זיהוי הורמוני מין בשכבת דמעות אנושית באמצעות בדיקות אימונוסורבנט הקשורות לאנזימים

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטת בדיקת אימונוסורבנט (ELISA) מותאמת לזיהוי וכימות של 17β-אסטרדיול וטסטוסטרון בנוזל דמעות אנושי שנאסף דרך צינורות מיקרו-קפילריים. גישה זו מאפשרת מדידה זעיר-פולשנית של רמות הורמוני הדמעות.

תקציר

שכבת הדמעות היא נוזל מורכב ורב-שכבתי, החיוני לשמירה על בריאות פני העין, בהירות הראייה והגנה מפני פתוגנים ולחצים סביבתיים. הוא מורכב בעיקר מליפידים, נוזל מימי, חלבונים מסיסים ומוצינים, ומשמש לא רק לשימון והגנה על העין אלא גם כמדיום אבחוני חשוב להפרעות על פני העיניים כגון יובש בעיניים (DED). הורמוני מין, כולל אנדרוגנים ואסטרוגנים, ידועים כמשפיעים על הרכב שכבת הדמעה, אך מדידת הורמונים אלה בנוזל דמעות מוגבלת בשל נפח דגימות נמוך ואתגרים טכניים. פרוטוקול זה מתאר שיטה שלב אחר שלב להתאמת ערכות ELISA (ELISA) הזמינות מסחרית לזיהוי וכימות 17β-אסטרדיול וטסטוסטרון בקרעים בסיסיים שנאספו באמצעות צינורות מיקרוקפילריים. תהליך העבודה כולל אסטרטגיות איסוף דגימות, דילול והכנת בדיקות אופטימליות כדי לאפשר ניתוח דגימות דמעות בנפח נמוך. הפרוטוקול מדגים את ההיתכנות והשחזור של זיהוי הורמונלי בנוזל דמעות באמצעות שיטות ELISA מותאמות. תוצאות מייצגות נגזרות מדגימות פיילוט מאוחדות ומטרתן להמחיש את ביצועי הבדיקה ולא הבדלים ביולוגיים. גישה זו עשויה לתמוך במחקרים עתידיים שיחקרו נוזל דמעות כמטריצה למדידת הורמונים במחקר על פני העיניים.

מבוא

סרט הדמעות ממלא תפקידים חיוניים בהגנה, הזנה ושימון פני העיניים¹. הוא בעובי של כ-2–5.5 מיקרון ובנפח של 3–10 מיקרו-ליטר, עם קצב מחזור של 1–2 מיקרוליטר לדקה בעין בריאה ^2,3. בלוטות הדמעות מפרישות את הרכיב המימי של הדמעות, העשיר במים, אלקטרוליטים, חלבונים וגורמים אנטי-מיקרוביאליים, בעוד שבלוטות המיבומיאן מייצרות שומנים שמאטים את אידוי שכבת הדמעה, ותאי הגביע הלחמית משחררים מוצינים התומכים בשימון פני העיניים⁴. הפקת דמעות מתרחשת בשתי דרכים עיקריות: 1) הפרשה בסיסית, ששומרת על שכבת דמעות יציבה על פני שטח עיניים בריאים, ו-2) הפרשת רפלקס, שמופעלת על ידי גירויים כמו גירוי, רגש או אורות חזקים. ההרכב הביוכימי שונה בין השניים, מה שיכול בסופו של דבר להשפיע על שיטת איסוף הדמעות לניתוח ^5,6. קרעים בסיסיים בדרך כלל מכילים ריכוזים גבוהים יותר של חלבונים וליפידים התומכים ביציבות שכבת הדמעות ובבריאות הקרנית, בעוד שקרעים רפלקסיים נוטים להיות בעלי נפח מימי גבוה יותר ומדוללים יותר כדי לשטוף את המגרים ולהגן על פני העיניים ^7,8,9.

מכיוון שדמעות פועלות לווסת דלקת, הגנה מפני פתוגנים ואספקת חומרים מזינים לקרנית האוואסקולרית¹, הן הפכו למוקד מחקר ביומרקרים¹⁰. קרעים מספקים אלטרנטיבה זעיר-פולשנית וחסכונית יחסית לדגימת דם למעקב אחר שינויים פיזיולוגיים, במיוחד כאלה המתרחשים בקרבת אתר המחלה⁸. כדי ללכוד את הנתונים הללו במדויק, איסוף נכון הוא חיוני¹⁰. צינורות מיקרו-קפילריים מזכוכית משמשים באופן נרחב לדגימת קרעים בסיסיים משום שהם מאפשרים איסוף עם גירוי מינימלי ודילול דמעות⁵. שיטה זו מצמצמת את הסיכון לקריעת רפלקס מגרה, שיכולה לשנות את הרכב הקרע ^9,11, על ידי מיקום זהיר של הצינור כדי להימנע ממגע עם הלחמית הבולטברית ושולי המכפיים. באמצעות גישה זו, חוקרים יכולים להשיג קרעים בסיסיים לא מדוללים המשקפים את המצב הפיזיולוגי של פני העין. זה מבטיח שהדגימה תישאר מדיום אמין לכימות אנליטים רגישים, כמו הורמוני מין^10,12. עם זאת, הנפח המוגבל שהושג מציב אתגרים אנליטיים לבדיקות ביוכימיות במורד הזרם. איסוף קרעים בסיסיים באמצעות צינורות מיקרו-קפילריים מניב בדרך כלל כמה מיקרוליטרים לכל דגימה, מה שמגביל את התאימות לבדיקות סטנדרטיות.

משטח העין האנושי מזוהה יותר ויותר כרקמת מטרה להורמוני מין^13,14. הראיות התומכות בכך כוללות זיהוי תמלילי mRNA לקולטני אנדרוגן (AR), קולטני אסטרוגן (ER) וקולטני פרוגסטרון (PR) בתאי אקינר של בלוטות הדמעות והמייבומיאן, וכן בתאי האפיתל של הקרנית, הלחמית ותאי הגביע הלחמית¹⁵. יתרה מזאת, זוהו mRNA המקודדים אנזימים סטרואידוגניים ברקמות אלו, מה שמרמז על היכולת להמיר קודמים של סטרואידים להורמוני מין פעילים ביולוגית מקומית¹⁶. דבר זה מצביע על פוטנציאל לסינתזת הורמונים במקום על פני העיניים ומעלה שאלה קריטית האם הורמונים אלו מופרשים לשכבת הדמעות ברמות ניתנות לזיהוי.

עדויות עדכניות מצביעות על כך שהורמוני מין הם חלק בלתי נפרד משמירה על הומאוסטזיס פני העיניים, אם כי המנגנונים המולקולריים המדויקים עדיין נמצאים תחת בדיקה^13,14. אנדרוגנים כמו טסטוסטרון נראים כמעודדים הפרשת שומנים ומדכאים דלקת; כתוצאה מכך, מחסור באנדרוגן מוכר באופן נרחב כגורם ליובש בעיניים באידוי 13,14,17. לעומת זאת, תפקיד האסטרוגנים מורכב יותר ותלוי בהקשר 13,14,18. בעודם מעורבים בוויסות הרכב ונפח הדמעות, תנודות אסטרוגן, כגון אלו המתרחשות במהלך גיל המעבר, הריון או שימוש באמצעי מניעה דרך הפה, קשורות לעיתים קרובות להפרשה מימית פגועה, ירידה ביציבות שכבת הדמעות ודלקת על פני ^{העיניים.} כתוצאה מכך, אנשים החווים חוסר איזון הורמונלי זה מייצגים אוכלוסייה בסיכון גבוה לפתח יובש בעיניים (DED)13,14,20.

למרות הראיות הללו, מעקב אחר מצב ההורמונלי אצל חולי DED נותר אתגר. באופן ספציפי, עדיין לא נקבע האם רמות ההורמונים הסרום המערכתיות משקפות במדויק את רמות ההורמונים המקומיות^בעין. הבחנה זו קריטית משום שרקמות פני העיניים הוכחו כמכילות קולטני הורמון מין וביטוי אנזימי סטרואידוגניים התומכים בסינתזה מקומית ובמטבוליזם של סטרואידים^מיניים. קיבולת תוך-קרינית זו מצביעה על כך שריכוזי ההורמונים המקומיים בשכבת הדמעות עשויים להיות שונים משמעותית מרמות הסרום במחזור¹³. לכן, מדידה ישירה של ריכוז ההורמונים בנוזל הדמעות היא הכרחית כדי להבין טוב יותר את ההשפעות ההורמונליות המקומיות על פני השטח העין. עם זאת, אמצעים כאלה מאתגרים מבחינה טכנית בשל כמות דגימות הדמעות הקטנה הזמינה לניתוח. טכניקות אנליטיות מתקדמות כמו כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה (LC-MS) שימשו לכימות הורמונים בדם ובנוזלי דמעות ברגישות גבוהה, אך שיטה זו דורשת כלים מיוחדים ומומחיות טכנית שעשויים שלא להיות נגישים לכל החוקרים^21,22.

מבחן אימונוסורבנט מקושר באנזימים (ELISA) הוא טכניקה מוכרת לזיהוי וכימות של חלבונים, נוגדנים והורמונים. לניתוח מולקולות קטנות כמו סטרואידים מיניים, פרוטוקול זה עושה שימוש בפורמט קשירה תחרותי. בשיטה זו, ההורמון הלא מסומן הנמצא בדגימת הדמעות מתחרה עם אנלוג הורמונלי מסומן באנזים על מספר מוגבל של אתרי קישור נוגדנים. בגלל תחרות זו, עוצמת האות, הנמדדת כצפיפות אופטית, פרופורציונלית הפוך לריכוז ההורמון בדגימה; בעצם, אות נמוך יותר מצביע על ריכוז גבוה יותר של הורמון היעד^23,24.

ELISA מציע מספר יתרונות מעשיים לכימות ממוקד. הוא חסכוני ונגיש מבחינה טכנית, ומאפשר יישום במעבדות סטנדרטיות ללא צורך במכשור מיוחד. יתרה מזאת, ELISA מאפשרת סינון בתפוקה גבוהה בפורמטים של 96 בארות עם הכנת דגימות מינימלית, ומציעה יעילות בזמן ויכולת שחזור גבוהה²³. עם זאת, ערכות ELISA מסחריות זמינות בדרך כלל מותאמות לדגימות ביולוגיות בנפח גבוה יותר כמו סרום או פלזמה, והביצועים שלהן בדגימות קרע בנפח נמוך אינם מוגדרים היטב. כדי להתמודד עם מגבלה זו, הפרוטוקול משלב אסטרטגיות אופטימליות של דילול דגימות וטיפול כדי לאפשר זיהוי הורמונלי בטווח הרגישות של הבדיקה.

במחקר זה אנו מציגים פרוטוקול ויזואלי המתאים ערכות ELISA זמינות מסחרית לזיהוי וכימות של 17β-אסטרדיול וטסטוסטרון בדגימת דמעות אנושית בנפח נמוך שנאספה באמצעות צינורות מיקרו-נימי זכוכית. פרוטוקול זה מדגיש שינויים מעשיים באיסוף, טיפול ובהכנת הבדיקה, כדי לאפשר מדידת הורמונים ניתנת לשחזור מתוך נפחי דמעות מוגבלים. עבודה זו מתמקדת בהקמת תהליך עבודה אפשרי ליישום מתודולוגיית ELISA קיימת לניתוח נוזלי קריעה. גישה זו עשויה לשמש בסיס למחקרים עתידיים שיחקרו רמות הורמונים מקומיות על פני העיניים.

פרוטוקול

מחקר זה אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת אינדיאנה (IRB#1908362633), והתקבלה הסכמה מדעת בכתב מכל המשתתפים לפני איסוף הדגימה.

1. אוסף סרטי דמעות.

1. הכנה
   1. קבעו את נפח הקרע שיש לאסוף, תוך התחשבות בכך שנדרשים שני שכפולים לאמינות סטטיסטית של תוצאות ELISA.
   2. הכינו צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל לאחסון סרט דמעה.
   3. בחר צינורות מיקרו-נימים מתאימים לאיסוף קרעים. מומלץ להתחיל עם 3.33 מיקרוליטר או 5 מיקרוליטר ולשנות לגודל קטן יותר אם אוספים מנפח קרעים נמוך יותר על פני השטח העין.
   4. הכינו נורת לחיצה מגומי המצורפת עם ערכת צינורות המיקרו-קפילרי, כדי להקל על העברת נוזל הדמעות לצינור מיקרוצנטריפוגה.
2. אוסף הדמעות
   1. הנחה את המשתתף להסתכל ישר קדימה או מעט כלפי מעלה.
   2. מניחים בעדינות את פתח הצינור המיקרו-קפילרי במניסקוס הדמע ליד הקנתוס הלטרלי כדי לאסוף קרעים בסיסיים.
   3. מזער מגע עם הלחמית הבולברית ושולי המכפיים כדי למנוע קרעים רפלקסיים ככל האפשר.
   4. מלא את הצינור בקרעים עד שזה מלא.
   5. אם יש צורך במספר טיפולים, קבעו מפגשים בטווח של 24 שעות זה מזה ובזמנים דומים במהלך היום כדי למזער את השונות ברמות ההורמונים.
3. אחסון קרעים
   1. סתום את החור בחלק העליון של נורת הסחיטה הגומי, ואז הכנס את הצינור המיקרו-נימי לתוך הנורה, תוך הכנסת הקצה הפתוח בתוך צינור המיקרוצנטריפוגה כדי לאפשר לקרעים לזרום החוצה מהצינור המיקרוקפילרי. ייתכן שיהיה צורך בלחיצה נוספת על הנורה כדי להוציא כמה שיותר מדגימת הדמע מהצינור המיקרוקפילרי.
   2. סגור את מכסה צינור המיקרוצנטריפוגה כדי למנוע אידוי.
   3. סובבו את הצינור באמצעות מכשיר מיקרוצנטריפוגה על שולחן בלחץ של 2,000 × גרם למשך 3–5 שניות כדי שהדגימה תהיה בתחתית הצינור לפני האחסון.
   4. אחסן ב-80 מעלות צלזיוס כדי לשמור על יציבות האנליט לפני הניתוח.

2. בדיקת טסטוסטרון

1. הכינו תקני טסטוסטרון, פעלו לפי הפרוטוקול
   1. עקבו אחר פרוטוקול הערכה, ודאו שיש חומרים וציוד להכנת תקני טסטוסטרון, בקרות ודגימות.
   2. שחזר את תקן הטסטוסטרון עם מים דה-יוניים או מזוקקים כדי לקבל תמיסה של 100 ng/mL. ודא שיקום מלא ותן לו לשבת לפחות 15 דקות.
   3. הכן את רמת הטסטוסטרון ביום הניסוי.
   4. הכינו 6 צינורות מיקרוצנטריפוגה לסטנדרט, עם 900 מיקרו ליטר מדלל כיול לצינור של 10 ng/mL ו-400 מיקרוליטר לצינורות הנותרים.
   5. פיפט 100 מיקרוליטר תמיסה מקורת לצינור הראשון (צינור 10 ng/mL), ערבב היטב והחלף את קצה הפיפטה להעברה הבאה.
   6. פיפטה של 200 מיקרוליטר מהצינור הראשון (צינור 10 ng/mL) לצינור הבא (3.33 ng/mL), מערבבים היטב, מחליפים את קצה הפיפטה להעברה הבאה וחוזרים על השלב עד הצינור האחרון (0.041 ng/mL).
   7. הערה: לאחר השלמת כל השלבים, אמורים להיות 7 ריכוזים של סטנדרטים. מדלל הכיול משמש כסטנדרט האפס (0 ng/mL). כל תקן מוכן מספיק לשתי שכפולים.
2. הכן את השליטה בטסטוסטרון: ריכוז נמוך, בינוני וגבוה
   1. שחזור כל בקבוקון עם נפח המים המזוקקים או המזוקקים שצוין בתעודת הניתוח (COA) של ערכת הבקרה
   2. מדלל כל בקרה ב-2-פי במדלל הכיול לפני השימוש בבדיקה
3. הכינו דגימות
   1. הסר דגימות דמעות מ-80 מעלות צלזיוס והנח אותן על קרח להפשרה.
   2. לאחר שהדגימות הפשרו לחלוטין, יש לבצע צנטריפוגה קצרה של דגימות הדמעות כדי לוודא שכל הדגימות נמצאות בתחתית הצינורות בטמפרטורת החדר למשך 3–5 שניות.
   3. מערבבים 20 מיקרוליטר דגימה עם 80 מיקרוליטר מדלל מכייל כדי לקבל נפח כולל של 100 מיקרוליטר לכל שכפול.
   4. תכנן שני שכפולים לניסוי עבור בארות אמינות ובארות קישור לא ספציפיות (NSB) לבקרת רקע.
   5. הערה: כל דגימה מנותחת בבארות כפולות. לכן, נדרש 40 מיקרוליטר דגימת קרע לכל משתתף לביצוע הבדיקה, תוך ערבוב עם 160 מיקרוליטר מדלל הכיול כדי להגיע לנפח כולל של 200 מיקרוליטר.
4. תהליך הבדיקה
   1. הכינו את כל התגובות, תקני העבודה, דגימות הדמעות והבקרות.
   2. הסר את הבארות העודפות ממסגרת המיקרופלטה והשחזר אותן לאריזה של הנוזל בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   3. יש להוסיף 50 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית (בצבע כחול) לכל באר, ללא בארות המיועדות לבארות NSB. כסו את הפלטה בנייר אלומיניום.
   4. הדגר את הפלטה בטמפרטורת החדר למשך שעה על מנער מיקרופלט אופקי (מסלול 0.12 אינץ') במהירות 500 ± 50 סל"ד או בהגדרה הקרובה ביותר הזמינה.
   5. הכן מספיק בופר שטיפה לסך כולל של 8 שטיפות – 400 מיקרוליטר לבאר/שטיפה (4 שטיפות לפני ו-4 שטיפות אחרי שלב הדגירה).
   6. שאופים את תכולת כל באר ושטפו את הצלחת 4 פעמים עם בופר שטיפה.
   7. להוסיף 100 מיקרוליטר מדלל כיול לבארות ה-NSB ואפס בארות סטנדרטיות.
   8. הוסף 100 מיקרולטר של דגימות קרע סטנדרטיות, בקרה ומוכנות לבארות המיועדות.
   9. הוסיפו 50 מיקרול של קונג'וגט טסטוסטרון לכל באר וערבבו היטב על ידי פיפטציה.
   10. דגרו בטמפרטורת החדר במשך 3 שעות על מנער מיקרופלט אופקי (מסלול 0.12 אינץ') במהירות 500 ± 50 סל"ד או בהגדרה הקרובה ביותר הזמינה.
   11. שואף כל באר ושוטף 4 פעמים עם בופר שטיפה.
   12. הכינו את תמיסת הסובסטרט מיד לפני השימוש על ידי ערבוב תגובת צבע A ו-Color React B ביחס של 1:1. הקצה 200 מיקרוליטר לכל באר. שאיבה מלאה של בופר השטיפה השארי לפני הוספת המצע.
   13. הוסיפו 200 מיקרו ליטר של תמיסת מצע לכל באר בתוך 15 דקות לאחר ההכנה. דגרו 30 דקות בטמפרטורת החדר על הספסל. הגן מפני אור על ידי כיסוי בנייר אלומיניום.
   14. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת עצירה לכל באר באותו סדר כמו בתמיסת המצע. מערבבים היטב כל באר והצבע אמור להשתנות מכחול לצהוב.
   15. מדוד את הצפיפות האופטית ב-450 ננומטר ו-560 ננומטר בתוך 30 דקות מהוספת תמיסת העצירה באמצעות קורא מיקרופלט.
   16. הערה: הוראות היצרן ממליצות על אורך גל ייחוס של 540 ננומטר או 570 ננומטר. בפרוטוקול זה, אורך גל של 560 ננומטר שימש כאופציה הקרובה ביותר בקורא המיקרופלט, לתיקון אותות רקע ופגמים אופטיים.
5. חישוב
   1. מחסר את הצפיפות האופטית הנמדדת ב-560 ננומטר (אורך גל ייחוס) מהצפיפות האופטית הנמדדת ב-450 ננומטר.
   2. הפחת את צפיפות האופטיקה הממוצעת של NSB מכל קריאה בודדת של תקנים, דגימות ובקרות, ואז מחשבים את ממוצע המדידות הכפולות.
   3. יצירת עקומה סטנדרטית על ידי התאמת הנתונים באמצעות מודל לוגיסטי בעל ארבעה פרמטרים (4PL).
   4. קבעו את ריכוזי הטסטוסטרון על ידי אינטרפולציה של ערכי הדגימה מהעקומה הסטנדרטית.
   5. כוונן את הריכוזים המחושבים על ידי יישום מקדם דילול של 5 כדי להתחשב בדילול הדגימה של 1:5.
   6. אמת את המדידה על ידי חישוב מקדם השונות (CV) בין השכפולים לא צריך לעלות על 20%.
      1. הערה: %CV = (SD/ממוצע) × 100

3. מבחן אסטרדיול

1. הכנת תקנים, בקרים ודגימות אסטרדיול
   1. עקבו אחר פרוטוקול הערכה, ודאו שיש חומרים וציוד זמינים להכנת תקנים, בקרות ודגימות.
   2. אפשר לכל החומרים והמגיבים להגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
   3. הכינו תגובת טרייה ביום הניסוי.
   4. התקנים והבקרה מוכנים לשימוש. אליקווט רק את הכמות הנדרשת לבדיקה הנוכחית כדי למזער זיהום ולהגביל שינויים חוזרים בטמפרטורה במהלך הטיפול.
   5. ודאו ששישה תקנים (מספר 0–5) מוכנים, כאשר תקן 0 מייצג 0 pg/mL, וכללו דגימת בקרה אחת שסופקה עם הערכה.
   6. הפשיר את הדגימות הקפואות מ-80°C על ידי הנחתן על הקפא.
   7. סובבו את דגימות הדמעות למטה כדי לוודא שכל הדגימות נמצאות בתחתית הצינור.
2. תהליך הבדיקה
   1. הסר את הבארות העודפות מהמיקרופלטה והשחזר אותן לאריזה של הנוזל בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   2. הוסף 20 מיקרו-ליטר של תקנים, בקרות ודגימות לבארות.
   3. הערה: כל תקן ודגימה צריכים להיבחן עם שני שכפולים.
   4. כדי להבטיח התפלגות אחידה, ערבבו היטב את כל התקנים, הבקרות והדגימות מיד לפני הפיפטרינג לבארות.
   5. הוסף 160 מיקרוליטר של 17 בטא Estradiol-HRP קונוגט לבארות הבדיקה.
   6. השאירו באר ריקה למצע ריק.
   7. כסו את הבאר בנייר אלומיניום לפני שמכניסים אותה לאינקובטור. התמיסה בבארות יכולה להתאדות אל נייר האלומיניום.
   8. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
   9. הכינו בופר כביסה מתמיסת שטיפה של 10X במהלך תקופת הדגירה.
   10. לאחר סיום הדגירה, הסר את נייר האלומיניום ושאף את הנוזל מהבארות.
   11. שטוף כל באר 3 פעמים עם Wash Buffer. להשרות > 5 שניות בכל מחזור כביסה.
   12. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת מצע TMB לכל הבארות.
   13. כסו את כל הצלחת בנייר אלומיניום ודגרו בטמפרטורת החדר בדיוק 30 דקות.
   14. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת עצירה לכל הבארות באותו סדר ובאותו קצב כמו תמיסת המצע TMB הקודמת.
   15. נער בעדינות את המיקרופלטה והמגיב משתנה מכחול לצהוב.
   16. מדוד את הספיגה ב-450 ננומטר בתוך 30 דקות מהוספת תמיסת העצירה.
3. חישוב
   1. הפחת את הספיגה של הבאר הרקה מקריאות כל התקנים, הדגימות והבקרות כדי לתקן פגמים באות הרקע ובאופטיות.
   2. חשב את ממוצע המדידות הכפולות.
   3. יצירת עקומת סטנדרט מתאימה ביותר באמצעות לוגיסטיקה בעלת ארבעה פרמטרים (4PL).
   4. קביעת ריכוז אסטרדיול על ידי אינטרפולציה של ערכי דגימה מהעקומה הסטנדרטית..
   5. אמת את המדידה על ידי חישוב מקדם השונות (CV) בין השכפולים לא צריך לעלות על 20%.
      1. הערה: %CV = (SD/ממוצע) × 100.

4. ניתוח נתונים באמצעות R ו-RStudio

1. התקן את R ו-RStudio, והתקן את החבילות הנדרשות המפורטות בטבלת החומרים לפני ביצוע ניתוח הנתונים.
2. ייבא מדידות צפיפות אופטית עבור תקנים, בקרות ודגימות לתוכנת הניתוח.
3. מעבד מראש את הנתונים על ידי תיקון אורכי גל כפי שמצוין בבדיקה. לאחר מכן מחסרים ערכים ריקים או ערכי NSB ומחשבים את ממוצע המדידות הכפולות.
4. התאמת עקומה סטנדרטית באמצעות מודל רגרסיה לוגיסטי בעל ארבעה פרמטרים (4PL) עם ריכוז כמשתנה בלתי תלוי וצפיפות אופטית כמשתנה תגובה.
5. בצע התאמת עקומה ב-R באמצעות פונקציית drm() מחבילת drc, כאשר המודל מוגדר כ-fct = LL.4() עבור רגרסיית 4PL, עם נתוני ריכוז וצפיפות אופטית כקלט.
6. בדוק את איכות התאמת העקומה (למשל, R² > 0.99 או איכות התאמה מקובלת) לפני פירוש ריכוזי הדגימה.
7. חישוב ריכוזי הורמונים באמצעות חיזוי הפוך באמצעות פונקציית ED() המבוססת על עקומת התקן המותאמת, תוך ציון המינון האפקטיבי התואם לערכי צפיפות אופטית של הדגימה בהתבסס על המודל המותאם.
8. כוונן את הריכוזים המחושבים על ידי יישום מקדם הדילול המתאים (למשל, ×5 לדילול 1:5).
9. דווחו על ריכוזי ההורמונים הסופיים ביחידות המתאימות (למשל, ng/mL או pg/mL), תוך הבטחת עקביות עם העקומה הסטנדרטית, וייצאו את הנתונים המעובדים לניתוח או ויזואליזציה נוספת.

תוצאות

מחקר סרט דמעת הפיילוט

בסך הכל נכללו 20 נשים (45–63) במחקר זה. סיווג DED התבסס על תסמינים ולפחות סימן קליני אחד של DED. בפרט, כל משתתפי DED קיבלו ציון מדד מחלות פני העיניים (OSDI) > 12 ולפחות עין אחת עם זמן פירוק דמעות פלואורסציין (TBUT) של < 5 שניות או ציון צביעת פלואורסצאין בקרנית (CFSS) של > 3 (סולם NEI²⁵). משתתפים שסווגו כלא DED קיבלו ציון OSDI < 12, TBUT של > 5 שניות בשתי העיניים, ו-CFSS של ≤ 3 בשתי העיניים. קריטריו...

דיון

איסוף וניתוח קרעים מאפשרים גישה נוחה להערכה מדעית של בריאות פני העיניים ולזיהוי סמנים ביולוגיים פוטנציאליים^10,22. הפרוטוקול שלנו מתאר התאמה מוצלחת של שיטות ELISA נפוצות לניתוח דגימות שכבת דמעות להורמוני מין. פיתחנו שיטה זו כדי להתמודד עם המגבלה העיקרית של ניתוח קרעים, הנפח הקטן יחסית של קרעים הזמינים. על ידי אופטימיזציה של זרימת העבודה כדי להתאים למגבלות מיקרו-נפח אלו, אנו מבטיחים זיהוי אמין מבלי לפגוע ברגישות הנדרשת לכימות הורמו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ערכת ELISA ל-17 בטא אסטרדיול	Abcam	ab108667
רדיד אלומיניום	Reynolds Wrap	10900000154	כל רדיד אלומיניום זמין למטבח להגנה על ריאגנטים מהאור
צינור מיקרוקפלרי 3.33 מיקרוליטר	Drummond	1-000-0033	כולל כדורית לחיצה להעברת נוזלים
צינור מיקרוקפלרי 5 מיקרוליטר	Drummond	1-000-0050	כולל כדורית לחיצה להעברת נוזלים
מכשיר מיקרוצנטריפוגה	Benchmark Scientific	C1012
צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל	Fisher	05-408-129
קורא מיקרופלטה	Promega	GM3000
נער מיקרופלטה אורביטלי	Labnet International Inc.	S2030-1000-B
שפת מחשב R	Posit Software, PBC (לשעבר RStudio Inc.)	גרסת R 4.5.1	הורד את שפת R לפני Rstudio דרך https://cran.r-project.org/
תוכנת RStudio	Posit Software, PBC (לשעבר RStudio Inc.)	RStudio 2023.06.1 Build 524 "Mountain Hydrangea"	https://posit.co/downloads/
חבילות R "drc", "ggplot2", "patchwork", "ggpp", "dplyr", "readr", "tidyr", "writexl"	Posit Software, PBC (לשעבר RStudio Inc.)		התקן את החבילה ב-Rstudio
ערכת בקרת טסטוסטרון	R&D Parameter	QC165	נמכר בנפרד מערכת ה-ELISA (KGE010)
ערכת ELISA לטסטוסטרון	R&D Parameter	KGE010