

2. בידוד רקמת האפיתל של השופכה

הערה: הפרוטוקול לבידוד שכבות אפיתל מהשופכה שונה ואופטימיזם מתוך פרוטוקול לבידוד אפיתל רירית הרחם¹⁴. איור 2 מציג שלבים לבידוד שכבות אפיתל של השופכה מהמחלקה הסטרומלית הסובבת (איור 2A).

1. העבר את השופכה המנותקת לצלחת פטרי סטרילית המכילה 1x תמיסת מלח מאוזנת של הנקס טרייה (HBSS, Ca ו-Mg, פרטים בטבלה משלימה 1).
   הערה: מומלץ לאסוף 4–5 שופכות בשלב זה לצורך הפרדה אפיתלית ועיכול תאים בודדים.
2. תחת מיקרוסקופ ניתוח, גזום שומן ורקמות חיבור סביב השופכה באמצעות מלקחיים דקים ומספריים קפיץ קטנים (איור 2B).
3. חתכו כל שופכה לשני חלקים שווים לרוחב והניחו על גבי מסננת רשת ניילון בגודל 100 מיקרון (איור 2C–G).
4. שטוף את הרקמות על ידי העברת 1 מ"ל של 1x HBSS (ללא קבלימיניום וללא מיליגריום) על הרקמות.
5. העברת חלקי רקמה לצינור מיקרוצנטריפוגה (MCT) בנפח 1.5 מ"ל (איור 2H) המכיל 1 מ"ל של 1% טריפסין (1% טריפסין, עם 1% עד 1x sHBSSa, פרטים המופיעים בטבלה משלימה 2).
6. לעכל את הרקמה על ידי דגירה למשך 15–30 דקות על סיבוב דגימה (30 סל"ד) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
7. לאחר הדגירה, הסר צינורות מטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. מוסיפים MgCl₂ (1 M MgCl₂, מלאי מוכן ב-1x HBSS) לריכוז סופי של 10 mM ו-DNase I (10 mg/mL DNase I, מלאי מוכן ב-1x PBS) לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל באותו צינור עם חלקי הרקמה.
8. העבר את הצינור לתנור היברידיזציה של 37 מעלות צלזיוס על סיבוב דגימה לדגירה למשך 15–30 דקות.
   הערה: זמני הדגירה של טריפסין ב-4°C ו-37°C ניתנים להתאמה בהתאם ליישום במורד הזרם. עדיף להשתמש בזמני דגירה של 15 דקות לצביעה מלאה ובדגירה של 30 דקות לעיכול תא יחיד.
9. העבר את הרקמות ל-MCT בנפח 1.5 מ"ל המכיל 10% סרום כבשים ב-1x HBSS (ללא Ca ו-Mg) כדי להרגיע את פעילות הטריפסין.
10. העבר רקמות שופכה לצינור חדש המכיל 1x HBSS קר (חופשי מ-Ca ו-Mg). לאחר מכן עברו לצלחת פטרי סטרילית המכילה 1x HBSS קר וקרח.
11. באמצעות שני מלקחיים דקים, סחטו את האפיתליום מהשופכה. החזק קצה אחד של החלק השופכה באמצעות זוג מלקחיים אחד.
12. ביד השנייה, לוחצים את החלק השופכני בין השיניים של המלקחיים, ומעבירים לאורך כל אורך החלק כדי לסחוט את האפיתל החוצה. חזור על כך עבור שברי השופכה שנותרו בצלחת כדי לבודד את האפיתל (איור 2I–J).
    הערה: לאחר הפרדה מכנית, שכבה דקה של רקמת אפיתל שקופה תופרש מהלומן של השופכה. האפיתל של השופכה מזוהה כקטעי רקמה דקים דמויי יריעה, שנראים בהירים יותר (שקופים) מהרקמה הסטרומלית. הבודדים האפיתליאליים צריכים להיות חתיכות רקמה דקות ושקופות שניתן להעביר לצלחת פטרי לטחינה. בידוד רקמות לא צריך להתפרק לחלוטין. אם חלקי הרקמה מתפרקים לחלוטין, ניתן לקצר את זמן הדגירה של הטריפסין.

3. עיכול לתלייה חד-תאית

1. העבר חתיכות מבודדות של אפיתליום לצלחת פטרי סטרילית באמצעות פיפטה קטנה מפלסטיק העברה או קצה פיפטה בנפח 200 מיקרוליטר. טחון את האפיתל לחתיכות קטנות באמצעות מספריים קפיץ קטנים בטיפה של 1x HBSS שנוספה ישירות לשברים (איור 2K).
   הערה: חלקי רקמת סטרומל שנותרו לאחר הפרדת האפיתל ניתנים לעיכול באותה שיטה כמו האפיתל המבודד.
2. העבר חתיכות קצוצות באמצעות פיפטה ל-MCT בנפח 2 מ"ל המכיל 1.5 מ"ל תמיסת עיכול אקווטאז מחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס). תמיסת העיכול של האקוטאז מכילה את הבאים: אקוטאז, 10 מיקרומום רוקי Y-27632, ו-100 מיקרוגרם/מ"ל DNase I.
3. העבר את הצינור המכיל את הרקמה ותמיסת העיכול לסיבוב דגימה בתנור היברידיזציה של 37 מעלות צלזיוס. תדגר לשעה אחת.
   הערה: ניתן לבדוק את תוכן השפופרת לעיכול מוצלח לפני הממשיך. עיכול מוצלח: הרקמה הטחונה מפוזרת היטב בתמיסת האקוטאז עם מעט חתיכות נראות לאחר הדגירה. עיכול כושל: חתיכות רקמה גדולות עדיין קיימות לאחר הדגירה בתמיסת אקוטאז. יש לקצוץ את הרקמות דק ככל האפשר לעיכול מוצלח.
4. לאחר שעה, העבר את כל תכולת ה-MCT בנפח 2 מ"ל לצינור צנטריפוגה בנפח 5 מ"ל והוסיפו 2 מ"ל של בופר שטיפה (1x PBS ללא Ca ו-Mg, עם אלבומין סרום בקר 1%).
5. סובב את המתלה ב-600 x g למשך 5 דקות בצנטריפוגה של 4 מעלות צלזיוס עם רוטור דלי מתנדנד.
6. שאופים את הסופרנטנט באמצעות ואקום עדין והחזירו את הכדור ל-1 מ"ל של בופר שטיפה באמצעות פיפטה של 1 מ"ל עם קצה פילטר.
7. באמצעות קצה הפיפטה, שברו את הכדור על ידי פיפטינג למעלה ולמטה עד שהגושים מתקטנים. העבר את המתלה עם 4 פעימות דרך מחט 23 1/2 שמחוברת למזרק 1 מ"ל, ואחר כך 4–6 פעימות דרך מחט 26 1/2 שמחוברת למזרק 1 מ"ל.
   הערה: נדרש מעבר דרך מחט קטנה כדי לקבל תלייה חד-תאית אחידה ולמנוע הצטברות תאים. בעוד ששלב זה עלול לגרום למתח גזירה ולמוות תאים, המחברים אופטימיזם את מספר המכות עם המחט והמזרק כדי לספק תלייה אחת ללא מוות תאים מופרז. דילוג על שלב זה מוביל לחלק גדול של תאים מקובלים, מה שיבלבל ניתוח במורד הזרם כמו ריצוף RNA תא יחיד וציטומטריית זרימה.
8. הוסף 1 מ"ל של בופר שטיפה כדי להרטיב את פני השטח של מסנן הפרדה מוקדם של 30 מיקרון הממוקם מעל צינור של 5 מ"ל. השתמש במזרק שמחובר למחט 26 1/2 כדי להעביר 1 מ"ל של תמיסת התא דרך המסננת.
9. הוסיפו 1 מ"ל של בופר שטיפה נוסף לצינור המכיל תאים, ואז קחו את התמיסה עם המזרק והעבירו אותה דרך המסנן. תאי פלט בצנטריפוגה ב-600 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס באמצעות רוטור דלי מתנדנד.
10. שאיפת הסופרנטנט והשיה מחדש את הכדור ב-100 מיקרוליטר של בופר שטיפה, והוסף 100 מיקרוליטר של בופר ליזיס תאי דם אדומים (RBC). דגרו את התעלה בטמפרטורת החדר בדיוק 3 דקות, ואז הוסיפו 4 מ"ל של בופר שטיפה ותחזירו את הכדור.
    הערה: מומלץ להסרת תאי דם תאי דם מהתלות האפיתל של תאי השופכה. למרות ששלב זה עשוי להשפיע מעט על חיוניות התאים האפיתליים, הפרוטוקול השתמש בבופר ליזיס תאי דם מדולל פי 0.5 ובדגירה של 3 דקות כדי למזער אובדן תאים ולשמור על חיוניות התא.
11. קצור תאים בצנטריפוגה ב-600 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס באמצעות רוטור דלי מתנדנד.
12. שואף את הסופרנטנט והחזיר את הכדור ל-50–200 מיקרוליטר של בופר שטיפה בהתאם לגודל הכדור.
    הערה: גודל הכדורים מרקמות שנאספו מ-4–5 דגימות אפיתל שופכה של עכברים מאוגדות יהיה קטן אך עדיין נראה לעין. חיוני לתאי צנטריפוגה באמצעות רוטור דלי מתנדנד כדי שהכדור יתאסף בתחתית הצינור ולא יימרח לאורך הצד. החוקרים תיעדו תפוקת תאים של 28,000–34,000 תאים חיים לכל אפיתל שופכה בעכבר.
13. העבר 5 מיקרוליטר אליקוט של תאים ל-MCT של 0.5 מ"ל והוסף 5 מיקרוליטר של טרייפן כחול. ערבב והעמס על המוציטומטר כדי לבדוק את התפוקה והחיוניות של התאים.

4. ניתוח ציטומטריית זרימה של בידוד תאים בודדים באפיתל השופכה

1. Aliquot 100,000 תאים בסך הכל בצינור צנטריפוגה בנפח 5 מ"ל לביצוע צביעת חיסון פלואורסצנטית של תאים בודדים מאפיתל השופכה או מהמחלקה הסטרומלית לצורך ציטומטריית זרימה. תשלים נפח בצינור ל-4 מ"ל עם 1x PBS.
   הערה: כדי להשיג תוצאות אמינות עם ציטומטריית זרימה, מומלץ להשתמש במינימום של 50,000 תאים לכל דגימה.
2. סובב את מתלה התא ב-500 x g למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס באמצעות רוטור דלי מתנדנד.
3. השליכו את הסופרנטנט ותחזירו את הכדור ל-50 מיקרוליטר של 1x PBS.
4. הוסף 50 מיקרוליטר של 2x צבע גוסט Violet 450 (1 מיקרוליטר צבע גוסט ב-500 מיקרוליטר של 1x PBS) לתליית התא כדי לקבל 100 מיקרוליטר של 1x תמיסת צבע גוסט.
   הערה: גוסט די V450 הוא צבע ריאקטיבי לאמין שניתן להשתמש בו להבחנה בין תאים ברי קיימא ללא-קיימים ביישומי ציטומטריית זרימה.
5. הוסף 5 מיקרוליטר של תמיסת חסימת קולטני Fc (נגד עכבר CD16/32) לכל 100 מיקרוליטר של תליית תא ודגר במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: שלב זה נדרש לחסימת קישור האימונוגלובולין לקולטני ה-Fc.
6. החזק את תליית התא על הקרח למשך 25 דקות נוספות.
7. דילל את תליית התא ל-5 מ"ל באמצעות בופר צביעת תאים (1x PBS, 0.02% (עם v) נתרן אזיד, ו-1% (עם v) BSA, ראו טבלה משלימה 3). סובב כלפי מטה ב-500 x g למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס באמצעות רוטור דלי מתנדנד. השליכו את הסופרנטנט והחזירו את כדור התא ל-100 מיקרוליטר של בופר צביעת תאים.
   הערה: אזיד נתרן הוא רעיל מאוד. הימנע ממגע עם עור, עיניים ובגדים. השתמש בציוד מגן אישי (PPE) מתאים בעת הטיפול.
8. ב-100 מיקרוליטר של תליון תאים, מוסיפים 5 מיקרוליטר של נוגדנים ראשוניים מצומדים: אנטי-CD326/EPCAM (תוויות תאים אפיתליים), אנטי-F4/80 (תוויות מקרופאגים של עכברים), ואנטי-CD45 (סמן פאן-אימוני) בדילול של 1:20. הנח את תליית התא על הקרח למשך 30 דקות.
9. מדלל את מתלי התא ל-5 מ"ל באמצעות בופר צביעת תאים, ואז סובב בטמפרטורה של 500 x g למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס באמצעות רוטור דלי מתנדנד. שאיפת הסופרנטנט והשתה מחדש את כדור התא ב-500 מיקרוליטר של בופר צביעת תאים.
10. העבר את מתלה התא דרך מסננת רשת ניילון 35 מיקרון על צינורות מיון מכסה מסנן. הניחו צינורות על קרח עד לניתוח נוסף.
11. בצע הגדרה ראשונית ובדיקת ביצועים על ציטומטר.
12. כוון מתחים באמצעות דגימות לא מוכתמות ומוצבעות במלואן. לבצע פיצוי באמצעות בקרות חרוזים ולהמשיך לרכישה.
    הערה: ניסויים עם יותר מפלואורופור אחד דורשים פיצוי. הכינו את אמצעי הפיקוח הדרושים על הפיצוי. תצטרך בקרות צביעה בודדות (כלומר, חרוזי פיצוי) לכל פלואורופור ששימש בניסוי. פיצוי יכול להתבצע אוטומטית בהתאם להגדרות תוכנת ציטומטר הזרימה. מומלץ בקרות FMO (פלואורסצנציה מינוס אחת) להבחנה בין אוכלוסיות תאים חיוביות לשליליות עבור פלואורופור מסוים. הכינו את ה-FMO על ידי הכללת כל הפלואורופורים בדגימה למעט זו שמבוקרת.
13. כוון שערים באמצעות בקרות FMO (פלואורסצנציה מינוס אחת) ולרכוש 50,000 אירועים לכל דגימה.

5. תרבית של אורגנואידים אפיתליים בשופכה

הערה: עבור אורגנואידים אפיתליים בשופכה בעכברים, יש לעקוב אחר הפרוטוקולים, סעיף 3, עיכול לתלייה חד-תאית, שלבים 3.1 עד 3.11. כדי להשיג מתלים חד-תאיים.

1. החזירו את כדור תא האפיתל של השופכה במדיום התרחבות אורגנואידי של 50–100 מיקרוליטר (פרטים מופיעים בטבלה משלימה 4). השגת חיוניות התא ומספר התאים על ידי ספירה על המוציטומטר.
2. הכינו תערובת של 1:4 של תליית תאים (חלק אחד) ו-Cultrex (4 חלקים), בריכוז סופי של 5000 תאים ב-25 מיקרוליטר. הוסף 3 טיפות של 25 מיקרוליטר תלייה (5000 תאים לטיפה) לכל באר של לוח עם 12 בארות.
   הערה: תמיד יש להשתמש בפיפט קולטרקס בעדינות עם קצה חיתוך כדי למנוע בועות.
3. העבר את הפלטה לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C (5%_CO2) למשך 15 דקות כדי להתקשות את הטיפות.
4. שכבו את הטיפות ב-800 מיקרוליטר של מדיום התרחבות אורגנואידי, בעדינות מצדי הבאר, והעבירו את הלוח חזרה לאינקובטור.
   הערה: נדרש שינוי מדיה כל יומיים. החלף את המדיה המעובדת במדיית התרחבות אורגנואידית טרייה של 800 מיקרוליטר.
5. צלם תמונות של האורגנואידים בכל יום מהיום 0 עד 6 ימים באמצעות מיקרוסקופ הפוך בהגדלה של פי 4–20.

6. היסטולוגיה של אורגנואידים בשופכה וצביעת חיסון

זהירות: קסילן הוא ממס דליק מאוד. השתמש בציוד מגן אישי מתאים לטיפול בכימיקל. אסוף קסילן משומש כפסולת ממס אורגנית. להשליך דרך תוכניות מאושרות לפסולת כימית מסוכנת. פורמלין רעיל וגורם לגירוי בעור, בעיניים ובנשימה. הימנעו ממגע עור ושאיפה. השתמש בציוד מגן אישי מתאים לטיפול בכימיקל. סילוק דרך מערכות סילוק פסולת כימית מסוכנת מוסדיות. הפרוטוקול להטמעת אורגנואידים של שופכה בבלוקי פרפין שונה ואופטימיזם מפרוטוקול להטמעת אורגנואידים של רירית הרחם¹⁴.

1. ביום השישי של תרבית האורגנואידים, להשליך את המדיה המשומשת ולשטוף את האורגנואידים עם 1x HBSS בטמפרטורת החדר. הוסיפו 1.5 מ"ל של פורמלין בופר ניטרלי (10%) לבארות למשך 15 דקות.
2. זרוק את הקיבע והוסף 1.5 מ"ל המטוקסילין לבארות למשך 10 דקות. זרוק את הכתם ושטוף פעמיים עם 1x HBSS.
3. הוסף 1 מ״ל של אגרוז UltraPure 2% בעל נקודת התכה נמוכה, המיוצר ב-1x HBSS בכל באר שמכילה 3 טיפות, והשאירו את האגרוז להתקשות במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
4. הסר בעדינות את האגרוז מהבאר באמצעות קצה שטוח של מרית דקה, ודא שטיפות קולטרקס ייסרו יחד איתו.
5. העבר את דיסק האגרוז לקלטת רקמה והתייבש ב-70% אתנול למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב מתמיד.
6. התייבש נוסף בריכוזים שונים של אתנול ולמשך זמן: 90% אתנול ל-30 דקות, 100% אתנול ל-30 דקות, 100% אתנול ל-60 דקות, 100% אתנול ל-90 דקות.
7. נמרח עודף אתנול ושק עם קסילן במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב מתמיד. חזור על שלב ניקוי הקסילן למשך 60 דקות.
8. הסר את עודף הקסילן והעבר לשעוות פרפין חודרת (65 מעלות צלזיוס) במהלך הלילה.
9. הוסיפו שכבה דקה של שעווה להטמעה לבסיס תבנית מתכתית ומניחים את דיסק האגרוז מעליה. הסר את התבנית מחמם הסלייד ושכב במהירות שעווה מוטבעת דרך הסלטים של תחתית הקסטה. תן לו להתגבש בטמפרטורת החדר.
10. חתכו בלוקי פרפין אורגנואידים על מיקרוטום כדי לקבל חתכים של 5 מיקרון. הניחו חלקים על שקופיות טעונות חיוביות.
11. צביעת המטוקסילין-אאוזין
    1. אפים בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס, דה-פרפינז עם קסילן ורייבש מחדש דרך סדרת שטיפות אתנול (קסילן 1 דקה, 100% אתנול 1 דקה, 95% אתנול דקה אחת, 75% אתנול דקה אחת)
    2. שטפו את המגלשות במי ברז ודגרו עם המטוקסילין מספר 2 של גיל למשך 3 דקות. הנח מגלשות מתחת לזרם מים מהברז כדי לפתח צבע כחול.
    3. הדגרה ב-95% אתנול למשך דקה, ואחריה תמיסת אאוזין של 0.25% לדקה אחת. שטוף את המגלשות במי ברז עד שהמים יצאו צלולים.
    4. ייבוש מחסניות (95% אתנול דקה אחת, 100% אתנול דקה אחת) ונקה עם קסילן (דקה אחת) לפני ההרכבה עם מדיום התקנה מהיר.
12. צביעת חיסון של חלקי פרפין
    1. אפו חלקי פרפין של 5 מיקרון בתנור היברידיזציה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 1–2 שעות.
    2. הסרת שעווה מחליקה על ידי טבילה בקסילן למשך 6 דקות בצנצנת צביעה.
    3. רידרט סלייד ב-100%, 95%, 75% אתנול במים מזוקקים למשך 6 דקות כל אחד. אחר כך שוטפים שקופיות במים מזוקקים למשך 5 דקות.
    4. הוסיפו סליידס בצלחת פיירקס מרובעת המכילה 0.01 מיליון חומצה ציטרית (במים מזוקקים) לתמיסת שאיבת אנטיגן, וכסה את התבנית בניילון נצמד. בצע שליפת אנטיגנים על ידי מיקרוגל בעוצמה גבוהה למשך 20 דקות.
    5. מקררים עד פושרים ל-20 דקות ושוטפים את הסליידס ב-PBS למשך 5 דקות. צייר מחסום הידרופובי סביב חלקי הרקמה ומוסיפים 100 מיקרוליטר לחתך של בופר חוסם סוסים למשך שעה בטמפרטורת החדר עם נדנוד עדין (ראו טבלה משלימה 5 להכנת בופר חסימת סוסים).
    6. הכינו תמיסת נוגדנים ראשונית בבופר חסימת סוסים על ידי הוספת נוגדנים ראשוניים בדילול מתאים (1:100–1:200). הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית לכל חלק. דגירה מחליקה למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם נדנוד עדין.
       הערה: אורגנואידים קיבלו נוגדנים לקרטין 5/KRT5 (סמן אפיתל בסיסי), P63 (סמן אפיתל בסיסי), KRT4 (סמן אפיתל בינוני/על-בסיסי) ו-KRT13 (סמן אפיתל בינוני/על-בסיסי).
    7. לאחר הדגירה הלילית, יש לשטוף את הסליידים ב-PBS 4 x 5 דקות בטמפרטורת החדר עם נדנוד עדין.
       הערה: כל השלבים הבאים צריכים להתבצע בקופסה מוגנת לאור בטמפרטורת החדר.
    8. הכינו תמיסת נוגדנים משנית בבופר חסימת סוסים, תוך הוספת נוגדנים משניים מתויגים פלואורסצנטית בדילול של 1:500. דגירה להחלקות למשך שעה בטמפרטורת החדר עם נדנוד עדין.
    9. שטיפת סליידס ב-PBS 4 x 5 דקות בטמפרטורת החדר עם נדנוד עדין.
       הערה: שלב אופציונלי: השתמש בערכות כיבוי אוטופלואורסצנציה כדי לכבות את אות הפלואורסצנציה האוטומטי.
    10. דגר עם תמיסת DAPI של 300 ננומטר למשך 5 דקות עם נדנוד עדין. שטוף ב-PBS 2 x 5 דקות בטמפרטורת החדר עם נדנוד עדין.
    11. הרכבה עם תמיסת הרכבה נגד דהייה (90% גליצרול, 0.2% n-פרופיל גלאט ב-1x PBS). קטעי תמונה במיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב-שדה.
        הערה: יש להתאים את הגדרות החשיפה של המצלמה לכל פלואורופור כדי למקסם את יחס האות לרעש תוך הימנעות מרוויית פיקסלים. השתמשו באותן הגדרות חשיפה בזמן הדמיית אורגנואידים שצובעו במפגש נתון.

7. צביעת מערכת חיסון מלאה של שכבות אפיתל מבודדות בשופכה

הערה: לצביעת מערכת חיסון מלאה, יש לעקוב אחרי הפרוטוקול, סעיף 2, בידוד רקמת אפיתל שופכה, שלבים 2.1 עד 2.12. כדי לקבל שכבות אפיתל בשופכה.

1. העבר בזהירות את רקמת האפיתל באמצעות פיפטת העברה או קצה פיפטה בנפח 200 מיקרוליטר לבאר של צלחת תרבית רקמה בת 24 בארות המכילה 500 מיקרוליטר של פורמלין בופר ניטרלי ב-10%. אטום את מכסה הצלחת בפרפין ודגר אותו על נדנדה למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: בצע את כל השלבים באותה באר כדי למנוע אובדן רקמת אפיתל.
2. שאפו בזהירות את הפורמלין מהבאר. בצע שטיפה עם 500 מיקרוליטר של 1x PBS ודוגר על נדנדה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על אותו שלב כביסה שוב.
3. הוסף לבאר 500 מיקרוליטר תמיסת חדירות המכילה 1x PBS + 1% טריטון X-100. אטום את מכסה הפלטה באמצעות פרפילם, ודגר במשך שעתיים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נדנוד עדין.
4. שאפו בזהירות את תמיסת הפרמיאביליזציה מהבאר.
5. בצע חסימה על ידי דגירה של רקמות בבופר חסימת סוסים בנפח 500 מיקרולטר המכיל 1% נוסף Triton X-100 (מתכון לבופר חסימת סוסים מסופק בטבלה משלימה 5). אטום את מכסה הצלחת עם פרפילם ודגר אותו ללילה בטמפרטורה של 4°C עם נדנוד עדין.
6. הכינו תמיסת נוגדנים ראשונית בבופר חסימת סוסים המכיל תוספת של 1% טריטון X-100 על ידי הוספת נוגדנים ראשוניים בדילול מתאים (1:100–1:200). שאיבת תמיסת חסימה והוספת 500 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית: אנטי-CDH1 (סמן תא אפיתלי) ואנטי-F4/80 (סמן מקרופאג עכברי). אטום את המכסה בפארפילם ודגר במשך 48–72 שעות בטמפרטורה של 4°C עם נדנוד עדין.
7. שאפו בזהירות את תמיסת הנוגדן הראשית ושטפו 3 פעמים עם פעם אחת של PBS למשך 30 דקות כל אחת בטמפרטורת החדר עם נדנוד עדין.
8. הכינו תמיסות נוגדנים משניות בבופר חוסם סוסים עם תוספת של 1% טריטון X-100 על ידי הוספת נוגדנים משניים בדילול מתאים (1:500).
9. הוסיפו 500 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית לבאר, כסו את הפלטה בנייר אלומיניום, ודגרו במשך 4–6 שעות בטמפרטורת החדר על נדנדה (נדנדה).
10. שאפו בזהירות את תמיסת הנוגדן המשני ושוטפים 3 פעמים עם 1x PBS למשך 30 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר.
    הערה: ניתן לבצע צביעת DAPI על ידי דגירה של רקמות עם תמיסת DAPI מדוללת (ריכוז סופי של 300 ננומטר) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שטוף טישו עם 1x PBS (2x5 דקות) בטמפרטורת החדר על נדנדה.
11. העבר בזהירות את רקמות האפיתל למחסנית זכוכית או צלחת הדמיה והוסף תמיסת הרכבה נגד דהייה (90% גליצרול, 0.2% n-פרופיל גלאט ב-1x PBS).
12. רקמות תמונה במיקרוסקופ פלואורסצנטי.
    הערה: בהתחשב בעובי הדגימה, המחברים ממליצים לבצע דימות במיקרוסקופ פלואורסצנטי המסוגל לחתך אופטי. במחקר זה, המחברים השתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב-שדה עם חתך אופטי של Apotome כדי להסיר אור מחוץ למפוקוס ולהשיג ערימות z. הושגו ערימות z של תמונות כדי להמחיש הקרנות דנדריטיות של מקרופאגים הקשורים לאפיתל.

תוצאות

ניתוח ואיסוף שופכת השופכה של נקבת העכבר הבוגרת

בחלק הראשון של מחקר זה, המחברים מספקים פרוטוקול מפורט לניתוח השופכה של הנקבה בעכבר. בהתחשב בהיקשרותו לדופן הנרתיק הוונטרלית ולמיקומו מתחת לסימפיזה הערווית, השיטה המוצגת כאן מאפשרת ניתוח נקי של השופכה הנשית באורך מלא (איור 1).

בידוד רקמת אפיתל שופכה וניתוח ציטומטריית זרימה עבור מבודדים חד-תאיים

עיכול טריפסין מוביל להפרדה קלה של רירית האפיתל של השופכה מהסטרומה הסובבת. ניתן לראות יריעות אפיתל עם שקיפות גבוהה יותר מרקמת הסטרום לאחר ההפרדה (איור 2). היריעות האפיתל המופרדות הניבו תליות חד-תאיות בעת עיכול אנזימטי. תאים בודדים שבודדים מאפיתל השופכה מראים עמידות גבוהה עקבית (>80%) באמצעות הדרת כחול טרייפן על ההמוציטומטר (איור 2L) וציטומטריית זרימה באמצעות צבעי חיוניות לגייטינג של תאים חיים (איור 3, קובץ משלים 1).

המחברים ביצעו ציטומטריית זרימה להערכת העשרת תאי אפיתל מתליות תא יחיד של אפיתל שופכה. כדי לבדוק את שריית התאים, תליית התא צובעת בסמן חי/מת, צבע רפאים ריאקטיבי לאמין V450. המחברים הבחינו בעקביות בחיות תאים של >80% לפי סמן חי/מת. הסמן חי/מת אפשר את המעבר לפסולת ותאים מתים במהלך ניתוח הזרימה. הם צבעו דגימות בסמן תאים אפיתל (CD326/EPCAM), סמן מקרופאג' (F4/80) וסמן תאי חיסון (CD45) כדי לתעד את הרכב התאים שבודדו בשיטה זו. תוצאות ציטומטריית הזרימה הראו כי המחברים בודדו אוכלוסיית תאי אפיתל מועשרת מהאפיתל של הנקבה בשופכה. בשני הניסויים העצמאיים שבוצעו, הקבוצה השיגה 80–90% מתאי אפיתל חיוביים ל-EPCAM לאחר גייטינג על תאים חיים. המחברים גם הבחינו ב~1.30% מתאי החיסון CD45+ בתכשיר האפיתלי. מקרופאגים הקשורים לריריית האפיתל היוו ~1.18% מהתאים החיים מהמחלקה האפיתלית. ניתוח ציטומטריית זרימה של תליות חד-תאיות מריעות אפיתל מראה זיהום סטרומלי מינימלי (5–6%), אשר מיוחס בעיקר לאנדותל וסקולרי לפי המחקר הקודם^{שלהם 5}. קובץ משלים 1 מציג תוצאות ציטומטריית זרימה עבור תכשירים חד-תאיים מהמחוזות האפיתל והסטרומלי. בהשוואה להעשרת 80–90% של תאי אפיתל שבודדו מהתא האפיתליאלי, תא הסטרום הראה גם 40–50% מתאי האפיתל הקצרים, שהם מהצינורות הקצרים והאפיתל הבלוטותי המתפשט מהלומן השופכה אל הסטרומה הסובבת (איור 3, קובץ משלים 1).

תרבות אורגנואידים אפיתליים בשופכה, היסטולוגיה וצביעת חיסון

המחברים גם מדגימו כיצד תאים אפיתליים בודדים המבודדים מהשופכה בריאים ויכולים ליצור אורגנואידים במטריצה תלת-ממדית, וצפו בצמיחה אורגנואידית מתאי אפיתל שופכה יחידים עד ליום השישי בתרבית (איור 4B–G). הם ביצעו צביעת המטוקסילין-אאוזין (H&E) כדי לצפות בהיסטולוגיה של אורגנואידים (איור 4H–J). המחברים הבחינו בשתי מורפולוגיות מובחנות של אורגנואידים אפיתליים בשופכה, אחד גדול וחלול, והסוג השני קטן ומוצק. בשני המקרים, האורגנואידים עברו סימנים שכבתיים וחוזרים שהובאו בציפוי האפיתל של השופכה הנשית, כולל KRT5 ו-P63 המסמנים את השכבה הבסיסית ו-KRT4 ו-KRT13 שסימנו שכבות תאים על-בסיסיות/ביניים (איור 4K–N), איור משלים 1). נבדקו ההבדלים ביכולת היווצרות אורגנואידים בין השופכה הפרוקסימלית לשופכה הדיסטלית. אורגנואידים שנוצרו מהשופכה הקרובה הכילו שיעור גבוה יותר של אורגנואידים חלולים, בעוד שאורגנואידים מהשופכה הדיסטלית יצרו כדורים מוצקים (איור 4O–P). בנוסף, הם הבחינו בהבדלים ביעילות יצירת אורגנואידים בתאי אפיתל המבודדים מהחלקים הפרוקסימליים והרחוקים של השופכה. אפיתל שופכה דיסטלי יצר אורגנואידים ביעילות גבוהה יותר מאשר אפיתל שופכה פרוקסימלי עם אותה צפיפות זריעה ראשונית (5000 תאים לטיפה) (איור 4Q–S).

צביעת מערכת חיסון שלמה של דפי אפיתל מבודדים בשופכה

החוקרים מציגים גם שיטה אופטימלית לצביעה מלאה של דפי האפיתל של השופכה של הנקבה בעכבר. כאן, הם צבעו דפי אפיתל בשני סימנים: F4/80 למאקרופאגים ו-E-cadherin/CDH1 לסימון חיבורי תא-תא אפיתל (איור 5). הרקמות צולמו באמצעות מיקרוסקופ Zeiss Axio Observer 7 עם חתך אופטי Apotome 3. דפי אפיתל מראים תיוג חזק עם נוגדן CDH1. הכנות שלמות של אפיתל שופכה מסומן בנוגדנים ל-F4/80 הראו מקרופאגים יוצרים קשת דנדריטים בציפית האפיתל. ניתן היה לצפות במקרופאגים שולחים תהליכים דנדריטיים בין תאי האפיתל של השופכה. בסך הכול, התוצאות מראות את התועלת של הפרוטוקולים המתוארים כאן לחקר רירית האפיתל של שופכת השופכה של נקבת העכבר.

איור 1: ניתוח עכבר לאוסף שופכות נשיות. (א) להניח את העכבר על הגב ולרסס את הבטן ב-70% EtOH. (B–C) פתח את הבטן על ידי הרמת העור ויצירת חתך אנכי. (ד) גזם שומן ורקמת חיבור כדי לחשוף את עצמות הערווה בצורת פרפר המחוברות בסימפיזיס הערווה (החץ בשחור). (ה) להפסיק את הסימפיזיס הערווי. (F) לאחר הסרת עצמות העררווה, ניתן לראות את השופכה יורדת כלפי מטה (מסומנת בקו מנוקד בשחור) מהשלפוחית. (G) משוך בעדינות את השלפוחית עם מלקחיים. השופכה נראית בבירור כצינור אדום דק. (H–I) משוך את השלפוחית כלפי מעלה מחלל הגוף. השתמש במתח על שלפוחית השתן כדי להפריד בין השופכה לדופן הנרתיק הוונטרלי. העבירי את המספריים בין השופכה לדופן הנרתיק כדי להפריד בין דרכי השתן והרבייה. (J–K) נתק את הקצה המרוחק של השופכה שמחובר לעור. (L) תמונה של נקבת עכבר שנחתה במערכת השתן התחתונה (FLUT), המציגה שלפוחית השתן והשופכה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: בידוד אפיתל השופכה והכנת תלייה חד-תאית. (א) סכמטי המתאר עיכול אנזימטי והפרדה מכנית של תא האפיתל והסטרומלי של השופכה, ואחריו עיכול תא יחיד. (ב) לפנות את השומן העודף ממערכת השתן התחתונה של הנקבה. (C–F) חתכו את השופכה מאזור צוואר שלפוחית השתן כדי להפריד בין השופכה לשלפוחית. אחר כך חותכים את השופכה לשני חצאים עם מספריים דקים. (ז) שטיפת חלקי שופכה בתמיסת HBSS של 1x על ידי העברת מסנן של 100 מיקרון. (ח) להעביר קטעי רקמת שופכה לתמיסת טריפסין 1%. דגר על סיבוב דגימה בחדר הקר. הוסף את MgCl₂ ו-DNase I לאותו צינור. דגרו בטמפרטורה של 37°C בתנור היברידיזציה על סיבוב דגימה. (I–J) בודדו את האפיתל על ידי לחיצה עדינה עם מלקחיים דקים לאורך שבר השופכה. (K) טישו נחתכים לחתיכות קטנות באמצעות מספריים דקים. העבר את רקמת האפיתל הטחונה לתמיסת עיכול אקוטאז ודוגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתנור היברידיזציה על סיבוב דגימה. (L) לספור תאי אפיתל ולהעריך את הקיימות באמצעות Trypan Blue עם המוסיטומטר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: ציטומטריית זרימה להערכת תליות חד-תאיות מאפיתל השופכה ותאי הסטרומה. ציטומטריית זרימה בוצעה על תכשירים חד-תאיים של תאים אפיתליים (A) של שופכת עכברים (A) ו-(B) מחלקות סטרומליות. תאים חיים הוגדרו כדי להרחיק תאים מתים שמוצבעו ב-Ghost Dye V450. תאים חיים הוערכו לביטוי CD45 (סמן פאן-אימוני), CD326/EPCAM (סמן פאן-אפיתלי) ו-F4/80 (סמן מקרופאג' עכברי). הנתונים מייצגים שני ניסויים עצמאיים שנערכו על מאגר של 5–6 עכברים בכל ניסוי ליצירת דגימות אפיתל וסטרומליות. קיצורים; SSC-A = אזור שיא פיזור צדדי; FITC = פלואורסאין איזותיוציאנט; APC = אלופיקוציאנין; PE = פיקואריתרין. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4: היסטולוגיה וצביעת חיסון של אורגנואידים אפיתל בשופכה. (א) תהליכי עבודה שמציגים סכמטית ליצירת אורגנואידים אפיתליים בשופכה. (B–G) מיקרוגרפים מייצגים בשדה בהיר של אורגנואידים אפיתליים בשופכה (UEOs) שנוצרו מתאים בודדים בימים שונים של התרחבות במבחנה. תמונות שדה בהיר מייצגות של (H) אורגנואידים אפיתל חלולים ו-(I) מוצקים בשופכה (UEOs) שמוצבעים בהמטוקסילין ואאוזין (H&E). (J) כימות של סוגי אורגנואידים שנוצרו בשלושה ניסויים עצמאיים. שורת השגיאה מייצג את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע. תמונות מייצגות של (K) אורגנואידים אפיתליים חלולים ו-(L) מוצקים בשופכה (UEOs) עם סמנים אפיתליים KRT13 (סמן אפיתל על-בסיסי), KRT5 (סמן אפיתל בסיסי) ו-P63 (סמן אפיתל בסיסי). תמונות המתארות תעלות פלואורסצנטיות בודדות מוצגות ב-K', K'', K''', L', L'' ו-L'''. תמונות מייצגות של (M) אורגנואידים חלולים ו-(N) אורגנואידים מוצקים של השופכה (UEOs) עם סמנים אפיתליים KRT4 (סמן אפיתל על-בסיסי) ו-KRT5 (סמן אפיתל בסיסי). תמונות המציגות תעלות פלואורסצנטיות בודדות מוצגות ב-M', M'', N' ו-N". (O) סכמטי של החתך של השופכה הפרוקסימלית והדיסטלית. (P) כימות סוגי אורגנואידים שנוצרו מהשופכה הפרוקסימלית והדיסטלית בשני ניסויים עצמאיים. מיקרוגרפים מייצגים בשדה בהיר של אורגנואידים אפיתל של השופכה ביום השישי (UEOs) שנוצרו מאפיתל שבודד מהשופכה הפרוקסימלית (Q) ו-(R) דיסטלית של השופכה. הנתונים של אורגנואידים שנוצרו מהשופכה המלאה מייצגים 3 ניסויים עצמאיים שנערכו עם מאגר של 3–5 עכברים בכל ניסוי. (S) נתוני אורגנואידים שנוצרו מהשופכה הפרוקסימלית והדיסטלית מייצגים שני ניסויים עצמאיים שנערכו עם מאגר של 3–4 עכברים בכל ניסוי. גרעינים מסומנים ב-DAPI (כחול). (פסי קשקש, 100 מיקרומטר). הסכימות שהוכנו עם BioRender ו-Adobe Illustrator. נוצר ב-BioRender. בינוי ג'וזף, ד. (2026) https://BioRender.com/jvf17v7 אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של האיור.

איור 5: צביעת חיסון מלאה של יריעות אפיתל בשופכה. (A) חתך קפוא בגודל 10 מיקרון של שופכת השופכה של נקבת העכבר הבוגרת במדיה חותכת אופטימלית, המראה צביעת חיסון לסמן המקרופאג של העכברים F4/80 (באדום) ולחלבון אפיתל E-cadherin/CDH1 (בירוק). (A') מייצג תצוגה מוגדלת של הטבעת ב-(A). (ב) דיאגרמה סכמטית המציגה שלבים לצביעה מלאה של גיליונות אפיתל מבודדים בשופכה. הצבעה חיסונית מלאה של ציפוי אפיתל השופכה של הנקבה המבודדת בוצע עם נוגדנים נגד סמן המקרופאג של העכברים F4/80 (באדום) ולחלבון האפיתליאלי E-cadherin/CDH1 (בירוק). (ג) תמונה מייצגת של התצוגה הממוזגת. (D) הקרנת עוצמה מקסימלית אורתוגונלית של התעלה האדומה המראה ארגון מקרופאגים. (E–F) מוגדל במבט של אפיתל ומקרופאגים נלווים. פס קנה מידה לבן, 50 מיקרומ'. פס סולם אפור, 500 מיקרומ'. הנתונים מייצגים שני ניסויים עצמאיים שנערכו על מאגר של 4–5 עכברים. סכמות שהוכנו ב-BioRender וב-Adobe Illustrator. נוצר ב-BioRender. בינוי ג'וזף, ד. (2026) https://BioRender.com/tjh9opk אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה מוגדלת של האיור.

טבלה משלימה 1: הכנת 1x HBSS (ללא Ca, Mg).אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 2: הכנת תמיסת 1x sHBSSa ו-1% תמיסת טריפסין.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 3: הכנת בופר צביעת תאים/זרימה.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 4: הכנת מדיום התרחבות אורגנואידי לאורגנואידים אפיתל שופכה.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימים 5: הכנת חסימת סוסים.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 1: ספירות תאים לניסוי ציטומטריית זרימה שבוצע על תאים בודדים מהמחלקה האפיתלית והסטרומלית של השופכה משני ניסויים עצמאיים.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 1: השוואה בין אפיתל שופכה של נקבת עכבר בוגרת לאורגנואידים אפיתליאליים בשופכה. תמונות מייצגות של (א) אפיתל שופכה של עכבר בוגר, (B) אורגנואידים אפיתליים חלולים בשופכה, ו-(C) אורגנואידים אפיתליים מוצקים בשופכה (UEOs) שמוצבעים בסמנים אפיתליים KRT13 (סמן אפיתל על-בסיסי), KRT5 (סמן אפיתל בסיסי), ו-P63 (סמן אפיתל בסיסי). תמונות המציגות תעלות פלואורסצנטיות בודדות מוצגות באותיות A', A'', A''', B', B'', C', C'' ו-C''. תמונות מייצגות של (D) אפיתל שופכה של עכבר בוגר, (E) אורגנואידים אפיתליים חלולים של השופכה ו-(F) אורגנואידים אפיתליים מוצקים בשופכה (UEOs) עם סמני אפיתל KRT4 (סמן אפיתל על-בסיסי) ו-KRT5 (סמן אפיתל בסיסי). תמונות המציגות תעלות פלואורסצנטיות בודדות מוצגות ב-D', D'', E', E'', F' ו-F". נתונים המייצגים 3 ניסויים עצמאיים שנערכו עם מאגר של 3–4 עכברים בכל ניסוי. גרעינים מסומנים ב-DAPI (כחול). (פסי קשקש, 100 מיקרומטר). אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

מחסומי אפיתל בגוף חשובים מאוד להגנה על המארח. אלו מדורים מיוחדים עם מספר סוגי תאי אפיתל ותאי חיסון תושבים נלווים. מחסומי אפיתל משתנים לאורך זמן ההתפתחות, ומקבלים ביטוי גנים להגנת המאכסן לעיתים קרובות בתגובה למיקרוביום או חשיפות סביבתיות. פגמים בשלמות האפיתל או בביטוי הגנים עשויים להשפיע על הגנת המארח¹⁵. חשוב לחקור רקמת אפיתל בנפרד כדי להבין חתימות טרנסקריפטומיות וכן לחקור מגעים בין תאים ושלמות אפיתליאלית. נכון לעכשיו לא תוארו שיטות מפורטות שמותאמות לבידוד רקמת אפיתל השופכה מהעכבר. בעוד שהאפיתל של שלפוחית השתן ניתן לבידוד רק באמצעות הפרדה מכנית¹⁶, האפיתל של השופכה נמצא בתוך צינור הסטרום של השופכה ודורש שילוב של הפרדה אנזימטית ומכנית לבידוד רקמת אפיתל.

כאן, המחברים מציגים שיטה אופטימלית לבידוד שכבות אפיתליות מהלומן השופכה של עכברים נקבות. השיטה יכולה לשמש ליצירת תליות חד-תאיות ביעילות גבוהה של תאי אפיתל שופכה ליישומים במורד הזרם כמו ציטומטריית זרימה, תרבית אורגנואידים וצביעה חיסונית. התאימות של שיטה זו לתהליכי עבודה של ריצוף RNA חד-תאי הודגמה בעבר על ידי אותה קבוצה⁵. עם שינויים ואופטימיזציה נוספת, ניתן להתאים את הפרוטוקול המוצג כאן להפקת רקמות אפיתל מאיברים צינוריים אחרים ליישומים במורד הזרם.

השלבים המרכזיים בפרוטוקול כוללים ניתוח מדוקדק של שופכת השופכה הנקבית הבוגרת באורך מלא, המאפשרת חקר הבדלים אזוריים לאורך הציר הפרוקסימלי-דיסטלי. לאחר מכן, הפרוטוקול משתמש בעיכול אנזימטי עדין כדי לשחרר את רירית האפיתל של השופכה מהסטרומה הסובבת. העיכול האנזימטי מרפה את האפיתל כדי לאפשר הפרדה מכנית על ידי לחיצה עדינה על צינור השופכה בין המלקחיים, כדי לשחרר את רקמת האפיתליאל. החוקרים ייפטמו בקפידה את תזמון עיכול הטריפסין כדי לאפשר בידוד של אפיתל שופכה בעל חיוניות גבוהה (> 80%) כיריעות לצביעה חיסונית או לבידוד תא בודד במורד הזרם (איור 3, קובץ משלים 1). עיכול תא יחיד של אפיתל שופכה חשף 80–90% מתאי האפיתל בבידוד אפיתל בשופכה. ממחקר קודם, המחברים זיהו שתאים לא-אפיתליאליים בתכשיר זה מורכבים בעיקר מתאי חיסון הקשורים לאפיתל ואנדותל וסקולרי⁵. השיטה הנוכחית לבידוד תא יחיד מניבה תליות חד-תאיות איכותיות ליישומים במורד הזרם כמו ציטומטריית זרימה וריצוף RNA תא יחיד, על ידי הסרת גושים תאים באמצעות שיבוש מכני באמצעות שאיבת מחט קטנה והסרת תאי דם אדומים באמצעות פירוק עדין.

התוצאות מראות כי שיטה זו יכולה לשמש להעשיר תאי מערכת חיסון ספציפיים (איור 3). אפיתל שמבודד מהשופכה הפרוקסימלית והדיסטלית ניתן גם הוא להיבחר בנפרד. בנוסף, המחברים הוכיחו שתאי אפיתל מבודדים יכולים לשמש ליצירת אורגנואידים שופכה שלא תוארו קודם לכן (איור 4). תוצאות אלו גם מראות שונות אזורית ביכולת יצירת אורגנואידים בשופכה הנקבית. בעוד שמחקריו האחרונים של המחבר הראו הבדלים פרוקסימליים-דיסטליים בביטוי הגנים האפיתל ובארגון תאי החיסון בשופכה הנקבית⁵, המחקר הנוכחי מראה שתאי אפיתל שופכה פרוקסימליים יוצרים פחות אורגנואידים מאשר אפיתל המבודד מהשופכה הדיסטלית (איור 4). מגבלה אחת של הפרדה מרחבית זו לשופכה פרוקסימלית ודיסטלית היא שאין סימן אנטומי שניתן להשתמש בו בזמן הניתוח להבחנה בין שני האזורים הללו. במחקר זה, המחברים חילקו את אורך השופכה בחצי כדי לקבל תאים פרוקסימליים ומרחקיים. שיטת הבידוד האפיתל המתוארת כאן יכולה לשמש לאפיון נוסף של ההבדלים בביטוי גנים ובהרכב התאים בין אפיתל השופכה הפרוקסימלי והדיסטלי של השופכה.

בעוד שהפרוטוקול האופטימלי המוצג כאן נגיש וניתן לשחזור, ישנם שלבים שדורשים תרגול וכיול זהיר. במיוחד, שיטת הדיסקציה המוצגת כאן דורשת חילוץ זהיר של צינור השופכה מתחת לסימפיזית הערווה תוך שמירה על כל אורך השופכה. בנוסף, יש להקפיד להסיר כל רקמת נרתיקה המחוברת לדופן השופכה הגבית לאחר הניתוח. השומן הקיים סביב צוואר שלפוחית השתן צריך להיות מוסר בזהירות כדי להפחית זיהום שומן במהלך יישומים במסגרת המשך כמו ריצוף RNA חד-תאים. בנוסף, יש לאופטם את עיכול הטריפסין בקפידה עם כל אצווה של אנזים כדי להבטיח עיכול עקבי. עיכול יתר של רקמות עלול לגרום לאובדן חיוניות התאים. המחברים אופטימיזם בקפידה את זמן עיכול הטריפסין, ומצביעים על חלון זמן של 15–30 דקות לשלב הדגירה ב-4°C ו-37°C. ניתן לאופטימיזציה נוספת בהתאם לכמות האנזים שבה משתמשים. כמו כן, קריטי לקצוץ רקמות לחתיכות קטנות לעיכול תא יחיד יעיל. המחברים השתמשו באקוטאז לעיכול חד-תאי נוסף, שכן הוא גורם להתנתקות עדינה. במקרה של ירידה בחיוניות התאים, ניתן לקצר את זמן דגירה של האקוטאז. בנוסף, המחברים כללו מעכב סלעים בתערובת העיכול Accutase כדי לשפר את הישרדות התאים. עיכול DNase מומלץ להפחתת הצטברות תאים על ידי עיכול DNA חוץ-תאי המשתחרר מתים מתים וגוססים. המחברים גם ממליצים להשתמש בבופר ליזיס תאי דם אדומים כדי להפחית זיהום תאי דם אדומים שעלול לבלבל תוצאות כמו ציטומטריית זרימה וריצוף RNA חד-תאים.

מגבלה אחת בשיטת הבידוד האפיתליאלי המוצגת כאן היא שהיא מותאמת במיוחד לשופכה של נקבת העכבר. שופכת השופכה של העכבר הזכרית מורכבת יותר מבחינה אנטומית, עם מבנה אפיתל משתנה מהשופכה הפרוקסימלית לשופכה הדיסטלית. בנוסף, השיטה יכולה לבודד רק את תאי האפיתל המצפים את לומן השופכה. בלוטות הפרשה של השופכה המחוברות ללומן השופכה דרך צינורות אפיתל קצרים אינן ניתנות לבידוד שכן הן מוטמעות ברקמת סטרומל. במקום זאת, מבנים אפיתליאליים אלו מועשרים במחלקת הסטרומלית שנותרה לאחר בידוד רירית האפיתל של השופכה (איור 3).

למרות מגבלות אלו, שיטה זו אפשרה תובנות חשובות על ארכיטקטורת האפיתל של השופכה ותאפשר חקירה נוספת של תאי חיסון הקשורים לאפיתל באמצעות הדמיית מקרופאגים הקשורים לאפיתל במקום. השיטה כבר הוכחה כתואמת לתהליכי ריצוף RNA חד-תאיים לזיהוי הטרוגניות תאית באפיתל השופכה ובתאי החיסון הנלווים⁵. בנוסף, היכולת לבודד אפיתל מהשופכה הפרוקסימלית והדיסטלית תאפשר למחקרים להבין את ההבדלים המרחביים בשופכה. חשוב לציין ששיטת עיכול תאי האפיתל מניבה תאים בודדים ברי קיימא שיכולים לייצר אורגנואידים אפיתליים בשופכה, שיהיו שימושיים לחקר אינטראקציות בין מארח לפתוגן וביולוגיה אפיתלית של השופכה. בסך הכל, שיטות אלו מוסיפות לארגז הכלים כדי לאפשר חקירות מעמיקות יותר בביולוגיה אפיתלית של השופכה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
#5 fine forceps
10% neutral buffered formalin	Sigma Aldrich	HT501128
10X HBSS	Sigma Aldrich	H4641
12-well plate	Corning	3513
30-micron pre-separation filter	Miltenyi Biotec	130-041-407
A83-01	Sigma Aldrich	SML0788
Accutase	Sigma Aldrich	SCR005
Adobe Illustrator	Adobe		כדי ליצור פאנלים של דמויות
Adobe Photoshop	Adobe		כדי ליצור פאנלים של דמויות
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010
Antibiotic/antimycotic	Sigma Aldrich	A5955
Anti-CD326 (EpCAM)	Invitrogen	17-5791-82	דילול 1:20, עבור ציטופלומטריה
Anti-CD45	Tonbo	35-0451-U100	דילול 1:20, עבור ציטופלומטריה
Anti-CDH1 (Rabbit)	Cell Signalling Technology	3195S	דילול 1:200
Anti-F4/80	Tonbo	50-4801-U100	דילול 1:20, עבור ציטופלומטריה
Anti-F4/80 (Rat)	Invitrogen	14-4801-82	דילול 1:200
Anti-Keratin 13 (Rabbit)	Abcam	ab92551	דילול 1:200
Anti-Keratin 4 (Mouse)	Abcam	ab9004	דילול 1:200
Anti-Keratin 5 (Chicken)	Biolegend	905904	דילול 1:800
Anti-Keratin 5 (Rabbit)	Cell Signaling Technology	71536	דילול 1:200
Anti-p63 (Mouse)	Biocare medical	CM163A	דילול 1:200
Axioobserver 7	Zeiss	431007-9904-000
B27 supplement	Invitrogen	12587010
Bovine serum albumin (BSA), fraction V	Genetix	PG-2330
CD-1 Mice	Charles River, USA	Crl:CD1(ICR)
Cultrex BME	R&D systems	3445-005-01
DAPI solution	Sigma Aldrich	D5942
D-Glucose	Qualigens	Q15405
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Himedia	MB058
di-Sodium Hydrogen Ortophosphate (Na2HPO4)	Qualigens	Q15825
DNase I	Sigma Aldrich	10104159001
Donkey anti-Chicken IgG (H+L) (AF488)	Jackson Immunoresearch	703-545-155	דילול 1:500
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) (AF488)	Jackson Immunoresearch	715-545-151	דילול 1:500
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	715-585-151	דילול 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	711-585-152	דילול 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) (AF647)	Jackson Immunoresearch	711-605-152	דילול 1:500
Donkey anti-Rat IgG (H+L) (AF647)	Jackson Immunoresearch	712-605-153	דילול 1:500
Donkey anti-Rat IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	712-585-153	דילול 1:500
EGF	PeproTech	AF-315-09
Eosin	Himedia	GRM938
Ethanol	Supelco	1.00983
Eukitt mounting media	Sigma Aldrich	3989
FGF10	PeproTech	450-61
Filter cap sorting tubes	Falcon/Corning	352235
Ghost Dye™ Violet 450	Tonbo biosciences	13-0863-T100
Glutamax	Invitrogen	35050061
Glycerol anhydrous	Merck	DA1P692899
Hematoxylin	Polysciences	24243
HEPES	Gibco	15630080
Horse serum	Gibco	26050088
Kaluza Analysis	Beckman Coulter	Kaluza Analysis 2.4	ניתוח נתונים של ציטופלומטריה
Magnesium chloride (MgCl2)	Qualigens	Q15535
Mouse TruStain FcX (anti-mouse CD16/32 )	Biolegend	101320
N-acetyl cysteine	Sigma Aldrich	A9165
Nicotinamide	Sigma Aldrich	N0636
Noggin	PeproTech	AF-250-38
n-Propyl gallate	Sigma Aldrich	P3130
Paraffin wax	Qualigens	Q19215
Potassium chloride (KCl)	Qualigens	Q13305
Potassium dihydrogen orthophosphate (KH2PO4)	Qualigens	19465
Primocin	Invivogen	ant-pm-05
RBC Lysis Buffer (10X)	Tonbo biosciences	TNB-4300-L100
Retinoic acid	Sigma Aldrich	R2625