מאמר שיטה

בידוד ואפיון של אקסוזומים שמקורם בתאי גזע במקור הדנטלי דרך מעברי התא

DOI:

10.3791/70977

⸱

10 באפריל 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College, 2Engineering Laboratory for Biomaterials and Tissue Regeneration, Ningbo Stomatology Hospital, 3Ningbo Savaid Stomatology and Otolaryngology Medical Institute, Ningbo ENT Hospital

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה סטנדרטית לבידוד ואפיון אקסוזומים שמקורם בתאי גזע מוך שיניים (DPSC) בין מעברים, ומאפשר הערכה שכפולה של איכות האקזוזומים ופעילות פונקציונלית ליישומים רגנרטיביים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע של מוך שיניים (DPSCs) מהווים מקור נגיש ורלוונטי קלינית לתאי גזע מזנכימליים, והאקסוזומים שמקורם הפכו לווזיקולות ביואקטיביים מבטיחים ליישומים חופשיים מתאים בהנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית. עם זאת, שיטות שחזוריות וסטנדרטיות לבידוד ואימות פונקציונלי של אקסוזומים שמקורם ב-DPSC עדיין מוגבלות, במיוחד ביחס לשונות שהוכנסה במהלך התפשטות התא בין מעברים. כאן, אנו מתארים תהליך עבודה מקיף, סטנדרטי, מבוסס ערכות, לבידוד וטיהור אקסוזומים ממדיום מותאם ל-DPSC, התואם לפרקטיקה מעבדתית שגרתית. שיטה זו מאפשרת שחזור עקבי של וזיקולות שלמות, המתאימים לאפיון מורפולוגי, מולקולרי ותפקודי באמצעות טכניקות נפוצות. זהות האקסוזומים מוערכת על פי מורפולוגיה, התפלגות גודל וביטוי סמנים, בעוד שהפעילות הביולוגית מוערכת באמצעות בדיקה אנטי-דלקתית מוגדרת במבחנה. כדי לבחון השפעות הקשורות למעבר, משווים אקזוזומים שמקורם במקטעי DPSC שונים באמצעות קריאה פונקציונלית זו, ומספקת מסגרת מעשית להערכת עקביות במהלך התפשטות התא. על ידי שילוב בידוד, טיהור, אפיון ואימות פונקציונלי לתוך תהליך עבודה אחד, פרוטוקול זה מציע גישה ניתנת לשחזור וניתנת להרחבה ליצירת אקסוזומים מאומתים פונקציונלית שמקורם ב-DPSC למחקר ביוחומרים ויישומים רגנרטיביים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אקסוזומים שמקורם בתאי גזע מזנכימליים משמשים כמתווכים מרכזיים לתקשורת בין-תאית ומדגימים פוטנציאל טיפולי משמעותי בתחומי הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית. אקזוזומים הם וזיקולות בקוטר 30–150 ננומטר, המסוגלים לספק מולקולות ביואקטיביות ולוויסות פונקציות שונות בתאי המקבל, כגון התפשטות, התמיינות ותגובה חיסונית 1,2. מבין מקורות תאי הגזע המזנכימיים (MSC) השונים, תאי גזע מוך שיניים (DPSCs) מעניינים במיוחד בשל נגישותם הקלה, יכולת רבייה חזקה, סיכון נמוך לגידולים ומינימום דאגות אתיות 3,4,5. אקסוזומים שמקורם ב-DPSCs (DPSC-Exos) מכילים מגוון רחב של מטען פונקציונלי, כולל חלבונים, mRNA ומיקרו-RNA, מה שמאפשר להם לשמר רבות מהתכונות הביולוגיות של תאי ההורים שלהם. מחקרים קודמים הראו כי DPSC-Exos יכולים לקדם אנגיוגנזה, תיקון עצבי, התחדשות עצם ותגובות אנטי-דלקתיות. מעבר לתפקידם בהנדסת רקמות, אקזוזומים מוכרים יותר ויותר כרגולטורים חשובים באונקוגנזה ובטיפול בסרטן, שם הם תורמים לעיצוב מחדש של מיקרו-סביבה של הגידול, עמידות לתרופות והתחמקות חיסונית6. אקסוזומים שמקורם ב-MSC, כולל אלו מ-DPSCs, מחזיקים ביכולות מולדות לכיוון גידול ותכונות אימונומודולטוריות, מה שממקם אותם ככלי מבטיחים לדור הבא למתן תרופות נגד סרטן ממוקדות או כסוכנים אימונותרפיים ללא תאים. על ידי עקיפת מספר מגבלות הקשורות לטיפולים מבוססי תאים, DPSC-Exos הפכו לרכיב ביואקטיבי בלתי תאי מבטיח ליישומים רגנרטיביים 7,8,9,10,11,12.

למרות יתרונות אלה, תרגום מחקר DPSC-Exo לשימוש ניסיוני או קליני שניתן לשחזור נותר מאתגר. מגבלה מרכזית היא היעדר פרוטוקולים מאוחדים וסטנדרטיים לבידוד וטיהור אקסוזומים. גישות בשימוש כיום כוללות אולטרצנטריפוגציה13, אולטרה-פילטרציה, משקעים, כרומטוגרפיה של הוצאת גודל, ולכידת אימונואפיניות 14,15. מבין שיטות אלו, משקעים מבוססי פולימר מציעים יתרונות מעשיים, כולל קצב תפוקה גבוה, תאימות למגוון רחב של נפחי דגימות ופשטות תפעולית, מה שהופך אותם למתאימים למחקרים הכוללים מספרים גדולים או דרישות הגדלה 16,17,18. ניתוחים השוואתיים של שיטות בידוד שונות, במיוחד בנוגע לתפוקת חלבונים ויחס חלקיקים לחלבון, תועדו רבות בספרות19. עם זאת, השפעת מספר המעבר של DPSC על המאפיינים והפעילות הביולוגית של אקזוזומים נגזרים לא טופלה מספיק, מה שמייצג פער חשוב בסטנדרטיזציה ובבקרת איכות ייצור DPSC-Exo.

כדי להתמודד עם מגבלות טכניות אלו, מחקר זה מציג פרוטוקול סטנדרטי מבוסס ערכה לבידוד וטיהור אקזוזומים ממדיום מותאם DPSC. בנוסף לאפיון פיזיקלי ומולקולרי, הפרוטוקול משלב בדיקה פונקציונלית להערכת הפעילות האנטי-דלקתית של אקסוזומים שמקורם במקטעי DPSC שונים, ומאפשר הערכה השוואתית של עקביות תלויה במעבר באיכות ותפקוד האקסוזום. תהליך העבודה מיועד ליישום פשוט במעבדות המצוידות במתקנים סטנדרטיים לתרבית תאים וביולוגיה מולקולרית. הוא מסתמך על ערכות זמינות מסחרית להפחתת שונות בין-ניסיונית וניתן להגדיל אותו בקלות כדי להתאים לצרכים ניסיוניים שונים. כדי למזער שונות בין תורמים, DPSCs מבודדים משיניים בודדות ומורחבים באופן עצמאי ולא מאוגדים ממספר תורמים. פרוטוקול זה שימושי במיוחד לחוקרים המעוניינים לייצר אקסוזומים שמקורם ב-DPSC מאומתים פונקציונלית ליישומים בהמשך, כולל ריפוי פצעים, הנדסת רקמות עצם ומחקרים של אימונומודולציה, שבהם עקביות בין אצווה היא חיונית. בסך הכול, הוא מספק מסגרת מעשית וסטנדרטית לייצור אקסוזומים שמקורם ב-DPSC לשימוש בהנדסת רקמות ובמחקר רפואה רגנרטיבית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נערך בהתאם לעקרונות הצהרת הלסינקי ואושר על ידי ועדות האתיקה המוסדיות. רקמות מוך שיניים אנושיות נאספו מטוחנות שלישיות שהושלכו או מטרוחות אורתודונטיות שנאספו בבית החולים לסטומטולוגיה נינגבו בהתאם להנחיות אתיות מוסדיות (פרוטוקול מס' NBKQYY2025LS-04; תאריך אישור: 30 במאי 2025). רקמות עור אנושיות נאספו מדגימות עורלה שהושלכו ונאספו במהלך הליכי ברית מילה שגרתיים במחלקה לאורולוגיה בבית החולים העממי המשויך של אוניברסיטת נינגבו, בהתאם להנחיות אתיות מוסדיות (פרוטוקול מס' 2024104; תאריך אישור: 30 באוקטובר 2024). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל התורמים או מהאפוטרופוסים החוקיים שלהם לפני איסוף הדגימות.

1. בידוד אקסוזומים שמקורם בתאי גזע ממוך הדנטלי

  1. בידוד, תרבות וזיהוי DPSCs
    1. איסוף והעברת דגימות
      1. לאסוף טוחנות שלישיות אנושיות שלמות מתורמים בגילאי 18–25 או טרוחנות קדם-טוחנות מתורמים בגילאי 12–16 לאחר עקירת אורתודונטיה.
      2. הניחו מיד את השיניים שנעקרו במי מלח מקוררים מראש (PBS) עם 100 U/mL פניצילין-G ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין.
      3. העבר דגימות למעבדה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ועיבוד תוך 6 שעות מההוצאה.
    2. חשיפה למוך הדנטלי ודיסוציאציה של רקמות
      1. טבלו ב-70% אתנול למשך 30 שניות; שטוף שלוש פעמים עם 1× PBS שמכיל 3% P/S (30 שניות כל אחד). הסירו בזהירות רקמות חניכיים ופריודונטליות שנותרו ממשטח השן באמצעות מספריים סטריליים או סכין מנתח.
      2. עטוף את השן בגזה סטרילית, ואז שבח בזהירות את הכתר באמצעות פטיש סטרילי כדי לחשוף את תא הגל.
      3. הפרדו בעדינות את רקמת העור מהדנטין, חצצו אותה לחתיכות קטנות (<1 מ"מ 3) באמצעות להבים כירורגיים סטריליים.
      4. העבר את שברי הרקמה לצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל המכיל תמיסת עיכול של 2.5 מ"ג/מ"ל דיספאז II ו-2.5 מ"ג/מ"ל קולגנאז סוג I.
      5. דגרו את התערובת באינקובטור בטמפרטורה של 37°C למשך 30–45 דקות עם ערבוב עדין.
        הערה: משך העיכול האנזימטי נקבע על פי נפח ומידת ההומוגניזציה של רקמת מוך הדן.
    3. סיום העיכול ותרבות תאים ראשונית
      1. עצרו את העיכול האנזימטי על ידי הוספת נפח שווה של Modified Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco, בתוספת סרום בקר עוברי (FBS) של 10%.
      2. צנטריפוגה את תליית התא ב-200 × גרם למשך 5 דקות כדי לפרוק את התאים ושברי הרקמה.
      3. השליכו את הסופרנטנט והחזירו את הכדור ל-1 מ"ל של מדיום תרבית מלא (α-MEM עם 20% FBS, 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין).
      4. זרעו את התאים והשתילים שהוחזרו לתוך תבנית של 60 מ"מ והוסיפו את כל מדיום התרבית לנפח סופי של 5 מ"ל.
      5. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה המכילה 5% CO₂.
    4. תחזוקת תאים ותת-תרבית
      1. רענן את מדיום התרביות כל 2–3 ימים.
      2. עוקב אחרי תאים מדי יום.
        הערה: DPSCs ראשוניים בדרך כלל נודדים מהשתלות רקמות ומגיעים למפגש של 80–90% בתוך 7–14 ימים.
      3. לתת-תרבית, יש לנתק תאים באמצעות 0.05% טריפסין-אתילנדיאמינטטטראצטית (EDTA) כאשר הם מגיעים ל-80–90% מפגש תאים.
        אזהרה: טריפסין הוא מגרה. יש ללבש ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות ומשקפי מגן.
      4. תאי מעבר ביחס של 1:3 באמצעות מדיום התרבית המלאה (עם 20% FBS).
      5. השתמש ב-DPSCs במעברים 2, 4 ו-6 לכל בידוד אקסוזומים במורד הזרם ובדיקות פונקציונליות.
    5. אפיון DPSCs באמצעות ציטומטריית זרימה
      1. ניתוק DPSCs במעבר הרצוי באמצעות 0.05% טריפסין-EDTA, מנטרל עם מדיום תרבית מלא, ואיסוף תליית התא.
      2. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר והשליכו את הסופרנטנט. החזירו את כדור התא ב-PBS וספרו את התאים. כוון את צפיפות התאים לכ-1 × 106 תאים למיליטר.
      3. Aliquot 100 מיקרוליטר של תליית התא לכל צינור ציטומטריית זרימה. דגרו את התאים בנוגדנים מצומדים פלואורוכרום נגד CD44, CD90, CD105, CD45, CD19 ו-CD14 בדילול של 1:100 ב-PBS למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C בחושך.
      4. שטפו את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל PBS לכל צינור, ואחר כך בצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות. זרקו בזהירות את הסופרנטנט והחזירו את כדור התא ל-300–500 מיקרוליטר PBS לניתוח.
      5. כללו נוגדנים מתאימים לביקורת איזוטיפית בריכוזים תואמים לכל פלואורוכרום כדי לאפשר תיקון רקע וגייטינג.
      6. נתחו דגימות באמצעות ציטומטר זרימה המצויד בלייזרים ומסננים מתאימים לפלואורוכומים שנבחרו. רכוש לפחות 10,000 אירועים לכל דגימה.
      7. בצע ניתוח נתונים באמצעות תוכנת ציטומטריית זרימה. ראשית, תאים עמידים בשער המבוססים על פיזור קדמי (FSC) ופיזור צד (SSC) כדי למנוע פסולת. לאחר מכן מרח שער סינגלט כדי להסיר דאבלטים.
      8. קבעו את ביטוי הסמנים על ידי השוואת עוצמת הפלואורסצנציה עם בקרות איזוטיפ מתאימות להגדרת אוכלוסיות חיוביות ושליליות.
  2. בידוד וטיהור של DPSC-Exos
    1. הכנת מדיום מותאם
      1. מגדלים DPSC בצלחת תרבית של 10 ס"מ עד שהם מגיעים ל-70–80% מפגש המים.
      2. הסר את המדיום המשומש ואז שטוף בעדינות את שכבת התאים פעמיים עם PBS מחומם מראש.
      3. הוסף 10 מ"ל מדיום מלא עם תוספת של 10% FBS מדולדל מאקסוזום.
      4. יש להדגיר את התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שמפגש התאים מגיע ל-90–100% (תהליך שבדרך כלל עולה על 24 שעות).
    2. אוסף של מדיום מותנה
      הערה: השאר את כל הצעדים הבאים על הקרח או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      1. העבר את המדיום המותאם לצינור צנטריפוגה.
      2. צנטריפוגה את המדיום בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ו-3,000 × גרם למשך 10 דקות להסרת תאים ופסולת גדולה.
      3. העבר בזהירות את הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה חדש מבלי להפריע לכדור.
      4. צנטריפוגה את הסופרנטנט בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ו-10,000 × גרם למשך 10 דקות כדי לשחרר חלקיקים קטנים יותר וגופים אפופטוטיים.
      5. סנן את הסופרנטנט דרך מסנן מזרק של 0.22 מיקרון לצינור צנטריפוגה נקי בנפח 50 מ"ל.
      6. עבדו מיד את המדיום המוקהר לבידוד אקסוזומים, או אליקווט, ואחסנו אותו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
        הערה: המדיום המבוקר יכול להיאחסן בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים. הימנעו ממחזורי הקפאה והפשרה חוזרים.
    3. בידוד אקסוזומים באמצעות משקעים מבוססי פולימר
      1. הפשיר את המדיום המבוקר על קרח אם הוא קפוא.
      2. בצינור סטרילי על קרח, משלבים את המדיום עם תמיסת ריכוז אקזוזום ביחס נפח של 4:1 (למשל, 20 מ"ל בינוני: תמיסה של 5 מ"ל). סחרור את התערובת למשך דקה אחת כדי להבטיח אחידות.
      3. השאירו את התערובת ללא הפרעה בטמפרטורה של 4°C למשך 16–18 שעות כדי לאפשר משקעים אקזוזומליים.
        הערה: ניתן להאריך את זמן הדגירה באופן מתאים כדי להגדיל את התפוקה, אך לא לעלות על 24 שעות.
      4. צנטריפוגות את התערובת בטמפרטורה של 4°C ו-10,000 × גרם למשך 75–80 דקות כדי להוציא את האקזוזומים. שאפו בזהירות והשליכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור.
      5. צנטריפוגה נוספת את הצינור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ו-10,000 × גרם למשך 2 דקות. הסר כל שאריות עליונות עם פיפטה.
      6. החזירו את כדור האקסוזום ל-1x PBS (השתמשו ב-200 מיקרוליטר PBS לכל 20 מ"ל מדיום מותכן).
      7. העבר את ההתלייה מחדש לצינור צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל וצנטריפוגה בטמפרטורה של 4°C ו-12,000 × גרם למשך 2 דקות, תוך שמירה על הסופרנטנט, המועשר בחלקיקי אקזוזום (חזור על כך במידת הצורך).
    4. טיהור אקסוזומים
      1. החלו את תליית האקסוזום על עמודת מסנן טיהור אקסוזום הממוקמת בצינור איסוף.
      2. צנטריפוגה את העמודה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ו-3,000 × גרם למשך 10 דקות.
      3. אסוף את הנוזל הזורם מהתחתית של צינור האיסוף. הנוזל הזה מכיל את האקסוזומים המטוהרים.
    5. אחסון אקסוזומים מטוהרים
      1. אליקווט את ההשעיה האקסוזום המטוהרת לנפחים חד-פעמיים המתאימים לניסויים במורד הזרם.
      2. אחסן את האליקווטים בטמפרטורה של -80°C.
        הערה: אליקיוטינג הוא קריטי למניעת מחזורי הקפאה והפשרה חוזרים, שעלולים לפגוע בשלמות האקסוזומים ובפעילות הביולוגית.
    6. אפיון וזיהוי של DPSCs-Exo
      1. בצע ניתוח מורפולוגי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני הולכה (TEM) כפי שמתואר בשלבים 1.2.6.2–1.2.6.6.
      2. השתמש בפפטה, שלף 10 מיקרולטר מדגימת ההתעלה האקסוזומי המוכנה, והניח אותה על פרפילם מוכן מראש. מניחים את רשת הנחושת המצופה פורמוואר/פחמן, צד הסרט פונה כלפי מטה, על הטיפה, ותאפשר לה להיספג באופן טבעי במשך 10–15 דקות.
      3. השתמש ברצועת נייר פילטר כדי לסחוט נוזלים עודפים ולתת לו להתייבש באוויר לזמן קצר.
      4. השתמש בפיפטה, שואב 10 מיקרו ליטר של תמיסת חומצה פוספוטונגסטית 2%, והניח אותו על הפרפילם. הפוך את הרשת שסיימה את שלב הספיחה כך שהצד של הסרט פונה לתמיסת הצביעה, ותן לה לשבת 3–5 דקות.
      5. השתמש ברצועת נייר פילטר כדי לספוג נוזלים עודפים ולתת לרשת להתייבש מתחת למנורת ליבון.
      6. לצפות ולצלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים מעבר.
      7. בצע ניתוח התפלגות גודל וריכוז באמצעות ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (NTA) כפי שמתואר בשלבים 1.2.6.8–1.2.6.12.
      8. שטוף את תא הדגימה שלוש פעמים במים אולטרה-טהורים.
      9. כייל את המכשיר באמצעות חרוזי פוליסטירן סטנדרטיים של 100 ננומטר לפי הוראות היצרן. המשך במדידות לאחר כיול מוצלח.
      10. שטוף את תא הדגימה עם 1× PBS.
      11. מדלל את דגימת האקסוזום ב-1× PBS (1:500) וטען אותה לתא הדגימה. מעקב אחרי תנועת חלקיקים בזמן אמת באמצעות תוכנת הכלי.
      12. אסוף נתונים ויצר את דוח הניתוח המתאים.
      13. זהה את סמני החלבון באמצעות ניתוח ווסטרן בלוט כפי שמתואר בשלבים 1.2.6.14–1.2.6.24.
      14. דגימות אקזוזום ליז באמצעות בופר לליזיס חלבוני ייחודי לאקסוזום וכימות ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חומצה ביצינכונינית (BCA).
      15. הכינו ג'לים לפתרון והערימה. טעין כמויות שוות של חלבון לכל נתיב והוסיף 5 מיקרוליטר של סמן חלבון לכל ג'ל.
      16. בצע אלקטרופורזה במתח קבוע של 80 וולט עד שהחזית של הצבע מגיעה לג'ל המתפרק, ואז העלה ל-120 וולט וממשיך עד שהחזית מגיעה לתחתית הג'ל.
      17. חתכו ממברנת פוליווינילידן פלואוריד (PVDF) לגודל המתאים והפעילו אותה על ידי השרייה במתנול למשך 5 דקות.
      18. הכינו בופר העברה המורכב מ-25 מ"מ מ' בסיס טריס, 192 מ"מ גליצין, ו-20% (v/v) מתנול (pH = 8.3). איזון את כל רכיבי ההעברה בזיכרון ההעברה.
      19. הרכיבו את כריך ההעברה בסדר הבא מקתודה לאנודה: ספוג – נייר פילטר – ג'ל – ממברנת PVDF – נייר פילטר – ספוג. הסר בועות אוויר ובצע העברת חלבון בזרם קבוע של 300 mA.
      20. לאחר ההעברה, שטפו את ממברנת ה-PVDF לזמן קצר עם תמיסת מלח עם טריס-באפר עם 0.1% Tween20 (TBST) וחסמו עם חלב דל שומן 5% למשך שעה בטמפרטורת החדר בניעור עדין.
      21. דגרו את הממברנה בנוגדנים ראשוניים (למשל, אנטי-CD63 ואנטי-TSG101) מדוללים בחלב דל שומן 5% למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C בניעור עדין. שטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBST למשך 5 דקות כל אחת.
      22. יש להדגיר עם הנוגדן המשני המתאים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, ואחר כך שלוש שטיפות עם TBST (5 דקות כל אחת).
      23. הכינו תמיסת עבודה אלקטרוכימיליומינציה (ECL) חדשה (ערבב את התמיסות A ו-B ביחס 1:1), החלו על הממברנה, וזהו אותות באמצעות מערכת הדמיה כימילומינסנציה.

2. בידוד ותרבות של קרטינוציטים ראשוניים בעור האנושי

  1. איסוף והעברת דגימות
    1. קבלו דגימות רקמת עורלה מתורמים גברים בריאים בבית החולים העממי המקושר של אוניברסיטת נינגבו.
    2. הניחו מיד את רקמת העורלה המופקת ב-PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, עם תוספת של 100 U/mL פניצילין-G ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין.
    3. העבר דגימות למעבדה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ועיבוד תוך 6 שעות.
  2. הכנה אספטית ופיצול רקמות
    1. טבלו את הרקמה ב-70% אתנול למשך 30 שניות עד 3 דקות.
      הערה: התאימו את זמן הטבילה לפי גודל הרקמה לחיטוי ראשוני.
    2. באמצעות מספריים סטריליים או סכין מנתחים, נתחים והסרת שומן תת-עורי ורקמת חיבור מדגימת הרקמה שנשטפה.
    3. טחנו אותו לחתיכות קטנות (גודל השבר <1 מ"מ 3) באמצעות להבים כירורגיים סטריליים.
      הערה: ליטוש של 3–4 דגימות רקמה בדרך כלל דורש פחות מ-15 דקות. הוסף כמות קטנה של PBS בזמן הטחינה אם הרקמה נראית יבשה.
    4. העבר את תערובת הרקמה הטחונה לצינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל המכיל תמיסת עיכול של 2.5 מ"ג/מ"ל קולגנאז סוג I ו-2.5 מ"ג/מ"ל דיספאז II. הוסיפו 10–20 מ"ל תמיסת עיכול לכל חתיכת רקמה קצוצה.
    5. דגרו את התערובת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. שמור על ערבוב עדין ב-80 × גרם, או ערבב את הצינור בעוצמה ביד כל 20 דקות.
  3. עיכול משני וטיפול ב-DNase
    1. הוסיפו 0.25% טריפסין-EDTA לתערובת העיכול ביחס נפח של 1:5. דגרו את הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות עם ערבוב עדין.
      אזהרה: טריפסין הוא מגרה. יש ללבש ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות ומשקפי מגן.
    2. הוסיפו תמיסת DNase I (10 מ"ג/מ"ל) לתערובת ביחס של 10 מיקרו-ליטר למילילטר מנפח העיכול הכולל. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עם ערבוב עדין.
  4. סיום העיכול ותרבות תאים ראשונית
    1. עצור את העיכול האנזימטי על ידי הוספת כמות שווה של DMEM בתוספת 10% FBS.
    2. חתוך את התערובת היטב על ידי פיפסת פיפסט למעלה ולמטה כ-20 פעמים כדי להפריד את שברי הרקמה. סנן את תליית התא דרך מסננת תאים של 100 מיקרון לצינור צנטריפוגה חדש בנפח 50 מ"ל.
    3. צנטריפוגה את תליית התא ב-200 × גרם למשך 5 דקות כדי לפרוק את התאים ושברי הרקמה.
    4. השליכו את הסופרנטנט והחזירו את הכדור ל-1 מ"ל של מדיום תרבית מלא (α-MEM עם 20% FBS, 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין).
    5. זרעו את התאים המושבים והשתילים לתוך תבנית תרבית של 10 ס"מ והוסיפו את מדיום התרבית המלאה לנפח סופי של 6 מ"ל.
    6. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה המכילה 5%CO2.
      הערה: יש להוסיף תרביות קרטינוציטים ל-Y-27632 בריכוז סופי של 5 מיקרומום במהלך התרבית.
  5. תחזוקת תאים ותת-תרבית
    1. רענן את מדיום התרביות כל 2–3 ימים.
    2. עוקב אחרי תאים מדי יום.
      הערה: קרטינוציטים ראשוניים של האפידרמל בעור בדרך כלל נודדים מאקסטלנטים של רקמות ומגיעים למפגש של 80-90% בתוך 10-14 ימים.
    3. לתת-תרבית, יש לנתק תאים באמצעות 0.05% טריפסין-EDTA כאשר הם מגיעים ל-80–90% מפגש (80–90%).
      אזהרה: טריפסין הוא מגרה. יש ללבש ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות ומשקפי מגן.

3. אימות תפקודי של תפקוד אנטי-דלקתי של אקסוזומים ממעברים שונים

  1. זריעה והכנת תאים
    1. קרטינוציטים אפידרמליים של זרעים בצפיפות של 1.5 ×-105 תאים לתוך לוח של 12 בארות. הוסף 1 מ"ל מדיום מלא לכל באר ותרבית את התאים למשך 24 שעות.
    2. כאשר המפגש של התאים מגיע לכ-70%, שאוף בזהירות את המדיום, שטוף בעדינות את שכבת התא פעמיים עם 1× PBS מחומם מראש.
  2. גירוי דלקתי וטיפול באקסוזומים
    1. השרה של מודל תאי פסוריאזפורמי, גירוי התאים עם תערובת הציטוקינים הפרודלקתית "M5" (המכילה IL-1α, IL-17A, IL-22, Oncostatin M ו-TNF-α, כל אחד בריכוז סופי של 10 ng/mL).
    2. לקבוצות הטיפול, יש לדגור יחד את התאים המגרים עם DPSC-Exos (50 מיקרוגרם לבאר).
    3. לקבוצת הבקרה השלילית (NC), יש להוסיף נפח שקול של PBS במקום אקזוזומים.
      הערה: בצע את כל הגירויים והטיפולים במדיום נטול Y-27632 כדי למנוע התערבות אפשרית במסלולי איתות דלקתיים.
  3. איסוף דגימות וניתוח qRT-PCR (השוואה פונקציונלית בין קטעים)
    1. קצור את התאים והוציא RNA לאחר 24 שעות טיפול.
    2. נתח את ביטוי הסמן הדלקתי המרכזי IL-23A.
      1. השווה את השפעות המעכבות על ביטוי IL-23A בקרב קבוצות טיפול באקסוזומים שמקורן במקטעים שונים (P2, P4 ו-P6) באמצעות qRT-PCR להערכת שינויים תלויי מעבר בתפקוד האקסוזומים.
      2. בצע qRT-PCR בתנאי המחזור הבאים: דה-דנאטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, ואחריה 40 מחזורי דנאטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות ואנילינג/הארכה ב-60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.
      3. בצע ניתוח עקומת התכה מ-65 מעלות צלזיוס עד 95 מעלות צלזיוס כדי לאשר את ספציפיות ההגברה.
        הערה: רצפי פריימר: Human-IL-23A (קדימה: 5'-GAAGAGGGAGATGAAGAGAC-3', הפוך: 5'-TATCCGATCCTAGCAGCTC-3'); Human-H36B4 (קדימה: 5'-GCAATGTTGCCAGTGTGTGT-3', אחורה: 5'-GCCTTGACCTTCAGCAAG-3')

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי ואפיון של תאי גזע במוך הדנטלי
תאי גזע ראשוניים במוך שיניים (DPSCs) שבודדו לפי הפרוטוקול המתואר הראו גדילה יציבה ומורפולוגיה מזנכימית טיפוסית במהלך התרחבות חוץ-גופית. כפי שמוצג באיור 1, DPSCs במעברים 2, 4 ו-6 הציגו אוכלוסייה הומוגנית של תאים דמויי פיברובלסטים בצורת כישור, ללא הבדלים מורפולוגיים נראים או סימנים להתמיינות ספונטנית בין המעברים. כל המעברים של DPSCs גודלו בתנאים זהים כדי למזער שונות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הסטנדרטי המתואר במחקר זה מספק מסגרת ניתנת לשחזור לבידוד תאי גזע מוך שיניים (DPSCs), לייצור אקסוזומים שמקורם ב-DPSC (DPSC-Exos), ולאימות תפקודי של וזיקולות אלו במספר מעברים תאיים. הדיון למטה מדגיש שיקולים פרוצדורליים קריטיים, אסטרטגיות אופטימיזציה, מגבלות מתודולוגיות, והרלוונטיות הרחבה יותר של תהליך עבודה זה למחקר ברפואה רגנרטיבית.

אמינות הפרוטוקול הזה תלויה בבקרת איכות קפדנית בשלבים הראשונים, החל ממקור וטיפול ברקמות. DPSCs בודדו מרקמות מוך שיניים ברי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרויקט מומן על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס' 82273554). המחברים מודים למעבדת הנדסת חומרים ביולוגיים והתחדשות רקמות בבית החולים לסטומטולוגיה בנינגבו על התמיכה המתמשכת ומודים לחברי הצוות הנוכחיים והקודמים על דיונם החשוב. המחברים מודים גם לד"ר ליליאנג שן מבית החולים העממי המקושר של אוניברסיטת נינגבו על עזרתו הנדיבה ותמיכתו החזקה במתן דגימות רקמת העורלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.05% Trypsin-EDTA SolutionGibco25300054בשל כוחו הדיגסטיבי, טריפסין נמצא בשימוש נרחב להפרדת תאים, העברת תרבית תאים שגרתית והפרדת רקמות ראשוניות.
100 mm Cell and Tissue Culture DishBiofilTCD010100משטח מטופל/לא מטופל
סטרילי &Non-Pyrogenic
DNase/RNase-Free
100 nm PS beadsThermo Fisher3100Aלפני ביצוע ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA), יש לכייל את המכשיר באמצעות סטנדרט עם גודל חלקיקים ידוע במדויק (100 ננומטר).
15-mL Bulk Conical Centrifuge TubeKIRGENKG2611סטרילי, RNase/Dnase וללא פירוגניות
200-mesh Formvar-carbon-coated copper gridZhongjing Scientific InstrumentsAZH200תומך בדגימות אקסוזום לצורך הדמיה TEM. ציפוי הפורמבר-פחמן משפר את הדבקת הדגימה ואת המוליכות, בעוד שהסריג ה-200-mesh מספק שטח פתוח נאות להפצה אחידה של חלקיקים והדמיה יציבה.
37 °C IncubatorThermo Scientific51032877חממת ה-CO2 ה-37 מספקת סביבה אידיאלית in vitro.
50-mL Bulk Conical Centrifuge TubeKIRGENKG2811סטרילי, RNase/Dnase וללא פירוגניות
Anti-CD63 antibody [MX-49.129.5]Abcamab193349נוגדן Anti-CD63 [MX-49.129.5] (ab193349) הוא נוגדן חד-שבטי של עכבר המזהה CD63 ב Western Blot, Flow Cytometry (Intra), Flow Cytometry, IHC-P, ICC/IF. מתאים ל אדם.
Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)]Abcamab125011נוגדן Anti-TSG101 [EPR7130(B)] (ab125011) הוא נוגדן חד-שבטי של ארנב המזהה TSG101 ב Western Blot, Flow Cytometry (Intra), Flow Cytometry, IHC-P, ICC/IF. מתאים ל אדם, עכבר, חולדה.
Automated cell counterCountstarIC1000מונה תאים אוטומטי לספירה מהירה ומדויקת של תאים
BCA Protein Assay KitBeyotimeP0012יש לה יחס ליניארי טוב בטווח הריכוזים של 50 - 2000 μg/ml.
Benchtop CentrifugeBIORIDGETD5צנטריפוגה שולחנית להפרדת דגימות מהירה ויעילה במסגרות מעבדה
Biological safety cabinetThermo Scientific1379ארון בטיחות ביולוגית הוא מכשיר התקנה סטרילי המגן על מפעילים, דגימות וסביבות מפני חומרים מסוכנים ביולוגית על ידי סינון פתוגנים מוטסים ומניעת זיהום צולב במהלך עבודה מיקרוביולוגית.
Cell Culture Plate,12-WellEppendorf0030721110טופלו בטיפול בתרביות רקמה, עם מכסה, תחתית שטוחה
סטרילי, ללא פירוגנים ניתנים לזיהוי, RNase & DNase, DNA אנושי & חיידקי
לא ציטוטוקסי
Cell Culture Plate,96-WellNEST 701001 0714Bטופלו בטיפול בתרביות רקמה, פוליסטירן, ללא פירוגניות, סטרילי
CellsavingNCMC40100ללא סרום, ללא חלבון מן החי
מדיום הקפאה של תאים
Collagenase, Type I, powderGibco17100017קולגנאז הוא פרוטאז המפרק את הקשר בין חומצת אמינו ניטרלית (X) לגליצין ברצף Pro-X-Gly-Pro, שנמצא בתדירות גבוהה בקולגן.
Dispase II, powderGibco17105041Dispase II (חומר פרוטאז נייטרלי) הוא אנזים אמינו-אנדו-פפטידאז המפרק את קשרי הפפטיד ה-N-סופים של שיירי חומצות אמינו לא קוטביים.
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco C11995500BT[+]4.5g/L D-Glucose
[+]L-Glutamine
[+]110mg/L Sodium Pyruvate
Evo M-MLV Reverse Transcription KitAGAG11707חומר תעתיק לאחור ייעודי ל-Real Time RT-PCR. הוא משתמש ב-Evo M-MLV reverse transcriptase עם יכולת הרחבה חזקה, המאפשרת סינתזה יעילה של cDNA תוך זמן קצר.
Exosome Concentration SolutionUmibioUR52111הפקת אקסוזומים מעל-תא התרבות
Exosome Depleted Fetal Bovine SerumUmibioUR50202הסרום העובר הפרה החופשי מאקסוזום הושג על ידי סינון סרום העובר הפרה הבריא שנאסף באופן סטרילי, ו- ≥99% מהאקסוזומים האנדוגניים בסרום העובר ה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lotfy, A., AboQuella, N. M., Wang, H. Mesenchymal stromal/stem cell (MSC)-derived exosomes in clinical trials. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 66 (2023).
  2. Shan, Z., Su, X., Liu, L., Duan, S. Liquid biopsy based on EV biomarkers: a new frontier for early diagnosis and prognosis assessment of cancer at ESMO 2024. Nano TransMed. 4, 100084 (2025).
  3. Gronthos, S., et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. J Dent Res. 81 (8), 531-535 (2002).
  4. Pineda, J. R., et al. In vitro preparation of human Dental Pulp Stem Cell grafts with biodegradable polymer scaffolds for nerve tissue engineering. Methods Cell Biol. 170, 147-167 (2022).
  5. Chansaenroj, J., et al. Potential of Dental Pulp Stem Cell Exosomes: Unveiling miRNA-Driven Regenerative Mechanisms. Int Dent J. 75 (2), 415-425 (2025).
  6. Dhar, R., Subramaniyan, V. Exosomes: a next-generation cancer theranostics. Nano TransMed. , 100096 (2025).
  7. Wang, Y., et al. Therapeutic effect of mesenchymal stem cells and their derived exosomes in diseases. Mol Biomed. 6 (1), 34 (2025).
  8. Tan, F., et al. Clinical applications of stem cell-derived exosomes. Signal Transduction Targeted Ther. 9, 17 (2024).
  9. Li, L., Ge, J. Exosome‑derived lncRNA‑Ankrd26 promotes dental pulp restoration by regulating miR‑150‑TLR4 signaling. Mol Med Rep. 25 (5), 152 (2022).
  10. Lin, T., et al. Inhibition of chondrocyte apoptosis in a rat model of osteoarthritis by exosomes derived from miR‑140‑5p‑overexpressing human dental pulp stem cells. Int J Mol Med. 47 (3), 7 (2021).
  11. Liang, X., et al. Dental pulp mesenchymal stem cell-derived exosomes inhibit neuroinflammation and microglial pyroptosis in subarachnoid hemorrhage via the miRNA-197-3p/FOXO3 axis. J Nanobiotechnology. 22 (1), 426 (2024).
  12. Lin, T. Y., et al. 2,3,5,4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside-stimulated dental pulp stem cells-derived exosomes for wound healing and bone regeneration. J Dent Sci. 20 (1), 154-163 (2025).
  13. Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
  14. Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Sci Rep. 9 (1), 5335 (2019).
  15. Li, P., et al. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  16. Ludwig, A. K., et al. Precipitation with polyethylene glycol followed by washing and pelleting by ultracentrifugation enriches extracellular vesicles from tissue culture supernatants in small and large scales. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1528109 (2018).
  17. Veerman, R. E., et al. Molecular evaluation of five different isolation methods for extracellular vesicles reveals different clinical applicability and subcellular origin. J Extracell Vesicles. 10 (9), e12128 (2021).
  18. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
  19. Gao, M., et al. Comparison of Yield, Purity, and Functional Properties of Large-Volume Exosome Isolation Using Ultrafiltration and Polymer-Based Precipitation. Plast Reconstr Surg. 149 (3), 638-649 (2022).
  20. Hilkens, P., et al. Effect of isolation methodology on stem cell properties and multilineage differentiation potential of human dental pulp stem cells. Cell Tissue Res. 353 (1), 65-78 (2013).
  21. Noda, S., et al. Effect of cell culture density on dental pulp-derived mesenchymal stem cells with reference to osteogenic differentiation. Sci Rep. 9 (1), 5430 (2019).
  22. Ahmad, P., et al. Isolation methods of exosomes derived from dental stem cells. Int J Oral Sci. 17 (1), 50 (2025).
  23. Chen, J., et al. Review on strategies and technologies for exosome isolation and purification. Front Bioeng Biotechnol. 9, 811971 (2021).
  24. Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circ Res. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  25. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404 (2024).
  26. Yakubovich, E. I., Polischouk, A. G., Evtushenko, V. I. Principles and problems of exosome isolation from biological fluids. Biochem (Mosc) Suppl, Membr Cell Biol. 16 (2), 115-126 (2022).
  27. Li, Y., et al. Dental stem cell-derived extracellular vesicles as promising therapeutic agents in the treatment of diseases. Int J Oral Sci. 14, 2 (2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Dental Pulp Stem CellsDPSC ExosomesExosome IsolationExosome PurificationExosome CharacterizationCell PassagesMesenchymal Stem CellsSize DistributionMarker ExpressionAnti Inflammatory Assay

מאמרים קשורים