מאמר שיטה

אסטרטגיות הדמיה להתערבות בדיקור סיני בעכברים מודל של מחלת אלצהיימר

186 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70998

⸱

21 באפריל 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Traditional Chinese Medicine, General Hospital of the Chinese People's Liberation Army, 2Meizhou Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine (Meizhou Hospital of Traditional Chinese Medicine), 3School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, 4Department of Psychosomatic Medicine, Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Capital Medical University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיית הדמיה מיקרו-PET בשילוב עם בדיקות התנהגותיות ומולקולריות להערכת דינמית של השפעות הדיקור האלקטרו-דיקורי על שקיעת β-אמילואידים ותפקוד קוגניטיבי במודל עכבר של מחלת אלצהיימר.

תקציר

מחלת אלצהיימר (AD) היא הפרעה נוירודגנרטיבית המאופיינת בעיקר בתפקוד קוגניטיבי מתקדם. אחת מהתכונות הפתולוגיות האופייניות לכך היא היווצרות פלאקים סניליים במוח כתוצאה מהפקדת חלבוני β-אמילואידים (Aβ). דיקור סיני הוכיח פוטנציאל בפרקטיקה הקלינית לשיפור התפקוד הקוגניטיבי אצל חולי AD. עם זאת, השפעותיה הדינמיות על פתולוגיית Aβ דורשות הבהרה אובייקטיבית באמצעות גישות טכנולוגיות מודרניות. טומוגרפיית פליטת מיקרו-פוזיטרון (micro-PET) מספקת כלי עוצמתי לתצפית לא פולשנית במצב חי של שקיעת Aβ במוחות של עכברי מודל AD. בפרוטוקול זה אנו מפרטים אסטרטגיית הדמיה המשתמשת ב-[18F]AV-45 micro-PET להערכת השפעות התערבות אלקטרואקופונקטורית, בשילוב עם בדיקות התנהגות של Morris Water Maze וניתוח מולקולרי Western Blot. הגישה המשולבת מאפשרת המחשה וכמותית של התקדמות פתולוגית Aβ במוחות של עכברי מודל AD. דבר זה מספק ראיות אובייקטיביות וכמותיות לבחינת ההשפעה הרגולטורית של דיקור סיני על הצטברות Aβ. על ידי שילוב עקרונות הרפואה הסינית המסורתית עם טכנולוגיות מודרניות של הדמיה מולקולרית וביולוגיה מולקולרית.

מבוא

ניטור ב-IVO של הצטברות β-אמילואיד (Aβ) במוח הוא חיוני להערכת ההתקדמות הפתולוגית של AD1. לאחר יישום קליני של טיפולי נוגדנים ממוקדים ב-Aβ (כגון לקאנמאב), הערכה אורכית וכמותית של עומס Aβ מוחי באמצעות PET הפכה לסטנדרט זהב לקביעת יעילות טיפולית2. בעוד שהדיקור הראה פוטנציאל במחקרים פרה-קליניים לוויסות חילוף החומרים של Aβ, גישות מחקר מסורתיות הסתמכו בעיקר על ניתוחים אקס ויבו, ללא כלים יעילים להערכה ישירה ואובייקטיבית של השפעתו הדינמית על שקיעת Aβ באורגניזמים חיים. בשנים האחרונות, התקדמות בטכנולוגיות דימות מולקולרית יצרה הזדמנויות להתמודד עם הפער הזה. מיקרו-PET אפשר תצפית לא-פולשנית ואורך על שקיעת Aβ בעכברי מודלשל AD 1. חשוב מכך, אסטרטגיות דימות חדשות מתפתחות מגישות חד-מטרה לפרדיגמות רב-מודליות. לדוגמה, מחקרים אישרו כי תת-סוגים מבניים שונים של סיבי Aβ מציגים זיקות קשירה משתנות למעקבי PET נפוצים, מה שמעלה דרישות חדשות לכימות מדויק3. במקביל, טכניקות מתפתחות כמו דימות נוירואימוני (למשל, TSPO PET) והערכות של תפקוד מחסום דם-מוח מציעות פרספקטיבות חסרות תקדים להבהרה מקיפה של המנגנונים הפתולוגיים המורכבים של AD וההשפעות הרב-מטרותיות שלהתערבויות טיפוליות.

בהתבסס על יסוד זה, מחקר זה שואף לפתח אסטרטגיית דימות מיקרו-PET מתקדמת תוך שימוש בגשואים הספציפיים ל-Aβ העדכניים להערכת השפעת התערבות דיקור דיני על שקיעת Aβ במוחות של עכברי מודל AD בחיים באופן דינמי וכמותי. המחקר לא רק יאמת את היעילות הטיפולית של דיקור, אלא גם ישאף לספק ראיות ישירות למנגנונים הבסיסיים שלו ברמת ההדמיה המולקולרית.

פרוטוקול

לבצע את כל הניסויים בהתאם להנחיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה שפורסמו על ידי המכון הלאומי לבריאות. פרוטוקול המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה הניסיונית של בעלי החיים של אוניברסיטת הרפואה הסינית בבייג'ינג (מספר: bucm-4-2021102707-5421).

1. הכנת בעלי חיים ניסיוניים

  1. קבל עכברים זכרים בני 6 חודשים מסוג APP/PS1 ועכברים תואמים לגיל ולמגדר C57BL/6 במשקל 28.0 ± 2.0 גרם.
  2. שים את העכברים בכלובים רגילים בטמפרטורת החדר של 24 ± 2 מעלות צלזיוס עם לחות של 40%–60%.
    הערה: בעלי החיים הוחזקו בכלובים סטנדרטיים במרכז בעלי החיים המעבדה של אוניברסיטת הרפואה הסינית בבייג'ינג, אוניברסיטת קפיטל לרפואה.
  3. שמרו על בעלי החיים במחזור סטנדרטי של 12 שעות אור/חושך (תקופה חשוכה: 20:00 עד 8:00 בבוקר) עם גישה חופשית למזון ולמים. החלף את המצעים מדי יום כדי להבטיח תנאי מגורים נקיים ויבשים.
  4. הסתגל בעלי החיים לסביבת המעבדה למשך 7 ימים. התחל ניסויים ביום השמיני לאחר ההסתגלות.

2. קיבוץ בעלי חיים והתערבויות

  1. שייך אקראית עשרים עכבר זכרים בני 6 חודשים מסוג APP/PS1 לקבוצת מודל מחלת אלצהיימר (קבוצת AD, n = 10) ולקבוצת אלקטרואקפונקטורה (קבוצת EA, n = 10). השייכו עשרה עכברים תואמים לגיל ולמין C57BL/6N לקבוצת ביקורת תקינה (N קבוצה, n = 10).
  2. זהה את שלוש נקודות הדיקור בראש עבור ההתערבות: GV20 (באי-הוי), GV26 (שואיגו), ו-GV29 (יינטאנג).
    הערה: מיקום נקודות הדיקור מבוסס על "אטלס נקודות דיקור חיות" שנוסח על ידי החברה למחקר דיקור ניסיוני של האגודה הסינית לאקופונקטורה מוקסיאבסטית. GV20 ממוקם באמצע בין קצות שתי האוזניים; GV29 נמצא בנקודת האמצע בין קצות הגבות המדיאליות; ו-GV26 ממוקם מתחת לספטום האף של העכבר, בצומת של שני השלישים התחתונים והשליש העליון של קו האמצע של חריץ השפה. התרשים הסכמטי מוצגת באיור 1.
  3. תנו גירוי אלקטרואקפונקטורה לקבוצת ה-EA פעם ביום למשך 20 דקות במשך 15 ימים רצופים.
    1. הרסן את העכבר היטב באמצעות שרוולי ריסון בד בעיצוב אישי זהים. ודאו שהגוף עטוף בנוחות כאשר הראש נשאר חשוף לחלוטין להחדרת מחט מדויקת ולנשימה תקינה.
    2. הכינו מחטי דיקור סטריליות חד-פעמיות (0.25 מ"מ × 13 מ"מ).
    3. יש להחיל שיטת דקירה מהירה (החדרה מהירה ומשיכה מיידית ללא החזקה) על נקודת הדיקור GV26 (שואיגו) באמצעות מחט דיקור סטרילית.
    4. חבר את ידיות המחטים ב-GV20 ו-GV29 לקליפסים של מכשיר דיקור אלקטרוני.
    5. הגדר את פרמטרי הגירוי על המכשיר כדי לספק גל דליל רציף, בתדר של 2 הרץ, מתח קבוע של 2 וולט, ועוצמת זרם של 0.1 מיליאמפר.
    6. התבונן בעכבר היטב וודא שעוצמת הגירוי גורמת לרעד קל וקצבי בראש העכבר.
  4. לשמור על עכברים בקבוצות N ו-AD בתנאי מגורים זהים ללא כל התערבות. חשוף את קבוצות ה-N וה-AD לאותם נהלי טיפול יומיומיים והגבלה כמו קבוצת EA לאורך כל 15 הימים כדי להבטיח עקביות בתנאי הניסוי.

3. מבחן מבוך המים של מוריס (MWM)

הערה: המסגרת ההתנהגותית (Morris Water Maze) בונה על עבודתנו הקודמת5.

  1. הכנת ציוד
    1. הניחו מיכל מים עגול (בקוטר 90 ס"מ, עומק 50 ס"מ) בחדר הבדיקה. מלא את המיכל במים (22 ± 2 מעלות צלזיוס) לעומק של 30 ס"מ.
    2. הוסיפו 0.5 ק"ג אבקת חלב רזה למים כדי להפוך אותה לאטומה. למעשה, מחלקים את המיכל לארבעה רבעים שווים (I, II, III ו-IV).
    3. מקם פלטפורמת מילוט (עגולה, בקוטר 5 ס"מ, 28 ס"מ גובה) במרכז רבע I.
    4. הניחו רמזים ויזואליים מובחנים של צורות שונות על הקיר הפנימי של כל רבע כדי לעזור לעכבר ללמוד ולשנן את מיקום הפלטפורמה.
    5. התקן מצלמה דיגיטלית 2 מטר מעל מרכז המיכל על התקרה וחבר אותה למערכת לכידת תמונה6.
  2. הרגל
    1. הסר את הפלטפורמה מהמיכל ביום שלפני מבחן הפלטפורמה הנסתרת. אפשר לעכבר לשחות בחופשיות במיכל במשך 90 שניות בבוקר ובצהריים כדי להתרגל לסביבה הניסיונית.
  3. בדיקת פלטפורמה נסתרת
    1. בצע את מבחן הפלטפורמה הנסתרת במשך חמישה ימים רצופים.
    2. בחר נקודות התחלה מהרבעים השני, השלישי והרביעי, בהתאמה, כדי לוודא שכל נקודת התחלה נמצאת במרחק שווה ממרכז המיכל.
    3. הנח את העכבר במים, מול קיר המיכל. אפשר לעכבר 10 שניות להתבונן סביבו לאחר שנכנס למים.
    4. הקלט את השהיה הבריחה ומסלול השחייה אם העכבר מוצא את הפלטפורמה הנסתרת ונשאר עליה במשך 5 שניות בתוך מגבלת 60 שניות. הכוון את העכבר לפלטפורמה ידנית אם הוא לא מוצא את הפלטפורמה בתוך 60 שניות.
    5. אפשר לחיה להישאר על הפלטפורמה במשך 10 שניות כדי לצפות ולשנן את המיקום, ולרשום את זמן הבריחה כ-60 שניות.
  4. בדיקת בדיקה מרחבית
    1. הסר את הפלטפורמה הנסתרת מהמיכל לאחר חמישה ימים רצופים של אימון בפלטפורמה מוסתרת.
    2. הנח כל עכבר במים מאחת מנקודות ההתחלה הממוקמות ברבע השני, השלישי או הרביעי. תן לעכבר לשחות בחופשיות במשך 60 שניות. תעד את מסלול השחייה ואת הזמן שבילה ברבע המטרה (רבע I).
    3. החזירו את כל העכברים לכלוביהם הביתיים מיד בין הניסויים כדי למזער מגע ישיר עם הניסוי.

4. ניתוח כתם מערבי

  1. הורד שישה עכברים בכל קבוצה 24 שעות לאחר סיום ההתערבות בת 15 הימים. נתח ומבודד במהירות רקמות היפוקמפוס טריות על הקרח.
  2. שקלו את רקמות ההיפוקמפוס והניחו אותן בצינורות מיקרוצנטריפוגה מקוררים מראש. הוסיפו בופר RIPA קר עם קוקטייל מעכב פרוטאז 1% וקוקטייל מעכב פוספטאז 1% ביחס של 10 מיקרוליטר בופר ל-1 מ"ג רקמה.
  3. הומוגניזציה יסודית של הרקמות באמצעות הומוגניזר רקמות מכני על קרח. בצנטריפוגה את האחיזה בהומוגנציה ב-12,000 x גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי להסיר פסולת תאית. אסוף בזהירות את הסופרנטנט והעבר אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש מקורר מראש.
  4. מערבבים את דגימות החלבון עם בופר טעינה של 5× SDS והרתיחו את התערובת בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לדנטורציה מלאה של החלבונים. טעינו כמויות שוות של חלבון (20 מיקרוגרם) בכל באר על ג'ל SDS-PAGE של 15%. כלול סמן משקל מולקולרי חלבוני מוצבע מראש בבאר סמוכה.
  5. הריץ את ג'ל הערימה במתח קבוע של 80 וולט במשך 30 דקות, ואז מפר את החלבונים בג'ל המפריד ב-120 וולט עד שהחזית של צבע הברומופנול הכחול מגיעה לתחתית הג'ל.
  6. העבר את החלבונים המופרדים לממברנת פוליווינילידן פלואוריד (PVDF) של 0.22 מיקרון בזרם קבוע של 250 mA למשך 90 דקות על הקרח. חסמו את ממברנת ה-PVDF עם 5% חלב דל שומן מומס במי מלח טריס-בופר המכיל 0.1% Tween 20 (TBST) למשך שעה בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין על שייקר.
  7. דגרו את הממברנה עם נוגדן ראשוני נגד Aβ (מדולל [1:1000] בבופר חסימה) ונוגדן ראשוני נגד GAPDH (מדולל [1:5000] בבופר חסימה) למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C על שייקר אופקי. דגרו את הממברנה עם נוגדן משני מצומד עם פרוקסידאז חזרת (HRP) (מדולל [1:2000] בבופר חסימה) למשך שעה בטמפרטורת החדר.
  8. שטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBST למשך 10 דקות כל אחת כדי להסיר נוגדנים משניים לא קשורים.
  9. יש להחיל תת-קרקע כימילומינסנציה משופרת (ECL) על הממברנה ולוכד את האות באמצעות מערכת הדמיה כימלומינצנטית.
  10. כמת את עוצמות רצועת החלבון באמצעות תוכנת ImageJ (גרסה 1.53a). נרמל את ערכי הגווני האפור של רצועות היעד לאלו של GAPDH, וחשב את רמות הביטוי היחסיות של החלבונים הרלוונטיים.

5. [18F] רדיוסינתזה AV-45

  1. לבצע תיוג רדיואלי באמצעות החלפה נוקלאופילית של 3.0 מ"ג מהתרכובת הקדומה ב-[18F]KF.
  2. לטהר את המוצר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) להשגת טוהר רדיוכימי (RCP) הגבוה מ-95%.
  3. המיס את התרכובת המסומנת באתנול.
  4. מדלל את התמיסה ב-0.9% נתרן כלוריד, והכין את המוצר הסופי באתנול 10% לשימוש עתידי.

6. הדמיית PET במצב חי

  1. בחרו ארבעה עכברים באקראי מכל קבוצת ניסוי.
    1. הניחו את העכבר על כרית חימום מים בסיבוב (37 מעלות צלזיוס) או מתחת למנורת חימום למשך 5–10 דקות לפני ההליך כדי לקדם את הרחבת כלי הדם של הוורידים הזנביים.
    2. אבטח את העכבר במגביל גלילי שקוף מתאים, כך שהזנב חשוף לחלוטין. חטא את הזנב וראה עוד יותר את הוורידים הצדדיים בזנב על ידי ניקוי העור עם מטוש של 70% אתנול.
  2. למשוך את רדיו-טרייסר AV-45 המנוסח לתוך מזרק אינסולין בנפח 0.5 מ"ל המצויד במחט. הכינו נפח הזרקה של כ-100–150 מיקרו-ליטר כדי להגיע למינון רדיואקטיבי יעד של 3.0 MBq (טוהר רדיוכימי > 95%)2.
  3. למדוד ולרשום את הרדיואקטיביות הראשונית של המזרק המלא במעקב באמצעות כיול מינון.
  4. הכנס את המחט, זוחל כלפי מעלה בזווית רדודה (כ-10°–20°) לתוך וריד הזנב הלטרלי. המתינו 60 דקות לאחר ההנחה, ואז הרדימו את העכבר על ידי שאיפת איזופלורן 2%.
  5. מקם את העכבר ובצע סריקת PET סטטית תלת-ממדית של 15 דקות.
  6. שחזר את נתוני ה-PET באמצעות אלגוריתם תלת-ממדי של המקסום תוחלת תתי-קבוצה מסודרת (OSEM).
  7. עבד את הנתונים המשוחזרים באמצעות תוכנת PMOD (גרסה 4.5).
    1. רישום משותף של הנתונים לתבנית מוח המתאימה לעכברים קטנים ובינוניים בתוך מודול המיזוג של PMOD. אפשר לתוכנה להגדיר אוטומטית את אזורי העניין (ROIs) במוח העכבר.
  8. חשב את ערכי הקליטה הסטנדרטיים (SUV). השגת יחס ערך קליטה סטנדרטי (SUVR) על ידי השוואת SUV של כל ROI לזה של המוחון8.
    הערה: השונות המקובלת במינון הניתן (2.0–3.8 MBq) מתאימה לתנודות יומיות בתפוקת רדיוטרייסר ולמשקל גוף של עכברים בודדים. מכיוון שכמותים מאוחרים יותר מסתמכים על יחס ערך קליטה סטנדרטי (SUVR)—שמנרמל את אזור היעד מול אזור ייחוס (מוחון)—שינויים מוחלטים במינון בטווח זה אינם פוגעים בתוצאות ההדמיה ההשוואתיות. טומוגרפיית פליטת מיקרו-פוזיטרון (Micro-PET) מוצגת באיור 2.

7. ניתוח סטטיסטי

  1. בצע את כל הניתוחים הסטטיסטיים באמצעות תוכנת SPSS (גרסה 19.0).
  2. הצג את הנתונים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD).
  3. יישם ANOVA חד-כיווני כדי לנתח את תוצאות בדיקות הפלטפורמה הנסתרות.
  4. ניתחו את הנתונים מבדיקת הגשוש המרחבי והדמיית PET באמצעות ANOVA במדידות חוזרות או ANOVA חד-כיווני, ואחריהם בדיקות פוסט-הוק של LSD להשוואות זוגיות.

תוצאות

השפעת הדיקור החשמלי על התפקוד הקוגניטיבי בעכברי APP/PS1

כדי להעריך את יכולת הלמידה המרחבית, העכברים עברו ניסויי אימון מהיום הראשון ועד היום החמישי. במבחן הפלטפורמה הנסתרת (איור 3A,B), עיכוב הבריחה של עכברים בכל הקבוצות הראה מגמת ירידה במהלך תקופת האימון. בהשוואה לקבוצת ה-N, קבוצת הפריעות הציגה השהיה בריחה ממושכת משמעותית (p < 0.05), מה שמעיד על ליקויים בולטים בלמידה ובזיכרון בעכברי APP/PS1 בני 6 חודשים. השהיית הבריחה בקבוצת AD הייתה ארוכה משמעותית מזו שבשתי קבוצות N ו-EA (p < 0.01). ראוי לציין שביום החמישי, השהיה הבריחה בקבוצת ה-EA הייתה קצרה משמעותית מזו שבקבוצת AD (p < 0.05) (איור 3C). לאחר תקופת האימון בת 5 הימים, הוערך הזיכרון המרחבי באמצעות מבחן הגשוש המרחבי. חושב היחס בין זמן השחייה ברבע היעד (הפלטפורמה) לבין סך זמן השחייה; יחס גבוה יותר מצביע על שימור זיכרון טוב יותר. התוצאות הראו כי יחס זמן השחייה בקבוצת הפריזם היה נמוך משמעותית מזה שבקבוצת ה-N (p < 0.01). לעומת זאת, קבוצת ה-EA הציגה יחס גבוה משמעותית בהשוואה לקבוצת ה-AD (p < 0.01). עם זאת, היחס בקבוצת EA נותר נמוך יותר מזה שבקבוצת N (p < 0.05) (איור 3D).

מספר מעברי הרציפות, שמשקף את דיוק הזיכרון המרחבי, נותח גם הוא. מספר גדול יותר של חציית חציות מצביע על שימור זיכרון טוב יותר. קבוצת ה-AD הציגה פחות חציית פלטפורמות מקבוצת N (p < 0.05), בעוד שקבוצת EA הראתה עלייה משמעותית בהשוואה לקבוצת AD (p < 0.05). למרות זאת, לקבוצת EA היו עדיין פחות חציות מאשר לקבוצת N (p < 0.05) (איור 3E).

השפעות האלקטרואקפונקטורה על שקיעת Aβ בהיפוקמפוס של מיקרופון APP/PS1e

הפקדת Aβ הוערכה באמצעות הדמיית PET, ויחס ערך הקליטה הסטנדרטי (SUVR) של המעקב Aβ המסומן ברדיו חושב בהיפוקמפוס של עכברי APP/PS1 (איור 4A). סריקות Micro-PET הראו כי גם קבוצת N וגם קבוצת EA הציגו ערכי SUVR נמוכים משמעותית לעומת קבוצת האלייזמור (איור 4B). ניתוח כמותי נוסף אישר כי ה-SUVR וה-Aβ של ההיפוקמפוס בקבוצת ה-EA היו גבוהים משמעותית מאלו שבקבוצת ה-N (p < 0.05), בעוד שהוא נותר נמוך משמעותית מזה שבקבוצת הפריהוי לאחר התערבות אלקטרואקפונקטורה (p < 0.05) (איור 4C).

השפעות האלקטרואקפונקטורה על ביטוי חלבוני Aβ

לאחר ההערכות ההתנהגותיות והדימותיות, ביטוי חלבון Aβ בהיפוקמפוס הוערך באמצעות ניתוח ווסטרן בלוט (איור 5A). ניתוח כמותי גילה כי הביטוי היחסי של Aβ בקבוצת האליימר היה גבוה משמעותית בהשוואה לקבוצת N (p < 0.05). קבוצת EA הראתה ירידה משמעותית בביטוי Aβ בהיפוקמפוס בהשוואה לקבוצת AD (p < 0.05). עם זאת, רמות הביטוי בקבוצת EA נותרו גבוהות יותר מאלו של קבוצת ה-N, מה שמעיד שלמרות שההתערבות הפחיתה ביעילות את הצטברות Aβ, היא לא ניקתה לחלוטין את הפלאקים הקיימים (איור 5B).

figure-results-1
איור 1: דיאגרמה סכמטית המציגה את מיקומי נקודות הדיקור GV20 (בייהווי), GV26 (שואיגו) ו-GV29 (יינטאנג) בעכברים. איור זה שומש מחדש באישור Sun ואחרים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: טומוגרפיית פליטת מיקרו-פוזיטרונים (Micro-PET). ה-IRIS PET/CT (Inviscan) היא מערכת הדמיה פרה-קלינית לעכברים וחולדות, עם רגישות גבוהה (>9%) ורזולוציה מרחבית של 1 מ"מ עם שדה ראייה צירי של 96 מ"מ. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: השפעת הדיקור החשמלי על התפקוד הקוגניטיבי. (א) מכשיר MWM. (ב) עכברים נבדקו באמצעות מכשיר מבוך המים של מוריס (MWM). (ג) מגמות בהשהיית בריחה במהלך מבחן הפלטפורמה הנסתרת. בהשוואה לקבוצת N, ◆◆p < 0.05; בהשוואה לקבוצת מחלת האלצהיימר (AD), ▲▲p < 0.05. (ד) יחס זמן השחייה ברבע הראשון. בהשוואה לקבוצת N, ◆◆p < 0.05; בהשוואה לקבוצת AD, ▲▲p < 0.05. (ה) מספר מעברי הרציף ברבע הרציף. בהשוואה לקבוצת N, ◆◆p < 0.05; בהשוואה לקבוצת AD, ▲▲p < 0.05. איור זה שומש מחדש באישור Sun ואחרים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 4: השפעות האלקטרואקופונקטורה על שקיעת Aβ. (א) אזור העניין בהיפוקמפוס העכבר מוצג בירוק. (B) תמונות טומוגרפיה פליטת מיקרו-פוזיטרונים של Aβ בעכברים מכל קבוצה. (ג) השוואה בין יחס ערך קליטה סטנדרטי של AV-45 (SUVR; אזור יעד/מוחון) בהיפוקמפוס של כל קבוצה, בכימות באמצעות מיקרו-PET. בהשוואה לקבוצת N, ◆◆p < 0.05; בהשוואה לקבוצת מחלת האלצהיימר (AD), ▲▲p < 0.05. איור זה שומש מחדש באישור Sun ואחרים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-5
איור 5: השפעות האלקטרואקפונקטורה על ביטוי חלבוני Aβ. (A) רצועות כתם מערביות מייצגות המציגות את רמות הביטוי של Aβ (4 kDa) ו-GAPDH (146 kDa) כבקרת טעינה. הפסים ממחישים ביטוי Aβ נמוך בקבוצת N, ביטוי גבוה בקבוצת AD, וביטוי מופחת בקבוצת EA בהשוואה למודל AD. (B) ניתוח כמותי של הביטוי היחסי בין Aβ ל-GAPDH בין קבוצות הניסוי. בהשוואה לקבוצת N, ◆◆p < 0.05; בהשוואה לקבוצת מחלת האלצהיימר (AD), ▲▲p < 0.05. איור זה שומש מחדש באישור Sun ואחרים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

דיון

הדמיה וכימות שקיעה בהיפוקמפוס מספקת חלון מכריע להתפתחות הפתולוגית של מחלת9 לספירה. למרות שקיימות מספר שיטות דימות מוחיות, השגת תרגום ברזולוציה גבוהה, כמותית ובין-מינים נותרה מכשול משמעותי. לדוגמה, הדמיית פלואורסצנציה קרובה באינפרא-אדום מוגבלת לעיתים קרובות ברזולוציה מרחבית, ו-MRI—אף שהוא מסוגל למפות שינויים מבניים—דורש לעיתים מינוני חומר ניגוד גבוהים מדי כדי להבחין ברובד עמילואיד ב-vivo. לעומת זאת, PET מהווה כלי תרגומי אופטימלי, המאפשר הערכה דינמית של דלקת עצבית, מטבוליזם גלוקוז והצטברות A הן במודלים בעלי חיים והן באוכלוסיות קליניות10,11. הדמיה מולקולרית באמצעות PET לא רק מסייעת באבחון מוקדם ובשלב פתולוגי מדויק. אך הוא גם חיוני למעקב אחר המעורבות והיעילות של טיפולים מתקדמים ל-AD12. הופעת טכנולוגיית מיקרו-PET בתחום הפרה-קליני הרחיבה משמעותית את השימוש ב-PET מעבר לסביבות קליניות ומחקר פרימטים לא-אנושיים. מאופיין ברזולוציה מרחבית גבוהה ורגישות גבוהה המותאמת לשדות ראייה קטנים, מיקרו-PET מאפשר לחוקרים לעקוב אחר התקדמות ניוונית נוירודגנרטיבית במודלים של מכרסמים לאורך13,14. חשוב לציין, מדדים כמותיים מבוססים כמו המחושבים על ידי SUVR ביחס לאזורי ייחוס חסרי פתולוגיה עמידה כמו המוחון, כמו המוחון, יכולים להיות מתורגם בצורה חלקה ממיטת המיטה15. היסטורית, הדמיית PET באמצעות מעקבים ספציפיים הראתה רגישות אבחנתית גבוהה (עד 90%) וספציפיות גבוהה (89%) עבור AD16,17. בעוד ש-[11C]PIB טרייסר חולל מהפכה בוויזואליזציה מוקדמת של עמילואידים, מחצית החיים הקצרה שלו הגבילה את הפריסה הנרחבתשלו 18. הפיתוח שלאחר מכן ואישור ה-FDA לשנת 2012 של [18F]AV-45 (Florbetapir) הפחיתומגבלות אלו, וסיפקו מחצית חיים ארוכה יותר לצד זיקה וסלקטיביות קשירה מצוינת ל-Aβ. כתוצאה מכך, [18F]AV-45 הפך למרכיב מרכזי הן באבחון קליני והן בהערכות פרה-קליניות.

יש לקחת בחשבון מספר שלבים קריטיים ושינויים פוטנציאליים בעת שימוש בפרוטוקול זה. ראשית, שליטה קפדנית על פרמטרי הרדיוסינתזה חיונית; כל סטייה בכמות הקדמון או בטמפרטורת התגובה עלולה לפגוע קשות בטוהר הרדיוכימי ובתפוקה של [18F]AV-45. שנית, יישור סטריאוטאקסי מדויק במהלך הדמיית PET הוא קריטי כדי למנוע השפעות של נפח חלקי, שעלולות להטות באופן מלאכותי את חישובי SUVR באזורים קטנים של היפוקמפוס בעכברים. לפתרון בעיות של יחסי אות לרעש נמוכים בתמונות PET, החוקרים צריכים לאמת את הפעילות הספציפית של המעקב המוזרק ולוודא שעומק ההרדמה האיזופלורני נשאר יציב, שכן תנועת הנשימה עלולה לטשטש תמונות.

לשיטה זו יש מגבלות מסוימות. בעוד שהמיקרו-PET AV-45 מספק מבט מקרוסקופי על עומס Aβ אזורי, הרזולוציה המרחבית שלו אינה מאפשרת הדמיה של פלאקים עמילואידים מיקרוסקופיים בודדים. יתרה מזאת, ההתערבות האלקטרואקופונקטורה בת 15 הימים שיושמה במחקר זה הראתה הפחתה משמעותית בעומס Aβ בהשוואה לעכברים עם AD שלא טופלו; עם זאת, בהתחשב בכך שניקוי מלא של פלאקי Aβ מבוססים דורש בדרך כלל חודשים של התערבות ממושכת, הפרדיגמה הנוכחית משקפת בעיקר מודולציה מוקדמת של דינמיקת Aβ מסיסה או עצירה של הפקדה הדרגתית במקום פינוי מלא של פלאק מבני. בנוסף, קבלת סריקות PET לפני ואחרי ההתערבות באותו נבדק תספק שליטה אורכית חזקה יותר, אסטרטגיה שיש לאמץ בעיצובים ניסיוניים עתידיים.

לסיכום, תוצאות מחקר זה מצביעות על כך שהתערבות אלקטרואקפונקטורה (EA) מפחיתה משמעותית את הצטברות Aβ ומשמרת על תפקוד קוגניטיבי מרחבי בעכברי APP/PS1. הבסיס המכניסטי לשיפור זה עשוי להיות קשור להשפעות הנוירומודולטוריות של נקודות דיקור21 של כלי המנהל (Du Mai), אשר קושרו אנטומית לרשתות פאסיאליות ונוירו-וסקולריות המקדמות זרימת דם ראשית ונתיבי ניקוי. באמצעות מתן ראיות מדימות מולקולריות חזקות וכמותיות, פרוטוקול זה מדגיש את חשיבות השילוב בין שיטות טיפוליות מסורתיות לבין הדמיה מוחית מתקדמת. מסגרת מתודולוגית זו סוללת את הדרך לחקירות מעמיקות יותר על מסלולי הטיפול של דיקור סיני במאבק ב-AD.

גילויים

כל המחברים הצהירו על ניגודי עניינים פוטנציאליים.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' 82004482, 82274654, 82274644), קרן המדע הטבעי של בייג'ינג (מס' 7252219), וקרן טיפוח החדשנות של המרכז הרפואי השישי של בית החולים הכללי של צבא שחרור העם (מס' CXPY202405). אנו מודים ל-Biorender (biorender.com) על סיפקתם את כלי הגרפיקה בהם השתמשו במחקר זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
[18F]AV-45מעבדת הרדיופרמצבטיקה של אוניברסיטת בייג'ינג נורמל— —המעקב הנפוץ ביותר בתעשייה
0.22 & mu; m ממברנת PVDFביוטייםFFP71העברת סרט יעילה
15% SDS-PAGE ג'לביוטייםP0066מעכבים את נדידת חלבוני מולקולות קטנות
5× בופר טעינה של SDSביוטייםP0015ודא פסים ברורים והפרדה מדויקת.
עכברי APP/PS1 זכרים בני 6 חודשיםחברת מחקר בעלי החיים הלבוטטורי קוונברג (סוז'ואו) בע"מ.SCXK (Su) 2018-0002בשימוש נרחב למחקר מחלת אלצהיימר.
 
עכברים זכרים בני 6 חודשים C57BL/6חברת מחקר בעלי החיים הלבוטטורי קוונברג (סוז'ואו) בע"מ.SCXK (Su) 2018-0002עבור קבוצת הביקורת הנורמלית
Aβ נוגדןפרוטינטק25524-1-APזיהוי A ובטא; מונומר
מחטי דיקור סטריליות חד-פעמיותג'ונגיאן טאי הה מדיקל אינסטרומנט בע"מZYTH2013030504כלי דיקור נפוצים
מצע ECLתרמו פישר (פירס)  32106 (500 מ"ל)זיהוי חלבוני מטרה
מכשיר אלקטרואקפונקטורה (EA)בייג'ינג Huawei Industrial Development Co., Ltd.HANSLH202ציוד אלקטרואקפונקטורה נפוץ בסין
GAPDHפרוטינטק23567-1-CBחלבון רפרנס קלאסי (1:5000)
נוגדן משני מצומד ל-HRPתרמו פישר סיינטיפיק (Invitrogen)31430 (2 מ"ל) / C31430100 (100μ L)זיהוי חלבוני מטרה (1:2000)
תוכנת ImageJNIH  גרסה 1.53aניתוח ערכי גווני אפור ברצועות
איזופלוראןקנטאור30135687 (250 מ"ל)הרדמה בטוחה ומהירה של עכברים
PET-CTמערכת הדמיה של IRIS PET/CTאיריסרגישות גבוהה ל-PET וביצועים כמותיים מצוינים
קוקטייל מעכב פוספטאזביוטייםP0055Bשמירה על מצב הזרחון של החלבונים
תוכנת PMODטכנולוגיות PMOD  גרסה 4.5 משמש ל  עיבוד וניתוח נתוני תמונת PET
סמן משקל מולקולרית של חלבון מוצבע מראשתרמו פישר (פירס)26619 (פעמיים; 250 ומיקרו; L) ניטור אלקטרופורזה והעברת ממברנה 
קוקטייל מעכב פרוטאזביוטייםP1046עיכוב רחב טווח של פעילות פרוטאז אנדוגנית
מאגר ניתוק RIPAביוטייםP0013Cשמירה על שינוי בזרחון חלבונים
אבקת חלב רזה המשמשת במכשיר מבוך המים של מוריסיילי6907992637815להפוך את המים לאטומים ולהסתיר פלטפורמות תת-מימיות
מערכת מבוך המים של מוריסחברת התוכנה צ'נגדו טיימנג, בע"מ.WMT-100Sציוד מבוך מים נפוץ בסין

מקורות

  1. Chiotis, K., Wang, Y., La Joie, R., Rabinovici, G. D. The role of amyloid-β and tau PET in the new era of Alzheimer disease therapies. J Nucl Med. 67 (2), 175-185 (2026).
  2. Zhao, Q., et al. Unraveling Alzheimer's complexity with a distinct Aβ42 fibril type and specific AV-45 binding. Nat Chem Biol. 22 (3), 482-490 (2025).
  3. Machado, L. S., et al. Association between FDG- and TSPO-PET signals across human and animal studies investigating neurodegenerative conditions: a systematic review. Mol Psychiatry. 31 (1), 559-575 (2025).
  4. Yin, H., Lu, Z., Deng, Y., Tian, X., Gong, Q. Decoding blood-brain barrier dysfunction in Alzheimer's disease: innovations and challenges in multimodal MRI and PET imaging biomarkers. Ageing Res Rev. 114, 102952(2025).
  5. Sun, R. -Q., et al. Improvement of electroacupuncture on APP/PS1 transgenic mice in behavioral probably due to reducing deposition of Aβ in hippocampus. Anat Rec (Hoboken). 304 (11), 2521-2530 (2021).
  6. Lakatos, I., et al. AI-driven framework for enhanced and automated behavioral analysis in Morris water maze studies. Sensors (Basel). 25 (5), 1564(2025).
  7. Zha, Z., Ploessl, K., Choi, S. R., Alexoff, D., Kung, H. F. Preclinical evaluation of [18F]D3FSP, deuterated AV-45, for imaging of β-amyloid in the brain. Nucl Med Biol. 92, 97-106 (2020).
  8. Wong, D. F., et al. In vivo imaging of amyloid deposition in Alzheimer disease using the radioligand 18F-AV-45 (florbetapir [corrected] F 18). J Nucl Med. 51 (6), 913-920 (2010).
  9. Almeida, Z. L., Vaz, D. C., Brito, R. M. M. Morphological and molecular profiling of amyloid-β species in Alzheimer's pathogenesis. Mol Neurobiol. 62 (4), 4391-4419 (2024).
  10. Naganuma, F., et al. A novel near-infrared fluorescence probe THK-565 enables in vivo detection of amyloid deposits in Alzheimer's disease mouse model. Mol Imaging Biol. 25 (6), 1115-1124 (2023).
  11. Kim, E., et al. In vivo multi-parametric manganese-enhanced MRI for detecting amyloid plaques in rodent models of Alzheimer's disease. Sci Rep. 11 (1), 12419(2021).
  12. van Dyck, C. H., et al. Lecanemab in early Alzheimer's disease. N Engl J Med. 388 (1), 9-21 (2022).
  13. Masdeu, J. C., Pascual, B., Fujita, M. Imaging neuroinflammation in neurodegenerative disorders. J Nucl Med. 63 (Suppl 1), 45S-52S (2022).
  14. Zhan, Y., et al. Hybrid PET/MRI imaging of Alzheimer's disease based on 18F-AV-1451. J Vis Exp. (218), e67574(2025).
  15. Lopresti, B. J., et al. Simplified quantification of Pittsburgh compound B amyloid imaging PET studies: a comparative analysis. J Nucl Med. 46 (12), 1959-1972 (2005).
  16. Herschman, H. R. Micro-PET imaging and small animal models of disease. Curr Opin Immunol. 15 (4), 378-384 (2003).
  17. Patwardhan, M. B., McCrory, D. C., Matchar, D. B., Samsa, G. P., Rutschmann, O. T. Alzheimer disease: operating characteristics of PET–a meta-analysis. Radiology. 231 (1), 73-80 (2004).
  18. Mintun, M. A., et al. [11C]PIB in a nondemented population: potential antecedent marker of Alzheimer disease. Neurology. 67 (3), 446-452 (2006).
  19. Romano, M., Buratti, E. Florbetapir F 18 for brain imaging of β-amyloid plaques. Drugs Today (Barc). 49 (3), 181-193 (2013).
  20. Choi, S. R., et al. Preclinical properties of 18F-AV-45: a PET agent for Abeta plaques in the brain. J Nucl Med. 50 (11), 1887-1894 (2009).
  21. Wang, G. -J., Ayati, M. H., Zhang, W. -B. Meridian studies in China: a systematic review. J Acupunct Meridian Stud. 3 (1), 1-9 (2010).

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

דימות Micro-PETשקיעת עמילואיד בטאאלקטרו-אקופונקטורהמבוך המים של מוריסWestern Blotליקוי קוגניטיבידימות מולקולרי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.