פרוטוקול הרכבת סרט להדמיית Z-stack ברזולוציה גבוהה של עיניים מורכבות דרוזופילה

Summary

המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לאפשר הדמיה לא הרסנית וניתוח כמותי של עיני תרכובת דרוזופילה. הוא משלב אסטרטגיית הרכבת סרט עם רכישת Z-stack סטריאומיקרוסקופית ושחזור עומק מורחב ליצירת תמונות ברזולוציה גבוהה וללא ארטיפקטים.

Abstract

כאן אנו מציגים פרוטוקול התקנה ודימות לא הרסני לניתוח פנוטיפי ברזולוציה גבוהה של עין התרכובת דרוזופילה. הפנוטיפ המדויק של עין תרכובת דרוזופילה מוגבל לעיתים קרובות על ידי הגאומטריה הקמורה והשבריריות המכאנית במהלך הטיפול. כדי להתמודד עם זה, אנו מפרטים תהליך דימות ורסטילי ולא פולשני שמאפשר ויזואליזציה ברזולוציה גבוהה ממספר זוויות. הפרוטוקול משתמש באסטרטגיית הרכבה מותאמת אישית עם דבק על פלטפורמת סרט הפוך, המאובטח את הזבובים על ידי הגוף והכנפיים תוך שמירה על הראש ללא פגיעה. חשוב לציין, תצורה גמישה זו תומכת בכיווני התקנה מובחנים: מיקום צידי ללכידת מלוא הקמירות של העיניים הבודדות, ומיקום קדמי להערכת סימטריה של כל הראש. שיטה זו גם מקלה על סידור מערכים בצפיפות גבוהה, ומאפשרת עיבוד מהיר של 20–30 דגימות בכל מפגש. על ידי שילוב סטריאומיקרוסקופיה של אור מוחזר עם רכישת Z-stack ושחזור עומק מורחב (EDF), תהליך העבודה יוצר תמונות קומפוזיט חדות וכמעט תלת-ממדיות. גישה זו שומרת על פיגמנטציה טבעית ומייצרת תמונות עשירות באיכות גבוהה ובניגודיות, המתאימות לניתוח פנוטיפי בקנה מידה כמותי באיברים.

Introduction

עין התרכובת Drosophila melanogaster היא מודל קלאסי ועוצמתי לחקר גדילת איברים, דפוסים ועמידות במהלך ההתפתחות. העין המורכבת מכ-800 אומטידיות מסודרות מאוד, ומספקת קריאה רגישה וניתנת לכימות של הפרעות גנטיות המשפיעות על התפשטות, התמיינות וארגון רקמות ^1,2,3. מניפולציה גנטית של התפתחות העין הניבה היסטורית תובנות יסודיות לגבי מסלולי איתות משומרים. מחקרים יסודיים הראו כי ביטוי חוץ-רחמי של גורם השעתוק ללא עיניים מספיק כדי לגרום להיווצרות עיניים ברקמות שאינן רשתית, ובכך קבע את העין כפרדיגמה להגדרת איברים ופלסטיות⁴. מחקרים מאוחרים יותר זיהו את מסלול האיתות של ההיפופוטם D. melanogaster כרגולטור מרכזי לגודל העין ומספר התאים באמצעות שליטה מתואמת של התרבות ואפופטוזיס ^5,6. במקביל, הוכח כי איתות Hedgehog ו-BMP מווסתים התקדמות מורפוגנטית, דיוק גדילה ודפוס מרחבי בתוך הרשתית^{המתפתחת 7,8}.

עם זאת, צילום תמונות מדויקות של העין המורכבת הבוגרת מציב אתגרים אופטיים משמעותיים בשל הגיאומטריה הקמורה והחצי-כדורית שלה. מיקרוסקופ שדה בהיר סטנדרטי מוגבל על ידי עומק שדה רדוד, מה שהופך את המיקוד בו זמנית בנקודה הגבית ביותר (קוטב) ובקצוות השוליים (קו המשווה) של העין בחשיפה^{אחת 9}. מגבלה זו גורמת לעיתים קרובות לתמונות שבהן חלקים משמעותיים משטח הרשתית מטושטשים, מה שמקשה על יישום כלי ניתוח תמונות ברזולוציה גבוהה ולמידת מכונה שנועדו לכמת פנוטיפים מגוונים. כדי לאפיין במלואו את פני הרשתית, יש להמחיש את כל העקמומיות ללא ארטיפקטים אופטיים. לכן, נדרשת שיטת הדמיה המשמרת על מורפולוגיית עיניים טבעית תוך אפשרות הדמיה ברזולוציה גבוהה של כל פני השטח המעוקלים של הרשתית.

יתרה מזאת, שיטות הכנת דגימות מסורתיות למיקרוסקופיה לעיתים קרובות פוגעות בשלמות המבנית של ראש הזבוב. טכניקות התקנה קונבנציונליות מסתמכות לעיתים קרובות על דבקים שיכולים להסתיר פרטים על פני השטח או לכלול מניפולציה פיזית עם פינצטה שמפעילה לחץ על קפסולת הראש. כפי שצוין במחקרים על מורפוגנזה של הרשתית, שלמות העין היא בעלת חשיבות עליונה. לחץ ישיר או דקירה גורמים לדליפת המולימפ, מה שמוביל לאובדן לחץ פנימי ולקריסה או "שקיעה" של פני העין. חפצים מכניים אלו יכולים לחקות פנוטיפים ניווניים או פגמים גנטיים, מה שמוביל לתוצאות חיוביות שגויות בסקרים רחבי היקף. מטרת פרוטוקול זה היא לספק תהליך התקנה ודימות לא הרסני לוויזואליזציה ברזולוציה גבוהה של עיניים מורכבות של דרוזופילה שלמות.

כאן אנו מציגים תהליך דימות מהיר וניתן לשחזור המאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של עיניים שלמות של תרכובת הדרוזופילה ומורפולוגיית הראש כולו ללא מגע ישיר עם הראש. בשיטה זו, זבובים בוגרים משותקים באמצעות אסטרטגיית הרכבה גמישה שמאבטחת את הגוף והכנפיים, ומאפשרת מיקום יציב בכיוון צדדי—ללכידת העקמומיות המלאה של עין אחת—או בכיוון חזיתי—כדי להעריך סימטריה של כל הראש ותכונות בין-עיניות. אסטרטגיית ההתקנה הרב-שימושית הזו מפחיתה נזק מכני ושומרת על גאומטריית העין הטבעית בתלת-ממד. בשילוב עם מיקרוסקופיה סטריאוסקופית באור מוחזר, רכישת Z-stack ושחזור עומק מוקד מורחב⁹, גישה זו יוצרת תמונות חדות ואיכותיות באופן אחיד מזוויות שונות, המתאימות הן לבדיקה איכותית והן לניתוח פנוטיפי כמותי. שיטה זו מתאימה במיוחד למחקרים של הפרעות גנטיות, פנוטיפים התפתחותיים וסינון מהיר של מורפולוגיית עיניים בדרוזופילה.

Protocol

1. איסוף דגימות וסינכרון

הערה: כדי להבטיח השוואה ניסיונית, נדרשת שליטה קפדנית על תזמון האקלוזיה. בתנאי תרבית סטנדרטיים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, אקלוזיה מתרחשת בדרך כלל 10 עד 12 ימים לאחר הטלת הביצים. יש לעקוב מקרוב אחרי הגולם במהלך חלון זה, שכן ההחשכה של כיסוי הגולם מצביעה על אקלוזיה קרובה.

1. שיטת טפיחה ישירה (שיטה סטנדרטית)
   1. הקישו בעדינות את בקבוקון תרבית הדרוזופילה הסטנדרטי בגודל 24 על 95 מ"מ (אטום עם פקק קצף) על כרית רכה כדי להוציא זבובים בוגרים לתחתית.
   2. הסר במהירות את הפקק ויישר את הפה של בקבוקון איסוף טרי עם בקבוקון התרבית.
   3. הפוך את ההגדרה כך שבקבוקון התרבות יהיה למעלה. הקישו בעדינות על הקירות כדי להעביר את הזבובים לבקבוקון האיסוף.
      הערה: שיטה זו אינה מומלצת אם המזון הסטנדרטי עם קמח תירס-אגר לח, שכן זבובים שנסגרו זה עתה נלכדים בקלות ולהרוג אותם. כדי למזער תמותה, בתחילה אוספים זבובים לתוך בקבוקון ריק בגודל 24 על 95 מ"מ. לאחר ההרדמה (שלב 3), העבירו את הזבובים לדופן הפנימית של בקבוקון בגודל 24 על 95 מ"מ המכיל מדיום מזון טרי.
2. שיטת העברת גאוטאקסיס שלילית (שיטת אנטי-הידבקות)
   1. הסר את הפקק מבקבוקון איסוף חדש והפך אותו על הספסל כדי למנוע כניסת זבובים תועה.
   2. החזק את בקבוקון התרבות כשהפתח פונה כלפי מטה. זבובים מטפסים כלפי מעלה לכיוון צד המזון, הרחק מהפתח.
   3. לאחר שהפתח מתפנה מזבובים, פתח במהירות את בקבוק התרבית ויישר אותו עם בקבוקון האיסוף ההפוך בגודל 24 על 95 מ"מ שעל הספסל.
   4. הקישו בעדינות על נקודת החיבור על הספסל כדי להניח את הזבובים לתוך בקבוקון האיסוף.
      הערה: שיטה זו מפחיתה משמעותית את התמותה הנגרמת מהיצמדות מזון אך גוזלת זמן רב יותר מנקישה ישירה.
3. שיטת ההרדמה CO₂ (שיטת יעילות גבוהה)
   1. הפוך את הבקבוקון כך שהפלאג יפנה כלפי מטה.
   2. הכנס בזהירות את המחט של אקדח ההרדמה CO₂ בין הפקק לדופן הבקבוקון.
   3. הפעל בעדינות את דוושת הרגל ושסתום היד כדי לשחרר 100% CO₂ בקצב זרימה נמוך ועדין.
   4. לאחר שהזבובים מורדמים ונפלו על הפקק, מניחים את בקבוקון התרבית אופקית. הסר את הפקק, יישר עם בקבוקון איסוף ריק, וטפח בעדינות על בקבוקון התרבית כדי להעביר את הזבובים המורדמים לתוך בקבוק האיסוף.
      הערה: זרימת אוויר מופרזת עלולה להניח זבובים על פני המזון, ולגרום להידבקות ולמוות; שמרו בקפדנות על זרימת_CO2 עדינה מספיקה כדי להרדים את הזבובים מבלי להזיז אותם פיזית. המוניטור טס מקרוב לסימנים מוקדמים של החלמה, כמו עוויתות עדינות או תנועות של הכנפיים והרגליים.
4. תיוג ותחזוקה
   1. סמן את בקבוקון האיסוף עם המין, תאריך האיסוף, תאריך האקלוקוזיה, הגנוטיפ ותנאי התרבית.
   2. הפרדת מין: אם הדמיה עפה מעל 10 ימים, מפרידים בין זכרים לנקבות לבקבוקי תרבית שונים המכילים מזון כדי למנוע הזדווגות והופעת דור F2, מה שעלול להפריע לסביבה הניסויית.
      הערה: ניתן לשמור זבובים בבקבוקים המכילים מזון בתנאי תרבית קודמים (למשל, 25 מעלות צלזיוס) עד שיגיעו לגיל הרצוי להדמיה.

2. הכנת לוח ההרכבה

1. קבל סלייד זכוכית סטנדרטי נקייה.
2. חתכו רצועת נייר דבק לבן שאורכה בערך 2 ס"מ מהשקופית.
3. הנח את הסרט על הסלייד כשהצד הדביק פונה כלפי מעלה (הצד הלא-דביק נגד הזכוכית). ודא שהסרט בולט מעל הסלייד בכ-1 ס"מ משני הקצוות.
4. אבטח את הקצוות הבולטים על ידי עטיפת שני רצועות סרט נוספות באורך ~5 מ"מ חזק סביב גב המחסנית.
5. ודאו שמשטח הדבק שטוח, מתוח וללא קמטים.
6. תיוג: סמן מדדי כיוון (למשל, "למעלה/למעלה" ו"למטה/למטה") או מזהי דגימות בקצוות הלא-דביקים של הסרט כדי להקל על מעקב כיוון ודגימות תחת המיקרוסקופ.
   הערה: בעת בחירת זבובים להדמיה, הימנעו מבחירת אנשים עם פערי גודל גוף משמעותיים. גם עם הגדלה זהה, שינויים בגודל הגוף עלולים לגרום לשטחי פנים עין מורכבים שאינם דומים.

3. המתת חסד והרכבה

1. המתת חסד
   1. העבר את הזבובים לבקבוק איסוף אטום וריק.
   2. הניחו את הבקבוקון האטום במקפיא בטמפרטורה של מינוס 80°C למשך 15–20 דקות.
      אזהרה: לעולם אל תנקב או תלחץ על הזבוב בקצות החדים של פינצטה דקה. אפילו דליפה קלה של המולימפה גורמת לאובדן מהיר של לחץ הידרוסטטי פנימי, מה שמוביל לשקעים מיידיים ולקריסה בלתי הפיכה של העין המורכבת, מה שפוגע באיכות ההדמיה.
2. הרכבה לתצוגה צדדית (עין מורכבת יחידה)
   1. מיקום: תחת מיקרוסקופ סטריאופרי סטנדרטי (למשל, Nikon SMZ745), השתמש במלקשים מדויקים כדי לכוון את הזבוב שהורס למצב צדדי (מונח בצד).
   2. העברה: באמצעות פינצטה דקה, אחיזה עדינה בזבוב בכנף (שמירה על היציבה הצידית) והעבירה ללוח ההדבקה המוכן.
   3. קיבוס: הדביק צד אחד של גוף הזבוב לסרט הדביק. פרוש את הכנפיים והדביק אותן שטוחות על הסרט כדי להגדיל את היציבות.
   4. ניהול איברים: במהלך ההרכבה, ודא שהרגליים אינן חוסמות את העין המורכבת. אם הרגליים הקדמיות חוסמות את שדה הראייה, השתמש בפינצטה כדי למשוך אותן בזהירות מהעין ולהדביק אותן היטב לסרט (למשל, להאריך אותן כלפי מטה או להחביא מתחת לחזה).
   5. קבעה: הטה את הפינצטה והשתמש בצד הקצה (לא בנקודה החדה) כדי ללחוץ בעדינות את הגוף אל הסרט כדי להבטיח קשר יציב.
   6. התאמה עדינה: בדוק אם הראש אופקי. אם העין אינה על מישור מוקד אחד, השתמש בפינצטה כדי לכוון את זווית הגוף.
3. התקנה לתצוגה קדמית (ראש שלם)
   1. מיקום: על כרית ההרדמה, כוון את הזבוב למצב שכיבה-בטן-צד כלפי מטה (שכיבה).
   2. העברה: השתמש בפינצטה כדי לאחוז בכנף אחת ולהרים את הזבוב. העבר אותו ללוח ההדבקה.
   3. קיבוע ראשוני: פתח בעדינות את שתי הכנפיים החוצה (שמאלה וימינה) ולחץ אותן בחוזקה על משטח הדבק כדי לעגן את הזבוב.
   4. ייצוב הגוף: לחץ בעדינות על החזה כדי להבטיח מגע מלא עם לוח הדבק. השתמש בפינצטה כדי לאחוז בעדינות בבטן האחורית (הזנב) ומשוך בעדינות ליישר את ציר הגוף לפני הדבקת הבטן לסרט.
   5. כיוון הראש: כוון את זווית הראש באמצעות פינצטה עדינה כדי להבטיח שמישור החזית (הפנים) מקביל למשטח הדבק. שתי העיניים המורכבות צריכות להיות ישרות ונראות באותו מישור מוקד.
4. סידור
   1. התקן מספר זבובים בשורות מקבילות או במערך דמוי רשת על פני השטח הדביק. ודאו שזבובים בודדים אינם חופפים כדי למנוע הפרעות ב-Z-stack, אם כי מותר אריזה צמודה כדי למקסם את קצב התפוקה (למשל, 20–30 זבובים בכל מחסנית). יישר את כל הזבובים כשראשיהם פונים לאותו כיוון (כפי שמצוין בתוויות בשלב 2.6) כדי להקל על הדמיה שיטתית.
   2. הכינו מערכי דגימות נפרדים להדמיה צדדית וחזיתית באמצעות קבוצות שונות של זבובים שהושמדו מאותה קבוצה. לאחר שזבוב נדבק לסרט, לא ניתן להסיר אותו או למקם אותו בבטחה מבלי לגרום לנזק מכני חמור לדגימה; לכן, לא ניתן לצלם מספר תצוגות ברצף מאותו אדם.
      הערה: מומלץ מאוד לצלם את הדגימות מיד לאחר המתת חסד וההתקנה כדי למנוע ייבוש רקמות.

4. רכישת תמונה

1. הפעלה ואתחול של מערכת הדמיה סטריאומיקרוסקופית ממונעת
   1. הדלק את המחשב, המסך ויחידת המיקרוסקופ ברצף.
   2. השיק את תוכנת LAS X.
   3. כאשר מופיעה הפקודה "אתחול/בדיקה עצמית", ודא שהמרווח מתחת למטרה נקי ממכשולים ולחץ על אישור. אפשר למיקרוסקופ להשלים את תנועת הכיול המלאה של ציר Z.
      הערה: השלבים הבאים מותאמים למיקרוסקופ סטריאופיאולוגי עם מערכת התוכנה LAS X.
2. מיקום דגימות ותאורה
   1. העבר את לוח ההרכבה המוכן לפלטפורמת הבסיס של המיקרוסקופ הסטריאופי הממונע, תוך מיקום ידני כך שהדגימה הראשונה במרכז המערך תחת מטרת המצלמה הדיגיטלית.
   2. הדליק את מקורות האור המשודר (בסיס) ואת האור הנכנס (למעלה). להדמיית עיניים מורכבת, השתמשו בעיקר באור מוחזר. כוון את הצמצם כדי להבטיח תאורה אחידה.
3. תצורת תוכנה
   1. הגדר את מצב הרכישה ל-Z-stack. בסביבות הפרויקט, קבע את עדיפות התנועה הרב-ממדית ל-'Z-first' כדי להבטיח הפעלה רציפה ויציבה של הנעת המנוע.
   2. הגדר את מצב ההדמיה לאור מוחזר.
   3. הפעל עומק מורחב (EDF) כדי לאפשר סינתזה של תמונה ממוקדת במלואה.
   4. בהגדרות המתקדמות של התמונה, הפעל טווח דינמי גבוה (HDR). מומלץ מאוד להפחית את ההדגשות הספקולריות והחשיפה המופרזת הנגרמים בדרך כלל על ידי פני השטח המחזירים והכיטיניים של העין המורכבת.
4. מיקום ואיזון לבן
   1. כוונו את כפתור ההגדלה לרמה המתאימה (למשל, גורם זום של פי 16 לתצוגה צדדית בעין אחת, ופי 12.5 לתצוגה הקדמית המלאה של הראש), כדי להבטיח שהאזור הספציפי תופס חצי עד שני שליש משדה הראייה.
   2. מקם ידנית את לוח ההרכבה כך שהחזה של הזבוב למרכז שדה הראייה.
   3. בצע כיול איזון לבן באמצעות החזה לתיקון טמפרטורת הצבע.
5. חשיפה ופרמטרי הדמיה (ערכי ייחוס)
   חשיפה: 60–80 מילישניות.
   רווח: 0–5 (שמור נמוך כדי למזער רעש).
   עוצמה: 60%–80%.
   גודל שלב ב-Z-stack: סטנדרטי: 8–12 מיקרון.
   הערה: לעיניים חלקות ובריאות (למשל, w¹¹¹⁸ × GMR-GAL4), גדלי צעדים עד 15 מיקרון עשויים להספיק, שכן העקמומיות הרציפה והסדירה דורשת פחות חתכים אופטיים. עם זאת, עבור פנוטיפים עיניים גסים או לא אחידים המאופיינים בשינויים טופולוגיים חדים, נדרשים גדלי צעדים קטנים יותר (עד 5 מיקרון) כדי ללכוד פרטים מבניים עדינים ולשפר משמעותית את דיוק השחזור של EDF.
6. הגדרת ולכידת Z-Stack
   1. לתצוגה רוחבית: הגדר את טווח ערימת ה-Z מהשפה המסלולית (התחלה) לאומטידיה המרכזית (קצה) באמצעות גודל צעד של 8–12 מיקרון.
   2. לתצוגה קדמית: כוון את כפתור הפוקוס עד שהקווי המתאר החיצוניים של העיניים המורכבות בדיוק בפוקוס (התחלה). כוון את המיקוד בכיוון ההפוך עד שהאוצ'לי המרכזי (עיניים צהובות-פשוטות) בחלק העליון של הראש פשוט בפוקוס (סוף). לחץ על 'הגדר סיום'.
   3. לחץ על עצור בשידור חי כדי להקפיא את התצוגה המקדימה.
   4. לחץ על התחל רכישה. המערכת תתפוס אוטומטית את מישורי המוקד המוגדרים ותסנתז תמונה ברזולוציה גבוהה וממוקדת במלואה.
7. שמירת קבצים:
   1. לאחר סיום שחזור ה-EDF, לחץ על סמל השמירה בממשק התוכנה (או עבור לקובץ > Save As).
   2. בחר את תיקיית היעד, הזן את שם הקובץ המיועד, ולחץ על שמור.
   3. יש לשים לב שכל רכישה מייצרת שלושה קבצי תמונה מובחנים: א. תמונה גולמית/ערוץ (גווני אפור); ב. תצוגת צבע מקדימה; ג. תמונה מורכבת של EDF (עם הסיומת "_Composite")
      הערה: יש לשמור גם את תמונת ה-RAW/ערוץ וגם את תמונת ה-EDF המורכבת לצורך ניתוח ותיעוד

Results

צינור הניסוי המלא, מאיסוף דגימות ועד רכישת תמונות, מסוכם באיור 1. היעילות של הפרוטוקול המותאם מודגמת באמצעות יצירת מערכי דגימות בצפיפות גבוהה. כפי שמוצג באיור 2A, ניתן לסדר 20–30 זבובים מונדים בתבנית רשת על פלטפורמת סרט הפוך אחת. סימני כיוון הכתובים בקצוות הלא-דביקים של הסרט מבטיחים כיוון ראש עקבי, מה שמקל על הדמיה מהירה ושיטתית עם מינימום התאמות שלבים. חשוב לציין, שיטה זו מסטנדרטית את תהליך הקיבוע ומאפשרת יצירה מהירה של מערכים ...

Discussion

העין המורכבת של דרוזופילה משמשת כקריאה פנוטיפית עוצמתית לסינון גנטי, שבו שינויים נראים בגודל העין, מחוספסות או פיגמנטציה ^2,3,8 מעידים לעיתים קרובות על הפרעות במסלולי איתות בסיסיים כמו היפופוטם ^5,6 או קיפוד 7. עם זאת, היעילות של מסכים כאלה נתקלה זמן רב בצוואר בקבוק בשל מגבלות תהליכי הדימות המסורתיים. טכניק...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מיכל גז פחמן דו-חמצני (CO2)	ספק מקומי	לא זמין
אקדח הרדמה CO2	T& L	DG-08
מצלמת מיקרוסקופ דיגיטלית	לייקה	DMC6200
פינצטה עדינה	וטוס	MOS-167B
פקקי קצף	דונגפנג	לא זמין
תוכנת רכישת תמונות (LAS X)	לייקה	3.7.1
תוכנת עיבוד תמונה (FIJI/ImageJ)	NIH	קוד פתוח
מאיר כיפה LED	לייקה	LED5000 HDI
תאורת צוואר אווז LED	קוסים	LG-10
סטריאוסקופ ממונע	לייקה	M205 FCA
עדשת אובייקטיבי	לייקה	1.0x PlanApo NA0.2
שסתום פדלי רגל פנאומטי	דלקסי	FV-320
בקבוקי תרבות דרוזופילה סטנדרטיים	לייבור	2424951
מדיום מזון סטנדרטי של דרוזופילה	לא זמין	קמח תירס-אגר-מולסה
שקופיות זכוכית סטנדרטיות	ציטוטסט	10127101P-G
סטריאומיקרוסקופ סטנדרטי	ניקון	SMZ745
סרט מסכה לנייר לבן	UBWIN	רוחב 25 מ"מ