חקירת מיקרו-סביבת השחלות: שיטות לבידוד, תרבית דו-ממדית ותרבות אורגנואידית של תאי סומטיקה בשחלות בעכברים

סיכום

אנו מתארים שיטות לבידוד תאי סומטיקה של שחלות העכבר מחלק מועשר בסטרומה של השחלה וליצירת אורגנואידים סומטיים של שחלות העכבר בגישה ללא פיגומים.

תקציר

השחלה מורכבת מאוכלוסיות הטרוגניות של תאים סומטיים, הן בתוך הזקיק והן בתוך הסטרומה הסובבת, שהם קריטיים לתמיכה בתפקוד השחלה וליצירת גמטות איכותיות. אנו מדווחים על שיטות לבידוד תאים סומטיים משחלות עכבר, כולל אנדותל, אפיתליאלי, סטרואידוגניים, סטרומליים ותאי חיסון. כאשר תאים סומטיים ראשוניים אלה מצופים ומתרבתים במערכת תרבית דו-ממדית מסורתית, ההטרוגניות, הארגון התאים, וכן האינטראקציות בין תא לתא ומטריקס תאים, שבדרך כלל נמצאים בשחלה, אובדים. לכן, אנו גם מתארים כיצד ליצור אורגנואידים סומטיים של שחלות בעכבר בגישה ללא פיגום. אורגנואידים אלו מתאספים בעצמם, שומרים על אוכלוסיות תאים מגוונות ומייצרים מטריצה חוץ-תאית וגורמים מופרשים, כולל ציטוקינים. אורגנואידים יכולים לשמש לניסויי קו-קולטורה וניתן לשמר אותם בתרבות לפחות 3 שבועות עם חיוניות גבוהה. בסך הכול, מודלים אלו מאפשרים בחינה של פיזיולוגיית השחלות והפתולוגיה מנקודת מבט של התא הסומטי.

מבוא

למרות שהביצית, או הגמטה הנקבית, חיונית להולדת הדור הבא, אוכלוסיות התאים הסומטיים בשחלה ממלאות תפקידים קריטיים בהתפתחות הגמטות, ייצור הורמוני סטרואידים וההומאוסטזיס של השחלות. ביציות, המוקפות בתאי גרנולוזה סומטיים ותאקה, מהוות את היחידות התפקודיות של השחלה הידועות כזקיקים. תאי גרנולוזה מחוברים פיזית לביצית באמצעות הקרנות טרנס-אזוריות ומספקים תמיכה מטבולית ותזונתית לביצית בנוסף לוויסות עצירה מיוטית ^1,2. יתרה מזאת, בתגובה לגונדוטרופינים, תאי גרנולוזה ותקה מייצרים הורמוני סטרואידים, כולל אסטרוגן, פרוגסטרון ואנדרוגנים, שיש להם השפעות מעבר למערכת הרבייה, המשפיעות על מערכת הלב-כלי הדם, מערכת השרירים והעצבים, ובכך משפיעות על בריאות האישה הכללית³. זקיקי שחלה מתפתחים בתוך סטומה שחלתית הטרוגנית המורכבת מכלי דם, תאי חיסון, מספר אוכלוסיות של פיברובלסטים בין-תאי תאי מזנכימיים, וכן מטריצה חוץ-תאית מסודרת מאוד (^ECM)4. מיקרו-סביבה סטרומלית זו מספקת רמזים פיזיקליים וכימיים המשפיעים על צמיחת הזקיקים, הביוץ והלוטאיניזציה⁴.

קיימות מספר שיטות לבידוד וטיפוח גמטות וזקיקים במבחנה, ושיטות אלו קידמו את הבנתנו לגבי אוגנזה ופוליקולוגנזה⁵. עם זאת, החלק הסומטי של השחלה נחקר באופן מועט, בין היתר בשל היעדר מודלים עמידים במבחנה. המודלים הנוכחיים של תא הסומטי בשחלה מוגבלים ברובם לסוג תא יחיד, כגון פיברובלסטים, אפיתל משטח השחלות, אנדותליאל, חיסון או תאי גרנולוזה 6,7,8,9,10,11. תרבית של תאים סומטיים ראשוניים של שחלות מוגדרות באופן רחב ב-2D מעדיפה אוכלוסיות מקרופאגים לאורך זמן, מה שמוביל לאובדן הטרוגניות התאית¹². יתרה מזאת, תרבית מונו-שכבתית דו-ממדית מסורתית (2D) אינה מאפשרת את האינטראקציות המגוונות בין תא לתא ולמטריצת תא הקיימות בשחלה. צמחי רקמת השחלה שומרים על המורכבות התאית והמבנית של הרקמה המקומית אך משתנים בהרכבם בהתאם למקום בו הם נגזרו^13,14.

אורגנואידים הם גרסאות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות), רב-תאיות, מוקטנות של איברים או רקמות שמופיעות מחדש בארגון ופונקציות ב-vivo ^15,16. אורגנואידים יכולים להיווצר מתאי גזע או תאים ראשוניים המבודדים מרקמה תקינה או חולה¹⁵. בהקשר של מערכת הרבייה הנשית, נוצרו אורגנואידים כדי לדגם את רירית הרחם, החצוצרה, צוואר הרחם והשליה¹⁷. עם זאת, ביחס לשחלה, עד לאחרונה, מודלים אורגנואידיים היו מוגבלים לסוג תא יחיד, כגון אפיתל פני השטח של השחלה או תאי סרטן, או שנוצרו מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים כדי להידמות למבני זקיקים ולא לסטומה של השחלה^17,18. מחקרים עדכניים יצרו ואפיינו אורגנואידים באמצעות אוכלוסיות הטרוגניות של תאים סומטיים שבודדו מרקמת עכבר, מקאק רזוס ורקמת שחלות אנושית 19,20,21. מודלים אורגנואידיים אלו אפשרו חקירה של המנגנונים התאיים שמאחורי הזדקנות השחלות, וכן את השפעות החשיפה לפתלאט על הרכב ECM^19,21.

בהתחשב בחשיבות הקריטית של תאים סומטיים, הן בזקיק והן בסטרומה, לתפקוד השחלות, אנו מתארים שיטות לבידוד תאים סומטיים מחלק מעשיר בסטרומה של שחלות עכברים ולגידולם במבחנה באמצעות תרבית מונו-שכבתית מסורתית או במודל אורגנואידי. באמצעות מיקרומולדים ללא פיגום, תאי הסומטיקה של השחלה יוצרים אורגנואידים בתוך 1–3 ימים. אורגנואידים שומרים על אוכלוסיות תאי שחלה מרכזיות, כולל פיברובלסטים, מקרופאגים ותאים סטרואידוגניים, וניתן לתרבית עד 3 שבועות עם חיוניות גבוהה. אורגנואידים סומטיים של שחלות תורמים להערכות טרנסקריפטומיות והיסטולוגיות, ניתוח מדיה מותנית, קו-קולטורציה עם סוגי תאים אחרים ושיטות סקר מורכבות. בסך הכול, אורגנואידים אלו מהווים מודל איתן לחקירת חוץ-גופית ומודולציה של מחלקת הסומטיקה של השחלה, וניתן ליישם אותם לחקר התפתחות השחלות, הזדקנות, פיזיולוגיה ופתולוגיה.

פרוטוקול

השימוש בבעלי חיים לפיתוח פרוטוקול זה נעשה בהתאם לוועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדית באוניברסיטת נורת'ווסטרן ולהנחיות המכון הלאומי לבריאות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה (מספר הבטחת רווחת בעלי חיים של אוניברסיטת נורת'ווסטרן: A3283-01; מזהה פרוטוקול IACUC: IS00013082_IM12). מידע על היצרן ומספרי קטלוג לכל החומרים, כולל יציקות סיליקון למיקרותבניות אגרוז, מדיה ותוספים, מופיעים בטבלת החומרים. סקירה של שלבי הפרוטוקול מוצגת באיור 1. כל שלבי הפרוטוקול צריכים להתבצע באמצעות ציוד מגן אישי מתאים, בהתאם לכל תקנות הבטיחות הביולוגית והסביבה המוסדית, ואלא אם צוין אחרת, במסגרת ארון בטיחות ביולוגית מסוג Class II.

איור 1: סכמטי של בידוד תאי סומטיקה בשחלת, יצירת אורגנואידים סומטיים בשחלת, ויישומים במורד הזרם. שחלות העכברים מבודדות והחלק הסטרומלי מועשר. החלק הסטרומלי המועשר מתעכל אנזימטית ומכנית. רקמה לא מעוכלת נלחמת החוצה. תאים עוברים פלט, שטופים, נספרים וציפוי לתרבות דו-ממדית. לצורך יצירת אורגנואידים, לאחר תרבית דו-ממדית במהלך הלילה, תאים נקצרים באמצעות טריפסין ומפוזרים, נשטפים ונספרים. תאים מוזרעים למיקרותבניות אגרוז לצורך תרבית אורגנואידים. אורגנואידים יכולים לשמש להיסטולוגיה, הפקת RNA/חלבונים, ניתוח מדיה מותנית, טיפולים, סקר תרופות, וכן לקולטורה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

1. הכנת מדיום לבידוד ותרבות של תאי סומטיקה בשחלות

הערה: עיכול רקמת השחלה ובידוד ותרבות של תאים סומטיים ראשוניים דורשים ארבעה סוגי מדיום: מדיום ניתוח (DM; משמש בשלבים 2.3–2.4 לכריתה ונקירה של שחלות עכבר), מדיום אנזימטי (EM; משמש בשלבים 2.5–2.8 לעיכול אנזימטי של שחלות עכברים מועשרות בסטומה), מדיום הקפאה (QM; שימש בשלב 2.9 להאטת עיכול אנזימטי), ומדיית ציפוי (PM; שימשה בשלבים 2.11–2.14 ושלב 4.6 לשטיפה, ציפוי ותרבות דו-ממדית של תאים סומטיים ראשוניים בשחלה, וכן להפסקת טריפסין בעת איסוף התאים מתרבות דו-ממדית). כל המדיה צריכה להיות מוכנה בארון בטיחות ביולוגי מחוטא מסוג Class II או במכסה זרימה למינרי. מתכוני המדיה המפורטים להלן מספיקים לעיבוד שחלות של 5–6 עכברים, אך יש להגדיל אותם לפי הצורך. כל המדיה ניתנת להכנת עד שבוע מראש ולאחסון בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, אך יש להוסיף את האנזימים ל-EM טריים ביום הבידוד של התאים.

1. הכינו DM (15 מ"ל) המכיל 1% סרום בקר עוברי (FBS) ו-0.5% פניצילין-סטרפטומיצין (PS) במדיום L-15 של לייבוביץ'. סטריליזציה של המדיה באמצעות פילטר סטרילי.
   הערה: DM מאוחסן לצורך חילופי אוויר סביבתיים ומשמש במהלך מיקרודיסציה של השחלה מרקמות סמוכות, וכן להעשרת החלק הסטרומלי.
2. הכינו EM (10 מ"ל) שמכיל 1% FBS ו-0.5% PS ב-αMEM. הוסף 82 יחידות אנזימטיות למיל"ר קולגנאז IV ו-0.2 מ"ג/מ"ל של DNase I (≥400 יחידות פעילות אנזימטית/מ"ג). המיס את האנזימים על ידי הפיכת המדיה ואז סטריליזציה באמצעות פילטר סטרילי.
   הערה: מדיום אנזימטי הוא נתרן ביקרבונט לצורך חילופי אוויר ב-5%_CO2 ומשמש לעיכול אנזימטי של חלקי רקמת השחלות.
3. הכינו QM (20 מ"ל) המכיל 10% FBS ו-0.5% PS במדיום αMEM. סטריליזציה של המדיה באמצעות פילטר סטרילי.
   הערה: QM הוא נתרן ביקרבונט להחלפת אוויר ב-5%_CO2 ומשמש לכיבוי העיכול האנזימטי.
4. הכן PM (30 מ"ל) שמכיל 10% FBS ו-1% PS ב-RPMI 1640 (המכיל 25 mM HEPES ו-2 mM L-גלוטמין). סטריליזציה של המדיה באמצעות פילטר סטרילי.
   הערה: PM הוא ביקרבונט נתרן להחלפת אוויר ב-5%_CO2 ומשמש לציפוי תאי סומטיקה ראשוניים בשחלה, וכן לתרבית דו-ממדית.

2. עיכול רקמת השחלה ובידוד תאים סומטיים ראשוניים

הערה: שחלות העכברים מבודדות ומתעכמות הן אנזימטית והן מכנית כדי לבודד תאים סומטיים ראשוניים. שחלות של 5–6 עכברים יכולות להיות מעובדות יחד באותה צלחת. השלבים הבאים צריכים להתבצע בטכניקת אספטי, רצוי באמצעות מיקרוסקופ ניתוח במכסה זרימה למינרי.

1. הוסף 10 מ"ל אלקטרומגנטית, 20 מ"ל QM ו-20 מ"ל PM לצלחות פטרי נפרדות של 100 מ"מ. איזון הכלים באינקובטור תרבית רקמה (סביבה לחה, 37°C עם 5%_CO2) למשך לפחות שעה לפני השימוש.
2. חמים את ה-DM באמבט מים (37 מעלות צלזיוס) לפני השימוש.
3. נתח את שחלות העכברים לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ המכילה 3 מ"ל DM. הפרדו את השחלות מרקמת השומן, מהבוץ והבורסה השחלתית המצורפת באמצעות מלקחיים דקים ו/או מיקרוסיסורים (איור 2Ai,ii). השתמש במיקרוסקופ ניתוח לפי הצורך למיקרודיסקציה.
4. העבר את השחלות המנותקות לזכוכית שעון בקוטר 45 מ"מ עם 2–3 מ"ל DM. תחת מיקרוסקופ ניתוח, עגנו ודקרו את כל אזורי השחלות באמצעות מחטים אינסולין 28-G עם הידיים הלא דומיננטיות והדומיננטיות, בהתאמה, למשך כ-10 דקות. סובבו לעיתים קרובות את רקמת השחלה כדי לוודא שכל האזורים מופרעים.
   הערה: ניקוב השחלות מעשיר את החלק הסטרומלי על ידי שחרור זקיקים פרה-אנטרוליים וכן קומפלקסים קומולוס-ביציות ותאי גרנולוזה מזקיקי אנטרל (איור 2Aiii–iv).
5. השתמשו במלקחיים דקים כדי להזיז שחלות עכברים מועשרות בסטרומה לצלחת פטרי עם EM מאוזן (איור 2Bi).
6. בעבודה מהירה כדי למזער שינויים בטמפרטורה וב-pH במדיה, קורעים את השחלות המועשרות בסטרומה לחלקים של כ-2–3 מ"מ עם מלקחיים דקים (איור 2Bii).
7. החזק את צלחת הפטרי בזווית והפיץ שוב ושוב פיפטות EM המכילות חלקי רקמת שחלה עם פיפטה p1000, מכוונים ל-1 מ"ל, 100× או למשך 3 דקות, המוקדם מביניהם (איור 2Biii). סובבו את צלחת הפטרי לפי הצורך כדי לוודא שכל חלקי הטישו מקבלים פיפט.
   הערה: אם הרקמה גדולה מדי לפיפט עם קצה p1000, ניתן לחתוך את הקצה באמצעות סכין סטרילית כדי להרחיב את הפתח. הקדח צריך להיות רחב מספיק כדי לאפשר לרוב (>50%), אך לא את כל, חלקי הרקמה להיכנס, וליצור אפקט גזירה.
8. העבר את צלחת הפטרי המכילה חלקי EM ורקמת שחלה לאינקובטור תרבית רקמה (סביבה לחה, 37°C עם 5% CO₂) ודגירה למשך סך הכל 30 דקות, הסרת הצלחת ופיפטינג שוב ושוב (100× או 3 דקות) לאחר 15 דקות, ואז שוב בסיום הדגירה של 30 דקות (איור 2Biii).
   הערה: לאחר 15 הדקות הראשונות של דגירה, יש לעכל את חלקי הרקמה מספיק כך ש->80% מהם ייכנסו דרך קצה פיפטה p1000 בלי צורך לחתוך את הקצה כדי להרחיב את הפתח. משך העיכול הכולל וכמות הפיפטינג הנדרשת תלויים בגודל ההתחלתי של חתיכות הרקמה הקרועות. יתרה מזאת, הגיל והעומס של העכבר, השונות הכפולה בפעילות האנזימים וגודל קדר הפיפטה יכולים כולם להשפיע על קצב פירוק הרקמות. יש לכבות את העיכול כאשר חלקי רקמת השחלה מפורקים לשברים בגודל של כ-1 מ"מ שעדיין נראים בעין (איור 2Biv). עיכול יתר עלול לגרום לאובדן תאים ולירידה בחיוניות התאים.
9. דיללו את האנזימים כדי להאט את עיכול הרקמות על ידי הוספת 20 מ"ל של מכון קוונומנט מאוזן מראש (איור 2Ci).
10. העבר את תליית התא דרך מסננת תא בגודל 40 מיקרון המונחת מעל צינור חרוטי של 50 מ"ל להסרת חלקי רקמה לא מעוכלים (איור 2Cii). צנטריפוגה את הסינון ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להפיל את התאים (איור 2Ciii).
11. שטיפת התאים על ידי הסרת הסופרנטנט באמצעות שאיבה, השעיית הכדור של התא ב-1 מ"ל של PM מאוזן מראש, העברת תליית התא לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל, וצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להחזיר את התאים (איור 2Civ).
12. הסר את הסופרנאנט, החזיר את כדור התא ב-1 מ"ל PM, צביע 10 מיקרו-ליטר אליקווט של תאים בכחול טרייפן כדי להעריך את חיוניות התאים, וסופר את התאים באמצעות המוציטומטר.
    הערה: ראו טבלה 1 למספרים צפויים של תאי סומטיקה ראשוניים בשחלה, בהתאם לזן ולגיל העכבר, בשלב זה של פרוטוקול הבידוד. חיוניות התאים בשלב זה צריכה להיות >80%.
13. לוחות את התאים על כלי שטופל בתרבות רקמה בצפיפות של כ-1.25 × 10 5-1.5 × 10⁵/ס"^{מ (}למשל, לספירות תאים של כ-3 × 10⁶, תאי לוחות על צלחת של 60 מ"מ שטופלה בתרבות רקמה, ולספירות תאים של כ-1 × 10⁶, תאי לוחות על באר אחת של צלחת 6 בארות שטופלה בתרבות רקמה).
    1. הוסף PM נוסף בהתאם לנפח הכולל של הצלחת או הצלחת (למשל, להוסיף 4 מ"ל PM אם משתמשים בצלחת 60 מ"מ או 2 מ"ל PM אם משתמשים בבאר של צלחת 6 בארות).
       הערה: צפיפות הציפוי שצוינה לעיל מומלצת אם התאים ישמשו ליצירת אורגנידים לאחר תרבית דו-ממדית במהלך הלילה. לתרבית דו-ממדית ארוכה יותר, ניתן לצפות תאים בצפיפות נמוכה יותר. מדיית ציפוי נוספת שלא התאזנה יכולה להיאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע. PM נדרש הן ליצירת אורגנואידים והן לשמירה על תאים סומטיים של השחלה בתרבות דו-ממדית. בשלב זה בפרוטוקול, ניתן לשמור על תאי הסומטיקה של השחלה בתרבות חד-שכבתית דו-ממדית (שלב 2.14) או לשמש ליצירת אורגנואידים (המשך לסעיף 3). תרבית דו-ממדית במהלך הלילה לפני יצירת אורגנואידים נחוצה כדי להסיר ביציות מהזקיקים בשלב מוקדם שעברו דרך מסננת התאים בגודל 40 מיקרון.
14. לאחר השריון בלילה (מינימום 16 שעות), שטפו את התאים עם מלח מפופר פוספט (PBS; Mg/Ca-free, pH 7.0–7.3) להסרת תאים מתים ופסולת (איור 3A). הוסיפו PM טרי אחרי הכביסה והחליפו מדיה ב-PM טרי כל יומיים לאורך התרבות (איור 3B).
    הערה: למרות עמידות תאים גבוהה לאחר הבידוד, בדרך כלל נצפית ירידה גדולה במספר התאים הכולל לאחר השריון בלילה עקב מוות תאים או חוסר יכולת להיצמד לכלי תרבית הרקמה (איור 3A).

איור 2: סכמטי של בידוד תאי סומטיקה בשחלות בעכברים. (A) תמונות מייצגות של (i,ii) כריתת שחלות בעכברים ו-(iii,iv) העשרת סטרומה. שחלת העכבר מסומנת בקו מקווקו ב-Ai. (B) תמונות מייצגות של חלקי רקמת השחלה לאורך העיכול המכני והאנזימטי. שחלות מועשירות בסטרומה (i) לפני ו-(ii) אחרי קריעה, (iii) חתיכות רקמת שחלה במהלך פיפטינג, ו-(iv) חתיכות רקמת שחלה לאחר העיכול. (ג) תמונות מייצגות של (i) כיבוי העיכול, (ii) סינון תליית התא, ו-(iii,iv) פלט של תאי השחלה הראשוניים של העכבר. השקעות ב-Cii ו-Ciii מראות חלקי רקמה לא מעוכלים שנתפסו על ידי מסננת התא וכדור התא לאחר הצנטריפוגה, בהתאמה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: תאים סומטיים ראשוניים בשחלה ניתנים לתרבית דו-ממדית. (א) תמונות אור משודרות של תאי הסומטיקה הראשוניים של השחלות שהוצפו בצלחת 60 מ"מ 16 שעות לאחר הציפוי, לפני ואחרי השטיפה עם PBS. (ב) תמונות אור משודרות של תאי הסומטיקה הראשוניים בשחלת, מצופות בלוח בן 24 בארות במשך 3 ימים בתרבית. פסי קנה מידה = 400 מיקרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

3. הכנת מיקרו-תבניות ומדיה של אגרוז ליצירת אורגנים ותרבות

הערה: אורגנואידים סומטיים של שחלות נוצרים ומגודלים במיקרותבניות אגרוז ללא פיגום עם מדיה אורגנואידית שחלתית. מיקרו-תבניות אגרוז ומדיה אורגנואידית שחלתית יש להכין בטכניקה אספטית בארון בטיחות ביולוגי מחוטא מסוג II או במכסה זרימה למינרי.

1. הכנת מיקרו-תבניות אגרוז
   1. הניחו יציקות סיליקון למיקרומולדים ומלקסי גראף לתוך שקית עיקור ואוטוקלב באמצעות מחזור יבש לעיקור (לחץ מעטפת: 20 psi, טמפרטורת תא: 250°F (121.11°C), זמן עיקור: 15 דקות).
      הערה: מספר יציקות סיליקון ניתנות לאוטוקלאב ולהשתמש בו זמנית ליצירת מיקרותבניות אגרוז במהירות גבוהה יותר.
   2. הוסף 1 מ"ל PBS המכיל 1% PS לכל באר בפלטת תרבית רקמה בת 24 בארות לאחסון תבניות המיקרו-אגרוז.
   3. המיס 1.5% (w/v) אגרוז סטרילי ב-PBS על ידי חימום במיקרוגל, באמבט מים חמים או על פלטה חמה.
      הערה: המסה של האגרוז על ידי חימום במיקרוגל בצינור קוני בנפח 50 מ"ל המונח בכוס של 100 מ"ל מלאה במים עובדת היטב (איור 4Ai). בנוסף לאפשרות הרתיחה מבוקרת, אמבט המים החמים שנוצר בכוס מאט את ההתמצקות המחודשת של האגרוז.
   4. אפשר לאגרוז הנוזלי להתקרר לכ-50 מעלות צלזיוס עד שניתן יהיה לטפל בצינור בנוחות.
   5. בהדרגה הפיפטה של 300–350 מיקרוליטר של 1.5% אגרוז לתוך יציקת הסיליקון, תוך שמירה על לא מילוי יתר או מילוי חלקי היציקה והימנעות מיצירת בועות (איור 4Aii). ודא שהאגרוז יוצר שכבה שטוחה בחלק העליון של היציקה במקום קצה קעור או קמור (איור 4Aiii,iv). פוצץ בועות באמצעות קצה פיפטה סטרילי מסוג p10 לפני שהאגרוז מתחיל להתקשות (איור 4Bi–iii).
   6. אפשר לאגרוז להתגבש ביציקת הסיליקון למשך 2–3 דקות בטמפרטורת החדר (איור 4Biv).
   7. לאחר שהתקשה, הפכו את יציקת הסיליקון מעל באר של לוח תרביות רקמה בת 24 בארות המכיל PBS + 1% PS. כופפו בזהירות את הסיליקון כדי לשחרר את המיקרו-תבנית של האגרוז לתוך הלוח (איור 4Ci).
      הערה: מיקרו-תבניות אגרוז הטבועות ב-PBS +1% PS בפלטת תרבית רקמה בת 24 בארות עטופה בפראפילם יכולות להיאחסן בטמפרטורה של 4°C עד חודש לפני השימוש (איור 4Cii). מיקרו-תבניות אגרוז צריכות להיות מוכנות לפחות 16 שעות לפני השימוש, שכן מיקרובארות מכילות לעיתים קרובות בועות אוויר מיד לאחר היציקה והטבילה ב-PBS + 1% PS (איור 4Ciii). עם זאת, בועות אוויר אלו מתפזרות במהלך האחסון (איור 4Civ). לפני השימוש בתרבות אורגנואידים, יש לבדוק בקפידה את המיקרובארות של אגרוז תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שמיקרובארות לא התמזגו או הופרעו במהלך היציקה (איור 4Di–iv). מיקרו-תבניות פגומות אינן מומלצות לייצור ותרבות של אורגנואידים. מומלץ להיות מוכנים עודף של מיקרומולד אגרוז כדי להסביר ~25% מהם יהיו פגמים
2. הכנת מדיה אורגנואידית שחלתית
   1. בארון בטיחות ביולוגית, הוסיפו תוספים של מדיום גדילה אורגנואידי (עכבר) 1 ו-2 ו-1% PS למדיום הבסיסי לפי הוראות היצרן. אחסן את המדיה האורגנואידית של השחלות המוכנה בטמפרטורה של 4°C עד שבועיים לפני השימוש.
      הערה: תוספים 1 ו-2 יכולים להיות מאוחסנים בטמפרטורה של -20°C.

איור 4: הצגת הכנה סכמטית של מיקרותבניות אגרוז. (א) תמונות מייצגות של (i) הכנת אגרוז ב-1.5%, (ii) פיפטינג ליציקות סיליקון, (iii) מילוי נכון, ו-(iv) יציקות סיליקון מלאות יתר על המידה. קווים מקווקו ב-Aiii ו-AIV מציגים תחתית שטוחה וקמורה של מיקרותבניות אגרוז, בהתאמה. (ב) תמונות מייצגות של (i,ii) יציקות סיליקון מלאות בועות באגרוז, (iii) פיצוץ בועות עם קצה פיפטה לפני ההתמצקות של האגרוז, ו-(iv) מיקרו-תבנית אגרוזית מוצקה בתוך יציקת הסיליקון. (ג) תמונות מייצגות של (i) הסרת מיקרותבניות אגרוז מוצקות מיציקות סיליקון, (ii) אחסון מיקרותבניות אגרוז בלוח עם 24 בארות המכילה PBS + 1% PS, (iii) בועות שנמצאות במיקרובארות מיד לאחר היציקה, ו-(iv) מיקרומולד אגרוז יצוק כראוי ללא בועות לאחר 16 שעות אחסון. (ד) תמונות מייצגות של מיקרומולדים עם (i,ii) בארות משולבות, (iii) בארות מופרעות, או (iv) נזק. קיצורים: PBS = סליין-מלח עם בופר פוספט; PS = פניצילין-סטרפטומיצין. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

4. יצירה ותרבות של אורגנואידים

הערה: לאחר תרבית דו-ממדית במהלך הלילה, תאים סומטיים ראשוניים בשחלות נקצרים מהתרבית הדו-ממדית ומוזרעים למיקרו-תבניות אגרוז ליצירת אורגנואידים. השלבים הבאים צריכים להתבצע בטכניקת אספטיקה בארון בטיחות ביולוגי מחוטא מסוג II.

1. חום PM ומדיה אורגנואיד ל-37 מעלות צלזיוס באמבט מים וחם 0.05% טריפסין לטמפרטורת החדר.
2. באמצעות מלקחיים גראפה, העבירו בזהירות את המיקרו-תבניות לבארות של לוח חדש עם 24 בארות (איור 5Ai).
3. הוסף 500 מיקרוליטר של מדיה אורגנואידית שחלתית לכל באר של לוח 24 בארות המכיל מיקרו-מובלד אגרוז (איור 5Aii). ודא שמיקרותבניות טבועות לחלוטין במדיה ואיזון את המיקרותבניות והמדיה לפחות 30 דקות בתנור (סביבה לחה, 37°C עם 5%_CO2).
4. הסר את PM מתאי הסומטיקה הדבוקים בשחלות על ידי שאיבה ושטיפת התאים עם PBS ללא מיליגניום/קאלבויום.
5. הוסף 0.05% טריפסין (1–2 מ"ל טריפסין לפלטה של 6 בארות או צלחת 60 מ"מ) כדי לקצור את התאים מתרבות דו-ממדית. דגרו את התאים בטריפסין למשך 2–3 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור.
6. וודא שתאים התנתקו תחת מיקרוסקופ ונטל את הטריפסין על ידי הוספת שני נפחים של PM מחומם לכל נפח טריפסין אחד.
7. העבר את תליית התא לצינור חרוטי של 15 מ"ל, והפך את התאים בצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
8. החזירו את התאים ל-1 מ"ל של PM, צבעו אליקו של תאים בכחול טריפן כדי להעריך את שריאות התאים, וספרו את התאים באמצעות המוסיטומטר.
   הערה: ראו טבלה 1 למספרים צפויים של תאי סומטיקה ראשוניים בשחלה, בהתאם לזן וגיל העכבר, לאחר תרבית דו-ממדית במהלך הלילה וטריפסיניזציה שלאחר מכן. הקיימות של תאים טריפסיניים בדרך כלל גבוהה מ-90%.
9. הפלטה של התאים בצנטריפוגציה (300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר) והשיה מחדש את כדור התא במדיה אורגואאידית שחלתית לצפיפות של 3.33 × 10⁶ תאים חיים ל-1 מ"ל מדיום, כלומר 2.5 × 10⁵ תאים חיים ל-75 מיקרוליטר של מדיום.
   הערה: כאן, 2.5 ×-10⁵ תאים נזרעים בכל מיקרו-עובש אגרוז. לכן, מספר המיקרו-מולדים הכולל שניתן ליצור תלוי במספר התאים הכולל. ניתן לייצר אורגנואידים עם פחות מ-2.5 ×-10-5 תאים בכל מיקרומולד של אגרוז, אך גודל האורגנידים, קינטיקת האגרגציה, הרכב התאים היחסי ותפקודיו, כולל ייצור הורמונים, עשויים להיות מושפעים.
10. הסר את תבניות המיקרו-אגרוז המאוזנות מהאינקובטור, ודא שהמיקרו-תבניות ממוקמות כך שתא הזריעה של התא פונה כלפי מעלה, והסירו את המדיה האורגנית השחלתית מתאי הזריעה (איור 5Aiii).
    1. הסרת המדיה מתאי הזריעה של המיקרו-תבניות באמצעות מלקחיים של גראף להרמת והטיית המיקרו-תבניות או באמצעות פיפטינג. כדי להסיר מדיה מתאי זריעת תאים באמצעות פיפטינג, הרחף בעדינות את קצה הפיפטה מעל פינת תא הזריעה בזמן משיכת המדיה. אין ליצור מגע ישיר עם מיקרו-אגרוז כדי להימנע מהפרעה למיקרובארות.
       הערה: תאי הזריעה של התאים צריכים להיות יבשים ככל האפשר, כך שמיקרובארות יהיו נראות בעין, אך החלק החיצוני של המיקרו-תבניות עדיין צריך להיות מוקף במדיה אורגנואידית שחלתית (איור 5Aiii).
11. יש לשחרר 75 מיקרוליטר מתליית התא (כלומר, 2.5 × 10⁵ תאים) ישירות לתא הזריעה של כל מיקרו-מולד של אגרוז ולהימנע מיצירת בועות (איור 5Bi). החזיר את לוח ה-24 בארות לאינקובטור.
12. שעה עד שעתיים לאחר זריעת התאים, יש להוסיף עוד 250 מיקרוליטר של חומר אורגנואידי שחלה מחומם סביב החלק החיצוני של מיקרו-תבניות אגרוז, תוך זהירות שלא להפריע לתאי הזריעה של התאים (איור 5Bii).
    הערה: תאים סומטיים ראשוניים בשחלה צריכים להתחיל להצטבר תוך 1–24 שעות לאחר הזרעה במיקרומולד של אגרוז (איור 5Biii).
13. החלף את המדיה סביב המיקרו-תבניות האגרוז ב-750 מיקרול של חומר אורגנואיד שחלה טרי ביום שאחרי זריעת התאים, ולאחר מכן כל יומיים לאורך כל התרבית.
    1. כדי להחליף את המדיה, החזק את הפלטה בזווית קלה כדי להסיר את המדיה המרוסקת סביב המיקרו-תבניות האגרוז. אל תסירו את המדיה מתאי הזריעה של התאים. הפיפט בעדינות מדיום טרי לכיוון קיר הבאר כדי לא להפריע לתאי הזריעה של התאים.
       הערה: מדיה מותאמת משינויים במדיה ניתן לשמור ולאחסן בטמפרטורה של -80°C לניתוח גורמי הפרשה אורגנואידיים. לאחר יצירת אורגנואידים (1–3 ימים לאחר זריעת התאים), ניתן להחליף את המדיה במדיה המכילה חלבונים רקומביננטיים, מעכבים וכו', כדי לבחון את השפעות הטיפולים השונים על תפקוד האורגנואיד או לצורך סקר מורכב.

איור 5: סכמטי של יצירת אורגנואידים סומטיים בשחלות. (א) תמונות מייצגות של (i) העברת מיקרותבניות אגרוז ללוח התרבית עם מלקחי Graefe, (ii) איזון של מיקרותבניות אגרוז במדיה אורגנואידית שחלתית, ו-(iii) הסרת מדיום מחדרי זריעת תאים. החץ ב-Aiii מציין תא זריעה ריק. (ב) תמונות מייצגות של (i,ii) זריעה של תאים למיקרותבניות אגרוז ו-(iii) סריקת אור מועברת של מיקרו-עובש אגרוז המכיל תאים סומטיים שחלתיים מצטברים. פס קנה מידה (Biii): 2500 מיקרון. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של הצורה.

5. שימוש באורגנידים ליישומים במורד הזרם

הערה: אורגנואידים יכולים לשמש למגוון יישומים במורד הזרם, כולל היסטולוגיה, יישומים בביולוגיה מולקולרית (כגון ניתוחי RNA/חלבונים), ניתוח מדיה מותנית וקולטורטורה.

1. היסטולוגיה
   הערה: ניתן לעבד אורגנואידים לנקודות קצה היסטולוגיות ללא הסרה ממיקרו-תבניות האגרוז. למעשה, אורגנואידים בתוך מיקרומולדים של אגרוז פועלים בדומה למיקרו-מערכי רקמה, וכך מאפשרים הערכה היסטולוגית בקצב גבוה של מספר אורגנואידים במרווחים עקביים בו זמנית.
   1. ממיסים 1.5% (עם כיוון) אגרוז סטרילי ב-PBS על ידי הרתיחה.
   2. בהתאם לתרבות של אורגנואידים סומטיים שחלתיים, החזק את הפלטה בזווית והסרת המדיה שמקיפה את המיקרו-תבניות האגרוזיות.
   3. מתחת למיקרוסקופ ניתוח, הסר את המדיה מתאי הזריעה של התאים על ידי ריחוף עדין של קצה פיפטה מעל פינת כל תא זריעה של תא ומשך בזהירות את המדיה מבלי להפריע לאורגנואידים או לשבש את המיקרו-עובש עצמו.
   4. פיפטה בזהירות של 100–125 מיקרוליטר של אגרוז נוזלי 1.5% מקוררת לכ-50 מעלות צלזיוס בפינת כל תא זריעה לתא כדי למלא ולאטום את תאי הזריעה של התאים, תוך זהירות שלא להפריע לאורגנואידים (איור 6Ai).
   5. תנו לאגרוז להתגבש למשך 2–3 דקות בטמפרטורת החדר.
   6. הוסף 750 מיקרוליטר של דיווידסון מותאם או 4% פאראפורמלדהיד לכל באר וקבע את האורגנואידים בתוך המיקרו-תבניות האטומות של האגרוז למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   7. לאחר הקיבוע, הסר את המקבע ושטוף את המיקרו-תבניות האגרוז ב-70% אתנול.
      הערה: ניתן לאחסן מיקרומולד ב-70% אתנול בטמפרטורה של 4°C עד לעיבוד רקמות (ייבוש, ניקוי וחדירת שעווה). במהלך עיבוד הרקמות, יש לעקוב אחרי כיוון המיקרותבניות של האגרוז.
   8. לאחר עיבוד הרקמות, הטמיעו את המיקרותבניות האגרוז בפרפין כך שהמיקרומולדים יהיו שטוחים בתוך בלוקי הפרפין ותחתית המיקרומולדים תהיה הראשונה להיחתך דרכה (איור 6Aii).
   9. חתך בלוקי פרפין ב-5 מיקרון ומניח את חתכי הרקמה על שקופיות מיקרוסקופ טעונות.
      הערה: נוכחות מיקרובארות ניתנת להמחיה בעין במהלך החתך הן בחתכי רקמה והן בבלוקי פרפין (איור 6Aiii,iv). נוכחות אורגנואידים בתוך חלקי מיקרו-מולד ניתנת לאימות על ידי בדיקת שקופיות חתוכות תחת מיקרוסקופ (איור 6Av). במקום למקם 2–3 חתכים רצופים על אותה שקף, הצבת 2–3 מקטעים שכל אחד מהם במרחק של 50 מיקרון (כלומר, כל^עשירית קטע) על סקופית אחת מעלה את ההסתברות שרוב האורגנידים יוצגו לפחות בקטע אחד בכל שקף. אורגנואידים מרווחים באופן עקבי בין חלקי רקמה, מה שמגביר את קלות ההדמיה לאחר צביעת היסטולוגיה (איור 6Avi).
   10. תן לסליידים להתייבש בתנור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
   11. המשך עם צביעת היסטולוגיה או אימונוהיסטוכימית או אחסן שקופיות בטמפרטורת^{החדר 19}.
2. איסוף אורגנואידים ליישומים מולקולריים
   הערה: לאחר תרבית, ניתן להסיר אורגנואידים מתבניות המיקרו-אגרוז ולעבד אותם למגוון יישומים ביולוגיים מולקולריים במורד הזרם, כולל הפקת RNA או חלבון להערכת ביטוי גנים או חלבונים.
   1. החזק את הפלטה המכילה את המיקרו-תבניות האגרוז בזווית קלה והסר את המדיה שמקיפה את המיקרותבניות על ידי פיפטינג.
   2. הוסיפו 750 מיקרוליטר של PBS בטמפרטורת החדר לבארות המכילות את המיקרו-תבניות האגרוז.
   3. השתמשו במלקחיים של גראף כדי להפוך ולערבב את המיקרו-תבניות של האגרוז ולשחרר את האורגנידים ל-PBS הסובב. אשר את שחרור האורגנואידים ממיקרו-תבניות האגרוז תחת מיקרוסקופ.
   4. הסר את המיקרו-תבניות הריקות של אגרוז באמצעות מלקחיים של גראף והעבר את ה-PBS המכיל את האורגנידים לצינורות מיקרוצנטריפוגה באמצעות פיפטינג.
   5. הפלטה את האורגנואידים בצנטריפוגציה ב-10,000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   6. הסר את הסופרנטנט על ידי שאיפה והמשך להפקת RNA או חלבון. לחלופין, הקפאת כדור התא במהירות ואחסון בטמפרטורה של -80°C¹⁹.
3. שמירת מדיה מותנית אורגנואידית לניתוח
   הערה: מדיה מותאמת מאורגניאידים יכולה להישמר לאורך כל התרבית לניתוח גורמים מופרשים אורגנואידים, כולל הורמונים, ציטוקינים וגורמי גדילה. תוצאות מייצגות מניתוח ציטוקינים במדיה מותנית אורגנואידית מוצגות באיור 7A.
   1. החזק את הפלטה המכילה את המיקרו-תבניות האגרוז בזווית קלה והסר את המדיה המותאמת שמקיפה את המיקרו-תבניות על ידי פיפטינג. אין להסיר מדיה מתאי הזריעה של התאים כדי למנוע הפרעה לאורגנידים.
   2. העבר את המדיה המותאמת לצינורות מיקרוצנטריפוגות והמשך לניתוח מדיה או הקפאת פלאש ואחסון בטמפרטורה של -80°C^19,22.
      הערה: באופן אופציונלי, צנטריפוגה את המדיה המעובדת ב-10,000 × גרם למשך 5 דקות כדי לפנות תאים מתים או פסולת. העבר את הסופרנטנט לצינורות מיקרוצנטריפוגות חדשים לפני ניתוח או אחסון המדיה.
4. קו-קולטורה אורגנואידית
   הערה: אורגנואידים סומטיים בשחלות יכולים להיות משותפים עם תאים ורקמות אחרים במספר שיטות. תוצאות מייצגות של קו-קולטורציה אורגנואידית עם תאי סרטן שחלות וזקיקים, בשיטות המתוארות בשלבים 5.4.1 ו-5.4.3, בהתאמה, מוצגות ב איור 7B,C.
   1. כדי ליצור אורגנואידים באמצעות שילוב של תאי סומטיקה של שחלות ראשוניות וסוגי תאים נוספים לחקירת השפעות אינטראקציות ישירות-תאים, עקוב אחר השלבים 5.4.1.1–5.4.1.4.
      1. עקבו אחר שלבים 4.1–4.9 לשטיפת תאי הסומטיקה הראשוניים של השחלות לאחר תרבית דו-ממדית במהלך הלילה, קצרו את התאים מתרבית דו-ממדית באמצעות 0.05% טריפסין, כדור, ספירה, והשיה מחדש את התאים במדיה אורגואאידית שחלתית בצפיפות של 2.5 ×-^10-5 תאים חיים ל-75 מיקרוליטר של מדיום.
      2. אם סוג התא השני דבק, קצרו את התאים מתרבות דו-ממדית. סופרים את התאים, שחררו אותם בצנטריפוגה, והשאירו אותם מחדש במדיה אורגואאידית שחלתית בצפיפות של 2.5 ×-^10-5 תאים חיים ל-75 מיקרוליטר של מדיום.
      3. שלבו את ההשעיה של תאי הסומטיקה הראשוניים בשחלה עם ההשעיה של סוג התא האחר ביחס ידוע.
      4. עקבו אחר השלבים 4.10–4.13 כדי לזרוע את תליית התא המתקבלת למיקרותבניות אגרוז ולאורגנידים תרבותיים.
   2. כדי להעביר מיקרומולדים של אגרוז המכילות אורגנואידים מעוצבים ללוחות של 24 בארות המכילים תאים או אורגנואידים אחרים, יש לעקוב אחר השלבים 5.4.2.1–5.4.2.4.
      הערה: כדי להעריך את השפעות הגורמים המופרשים שמקורם באורגנואידים על סוגי תאים אחרים ולהפך, אורגנואידים שנוצרו יכולים להישאר בתוך המיקרו-תבניות של האגרוז, ומיקרומולדים שלמים של אגרוז יכולים להיות מועברים ללוח של 24 בארות המכיל תאים או אורגנואידים נוספים. שיטות קו-קולטורה אלו יכולות לשמש כאשר מדיה אורגנואידית שחלתית יכולה לשמש לתרבית שני סוגי התאים/רקמות.
      1. מדיה אורגנואידית חמה של שחלות עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
      2. החזק את הפלטה המכילה את המיקרו-תבניות האגרוז בזווית והסר את המדיה שמסביב למיקרותבניות האגרוז באמצעות פיפטינג.
      3. באמצעות מלקחי גראפה, העבר בזהירות את המיקרו-תבניות ללוחות עם 24 בארות המכילות תאים או אורגנואידים נוספים.
      4. הוסף 750 מיקרוליטר של מדיה אורגנואידית שחלתית טרייה כדי להקיף את המיקרו-תבניות האגרוזיות.
   3. כדי להסיר אורגנואידים שנוצרו ממיקרותבניות האגרוזות ולהעביר אותם למיקרותבניות חדשות של אגרוזות, יש לעקוב אחר השלבים 5.4.3.1–5.4.3.13.
      הערה: אם מדיה אורגנואידית שחלתית אינה המדיה הרצויה לניסויי קו-קולטורה, הפרדיגמה המתוארת בשלב 5.4.2 מציבה אתגר של העברת מדיה משמעותית, בהתחשב בכך שמיקרותבניות אגרוז רוויות במדיה אורגנואידית שחלתית. אורגנואידים שנוצרו (1-3 ימים לאחר זריעת תאים ראשונית) יכולים להיות מועברים ממיקרו-תבניות האגרוז שלהם ומועברים למיקרותבניות חדשות לתרבית נוספת או קו-קולטורה, במטרה למנוע העברת המדיה.
      1. חממו את המדיה הרצויה לקוקולטורה ל-37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
         הערה: מדיום מבוססי DMEM, αMEM ו-F12 שימשו בהצלחה בניסויים קו-קולטורליים עם אורגנואידים סומטיים שחלתיים.
      2. באמצעות מלקחיים גראפה, העבירו בזהירות את מיקרו-תבניות האגרוז החדשות מ-PBS +1% PS לבארות של צלחת 24 בארות המכילה תאים או אורגנואידים נוספים לתרבית משותפת.
      3. ודא שמיקרומולד טבול לחלוטין במדיה, הוסף מדיה נוספת רצויה לקו-קולטור לפי הצורך, ואזן את המיקרומולדים והמדיה לפחות 30 דקות באינקובטור (סביבה לחה, 37 מעלות צלזיוס עם 5%_CO2).
      4. החזק בזווית קלה את הפלטת המכילה את תבניות המיקרו-אגרוז עם אורגנואידים מעוצבים והסר את המדיה שמקיפה את המיקרו-תבניות האגרוז באמצעות פיפטינג.
      5. הוסף את המדיה הרצויה לקו-קולטורה סביב מיקרותבניות האגרוז יחד עם האורגנידים שנוצרו.
      6. השתמשו במלקחיים גראף כדי להפוך ולערבב את המיקרו-תבניות האגרוז ולשחרר את האורגנידים לתוך המדיה הסובבת. אשר את שחרור האורגנואידים ממיקרו-תבניות האגרוז תחת מיקרוסקופ.
         הערה: אם תאי הסומטיקה הראשוניים בשחלה לא הצטברו כראוי, ייתכן שאורגנואידים לא יישארו שלמים כאשר הם מוסרים ממיקרו-תבניות אגרוז. הרכבת אורגנואיד עשויה להימשך 1–3 ימים, בהתאם לזן ולגיל העכברים מהם בודדו תאי הסומטיקה של השחלות.
      7. הסר את המיקרותבניות הריקות של האגרוז באמצעות מלקחיים של גראף והעבר את המדיה המכילה את האורגנידים לצינורות מיקרוצנטריפוגה באמצעות פיפטינג.
      8. צנטריפוגה את האורגנואידים ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      9. תחת מיקרוסקופ ניתוח, הסר את הסופרנטנט באמצעות פיפטינג, ומשאירים 50–75 מיקרו-ליטר של מדיה המכילה את האורגנידים.
      10. הסר את המיקרו-תבניות המאוזנות מהאינקובטור וודא שהמיקרו-תבניות ממוקמות כך שתא הזריעה של התאים פונה כלפי מעלה.
      11. הסרת המדיה מתאי הזריעה של התאים באמצעות מלקחיים של גראף או באמצעות פיפטינג.
          הערה: בארות לא אמורות להכיל יותר מ-500 מיקרו ליטר של מדיה כדי שניתן יהיה לרוקן את תאי הזרעה של המיקרו-תבניות.
      12. העבר את האורגנואידים ישירות לתא הזריעה של התאים בכל מיקרו-אגרוז חדש באמצעות פיפטינג. החזיר את לוח ה-24 בארות לאינקובטור.
      13. לאחר שעה–שעתיים, מוסיפים עוד 250 מיקרוליטר מהמדיה הרצויה סביב החלק החיצוני של מיקרותבניות האגרוז, תוך זהירות שלא להפריע לתאי הזריעה של התאים.

איור 6: סוגי תאי שחלות מרכזיים נשמרים באורגנואידים סומטיים של השחלות. (א) תמונות מייצגות של (א) איטום מיקרו-עובש עם אגרוז בסוף התרבית, (ii) מיקרו-מובש לא חתוך, ו-(ג) מיקרו-מובלד חתך המוטמע בבלוק פרפין. ניתן לראות מיקרובארות ב-(iv) חלקים מותקנים, ונוכחות אורגנואידים בתוך מיקרותבניות חתוכים יכולה (v) להיות מאומת תחת מיקרוסקופ לפני (vi) צביעה היסטולוגית. (B) תמונות מייצגות של חתכי רקמת שחלות בעכבר וחתכי אורגנואידים סומטיים בשחלות לאחר צביעה אימונוהיסטוכימית באמצעות נוגדנים נגד Vimentin, F4/80, Foxl2 ו-3β-HSD. פסי קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: H&E = המטוקסילין ואאוזין. איור זה הותאם באישור מדיפאלי ואחרים^. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 7: קו-קולטורציה של אורגנואידים סומטיים של שחלות עם זקיקים ותאי סרטן שחלה. (א) הפרשה ציטוקינים אורגנואידית נמדדה לכל מיקרומולד אגרוז ביום החמישי של התרבית ונרמלה למדיה מותאמת ממיקרותבניות אגרוז ללא אורגנואידים. N = 4 מיקרומולד אגרוז. (ב) תמונות אור משודרות של זקיקי שחלות בימים 0, 4 ו-8 של התרבית עם או בלי (בקרה) אורגנואידים ו-(i) סכמטיקה של פרדיגמת הקו-תרבות. פסי קנה מידה = 400 מיקרון. כימות (ii) הישרדות זקיקים ו-(iii) גדילה במשך 8 ימי תרבית עם או בלי (בקרה) אורגנואידים. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. חלק משורות השגיאה קטנות מדי כדי לדמיין. N = 56 זקיקים לכל קבוצה. **P < 0.01. (C) תמונות אור מועברות (למעלה) ותמונות פלואורסצנטיות (תחתונה) של תאי סומטיקה ראשונית בשחלה שנגרמו ביחס של 10:1 עם תאי סרטן שחלות אדומים מסומנים בחלבון פלואורסצנטי (OVCAR8-RFP) באורגנואידים בימים 1, 3 ו-5 של התרבית. פסי קנה מידה = 400 מיקרון. קיצור: RFP = חלבון פלואורסצנטי אדום. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

6. טיפים לפתרון תקלות

1. בעיה 1: מספר התאים הסומטיים הראשוניים המבודדים בשחלה נמוך מהצפוי.
   הערה: אם קטעי רקמת השחלה קטנים באופן עקבי מ-1 מ"מ או אינם נראים לעין לאחר עיכול אנזימטי, מספר התאים המבודדים עשוי להיות נמוך בשל ירידה בחיוניות עקב עיכול יתר. אם קטעי רקמת השחלה גדולים מ-1 מ"מ לאחר עיכול אנזימטי, מספר התאים המבודדים עשוי להיות נמוך בשל עיכול לקוי של רקמת השחלה.
   1. אם שברי רקמת השחלה גדולים מ-1 מ"מ לאחר עיכול אנזימטי, יש לעקוב אחר שלבים 6.1.1.1–6.1.1.2.
      1. לאשר שקולגנאז IV ו-DNase I נמצאים בטווח חיי המדף המומלצים שלהם ולא איבדו פעילות אנזימטית עקב אחסון לא נכון או, במקרה של DNase I, מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים.
      2. הגדלת כמות הפיפפטינג החוזרת של רקמת השחלה, הקטנת גודל הקדרה של קצה ה-p1000 אם נחתכה כדי להרחיב את הפתח, ו/או הארכת זמן הדגירה ב-EM.
   2. אם שברי רקמת השחלה קטנים בהרבה מ-1 מ"מ לאחר עיכול אנזימטי, יש להפחית את כמות הפיפטציה החוזרת של רקמת השחלה, להגדיל את גודל הקידוח של קצה ה-p1000 על ידי חיתוך כדי הרחבת הפתח, ו/או להקטין את סך הדגירה ב-EM.
2. בעיה 2: יותר מ-~25% ממיקרותבניות אגרוז יצוקות סובלות מפגמים
   1. ודאו שיציקת הסיליקון נקייה מכל שאריות אגרוז ופסולת. אם צריך, שטוף את יציקות הסיליקון ב-PBS וחזר לחטא על ידי אוטוקלב. במידת הצורך, חממו מחדש את האגרוז של 1% המשמש ליציקה, שכן אגרוז המתקשה עלול לא למלא את יציקת הסיליקון באופן אחיד ו/או לגרום לבועות.
   2. לאחר פיפט ליציקת הסיליקון, אפשר לאגרוז להתקשות לחלוטין, שכן הסרה מוקדמת של מיקרו-עובש האגרוז מהיציקה עלולה לגרום להפרעות במיקרובארות.
   3. ודאו שיציקות הסיליקון אינן מלאות מספיק, שכן הדבר עלול להפחית את שלמות המבנה של מיקרו-תבנית האגרוז, ולהוביל לנזק כאשר הסיליקון מכופף להסרת המיקרו-תבנית של האגרוז.
   4. בנוסף, יצרן יציקות הסיליקון ממליץ לעבור אוטוקלב לא יותר מ-12 פעמים. אם יצק הסיליקון עבר עיקור מופרז, יש להחליף אותו.
3. בעיה 3: אורגנואידים אינם נוצרים ביותר מ-10% מהמיקרובארות
   1. ודאו שיציקות הסיליקון אינן מלאות יתר על המידה בעת יציקת המיקרו-תבניות האגרוז, שכן הדבר עלול להוביל לחלוקה לא סדירה של התאים למיקרובארות, מה שמעדיף את המיקרובארות המרכזיות במיקרו-האגרוז על פני המיקרובארות החיצוניות.
   2. הימנעו מיצירת בועות בעת הפיזור את תליית התאים לתא הזריעה של מיקרו-תבניות האגרוז, שכן בועות עלולות להפריע להתפלגות התאים למיקרובארות.
   3. אם יש צורך, התחל עם תליית תאים של מעל 75 מיקרוליטר (בצפיפות של 3.33 ×^10-6 תאים חיים ל-1 מ"ל) לכל מיקרומולד, כדי להבטיח שלא נוצרות בועות עקב נפח לא מספק בקצה הפיפטה.
   4. הגדל את המרווח בין זריעת התאים להוספת מדיה אורגנואידית שחלתית לחלק החיצוני של מיקרו-האגרוז כדי להבטיח מספיק זמן לתאים להתיישב במיקרובארות.

תוצאות

כדי לקבוע את הרכב התאים של אורגנואידים סומטיים בשחלה, ביצענו אימונוהיסטוכימיה של חתכי רקמת אורגנואיד לאחר 6 ימי תרבית, תוך שימוש בנוגדנים נגד סוגי תאי שחלה מרכזיים. אורגנואידים הכילו פיברובלסטים חיוביים לוימנטין, מקרופאגים חיוביים ל-F4/80, וכן אוכלוסיות תאים סטרואידוגניים (איור 6B)¹⁹. השתמשנו בנוגדן נגד Foxl2 לסימון תאי גרנולוזה וגרנולוזה-לוטאין, בנוסף בנוגדן נגד 3β-HSD לסימון תאי תקה, תאי תקה-לוטאין ופיברובלסטים סטרואידוגניים. אורגנו...

דיון

מאמר זה מתאר שיטות לבידוד תאי סומטיקה ראשוניים של שחלות העכברים מחלק מועשר בשחלה, באופן השומר על ההטרוגניות של מחלקת הסומטיקה של השחלות. תאים סומטיים של שחלות ראשוניות בעכברים יכולים להיות מתורבתים בשכבה חד-ממדית או ליצירת אורגנואידים סומטיים של שחלות באמצעות מיקרותבניות אגרוזיות ללא פיגומים. מיקרו-תבניות אגרוז מכילות 96 מיקרובארות להיווצרות אורגנואידים ומתאימות לבאר אחת של לוח של 24 בארות, מה שהופך את השיטה לייצור תפוקה גבוהה לייצור מספר רב של אורנואידים בגודל אחיד. יתרה מזאת, מיקרו-תבנ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.2 µm, מסנן מזרק פוליאתרסולפון	Corning	431229
צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל	MIDSCI	PR-MCT15
כוס זכוכית 100 מ"ל	Fisherbrand	FB100100
צלחות פטרי 100 מ"מ	Corning	351029
צינורות חרוטיים 15 מ"ל	ThermoFisher Scientific	339651
צלחות 24 באר (TC-treated)	Corning	353047
מחטי אינסולין 28-gauge	Exel International	26027
צלחות פטרי 35 מ"מ	Corning	351008
נוגדן 3β-HSD	Cosmo Bio	K0607	1:1000
פאראפורמלדהיד 4%	Electron Microscopy Sciences	1574100
מסנן תאים 40 µm	Corning	431750
זכוכית שעונית 45 מ"מ	Electron Microscopy Sciences	7054345
צינורות חרוטיים 50 מ"ל	ThermoFisher Scientific	339652
מזרק סטרילי 60 מ"ל	Air-Tite	ML60
צלחות 60 מ"מ TC-treated	Corning	353037
צלחות 6 באר (TC-treated)	Corning	353046
אגרוז	Hoefer	GR140-500	Gel strength >1200 g/cm2; Gel Temperature 36 °C
שקית סטריליזציה אוטקלב	Fisherbrand	01-812-55
נוגדן Anti-Mouse IgG ביונטין	Vector Laboratories	BA-9200-1.5	1:200
נוגדן Anti-Rabbit IgG ביונטין	Vector Laboratories	PK-6101	1:200
נוגדן Anti-Rat IgG ביונטין	Vector Laboratories	BA-9400-1.5	1:100
חומר צביעה כחול	Fisherbrand	23-245681
צנטריפוגה עם רוטור כדורית לצינורות חרוטיים 50 מ"ל	ThermoFisher Scientific	Sorvall X1R Pro-MD
ארון בטיחות ביולוגי Class II	The Baker Company	SG403A
נוגדן Cleaved Caspase-3 (CC3)	Cell Signaling Technology	9579T	1:250
חממה תרביתית CO2	ThermoFisher Scientific	Heracell VIOS 160i CO2 Incubator
קולגנאז, סוג IV, אבקה	Gibco, Fisher Scientific	17-104-019
ערכת מערך נוגדנים ציטוקינים C-Series Mouse 3	RayBiotech	AAM-CYT-3-8
Cytoseal XYL	Epredia	83124
דאוקסיריבונוקלאז I מבלוטת הלבלב של פרה	Millipore Sigma	DN25-100MG	Dnase I
מספריים מיקרוסקופיים לניתוח	World Precision Instruments	WPI-14003
מספריים לניתוח	World Precision Instruments	WPI-15922
מיקרוסקופ ניתוח	Leica	MZ9.5, S9 series
DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיום	Gibco, Fisher Scientific	14-190-250	pH 7.0–7.3
אאוזין	Fisherbrand	23-314631
נוגדן F4/80	Bio-Rad	MCA497G	1:50
סרום בקר עוברי, מאושר, מושמט חום, ארצות הברית	Gibco, ThermoFisher Scientific	10082147
מלקטות ניתוח עם קצה דק	World Precision Instruments	WPI-14098
נוגדן FOXL2	Abcam	ab246511	1:200
מלקטות Graefe	Fine Science Tools	1105010
המטוקסילין	EK Industries	EKI 47971GL
המוציטומטר	MedOne	DHCN015
מערכת הדמיה	ThermoFisher Scientific	EVOS FL Auto
IntestiCult Organoid Growth Medium (Mouse)	STEMCELL Technologies	06005	Basal medium, Supplements 1 and 2
תאית זרימה לינארית	IVFtech	IVFtech sterile workstation
מדיום Leibovitz's L-15	Gibco, Fisher Scientific	11415114
שקופיות מיקרוסקופ	Mercedes Scientific	MER 7255/90/WH/CC
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids	Millipore Sigma	Z764043-6EA	Silicone casts for agarose micromolds
תמיסת קיבוע Davidson's מותאמת	Electron Microscopy Sciences	6413350
תאי OVCAR8-RFP			מתנת ד"ר ג'ואנה בורדט, אוניברסיטת אילינוי בשיקגו
פניצילין-סטרפטומצין	Millipore Sigma	P4333-100ML
תמיסת צביעה פיקרוסיריוס אדום	StatLab	STPSRPT
מדיום RPMI 1640 Medium (ATCC modification)	Gibco, Fisher Scientific	A1049101
צנטריפוגה שולחנית	Eppendorf	Centrifuge 5430 R
כחול טריפ