הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדמיה תוך-חיונית של מיקובקטריום טוברקולוזיס אוקסוטרופי מוחלש בריאות עכברי במהלך זיהום תוך-כלי מוקדם

104 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71019

⸱

30 ביוני 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine, 2Integrated Imaging Program for Cancer Research, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 3Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine, 6Cancer Dormancy Institute, Albert Einstein College of Medicine, 7Montefiore Einstein Comprehensive Cancer Center, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיה תוך-חיונית של Mycobacterium tuberculosis המאושר על ידי BSL-2 מוחלש. מאמץ בריאה העכברית באמצעות חלון ריאה קבוע. גישה זו מאפשרת ניתוח אורך ברזולוציה תאית אחת של אינטראקציות מוקדמות בין מארח לפתוגן, כולל מיקום חיידקים, דינמיקת כלי דם וספיגת מקרופאגים באותה מיקרוסביבה ריאתית.

תקציר

מיקרוסקופיה תוך-חיונית מאפשרת הדמיה ישירה של תהליכים תאיים דינמיים בתוך רקמות שלמות. עם זאת, יישומה למיקובקטריום טוברקולוזיס (Mtb) מוגבל בשל דרישות הכלה ברמת בטיחות ביולוגית 3 (BSL-3) והאתגרים הטכניים בייצוב הריאה להדמיה ברזולוציה גבוהה. כאן אנו מציגים פרוטוקול המשלב את חלון החזה להדמיה ברזולוציה גבוהה של ריאת העכברים (WHRIL) עם mc27902, זן Mtb משולש אוקסוטרופי מוגדר גנטית ומאושר לשימוש בתנאי BSL-2. אנו גם מתארים את היווצרות mc28471, נגזרת מבטאת עגבנייה של mc27902, את ההכנה לזיהום תוך ורידי, ואת יישומו להדמיה תוך-חיונית בעכברי מדווחים. מערכת זו מאפשרת ויזואליזציה בזמן אמת של דינמיקת הזיהומים המוקדמים, כולל כניסה מהירה של חיידקים לכלי דם ריאתיים, הצטברות, התפשטות לפרנכימת הריאה, וספיגת מקרופאגים באותו מיקרו-סביבה ריאתית במהלך שלושת הימים הראשונים לאחר ההדבקה. על ידי מתן הדמיה אורכית של חיידקים ואינטראקציות בין מארח-פתוגן ברזולוציית תא יחיד, גישה זו מתגברת על מגבלות מרכזיות הקשורות להדמיה קונבנציונלית ומודלים בעלי שליטה גבוהה. פרוטוקול זה מספק פלטפורמה מעשית תואמת BSL-2 להדמיה תוך-חיונית בזמן אמת של מיקובקטריות מוחלשות בריאות ומבסס בסיס למחקרים מכניים של פיזיולוגיה חיידקית, זיהוי מארח ופינוי חיסוני.

מבוא

מיקרוסקופיה תוך-חיונית ברזולוציה גבוהה שינתה את חקר ההתנהגות התאית הדינמית ברקמות שלמות בכך שאפשרה הדמיה ישירה של נדידת תאים, אינטראקציות וסקולריות ומעקב חיסוני ברזולוציה תאית בודדת 1,2,3,4. בעוד שגישות אלו בשימוש נרחב במחקר סרטן 3,5, יישומן לזיהומים ריאתיים מוגבל בשל תנועת הנשימה, שבריריות הרקמות ומגבלות בטיחות ביולוגית. התקדמות אחרונה בפלטפורמות הדמיה של בית החזה, כולל חלונות אופטיים מיוצבים בוואקום ומושתלים לצמיתות, התמודדה עם רבים מהאתגרים הטכניים הללו על ידי מתן הדמיה יציבה וללא תנועה של מיקרו-סביבת הריאות לאורך תקופות ממושכות 6,7,8,9,10. חלונות קבועים להשתלה, במיוחד, הם כלים רבי עוצמה, שכן הם מאפשרים הדמיה חוזרת של זרימת כלי דם, דינמיקת תאי החיסון והתנהגות תא יחיד במשך שעות עד שבועות, והיו חיוניים בהגדרת מנגנוני הגרורות של סרטן, חדירות כלי דם ומעקב חיסוני11,12.

למרות ההתקדמויות הללו, הדמיה תוך-חיונית לא יושמה קודם לכן על זיהום Mycobacterium tuberculosis (Mtb) בריאות יונקת בתוך החיים, ברזולוציה של תא יחיד. התקדימים הקרובים ביותר מגיעים מהדמיה תוך-חיונית של זיהומים מיקובקטריאליים בסביבות אחרות. הדמיה בזמן אמת של זיהום Mycobacterium marinum בעוברי דגי זברה13 חשפה אינטראקציות מוקרופאגים מוקדמות והתחלת גרנולומה, בעוד שהדמיה בשני פוטונים של גרנולומות מונעות על ידי BCG בכבד העכבר14,15 חשפה דינמיקה בין מקרופאגים ותאי T במהלך התפתחות הגרנולומה והפגינה הצגה מוגבלת של אנטיגן ותפקוד אפקטור של תאי T בתוך נגעים גרנולומטוזיים. מחקרים אלו הקימו תובנות יסוד לגבי אינטראקציות בין המארח לפתוגני מיקובקטריאלי, אך לא הגיעו לריאה היונקית שלמה 8,16.

שיטות הדמיה תוך-חיוניות יושמו גם על הריאה בהקשרים זיהומיים וביולוגיים נוספים, כולל הדמיה ריאתית כללית8, מחקרים המגלים כי מקרופאגים אלוואולריים מסיירים יכולים להסתיר חיידקים ממערכת החיסון17 ומאפיינים את התגובה המיאלואידית המיידית לזיהום SARS-CoV-2 בריאות האדם16. הדמיה תוך-חיונית יושמה באופן דומה לריאות נגועות בשפעת, ומאפשרת הדמיה ישירה של התנהגות תאי חיסון דינמית בתוך רקמת הריאה הנגועה18,19.

גישות דימות אופטי לכל הגוף באמצעות גירוי מיקרואנדוסקופיסיב אופטי 20 וטכנולוגיית פלואורסצנציה אנזימטית מדווחת21,22 אפשרו זיהוי רגיש של Mtb בריאות עכברים, אך אינן יכולות לזהות אשכולות בודדים או קטנים של חיידקים, לעקוב אחר דינמיקת הצטברות חיידקים, או להמחיש אינטראקציות ישירות בין מיקובקטריה לתאי מארח בתוך רקמת הריאה שלמה. שיטות הדמיה תוך-חיוניות בהגבלה גבוהה יושמו לריאות נגועות בסביבות BSL-3, כולל פלטפורמות הדמיה רב-פוטונית ממוקדות ב-SARS-CoV-2 ב-SARS-CoV-2 ופלטפורמות רב-פוטון ממוקדות Mtb24. מחקרים אלו מראים את היתכנות התמונה של ריאות נגועות תחת כליאה, אך מערכות כאלה נותרות תובעניות מבחינה טכנית ואינן נגישות באופן נרחב. עבודה עם Mtb אלימות דורשת בידוד BSL-3, מה שמציב אתגרים הנדסיים וביובטיחותיים משמעותיים בהדמיה תוך-חיונית 23,24. כתוצאה מכך, רוב המחקרים על זיהום מוקדם ב-Mtb מסתמכים על בדיקות קצה סטטיות שאינן יכולות ללכוד את הדינמיקה המרחבית והזמנית של התנהגות חיידקים בריאות.

פיתוח זני Mtb משולשים-אוקסוטרופיים המוגדרים גנטית ומאושרים על ידי BSL-2 מספק הזדמנות ייחודית להתגבר על מגבלות אלו. זן mc27902, נגזרת אוקסטורופית Mtb של פנטותנט-לאוצין-ארגינין מ-H37Rv, מוחלש לחלוטין, אינו משתכפל בעכברים עם מערכת חיסון מוחלשת, שומר על צביעה קלאסית מהירה לחומצה, מציג רגישות לפאג' רגילה, וניתן לטפל בו בבטחה מחוץ למתקני BSL-325. תכונות אלו הופכות את mc27902 לתחליף אידיאלי ליצירת גישות דימות תוך-חיוניות ולבדיקת אינטראקציות מוקדמות בין מארח לפתוגן תחת בידוד ביו-בטיחותי מופחתת.

כאן, אנו מיישמים את חלון הדמיה ברזולוציה גבוהה של הריאה (WHRIL) עם mc28471, נגזרת מבטאת טומטומטר פלואורסצנטי של זן ה-Mtb המשולש mc27902, כדי להמחיש זיהום מוקדם של Mtb בריאה שלמה של עכברים. ניסויים בוצעו בעכברי Rag2-/- 26 עם מערכת חיסון מוחלשת עם עכברי MacBlue27, שבהם פרומוטר Csf1r מניע ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ציאן משופר (ECFP) במונוציטים, מיקרוגליה, ותת-קבוצות של תאי דנדריט ומאקרופאגים. הגן הטרנסג'ני MacBlue מאפשר הדמיה ברורה של אוכלוסיות הפגוציטים המונוגרואליים במהלך זיהום מוקדם ב-Mtb. בחרנו להשתמש בעכברים חסרי Rag2 כדי למקד את המערכת באינטראקציות המולדות המולדות בין המארח לפתוגן ולהימנע מהמורכבות הנוספת של תגובות חיסוניות אדפטיביות במהלך חלון ההדמיה הקצר שנבדק כאן. חשוב לציין, שטכניקה זו אינה מוגבלת לעכברים חסרי Rag2 וניתן לבצע אותה גם בבעלי חיים חיסוניים לא מקצועיים.

על ידי שילוב חלון ריאה קבוע עם זן Mtb מוחלש פלואורסצנטי תואם BSL-2, פלטפורמה זו מאפשרת הדמיה תוך-חיונית סדרתית של אינטראקציות בין חיידקים לתאי מארח באותה מיקרוסביבה ריאתית ברזולוציה של תא יחיד במשך מספר ימים. למרות שהודגם כאן לזיהום מוקדם, הפלטפורמה עצמה אינה מוגבלת בהכרח לנקודות זמן מוקדמות ויכולה, עקרונית, להיות מיושמת בשלבים מאוחרים יותר בהתאם למודל הניסויי ולעיצוב המחקר. מכיוון שהיישום המוצלח של פלטפורמת הדמיה זו תלוי בשימוש בתכשיר החיידים הפלואורסצנטי הספציפי המתואר כאן, כללנו את השלבים החיוניים הנדרשים לייצור והכנת המגיב כחלק מהפרוטוקול המלא. פלטפורמה זו מספקת הדמיה ישירה בזמן אמת של התנהגות Mtb ב-vivo ומבססת בסיס למחקרים מכניים עתידיים של פיזיולוגיה חיידקית, זיהוי מארח ופינוי מתווך חיסוני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות לבטיחות ביולוגית וטיפול בבעלי חיים ואושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של מכללת אלברט איינשטיין לרפואה (IACUC). הזן mc28471 הוא טרנספורמנט pYUB1169 של mc27902, זן Mtb משולש אוקסוטרופי המאושר לשימוש ב-BSL-2. כל העבודה שכללה חיידקים חיים בוצעה תוך שימוש באמצעי זהירות סטנדרטיים לטיפול במיקובקטריה.

1. בניית זן ה-MTB mc 8471 המאושר על ידי BSL-2 tdTomato-expressing mc8471

  1. יצירת BSL-2-safe mc28471 עם ביטוי tdTomato-Safe, באמצעות טרנספורמציית פלסמיד
    1. המרו את הזן המשולש האוקסוטרופי mc27902 המאושר על ידי BSL-2 עם הפלסמיד המיקובקטריאלי האפיזומלי pYUB1169, המכיל את גן tdTomato המובע מהפרומוטר G13, ליצירת הנגזרת הפלואורסצנטית mc28471.
    2. החרינו 100 מיקרוליטר של mc27902 (צפיפות אופטית ב-600 ננומטר (OD600 ננומטר) של 0.7-1.0) ב-10 מ"ל של Middlebrook 7H9 סטרילי, בתוספת העשרת OADC (10% (v/v)), גליצרול (0.2% (v/v)), D-פנטותנט (24 מ"ג/ליטר), L-לאוצין (50 מ"ג/ליטר), L-ארגינין (200 מ"ג/ליטר), נתרן פרופיונאט (0.1 מ"מ) וטילוקספול (0.05% (v/v)) בבקבוק דיו של 30 מ"ל.
    3. דגרו את התרבית, תוך ניעור איטי (100 סל"ד) ב-37 מעלות צלזיוס עד שהיא מגיעה ל-OD600 ננומטר של 0.7-1.0.
    4. העבר את התאים לצינור צנטריפוגה קונית של 15 מ"ל וצנטריפוגה למשך 10 דקות בעוצמה של 3,000 x גרם בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט והחזירו את התאים ל-10 מ"ל גליצרול סטרילי 10% המכיל 0.05% (v/v) טילוקספול (שטיפה #1). חוזר על הצנטריפוגציה ושוטף פעמיים. החזירו את כדור התא ל-0.175 מ"ל של 10% גליצרול המכיל 0.05% (v/v) טילוקספול והוסיפו 2 מיקרוליטר pYUB1169 DNA (100-200 ng DNA).
    5. העבר את mc27902 ו-pYUB1169 לקובט אלקטרופורציה בקוטר 0.2 ס"מ. חכה 10 דקות. הקשה על הקובטה 2x עד 3x כדי להסיר בועות אוויר ואלקטרופורט ב-2,500 mV, 1,000 Ω, 25 מיקרו-פרנהייט, זמן קבוע 20 מילישניות, בטמפרטורת החדר.
    6. הוסף 1 מ"ל של Middlebrook 7H9 סטרילי בתוספת העשרת OADC (10% (v/v)), גליצרול (0.2% (v/v)), D-פנטוטנאט (24 mg/L), L-לאוצין (50 mg/L), L-ארגינין (200 mg/L), נתרן פרופיונאט (0.1 mM) וטילוקספול (0.05% v/v)) לקובטה והעבר את תכולת הקובטה לצינור צנטריפוגה קונית בקוטר 15 מ"ל. דגור את הצינור תוך כדי ניעור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
    7. צלחת 0.1 מ"ל של תערובת הטרנספורמציה על צלחת אגר Middlebrook 7H10 בתוספת העשרת OADC (10% (v/v)), גליצרול (0.2% (v/v)), D-פנטותנט (24 mg/L), L-לאוצין (50 mg/L), L-ארגינין (200 mg/L), נתרן פרופיונאט (0.1 mM) וקאנאמיצין (20 mg/L). צנטריפוגות את תערובת הטרנספורמציה שנותרה, זרקו 0.9 מ"ל מהסופרנטנט, והחזירו את כדור התא לסופרנאנט שנותר. העבירו את התאים שהוחזרו לצלחת אגר Middlebrook 7H10 שנייה המכילה את אותם תוספים ואנטיביוטיקה. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3–4 שבועות. מושבות ורודות מצביעות על טרנספורמנטים מוצלחים.
    8. בחרו מושבה ורודה מבודדת אחת וגדלו אותה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, תוך רעד איטי, ב-5 מ"ל של Middlebrook 7H9 סטרילי בתוספת העשרת OADC (10% (v/v)), גליצרול (0.2% (v/v)), D-פנטותנט (24 mg/L), L-לוצין (50 mg/L), L-ארגינין (200 mg/L), נתרן פרופיונאט (0.1 mM), טילוקספול (0.05% (v/v)) ו-20 מ"ג/L קאנמיצין בבקבוק דיו של 30 מ"ל.
  2. הכנת MC28471 לזיהום תוך ורידי
    1. גידול 10 מ"ל של mc28471 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, רועד לאט, ב-Middlebrook 7H9 סטרילי בתוספת העשרת OADC (10% (v/v)), גליצרול (0.2% (v/v)), D-פנטותנט (24 mg/L), L-לאוצין (50 mg/L), L-ארגינין (200 mg/L), נתרן פרופיונאט (0.1 mM), טילוקספול (0.05% (v/v)), ו-20 mg/L קאנמיצין בבקבוק דיו 30 מ"ל עד שלב הלוג האמצעי (OD600 ננומטר אמור להיות בין 0.7 ל-1.0).
    2. העבר את התאים לצינור צנטריפוגה קונית של 15 מ"ל ולצנטריפוגה 10 דקות בטמפרטורה של 3,000 x גרם בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט והחזירו את התאים ל-10 מ"ל של מלח סטרילי עם בופר פוספט המכיל 0.05% (v/v) טילוקספול (PBS-T, שטיפה #1). חוזר על הצנטריפוגציה ושוטף פעמיים. החזירו את כדור התא ל-4 מ"ל PBS-T וסוניק את התאים בעוצמה של 100 וואט, 2x 1,000 ג'ול.
    3. מדדו את הצפיפות האופטית של התרבית ודיללו אותה ב-PBS-T לריכוז סופי של 5 x 106 CFU לכל הזרקה, תוך שימוש בהמרה משוערת ש-OD600 ננומטר של 1 מתאימה ל-1 x 108 CFU/mL. מכיוון שקשר זה יכול להשתנות בהתאם למאמץ ולתנאי הצמיחה, יש לכייל אמפירית את OD600 ננומטר מול ערכי CFU מצופים כדי להבטיח דיוק ושחזוריות.

2. השתלת חלון ריאה קבוע בעכברים להדמיה תוך-חיונית

  1. הכינו עכבר Rag2KO MacBlue להדמיה תוך-חיונית. במחקר זה, נעשה שימוש בעכבר זכר בן 10 שבועות במשקל 30 גרם. עם זאת, עכברים משני המינים, בגילאי 8-12 שבועות, ובטווח המשקל הצפוי לגיל זה, מתאימים להליך זה. זן זה מבטא חלבון פלואורסצנטי ציאני משופר (ECFP) במאקרופאגים על רקע Rag2-knockout ונוצר על ידי הכלאה של עכברים B6.129S6-Rag2tm1FwaN12 (Rag2, דגם RAGN12) עם עכברי Tg (Csf1r-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J (מאגר מס' 026051).
  2. השתלת חלון הדמיה ברזולוציה גבוהה של הריאה (WHRIL) 24 שעות לפני זיהום חיידקי כדי לספק גישה אופטית יציבה לריאה ולאפשר התאוששות לפני ההדמיה.
  3. השרה הרדמה עם 5% איזופלורן בתא השראה. ודאו עומק הרדמה מספק לפני תחילת כל הליך ועקבו אחר החיה לאורך כל הניתוח וההדמיה כדי למנוע כאב, מצוקה או פגיעה נשימתית.
  4. מתן הקלה לפני הניתוח: הזריק 10 מיקרולטר (0.1 מ"ג/ק"ג) של בופרנורפין מדולל ב-90 מיקרוליטר של PBS סטרילי תת-עורית.
  5. מרחו משחה עינית על שתי העיניים כדי למנוע ייבוש בקרנית במהלך ההרדמה.
  6. לקשור תפר משי 2-0 סביב בסיס קטטר 22G, ולהשאיר זנבות באורך ~2 אינץ' לקיבוע הקטטר.
  7. תן להעכבר אינטובציה עם קטטר קשור לתפר. דמיינו את פתיחת קנה הנשימה באמצעות הארה מחדש ואשר את המיקום באמצעות נורת נפוח (עליית חזה דו-צדדית).
    הערה: אינטובציה לא נכונה עלולה לגרום לפגיעת דרכי הנשימה או אוורור לקוי. יש להמשיך רק לאחר שהמיקום הנכון מאושר על ידי הרחבת החזה הדו-צדדית.
  8. אבטח את קטטר האינטובציה על ידי קשירת תפר המשי 2-0 סביב האף לאחר אינטובציה מוצלחת. חבר את הקטטר למכונת הנשמה.
  9. הניחו את העכבר בדקוביטוס לטרלי הימני על פלטפורמת ניתוח מחוממת כדי לחשוף את החזה השמאלי, ואז אבטחו את הגפיים הקדמיות, האחוריות והגב עם סרט דבק לשמירה על מיקום יציב לאורך כל ההליך.
  10. הפחת איזופלורן ל-3% לשארית הניתוח. הסירו שיער מהחזה העליון השמאלי באמצעות קרם להסרת שיער.
  11. הכינו את שדה הניתוח עם תמיסת חיטוי. הרימו את העור ובצעו חתך מעגלי בעובי 5-10 מ"מ עם מכת ביופסיה (33-35-SH) כ-7 מ"מ שמאל לעצם החזה ו-7 מ"מ מעל השוליים התת-צלעיים, במרכז המרחב הבין-צלעי6 עד 7.
  12. בדוק את השדה החשוף לכלי דם שטחיים. אם יש צורך בחלוקת כלי גלוי, יש לצרוב את שני הקצוות לשמירה על המוסטזיס. הסר את הרקמה הרכה שמעליה כדי לחשוף את הצלעות בצורה ברורה לפני הכניסה לחלל החזה.
  13. אחיזה והגביה של הצלע השישית או השביעית עם מלקחיים וחוררים בעדינות את השריר הבין-צלעי ביניהם באמצעות מספריים קהים (צד מעוגל הפונה לריאה) כדי להיכנס לחלל החזה.
    הערה: היכנסו בעדינות לחלל החזה ובמבט ישיר כדי להימנע מקרעים בריאות, כלי הדם הבין-צלעיים או הרקמות הסובבות.
  14. הפעילו פרצי אוויר דחוס קצרים ועדינים בפתח הבין-צלעי כדי לרוקן זמנית את פני הריאה הסמוכים ולהפריד אותם מדופן החזה לפני יצירת פתח החלון.
  15. מקם את מכת הביופסיה על כלי החיתוך והנחה את כלי החיתוך דרך הפתח הבין-צלעי, תוך שמירה על מקביל לדופן החזה. תדחוף פגם עגול בקוטר 5 מ"מ בצלעות.
  16. הנח תפר משי 5-0 באורך ~1 מ"מ מקצה הפגם העגול, ועבר בין הצלעות הסמוכות כדי להקיף את הפתח.
  17. הנח את מסגרת החלון כך שקצוות הפגם בדופן החזה יתאימו לחריץ המסגרת, ואז הדק וקבע את תפר הארנק כדי לנעול את המסגרת במקומה.
  18. טעין דבק ג'ל ציאנואקרילט לתוך מזרק בנפח 1 מ"ל. הרימו בעדינות את המסגרת כדי להפריד אותה מהריאה, ואז מרחו שכבה דקה של דבק ציאנואקרילט על פני השטח התחתונים של המסגרת.
  19. ייבשו את פני הריאה באמצעות זרם מתמשך ועדין של אוויר דחוס עד שהמשטח נראה מט.
    הערה: השתמש רק בזרם אוויר עדין והימנע מייבוש ממושך, שכן כוח יתר או ייבוש יתר עלולים לפגוע במשטח הריאה ולפגוע בהידבקות החלון.
  20. באמצעות לחץ נשיפה חיובי (PEEP), מנפח את הריאה ואז הדביק את החלון למסגרת. שחרר את ה-PEEP והשאיר לחץ על מסגרת החלון למשך 20-30 שניות.
    הערה: לחץ עודף במהלך הנפיחה או מיקום המסגרת עלול להזיק לריאה או לפגוע באיטום. הפעילו רק את הלחץ המינימלי הדרוש כדי להגיע לאיפוזציה עדינה.
  21. הנח תפר משי נוסף 5-0 באורך <1 מ"מ מקצה חתך העור. הכניסו את העור מתחת למסגרת, ודאו שכל העור העודף נתפס מתחת למסגרת החלון או נחתך, ואז מהדקים היטב את חוט התיק וקשרו היטב.
  22. באמצעות פיקאפ ואקום, מרחו שכבת דבק דקה מאוד מתחת למשטח הכיסוי בקוטר 5 מ"מ, ומגרדים עודפים מקצה זכוכית כיסוי מלבנית. שוב, ייבשו את משטח הריאה בזרם מתמשך ועדין של אוויר דחוס.
  23. מקמו את הכיסוי המעגלי בתוך שקע מסגרת החלון בזווית רדודה (~15°) מעל פני הריאה. הגבירו לזמן קצר את לחץ דרכי הנשימה כדי לנפח את הריאה, ואז סובבו את הכיסוי למצב מקביל כך שמשטח הריאה יתנגד לתחתית הזכוכית. שמור על לחץ עדין במשך כ-25 שניות בזמן שהדבק מתייצב, ואז נתק את פיקאפ הוואקום מהכיסוי.
    הערה: הימנעו מלכידת בועות או מריחת דבק עודף במהלך הנחת הכיסוי, שכן כל אחד מהם עלול להפחית את איכות התמונה, לשבש את האיטום או לפגוע במשטח הריאה.
  24. מרח כמות קטנה של ציאנואקרילט נוזלי בממשק בין הכיסוי למסגרת המתכת כדי לחזק את האטימה האטומה לאוויר.
  25. חבר מחט סטרילית למזרק אינסולין של 1 מ"ל. הכנס את המחט ממש מתחת לתהליך הזיקפואיד והתקדמו לכיוון הכתף השמאלית דרך הסרעפת אל חלל בית החזה. שאופים בעדינות כדי להסיר שאריות אוויר תוך-חזה.
    הערה: קדימו את המחט בזהירות כדי למנוע ניקוב בריאות, לב או כלי דם עיקריים. שאפו בעדינות ורק עד שהאוויר שנותר יוסר.
  26. כבה איזופלורן והמשך אוורור עם 100% חמצן עד שקצב הנשימה הער כמעט תקין מתחדש. אין להשאיר את החיה ללא השגחה במהלך ההחלמה. אם הנשימה הספונטנית התקינה אינה חוזרת בזמן, יש לספק טיפול תומך מתאים או לבצע המתת חסד בהתאם להנחיות המוסדיות.
  27. הסר את התפר המקבע, הוצא את הצינור מהעכבר, והכנס אותו לכלוב נקי וחמים להחלמה. לעקוב אחרי החיה עד שהיא יוכלה ללכת במלואה; עכברים שאינם מצליחים לשוב לנשימה תקינה צריכים להיות מוותים לפי הנחיות מוסדיות.
  28. מתן הקלה לאחר הניתוח: הזריק 10 מיקרולטר (0.1 מ"ג/ק"ג) של בופרנורפין מדולל ב-90 מיקרוליטר של PBS סטרילי תת-עורית.

3. הדמיה תוך-חיונית

  1. אפשר לעכברים להתאושש לאחר השתלת החלון לפני ההדמיה. בצע הדמיה בין 1 ל-5 ימים לאחר הניתוח.
  2. השרה הרדמה עם 3% איזופלורן, ואז שמירה על 1.5% לאורך כל תקופת ההדמיה.
  3. הכנס את מתאם לוח החלון המותאם אישית בין העור לשוליים החיצוניים של מסגרת חלון ההריאה ומאובטח לוח שלב מיקרוסקופ סטנדרטי באמצעות סרט דבק.
  4. הנח את העכבר עם מתאם מסגרת הבמה-חלון המותאם אישית שמחובר לשלב התרגום של מיקרוסקופ. שמור על טמפרטורת גוף ~37°C באמצעות תא מחומם באוויר מאולץ עם לולאת משוב חיישן טמפרטורה.
  5. עם העכבר על לוח הבמה, משוך בעדינות את העור סביב העין בצד ההזרקה כדי לחשוף את הקנתוס המדיאלי ולהזריק FITC-דקסטרון (150 קילו-דלטון; 20 מ"ג/מ"ל, 100 מיקרוליטר) רטרו-אורביטלי כדי לסמן את כלי הדם.
  6. צילום סנאפשוט, z-stack או תמונות טיים-לאפס של כלי הדם הריאתיים לפני הזרקת חיידקים באמצעות הפרמטרים הבאים.
    1. להגדרות מיקרוסקופיה קונפוקלית: עומק ביט: 12 ביט, קצב פריים: 2 פריימים לשנייה, גודל תמונה: 512 × 512 פיקסלים, גודל פיקסל: 0.497 מיקרומטר/פיקסל, 0.994 מיקרומטר/פיקסל, גודל Z-step: 2 מיקרומטר, עומק z כולל: 50–70 מיקרומטר, ממוצע פריים: 3, מהירות סריקה: 2 מיקרו-שנייה/פיקסל (977 שורות לשנייה), אורכי גל עירור לייזר: 405 ננומטר, 488 ננומטר, 559 ננומטר, עוצמת לייזר בדגימה: 230 מיקרווואט (405 ננומטר), 75 מיקרווואט (488 ננומטר), 40 מיקרווואט (559 ננומטר), מסנני זיהוי: 430-470 ננומטר (כחול), 505-540 ננומטר (ירוק), 575-675 ננומטר (אדום), רווחי גלאי: 800 וולט לכחול, 650 וולט לירוק, 700 וולט לאדום, קוטר חור סיכה: 60 מיקרומטר או יחידת איירי אחת ל-559 ננומטר
    2. במיקרוסקופיה מרובת פוטונים, יש להשתמש באותם פרמטרים של הדמיה כמו במיקרוסקופיה קונפוקלית, למעט שנעשה בשימוש בלייזר עירור של 920 ננומטר עם הספק לייזר של 25 mW בדגימה.
  7. הזרקה רטרו-אורביטלית 5 x 106 CFU tdTomato-expressing mc28471.
    הערה: יש לבצע הזרקות רטרו-אורביטליות רק עם אימון והגבלה מתאימים, שכן טכניקה לא נכונה עלולה לגרום לפציעת עיניים, דימום או כישלון במתן החיסון.
  8. רכוש תמונת מצב, z-stack ותמונות טיים-לאפס של שחפת ותאים וכלי דם מסומנים פלואורסצנטית, תוך שימוש בפרמטרי ההדמיה ב-3.6.1 ו-3.6.2. כוון את הרווח של כל הגלאים כדי למקסם את האות תוך הימנעות מרוויה של הגלאי.
  9. לאחר ההדמיה, כבה איזופלורן והוציא את העכבר מהמיקרוסקופ. שמור על העכבר חם ועקוב עד להחלמה מלאה.
  10. חזרה על הדמיה בנקודות הזמן הבאות לאחר הזרקת MC28471: 0-60 דקות, 6 שעות ו-3 ימים. בכל מפגש הדמיה, הזרקו מחדש את FITC-dextran (100 מיקרוליטר, רטרו-אורביטלי) כדי להמחיש את כלי הדם, ואז לצלם תמונות כפי שמתואר בשלבים 3.8-3.9.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לאחר אלקטרופורציה וברירה של קאנמיצין, מושבות מבודדות של mc28471 הציגו פלואורסצנציה אדומה בוהקת, מה שאישר ביטוי יציב של tdTomatoes. חיידקי MC28471 הורחבו, הוכנו כמתלים חד-תאיים, והועברו תוך-ורידי לעכברים הנושאים WHRIL שהושתל בניתוח. בוצעה הדמיה תוך-חיונית כדי להמחיש את הדינמיקה המוקדמת של זיהום ב-MTB בסביבת המיקרו-סביבה של הריאות. במחקר זה, נרכשו תמונות בסיסיות של כלי הדם הריאתיים לפני הזיהום (איור 1A), ואחריהן תמונות תוך-חיוניות בתוך 60...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פלטפורמה זו מתמודדת עם פער אמיתי במחקר השחפת על ידי אפשרות הדמיה ישירה של חיידקים ואינטראקציות בין תאים מארחים בריאה היונקת שלמה בתנאי BSL-2. אסטרטגיות הדמיה in vivo קודמות, כולל זיהוי אופטי לכל הגוף באמצעות גירוי מיקרואנדוסקופיסיב אופטי 20, הדמיית פלואורסצנציה של אנזים מדווח21, ו-Mtb22 הביטוי חלבון פלואורסצנטי קרוב לאינפרא-אדום, אפשרו ניטור אורכי רגיש של עומס חיידקים ותגובות תרופות, אך הן מודדות רק עומסי חי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה במענקים הבאים: AI26170; קרן משפחת אוולין-ליפר ומרכז הביופוטוניקה גרוס ליפר. אנו מודים לתמיכה מהמתקן להדמיה אנליטית, בתמיכת מענק P30 CA013330 של מרכז הסרטן של NCI.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
15 ml conical tubeCorning430790
2-0 silk tie Ethicon, IncLA55G
5 mm coverslipElectron Microscopy Sciences72296-05
5 mm disposable biopsy punchIntegra33-35-SH
5-0 silk purse-string suture Ethicon, Inc640G
Blunt micro-dissecting scissorsRobozRS-5980
BuprenorphineHospira0409-2012-32הזרקת 10 מיקרוליטר של בופרנורפין (0.3 מ"ג / מ"ל תמיסת בסיס) מדוללת ב- 90 מיקרוליטר של PBS סטרילי (המינון הסופי = 0.1 מ"ג / ק"ג) 
Compressed air canisterFalconDPSJB-12
Cyanoacrylate adhesiveLoctite234790
D-calcium pantothenateAcros243305000
ECM 630 Electroporation System Complete, with Safety standBTX Harvard Apparatus45-0051
Electroporation cuvetteFisher ScientificFB102
FITC-DextranSigma-AldrichFD150S-1G150 kDa
GlycerolFisher ChemicalsG33-1
Graefe forcepsRobozRS-5135לאחיזה והגבהה של הצלע במהלך הליך השתלת חלון הריאה
Isoflurane Pivetal78949580
Isoflurane vaporizerSurgiVetVCT302
KanamycinGoldbio.comK-120-25
L-arginine monohydrochlorideSigma-AldrichA5131-100G
L-leucineSigma-AldrichL8000
MacBlue miceJackson LabsStrain #: 026051
Middlebrook 7H10 AgarDifco262710
Middlebrook 7H9 brothDifco271310
Middlebrook OADC EnrichmentBecton Dickinson 212351
Murine ventilatorKent ScientificPS-02PhysioSuite
NairChurch & Dwight Co., Inc.40002957
PBSCorning21-031-CV
PETG media inkwell bottleThermo Scientific342020
PhysioSuiteKent ScientificPS-5623כדי לפקח על נפח הנשימה של העכבר באמצעות אינטובציה במהלך הניתוח
Plasmid pYUB1169Plasmid מותאם אישית
Rag2 KO miceJackson LabsStrain #: 008449
Small animal lung inflation bulbHarvard Apparatus72-9083
Sodium propionateThermo ScientificA17440.36
SonicatorFisher ScientificFB705
Sorval Centrifuge X pro seriesThermo Scientific75009020
Spectrophotometer Genesys 10 UVThermo Spectronic335903
SurgiSuiteKent ScientificSURGI-M02פלטפורמת ניתוח רב-פונקציונלית לעכברים, עם חימום
Tracheal catheterExelint International2674622G
TyloxapolSigma-AldrichT0307-50G
Vacuum pickup system metal probe Ted Pella, Inc.528-112

מקורות

  1. Scheele, C., et al. Multiphoton intravital microscopy of rodents. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-26 (2022).
  2. Niesner, R. A., Hauser, A. E., Entenberg, D. Life Through a Lens: Technological Development and Applications in Intravital Microscopy. Cytometry A. 97 (5), 445-447 (2020).
  3. Perrin, L., Bayarmagnai, B., Gligorijevic, B. Frontiers in Intravital Multiphoton Microscopy of Cancer. Cancer Rep (Hoboken). 3 (1), e1192(2020).
  4. Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J Cell Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
  5. Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nat Rev Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
  6. Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung. J Vis Exp. (173), e62761(2021).
  7. Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. J Vis Exp. (116), e62761(2016).
  8. Presson, R. G. Jr, et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
  9. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  10. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  11. Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), e29917(2014).
  12. Prunier, C., Chen, N., Ritsma, L., Vrisekoop, N. Procedures and applications of long-term intravital microscopy. Methods. 128, 52-64 (2017).
  13. Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  14. Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).
  15. Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
  16. Magnen, M., et al. Immediate myeloid depot for SARS-CoV-2 in the human lung. Sci Adv. 10 (31), eadm8836(2024).
  17. Neupane, A. S., et al. Patrolling Alveolar Macrophages Conceal Bacteria from the Immune System to Maintain Homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125.e11 (2020).
  18. Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nat Protoc. 15 (3), 1041-1065 (2020).
  19. van de Wall, S., et al. Dynamic landscapes and protective immunity coordinated by influenza-specific lung-resident memory CD8(+) T cells revealed by intravital imaging. Immunity. 57 (8), 1878-1892.e5 (2024).
  20. Nooshabadi, F., et al. Intravital excitation increases detection sensitivity for pulmonary tuberculosis by whole-body imaging with beta-lactamase reporter enzyme fluorescence. J Biophotonics. 10 (6-7), 821-829 (2017).
  21. Sharan, R., Yang, H. J., Sule, P., Cirillo, J. D. Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence. J Vis Exp. (132), e56801(2018).
  22. Sommer, R., Cole, S. T. Monitoring Tuberculosis Drug Activity in Live Animals by Near-Infrared Fluorescence Imaging. Antimicrob Agents Chemother. 63 (12), e01280-19(2019).
  23. Castanheira, F. V. S., et al. Intravital imaging of three different microvascular beds in SARS-CoV-2-infected mice. Blood Adv. 7 (15), 4170-4181 (2023).
  24. Barlerin, D., et al. Biosafety Level 3 setup for multiphoton microscopy in vivo. Sci Rep. 7 (1), 571(2017).
  25. Vilcheze, C., et al. Rational Design of Biosafety Level 2-Approved, Multidrug-Resistant Strains of Mycobacterium tuberculosis through Nutrient Auxotrophy. mBio. 9 (3), e00938-18(2018).
  26. Shinkai, Y., et al. RAG-2-deficient mice lack mature lymphocytes owing to inability to initiate V(D)J rearrangement. Cell. 68 (5), 855-867 (1992).
  27. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
  28. Cohen, S. B., et al. Alveolar Macrophages Provide an Early Mycobacterium tuberculosis Niche and Initiate Dissemination. Cell Host Microbe. 24 (3), 439-446.e4 (2018).
  29. Pandey, A. K., Sassetti, C. M. Mycobacterial persistence requires the utilization of host cholesterol. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (11), 4376-4380 (2008).
  30. Bhatt, A., et al. Deletion of kasB in Mycobacterium tuberculosis causes loss of acid-fastness and subclinical latent tuberculosis in immunocompetent mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (12), 5157-5162 (2007).
  31. Hsu, T., et al. The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (21), 12420-12425 (2003).
  32. Vilcheze, C., Porcelli, S. A., Chan, J., Jacobs, W. R. Jr Sterilization by Adaptive Immunity of a Conditionally Persistent Mutant of Mycobacterium tuberculosis. mBio. 12 (1), e02391-20(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

232232JoVEin vivo
הדמיה תוך-חיונית של מיקובקטריום טוברקולוזיס אוקסוטרופי מוחלש בריאות עכברי במהלך זיהום תוך-כלי מוקדם
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.