פרוטוקול הרכבת סרט להדמיית Z-stack ברזולוציה גבוהה של עיניים מורכבות דרוזופילה

Summary

המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לאפשר הדמיה לא הרסנית וניתוח כמותי של עיני תרכובת דרוזופילה. הוא משלב אסטרטגיית הרכבת סרט עם רכישת Z-stack סטריאומיקרוסקופית ושחזור עומק מורחב ליצירת תמונות ברזולוציה גבוהה וללא ארטיפקטים.

Abstract

כאן אנו מציגים פרוטוקול התקנה ודימות לא הרסני לניתוח פנוטיפי ברזולוציה גבוהה של עין התרכובת דרוזופילה. הפנוטיפ המדויק של עין תרכובת דרוזופילה מוגבל לעיתים קרובות על ידי הגאומטריה הקמורה והשבריריות המכאנית במהלך הטיפול. כדי להתמודד עם זה, אנו מפרטים תהליך דימות ורסטילי ולא פולשני שמאפשר ויזואליזציה ברזולוציה גבוהה ממספר זוויות. הפרוטוקול משתמש באסטרטגיית הרכבה מותאמת אישית עם דבק על פלטפורמת סרט הפוך, המאובטח את הזבובים על ידי הגוף והכנפיים תוך שמירה על הראש ללא פגיעה. חשוב לציין, תצורה גמישה זו תומכת בכיווני התקנה מובחנים: מיקום צידי ללכידת מלוא הקמירות של העיניים הבודדות, ומיקום קדמי להערכת סימטריה של כל הראש. שיטה זו גם מקלה על סידור מערכים בצפיפות גבוהה, ומאפשרת עיבוד מהיר של 20–30 דגימות בכל מפגש. על ידי שילוב סטריאומיקרוסקופיה של אור מוחזר עם רכישת Z-stack ושחזור עומק מורחב (EDF), תהליך העבודה יוצר תמונות קומפוזיט חדות וכמעט תלת-ממדיות. גישה זו שומרת על פיגמנטציה טבעית ומייצרת תמונות עשירות באיכות גבוהה ובניגודיות, המתאימות לניתוח פנוטיפי בקנה מידה כמותי באיברים.

Introduction

עין התרכובת Drosophila melanogaster היא מודל קלאסי ועוצמתי לחקר גדילת איברים, דפוסים ועמידות במהלך ההתפתחות. העין המורכבת מכ-800 אומטידיות מסודרות מאוד, ומספקת קריאה רגישה וניתנת לכימות של הפרעות גנטיות המשפיעות על התפשטות, התמיינות וארגון רקמות ^1,2,3. מניפולציה גנטית של התפתחות העין הניבה היסטורית תובנות יסודיות לגבי מסלולי איתות משומרים. מחקרים יסודיים הראו כי ביטוי חוץ-רחמי של גורם השעתוק ללא עיניים מספיק כדי לגרום להיווצרות עיניים ברקמות שאינן רשתית, ובכך קבע את העין כפרדיגמה להגדרת איברים ופלסטיות⁴

Protocol

1. איסוף דגימות וסינכרון

הערה: כדי להבטיח השוואה ניסיונית, נדרשת שליטה קפדנית על תזמון האקלוזיה. בתנאי תרבית סטנדרטיים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, אקלוזיה מתרחשת בדרך כלל 10 עד 12 ימים לאחר הטלת הביצים. יש לעקוב מקרוב אחרי הגולם במהלך חלון זה, שכן ההחשכה של כיסוי הגולם מצביעה על אקלוזיה קרובה.

1. שיטת טפיחה ישירה (שיטה סטנדרטית)
   1. הקישו בעדינות את בקבוקון תרבית הדרוזופילה הסטנדרטי בגודל 24 על 95 מ"מ (אטום עם פקק קצף) על כרית רכה כדי להוציא זבובים בוגרים לתחתית.
   2. הסר במהירות את הפקק ויישר את הפה של בקבוקון איסוף טרי עם בקבוקון התרבית.
   3. הפוך את ....

Results

צינור הניסוי המלא, מאיסוף דגימות ועד רכישת תמונות, מסוכם באיור 1. היעילות של הפרוטוקול המותאם מודגמת באמצעות יצירת מערכי דגימות בצפיפות גבוהה. כפי שמוצג באיור 2A, ניתן לסדר 20–30 זבובים מונדים בתבנית רשת על פלטפורמת סרט הפוך אחת. סימני כיוון הכתובים בקצוות הלא-דביקים של הסרט מבטיחים כיוון ראש עקבי, מה שמקל על הדמיה מהירה ושיטתית עם מינימום התאמות שלבים. חשוב לציין, שיטה זו מסטנדרטית את תהליך הקיבוע ומאפשרת יצירה מהירה של מערכים .......

Discussion

העין המורכבת של דרוזופילה משמשת כקריאה פנוטיפית עוצמתית לסינון גנטי, שבו שינויים נראים בגודל העין, מחוספסות או פיגמנטציה ^2,3,8 מעידים לעיתים קרובות על הפרעות במסלולי איתות בסיסיים כמו היפופוטם ^5,6 או קיפוד 7. עם זאת, היעילות של מסכים כאלה נתקלה זמן רב בצוואר בקבוק בשל מגבלות תהליכי הדימות המסורתיים. טכניק.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מיכל גז פחמן דו-חמצני (CO2)	ספק מקומי	לא זמין
אקדח הרדמה CO2	T& L	DG-08
מצלמת מיקרוסקופ דיגיטלית	לייקה	DMC6200
פינצטה עדינה	וטוס	MOS-167B
פקקי קצף	דונגפנג	לא זמין
תוכנת רכישת תמונות (LAS X)	לייקה	3.7.1
תוכנת עיבוד תמונה (FIJI/ImageJ)	NIH	קוד פתוח
מאיר כיפה LED	לייקה	LED5000 HDI
תאורת צוואר אווז LED	קוסים	LG-10
סטריאוסקופ ממונע	לייקה	M205 FCA
עדשת אובייקטיבי	לייקה	1.0x PlanApo NA0.2
שסתום פדלי רגל פנאומטי	דלקסי	FV-320
בקבוקי תרבות דרוזופילה סטנדרטיים	לייבור	2424951
מדיום מזון סטנדרטי של דרוזופילה	לא זמין	קמח תירס-אגר-מולסה
שקופיות זכוכית סטנדרטיות	ציטוטסט	10127101P-G
סטריאומיקרוסקופ סטנדרטי	ניקון	SMZ745
סרט מסכה לנייר לבן	UBWIN	רוחב 25 מ"מ