לאחר פתרון מרחבי, פרופיילינג מולטיאומי חד-תאי משולב של מטרות טרנסקריפטום ואפיגנומיה בחתכי רקמה קפואים.

Summary

מחקר זה מציג פרוטוקול מולטיאום מרחבי Trekker–CUT&Tag, המשלב ברקידוד מרחבי ישיר של חתך רקמה עם ניתוח מולטיאום חד-תאים. גישה זו מאפשרת פרופילינג חד-תאי של ביטוי גנים ושינוי ההיסטון H3K27ac בו-זמנית, ומציעה תובנות מכניות על ויסות גנים בהקשר של מיקרואנטומיה של רקמות.

Abstract

טכנולוגיות מולטיאומיות מרחביות בשילוב עם פרופילינג של תא יחיד מציעות הזדמנויות חסרות תקדים להבהיר את הארכיטקטורה המולקולרית והתאית של רקמות מורכבות. שילוב של ברקידוד מרחבי של גרעינים בתוך קריוסקטים בודדים המוכנים מגושמי רקמה המוטמעים במדיום הקפאה בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) עם בדיקות מולטיאומיות חד-תאיות לתהליך עבודה פשוט ויעיל יכול להקל על ההערה והניתוח המולקולרי המרחב של תאים בסוגי רקמות. מחקר זה מדווח על חיתוך מרחבי תחת גישת מולטי-אום CUT&Tag (CUT&Tag) שמפרפרת בו-זמנית את שינוי ההיסטון H3K27ac ואת ביטוי הגנים במקטע מוח קפוא יחיד. לאחר ברקידוד מרחבי, גרעינים בודדים מבודדים ונחשפים ל-CUT&Tag, לכידת DNA, RNA וברקודים מרחביים משולבים, הכנת ספרייה וריצוף. זרימת העבודה מייצרת פרופילים אפיגנומיים וטרנסקריפטומיים בעלי ערות מרחבית מאותם גרעינים, ומאפשרים הקצאת המידע המולטיאומי לקואורדינטות אנטומיות. שילוב מידע אפיגנומי עם נתונים טרנסקריפטומיים מרחביים מעלה את הדיוק של זיהוי סוגי התאים וחושף תוכניות רגולטוריות מאורגנות במרחב ואינטראקציות בין תא לתא בתוך רקמות שלמות.

Introduction

ביולוגיה מרחבית היא תחום המתקדם במהירות שממפה את המיקום, הארגון והאינטראקציות של מולקולות, תאים ורקמות בסביבתם הטבעית ^1,2,3. בניגוד לשיטות תא בודדות בכמויות גדולות או קונבנציונליות שדורשות פירוק רקמתי וגורמות לאובדן מידע מיקומי, גישות מרחביות שומרות על הקואורדינטות הפיזיות של אנליטים או תאים/גרעינים, ומאפשרות חקירה ישירה של האופן שבו ארכיטקטורת הרקמה משפיעה על זהות תא, תקשורת בין-תאית ותפקוד ביולוגי 4,5,6,7 . בעוד שטרנסקריפטומיקה מרחבית ופרוטאומיקה מרחבית הן כיום המודאליות הנפוצות ביותר, התחום מתרחב במהירות לעבר פרופיל רב-אומי מרחבי ^3,8,9. קופרופילינג של ביטוי גנים ומצבים אפיגנומיים בתוך אותה רקמה הוא עוצמתי במיוחד, שכן הוא מקשר ישירות בין תפוקת השעתוק למנגנוני ויסות — כגון נגישות כרומטין ושינויים בהיסטונים — השולטים בפעילות הגנים וידועים כמשתנים בין תחומים מרחביים 10,11,12 . לכן, ניתוח אפיגנום מרחבי משולב וטרנסקריפטום יספק תובנות קריטיות לגבי האופן שבו תוכניות רגולטוריות מעצבות זהות תאית וארגון רקמות.

פותחו מספר אסטרטגיות מולטיאומיות מרחביות כדי לאפשר פרופילינג אפיגנומי וטרנסקריפטומי בו-זמנית. ברקודינג דטרמיניסטי בריצוף רקמות (DBiT-seq) משתמש בערוצים מיקרופלואידיים כדי להעביר ברקודים מרחביים ישירות או בעקיפין, באמצעות חותמת לוחות ג'ל, לחתכי רקמה, ומאפשר הערות מרחביות של אנליטים. גישה זו מאפשרת קופרופילינג מרחב של תכונות אפיגנומיות וטרנסקריפטומיות 12,13,14,15. שיטת Slide-tag, שמסחרית כפלטפורמת Takara Trekker, מכניסה ישירות ברקודים מרחביים לרקמות שלמות לפני הדיסוציאציה, ומאפשרת עיבוד גרעינים מאונדקסים מרחבית באמצעות זרימות עבודה סטנדרטיות של תא יחיד ולהקרינה חישובית חזרה לקואורדינטות הרקמה המקוריות^{שלהם 16}. לעומת זאת, הבדיקה המרחבית לכרומטין נגיש, שושלות תאים וביטוי גנים באמצעות ריצוף (SPACE-seq) משתמשת באסטרטגיית יעד החוצה שבה מטרות אפיגנטיות עם זנב פולי(A) ו-mRNA נלכדים על רצף לכידת פולי-dT באריחי טרנסקריפטומיקה מרחבית¹⁷.

חיתוך מתחת למטרות ותיג (CUT&Tag) הוא כלי עוצמתי למיפוי אינטראקציות בין DNA לחלבונים היסטונים או לא-היסטונים מדגימות בעלות קלט נמוך מאוד¹⁸. CUT&Tag מסתמך על פיצול כרומטין Tn5 המתווך על ידי טרנספוזה ותיוג DNA (תיוג), תוך שימוש ב-Tn5 מונחה על ידי נוגדנים עם חלבון A, מצורף לחיתוך ספציפי ללוקוס ולסימון מולקולרי. בעוד שמבחן CUT&Tag הקונבנציונלי כולל שלבי דגירה ושטיפה מרובים, נעשה שימוש בזרימת עבודה פשוטה ויעילה של CUT&Tag לשיפור יעילות CUT&Tag ביישומים מולטי-אומיים חד-תאיים במורד הזרם¹⁹.

איור 1: סקירת זרימת עבודה ובקרת איכות של מבחן המולטיאום המרחבי Trekker–CUT&Tag. (A) דיאגרמה סכמטית של זרימת העבודה המרחבית של Trekker–CUT&Tag. חתך קורונלי של רקמת מוח עכבר קפואה טרייה מותקן על אריח מרחבי של טרקר ועובר ברקודינג מרחבי. לאחר ניתוח רקמות, הגרעינים מבודדים ומוערכים לתפוקה ואיכות. כ-50,000 גרעינים משמשים ל-H3K27ac CUT&Tag, וגרעינים מתויגים עוברים ברקודינג חד-תאי באמצעות 10x חרוזי ג'ל Genomics Chromium Multiome לאחר הספירה. DNA ברקודד תא יחיד מוגבר מראש ומחולק לשני חלקים. ספריית CUT&Tag המאונדקסת נוצרת ישירות על ידי PCR אינדקס. לספריות ביטוי גנים וברקוד מרחבי, DNA מוגבר מראש מוגבר עוד יותר ונבחר לפי גודל. מקטעים התואמים לגדלים טיפוסיים של cDNA משמשים להכנת ספריית ביטוי גנים, בעוד שקטעי DNA קצרים יותר משמשים ליצירת ספריית הברקוד המרחבית. הספריות מתוכננות וממופות לפי 10x הנחיות של Genomics ו-Curio Trekker. ציר הזמן הניסויי הצפוי מסומן משמאל. (ב) נקודות ביקורת מרכזיות בבקרת איכות (QC) ושיקולים קריטיים לאורך כל תהליך העבודה. בקרת איכות הגרעינים כוללת הערכת תפוקה, שלמות, הצטברות ותכולת הפסולת. בקרת איכות מוקדמת כוללת הערכת התפלגות גודל DNA וזיהום דימר פריימר לכל הספריות. הספציפיות של ספריית CUT&Tag מוערכת באמצעות PCR כמותי (qPCR), המודד העשרה של אזורים גנומיים יעדיים על רקע. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

מחקר זה מציג מבחן רב-תחומי מרחבי של Trekker CUT&Tag, שמבוחן בו זמנית את שינוי ההיסטון H3K27ac הקשור לאלמנטים רגולטוריים סיסיים פעילים ולביטוי גנים בחתכי רקמה טריים שהוקפאו. פרוטוקול זה מספק הליכים שלב אחר שלב לברקודינג מרחבי של Takara Trekker, פירוק רקמות ובידוד גרעינים, ספירת גרעינים ובקרת איכות, פרופיל CUT&Tag בקלט נמוך של שינוי H3K27ac, לכידת מטרות מולקולריות על חרוזי ג'ל Multiome חד-תאיים של Genomics 10x והכנת ספרייה. תהליך העבודה הודגם באמצעות חתך קורונלי של רקמת מוח העכבר. בניגוד לזרימת העבודה הסטנדרטית של 10x Genomics Multiome, שבה נגישות הכרומטין נמדדת באמצעות בדיקה לכרומטין הנגיש לטרנספוזאז עם רצף בתפוקה גבוהה (ATAC-seq), פרוטוקול זה מחליף קטעי DNA שמקורם ב-CUT&Tag בקטעי ATAC, ומאפשר חקירה ישירה של נופי שינוי היסטונים ברזולוציה תא יחיד. כדי לקשר ברקודים מרחביים של Trekker עם ברקודים חד-תאיים של Genomics 10x, ברקודים מרחביים עם זנב פולי(A) ותמלולי mRNA נלכדים על ידי רצפי הפולי-dT של חרוזי הג'ל של Multiome, בעוד שברי DNA של CUT&Tag נלכדים על ידי רצפי המרווח. אסטרטגיית הלכידה הכפולה הזו מאפשרת שחזור סימולטני של מידע אפיגנומי, טרנסקריפטומי ומרחב מאותו גרעין יחיד. למיטב ידיעתנו, זהו תהליך העבודה המולטיאומי המרחבי הראשון שמשלב ישירות אנוטציה מרחבית של טרקר בברקוד עם מבחן מולטי-אום חד-תאי כדי לאפיל משותף את התפלגות הגנום של סימן היסטון ואת הטרנסקריפטום. הנופים המולטי-אומיים שנוצרו במרחב, המשלבים נתוני תפוסה וביטוי גנים של H3K27ac, מאפשרים הקרנה של פרופילי תאים בודדים חזרה לקואורדינטות הרקמה המקוריות שלהם ומספקים קשר ישיר בין מנגנוני רגולציה אפיגנומיים לתוכניות שעתוק ביחס לארכיטקטורה של הרקמה השלמה.

Protocol

עכברים בוגרים הושמתו באמצעות שאיפת CO₂ (IACUC #: A48315-15-R24) לפני קציר הרקמות. המוחות הוסרו לחלוטין לאחר קרניוטומיה סגיטלית והסרת הקלווריה החצית. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. התקנת חתך רקמה על אריח הברקוד של Trekker לברקוד מרחבי

1. הכן את הדברים הבאים לפני שמתחילים.
   1. איזון את בלוק הרקמה המוטמע בטמפרטורת החיתוך האופטימלית (OCT) בקריוסטט לפני החיתוך. הכינו את הבופרים לפיצול UV, דיסוציאציה של רקמות ובידוד גרעינים.
      הערה: הטמפרטורה האופטימלית לחתך עשויה להשתנות בהתאם לסוג הרקמה.
   2. לבידוד גרעינים, קרר את הצנטריפוגה עם דליי נדנדה לצינורות של 1.5 מ"ל עד 4 מעלות צלזיוס. קיררו צלחת עם 12 בארות עם טבעת Trekker על הקרח.
   3. הגדר את מד ה-UV למגבלת הזרם המקסימלית (1.2 אמפר) והספק מקסימלי.
2. רשם את מזהה אריח הברקוד המרחבי (למשל, U0001_001) של אריח Trekker לשימוש.
   הערה: כל אריח של טרקר מכיל קואורדינטות ברקוד ייחודיות. מזהה האריח נדרש כדי לשלוף את הקובץ הנכון למיפוי ברקוד מרחבי של נתוני הרצף.
3. חתך את הרקמה. חתך קורונלי בעובי 25 מיקרומטר במיקום משוער של ברגמה -1 מ"מ בוצע בטמפרטורה של −18 מעלות צלזיוס (איור 1A).
   הערה: העובי עשוי להיות מוגדל ל-30 מיקרון כאשר עובדים עם רקמות בעלות תאיות נמוכה.
4. מקם את החלק (או האזור המעניין) על האריח המרחבי והמיס אותו על ידי הנחת אצבע בעדינות בתחתית זכוכית הסלייד.
   אזהרה: אם יש צורך, בדקו את הנהלים דרך מדידות בקרת האיכות של הגרעינים באמצעות אריח האימון של טרקר.
5. השתמשו בפינצטה כדי להסיר את האריח מהדבק השקוף ולהכניס אותו לבאר של צלחת תרבית רקמה עם 12 בארות על קרח מעל טבעת ה-Trekker. מיד פיפט של 30 מיקרוליטר של בופר חיתוך UV של טרקר על האריח, כדי לוודא שכל הרקמה מכוסה בבופר.
6. הנח את מנורת ה-UV (הגדרת 1.2 אמפר) על הפלטה ישירות מעל הבאר. הדלק למשך דקה אחת כדי לשחרר את הברקודים תוך שמירה על הכל על הקרח.
   זהירות: יש ללבוש משקפי UV מגנים בעת עבודה עם מנורת UV.
7. כבה את מנורת ה-UV ודוגר את האריח על קרח למשך 7.5 דקות. במהלך הדגירה, מוציאים תא שטיפה של Trekker בגודל 10 x 10 וממלאים את תא 1 ו-2 ב-400 מיקרוליטר של בופר שטיפה קר של גרעיני Trekker לדגימה על הקרח.
8. הרימו בזהירות את האריח עם פינצטה מבלי לגעת בחרוזים ושטפו את האריח בתא 1 למשך 5 שניות. שטוף את האריח בתא 2 למשך 5 שניות. הנח בזהירות את האריח בבאר בלוח עם 12 בארות על קרח. חלק הרקמה צריך להיות צבוע בכחול ולהיות נראה בקלות.

2. פירוק רקמות ובידוד גרעינים

1. פזר 175 מיקרוליטר של בופר מיניט A, מכוון לרקמה. חזור על זה עוד 3 פעמים כדי להגיע לסך של 700 מיקרוליטר. בכל חלוקה, כוון לחלקים שונים של האריח כדי לנתק את כל הרקמה מהאריח.
   הערה: הימנע מזיהום חרוזים כתוצאה משריטה של האריח או מנפילת חרוזים.
2. המשך לנתק את הרקמה מהאריח על ידי שאיפת הבופר מצדו של הבאר והזרקתו לאזורים המכוסים ברישומה, תוך שמירה על הפלטת על קרח ככל האפשר. חזור על כך עד שלא נשאר רקמה על האריח. לאחר שכל הרקמה הוסרה מהאריח, השתמשו בפינצטה בזהירות כדי להעביר את האריח לבאר ריקה.
3. השתמש בפיפטה P1000 כדי להפריד גרעינים באופן מכני עם טריטורציה חוזרת באותו באר. חזור על זה עד שלא נשארו גושי רקמה נראים לעין.
4. העבר בזהירות את תליית הגרעין למחסנית מסנן עם צינור איסוף מערכת הבידוד Invent Minute ליחיד-גרעין לרקמות/תאים נוירונים. דגרו את הצינור עם הפקק פתוח בטמפרטורה של –20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. סגרו את מחסנית הסינון ולחצו מיד על צנטריפוגה ב-13,000 x g למשך 30 שניות במיקרוצנטריפוגה מקוררת.
5. זרקו את מחסנית המסנן ותחזירו את הכדור על ידי פיפטינג עדין של 10–20 פעמים. סובבו את הצינור בצנטריפוגה המקוררת מראש עם דליים מתנדנדים בעוצמה של 600 x g למשך 5 דקות. הסר בזהירות את הסופרנטנט ותשהה את הכדור ב-200 מיקרוליטר של בופר Trekker C.
6. הוסיפו 1 מ"ל של בופר Minute קר Invent Minute B לצינור אפנדורף בקוטר 1.5 מ"ל עם חיבור נמוך והנחו בזהירות 200 מיקרול של תליית גרעין מעל בופר מינוט B על ידי פליטה איטית כנגד דופן הצינור כדי למנוע ערבוב של השכבות. סובב את הצינור בצנטריפוגה מקוררת מראש עם דליי נדנודה בעוצמה של 500 x g למשך 10 דקות. הסר בזהירות את השכבה החלבית והסופרנטנט.
7. החזירו בעדינות את הגרעינים עם 24 מיקרוליטר של בופר Trekker C והתקדמו למדידות בקרת איכות של גרעינים מבודדים.

איור 2: הערכת בקרת איכות של גרעינים מבודדים. תמונות ברייטפילד מייצגות של גרעינים מבודדים מרקמת מוח העכבר. הגרעינים צובקו ב-0.4% כחול טרייפן והודגמו בהגדלה של פי 40 כדי להעריך את שלמות הגרעין ונוכחות הפסולת. הכנת הגרעינים המוצגת משמאל מציגה גרעינים באיכות גבוהה ושלמים המתאימים לבדיקות במורד הזרם, בעוד שההכנה המוצגת מימין מדגימה גרעינים באיכות ירודה עם אגרגטים רקמתיים שמפורקים חלקית. גרעינים פגומים או קרועים מסומנים על ידי ראשי חץ מלאים. פס הסולם הוא 100 מיקרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של האיור הזה.

3. ספירה ומדידות בקרת איכות של גרעינים מבודדים

1. לספירת גרעינים, קחו 2 מיקרוליטר מתליית הגרעין לתוך 8 מיקרוליטר של בופר Trekker C. מערבבים 10 מיקרוליטר מתליית הגרעינים המדוללת עם 10 מיקרוליטר של תמיסת צביעה AO/PI. ספרו את הגרעינים לפי הוראות היצרן.
2. כדי להעריך את איכות הגרעינים המבודדים, יש לדלל 2 מיקרו-ליטר של השעיית הגרעינים ל-8 מיקרוליטר של תמיסת טריפאן כחולה של 4%. בדוק את הגרעינים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה בהגדלה של 40x, תוך בדיקת מורפולוגיה שלמה של ממברנה גרעינית ותכולת פסולת לא גרעינית (איור 2).
3. המשך מיד לבדיקת CUT&Tag רב-גרעין (CUT&Tag על H3K27ac + ביטוי גן).
   אזהרה: המשיכו לצעדים הבאים אם לפחות 30,000 גרעינים איכותיים נמצאים.

4. תיוג CUT&Tag על גרעינים מבודדים

1. הכינו את בופר הדגירה CUT&Tag I. הניחו אותו על הקרח.
2. הכינו נוגדן ראשוני וטרנספוזה שמופעלים על ידי אנזים הנחה (TAG) קונוגט.
   1. הוסף 46.23 מיקרוליטר של בופר דגירה מסוג CUT&Tag I ו-1.33 מיקרוליטר של אנזים TAG לצינור PCR על קרח. הוסיפו כמות אופטימלית של נוגדנים ראשוניים לצינור. ערבב לאט על ידי פיפטינג של 10 פעמים.
      הערה: נוספו 2.43 מיקרוליטר של נוגדן אנטי-H3K27ac לתגובה. כמות הנוגדנים אומתה לבדיקות CUT&Tag בכמות גדולה ובמקום . אופטימיזציה של כמות הנוגדנים לקונוגציה של אנזימי TAG באמצעות בדיקה נפשית. הנוגדן האופטימלי הוגדר כרכוז הנמוך ביותר שהשיג אות לרעש מקסימלי, כפי שנקבע על ידי qPCR במיקומי מטרה חיוביים ושליליים.
   2. סובב בקצרה והנח את הצינור על סיבוב 18 סל"ד. דגרו בטמפרטורת החדר במשך שעה. התערובת המתקבלת יכולה להיות מוכנה מראש ולהניח על קרח למשך עד 5 שעות.
      הערה: דגירה של נוגדנים-TAG יכולה להתבצע במקביל לבידוד הגרעינים או לפניו.
3. דגירה של גרעינים מבודדים עם אנזים נוגדן-TAG מצמיד.
   1. סובבו את הצינור (שלב 2.7) של גרעינים מבודדים בצנטריפוגה המקוררת מראש עם דליים מתנדנדים בעוצמה של 500 x g למשך 10 דקות. הסר את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור והשאר ~5 מיקרוליטר של סופרנאנט.
   2. הוסיפו 25 מיקרולטר של בופר דגירה מסוג CUT&Tag I (שלב 4.1) והחזירו אותו על ידי פיפטינג עדין של 10 פעמים. העבירו את הגרעינים לצינור (שלב 4.2.2) המכיל את ה-TAG המשולב של נוגדנים באמצעות אותו קצה פיפטה. מערבבים בעדינות על ידי פיפיפטינג 10 פעמים ומניחים את הצינור על רוטטור עדין.
   3. דגירה ללילה בטמפרטורה של 4°C.
4. ביום הבא (יום 2), הכן 1X בופר גרעיני CUT&Tag והנח על קרח.
5. תיוג CUT&Tag
   1. שלף את צינור התגובה (שלב 4.3.3) מהסיבוב. הוסף 5 מיקרוליטר של מפעיל CUT&Tag והעבר את התערובת לצינור חדש בנפח 1.5 מ"ל. הדגרה למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס על ה-ThermoMixer ב-550 סל"ד.
   2. שולפים את הצינור, מוסיפים 20 מיקרוליטר של בופר קירור CUT&Tag, ומערבבים בעדינות את התגובה על ידי פיפטינג של 10 פעמים. צנטריפוגה את הצינור בצנטריפוגה מקוררת מראש עם דליי נדנודה ב-500 x גרם למשך 10 דקות. הסר את הסופרנטנט מבלי להפריע לגרעין, ומשאיר ~5 מיקרוליטר של סופרנטנט בתחתית הצינור.
   3. הוסיפו 100 מיקרוליטר של בופר גרעיני 1X CUT&Tag והשהיינו מחזירים את הגרעינים על ידי פיפטינג עדין של 10 פעמים. סובב את הצינור בצנטריפוגה מקוררת מראש עם דליי נדנודה בעוצמה של 500 x g למשך 10 דקות. הסר 85 מיקרו-ליטר מהסופרנאנט, והשאירו ~15 מיקרוליטר. החזירו את הגרעינים על ידי פיפטינג עדין ואיטי של 10 פעמים.
6. ספירת גרעינים מסומנים וקביעת מספר המטרה
   1. הוסף 1 מיקרוליטר מתליית הגרעינים המסומן לתוך 9 מיקרוליטר של תמיסת מלח עם בופר פוספט ומערבב עם 10 מיקרוליטר של תמיסת צביעת AO/PI. ספירת גרעינים מתויגים כפי שמתואר בשלב 3.1.
   2. השתמשו ב-1.6 פעמים מספר הגרעינים היעד ליצירת GEM תא יחיד כדי להשיג את מספר הגרעינים הרצויים.
   3. סובבו את הצינור בצנטריפוגה המקוררת מראש עם דליי נדנדה בעוצמה של 500 x גרם למשך 10 דקות והסירו בזהירות את הסופרנטנט, כך שהשאירו נפח סופי של 8 מיקרוליטר.

5. ברקידוד תא יחיד של גרעינים מסומנים והגברה מוקדמת של DNA מקודד

1. הוסף 7 מיקרוליטר של בופר ATAC B ל-8 מיקרוליטר של הגרעינים המתויגים עם מספר גרעיני המטרה הצפוי לניסוי שלך.
   הערה: ראו פרטים נוספים על הגדרות תגובה ותפעול מכשיר Chromium X בפרוטוקול "GEM Generation & Barcodeding" של מדריך המשתמש Chromium Next GEM Single-Cell Multiome ATAC + Gene Expression Kit (CG000338 Rev G).
2. יצירת GEM וברקידוד באמצעות כלי Chromium X.
   1. הוסף 60 מיקרוליטר של תערובת מאסטר של GEM לצינור המכיל גרעינים ממותגים. ערבבו בעדינות על ידי פיפטינג והעמיסו לשורה 1 של שבב Chromium Next GEM J.
   2. הכינו חרוזי ג'ל מולטיאום חד-תאיים והעמיסו 50 מיקרוליטר חרוזי ג'ל לשורה 2. פזר 45 מיקרו ליטר של שמן חלוקה לבארות בשורה 3.
   3. הנח את השבב J המורכב עם האטם במגש של כלי ה-Chromium X והפעיל את הכלי.
   4. שאפו לאט 100 מיקרוליטר של GEMs מהנקודות הנמוכות ביותר של בארות ההתאוששות בשורה העליונה 3. השחרר לאט את ה-GEMs לצינור ה-PCR החדש על קרח עם קצות הפיפטה צמודים לדפנות הבארות.
   5. דגרו את ה-GEMs שנאספו במחזור תרמי (טמפרטורת מכסה ב-50°C) עם הפרוטוקול הבא: מחזור אחד של 37°C למשך 45 דקות, מחזור אחד של 25°C למשך 30 דקות, ו-4°C להחזקה.
   6. הוסף 5 מיקרו ליטר של חומר קירור וערבב לאט על ידי פיפטינג של 10 פעמים.
3. ניקוי דגירה לאחר ה-GEM וטיהור DNA
   הערה: ראו פרטים נוספים בפרוטוקול "ניקוי לאחר דגירה לאחר GEM" של מדריך המשתמש Chromium Next GEM Single-Cell Multiome ATAC + Gene Expression Kit (CG000338 Rev G).
   1. הוסיפו 125 מיקרוליטר של חומר התאוששות בצבע ורוד לצינור בטמפרטורת החדר והפכו בעדינות את הצינור 10 פעמים. צנטריפוגה לזמן קצר. הסר לאט והשליך 125 מיקרוליטר של חומר התאוששות/שמן מחיצה (ורוד) מתחתית הצינור.
   2. הוסף 200 מיקרול של תערובת ניקוי Dynabeads לצינור וערבב על ידי פיפטינג של 10 פעמים. דגרו 10 דקות בטמפרטורת החדר. הנח את הצינור על המעמד המגנטי עד שהתמיסה תתפנה. הסר את הסופרנטנט.
   3. הוסף 300 מיקרוליטר של 80% אתנול טרי לכדור. דגר 30 שניות והסר את הסופרנטנט. הוסף 200 מיקרוליטר של 80% אתנול לכדור, דגר 30 שניות, והסר את הסופרנטנט. סובב את הצינור בקצרה והנח אותו על המגנט. הסר את הסופרנטנט שנותר.
   4. הסר את הצינור מהמגנט. הוסף מיד 50.5 מיקרוליטר של תמיסת שחרור I. מערבב על ידי פיפטינג ודגירה למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. סובב בקצרה והניח את הצינור על המגנט עד שהתמיסה מתנקה. העבר 50 מיקרוליטר של תמיסה מנוקה לצינור חדש.
   5. טיהור DNA באמצעות חרוזים פרמגנטיים
      1. הוסיפו 90 מיקרוליטר של חרוזים פרמגנטיים (1.8X) לכל דגימה וערבבו על ידי פיפטציה יסודית. דגרו 5 דקות בטמפרטורת החדר. סובב בקצרה והניח את הצינור על המגנט עד שהתמיסה מתנקה. הסר את הסופרנטנט.
      2. הוסף 200 מיקרוליטר של 80% אתנול לכדור. דגרה במשך 30 שניות. הסר את האתנול. חזור על זה עוד פעם אחת.
      3. סובב בקצרה והניח את הצינור על המגנט. הסר את הסופרנטנט שנותר.
      4. הסר את הצינור מהמגנט. הוסף 46.5 מיקרוליטר של בופר EB ומערבב באמצעות פיפטינג. דגרו 2 דקות בטמפרטורת החדר. סובב והניח אותו על המגנט עד שהתמיסה מתנקה.
      5. העבר 46 מיקרוליטר של DNA מטוהר לצינור חדש.
4. הגברה מוקדמת של DNA מקודד.
   1. הוסף 54 מיקרוליטר של תערובת קדם-הגברה לכל דגימה. תערובת פיפט וצנטריפוגה לזמן קצר.
   2. דגירה במחזור תרמי (טמפרטורת מכסה 105 מעלות צלזיוס) עם הפרוטוקול הבא: מחזור אחד של 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; מחזור אחד של 98 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; סה"כ 7 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 63 מעלות צלזיוס ל-30 שניות, 72 מעלות צלזיוס לדקה אחת; מחזור אחד של 72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת; ועצירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. אחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
   3. ביום הבא (יום 3), טיהר DNA מוגבר מראש באמצעות חרוזים פרמגנטיים (1.6X) כפי שמתואר בשלב 5.3.5. הוסף 80.5 מיקרוליטר של בופר EB לצינור וערבב באמצעות פיפטינג. דגרו 2 דקות בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס (טמפרטורת החדר). סובב בקצרה והניח את הצינור על המגנט עד שהתמיסה מתנקה.
   4. העבר 80 מיקרוליטר של DNA מוגבר מראש לצינור חדש. השתמש ב-40 מיקרוליטר ליצירת ספריית CUT&Tag. אחסן את ה-DNA המוגברים שנותרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: 40 מיקרו-ליטר מה-DNA המוגברים הנותרים ישמשו בהמשך לביטוי גנים ולספריות ברקוד מרחביות.

6. הכנה בספרייה ל-CUT&Tag, ביטוי גנים וברקודים מרחביים

1. הכנת ספריית scCUT&Tag
   1. העבר 40 מיקרו-ליטר של DNA מוגבר מראש לצינור חדש והוסיף 60 מיקרוליטר של תערובת PCR עם מדד דגימה. ערבב על ידי פיפטינג וסובב בקצרה.
   2. דגרו במחזור תרמי (טמפרטורת מכסה ב-105 מעלות צלזיוס) עם הפרוטוקול הבא: מחזור אחד של 98 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות; סה"כ 12 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס ל-20 שניות, 67 מעלות צלזיוס ל-30 שניות, 72 מעלות צלזיוס ל-20 שניות; מחזור אחד של 72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת; 4 מעלות צלזיוס לאחיזה).
      הערה: מספר המחזור האופטימלי תלוי במספר הגרעינים ההתחלתי ובסימן ההיסטון שמסומן. שנים עשר מחזורי הגברה שימשו לסימון H3K27ac בניסוי.
   3. סלקציה כפולה וניקוי DNA באמצעות חרוזים פרמגנטיים (0.6X, 1.55X)
      1. הוסף 60 מיקרוליטר של חרוזים פרמגנטיים (0.6X) לכל דגימה וערבב על ידי פיפטינג יסודי. דגרו 5 דקות בטמפרטורת החדר. סובב בקצרה והניח את הצינור על המגנט עד שהתמיסה מתנקה.
      2. העבר 150 מיקרוליטר של סופרנטנט לצינור חדש. הוסף 95 מיקרוליטר של חרוזים פרמגנטיים (1.55X) לכל דגימה (סופרנאנט) ומערבב באמצעות פיפטינג. דגרו 5 דקות בטמפרטורת החדר. הנח את הצינור על המגנט עד שהתמיסה מתנקה. הסר את הסופרנטנט.
      3. הוסף 300 מיקרוליטר של 80% אתנול לכדור. חכה 30 שניות. הסר את האתנול. חזור על זה עוד פעם אחת. סובב בקצרה והניח את הצינור על המגנט. הסר את הסופרנטנט שנותר.
      4. הסר את הצינור מהמגנט. הוסף 20.5 מיקרוליטר של בופר EB לצינור ומערבב באמצעות פיפטינג. דגרו 2 דקות בטמפרטורת החדר. סובב והניח אותו על המגנט עד שהתמיסה מתנקה.
      5. העבר 20 מיקרוליטר של ספריות CUT&Tag מטוהרות ומאונדקסות לצינורות חדשים.
2. בדיקת איכות לספריית CUT&Tag
   1. ניתוח התפלגות גודל ה-DNA בספרייה
      1. מערבבים 1 מיקרוליטר של DNA ספרייה מטוהר עם 1 מיקרוליטר של בופר TE נמוך.
      2. מערבבים את ה-DNA המדולל עם בופר עבודה של מנתח המקטעים והפעל על המכשיר עם ערכת החלקים HS NGS ברגישות גבוהה (1-6000bp) (איור 3A).
   2. הערך את ההעשרה של לוקוס גנומי חיובי ל-H3K27ac לפני ריצוף ומיפוי.
      1. מערבבים 1 מיקרוליטר של DNA ספרייה מטוהר עם 4 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז. השתמש ב-1 מיקרוליטר של DNA ספרייה מדולל למדידות qPCR עבור שלושה לוקוסי גנומיים.
         הערה: עבור H3K27ac CUT&Tag, הפריימר החיובי תוכנן מהלוקוס Actb-TSS, בעוד שפריימרים המיועדים ל-T1-TSS ולוקוס בין-גני שימשו כבקרות שליליות²⁰ (טבלה 1). DNA גנומי של עכבר שימש כבקרה לקלט לנרמול יעילות PCR (איור 3B).
      2. הכינו סך של 20 מיקרוליטר מתערובת התגובה כדלקמן: 1 מיקרוליטר DNA ספרייה מדולל, 2 מיקרוליטר של תערובת פריימר 10 מיקרומון, 10 מיקרוליטר של תערובת גרין מאסטר 2X SYBR, ו-7 מיקרוליטר מים ללא נוקליאז.
      3. הרץ את פלטת ה-qPCR המוכנה על מערכת ה-CFX Opus Real-Time PCR באמצעות תוכנית המחזור המתאימה לזיהוי SYBR Green.
3. הגברה של cDNAs ו-DNA ברקוד מרחבי.
   1. העבר 35 מיקרוליטר של DNA מוגבר מראש (שלב 5.4.4) לצינור חדש והוסף 65 מיקרוליטר של תערובת תגובה להגברת cDNA. ערבב על ידי פיפטינג וסובב בקצרה. הפריימר המשמש להגברת cDNA וברקוד מרחבי הוא Feature cDNA Primers 2.
   2. דגרו במחזור תרמי (טמפרטורת מכסה ב-105 מעלות צלזיוס) עם הפרוטוקול הבא: מחזור אחד של 98 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות; סה"כ 8 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס ל-20 שניות, 63 מעלות צלזיוס ל-30 שניות, 72 מעלות צלזיוס לדקה אחת; מחזור אחד של 72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת; 4 מעלות צלזיוס להחזקה.
      הערה: מספר המחזור האופטימלי חייב להיקבע בהתבסס על סוג התא, תכולת ה-RNA ומספר הגרעינים ההתחלתי. בניסוי זה בוצעו 8 מחזורי הגברה.
   3. טיהור cDNA מוגבר
      1. סלקציה כפולה וטיהור DNA באמצעות חרוזים פרמגנטיים (0.6X, 2.0X) כפי שמתואר בשלב 6.1.3. הוסף 60 מיקרוליטר של חרוזים פרמגנטיים (0.6X) לכל דגימה וערבב באמצעות פיפטינג. דגרו 5 דקות בטמפרטורת החדר. הנח את המגנט על התמיסה עד שהיא מתפזרת.
      2. להעביר ולחסוך 75 מיקרו-ליטר של סופרנטנט בצינור חדש מבלי להפריע לכדור. שמור על טמפרטורת החדר.
         זהירות: אל תזרקו את הסופרנטנט, שכן הוא מכיל DNA מועשר לשברים קצרים יותר שישמשו ליצירת ספריית הברקוד המרחבית.
      3. הסר את הסופרנטנט שנותר מהכדור. שטוף עם 80% אתנול פעמיים כפי שמתואר בשלב 6.1.3.
      4. הוסף 40.5 מיקרוליטר של בופר EB לצינור ומערבב על ידי פיפטינג. דגרו 2 דקות בטמפרטורת החדר. סובבו בקצרה והניחו את המגנט עד שהתמיסה מתנקה.
      5. העבר 40 מיקרוליטר של cDNA מוגבר לצינור חדש. שמור את זה על הקרח כדי להכין ספריית ביטוי גנים מאונדקסת.
         הערה: חלק זה מעשיר את ה-DNA עבור גודל טיפוסי של cDNA.
   4. טיהור DNA ברקוד מרחבי מוגבר
      1. הוסף 70 אלוליטר של חרוזים פרמגנטיים (2.0X) ל-75 מיקרוליטר של הסופרנטנט שנשמר קודם (שלב 6.3.3.2. ערבב על ידי פיפטינג וסובב בקצרה. דגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הנח את הצינור על המגנט עד שהתמיסה מתנקה. הסר את הסופרנטנט.
      2. שטוף עם 80% אתנול פעמיים כפי שמתואר בשלב 6.1.3.
      3. הוסף 40.5 מיקרוליטר של בופר EB לצינור ומערבב על ידי פיפטינג. דגרו 2 דקות בטמפרטורת החדר. סובבו בקצרה והניחו את המגנט עד שהתמיסה מתנקה.
      4. העבר 40 מיקרוליטר של DNA ברקוד מרחבי מוגבר ומטוהר לצינור חדש. אחסן ב-−20 מעלות צלזיוס ליצירת ספריית הברקוד המרחבית המאונדקסת.
   5. ניתוח גדלי cDNA על ידי מנתח המקטעים. מערבבים 1 מיקרוליטר של cDNA מוגבר עם 1 מיקרוליטר של בופר TE נמוך. הרץ את ה-DNA המדולל באמצעות מנתח קטעים כפי שמתואר בשלב 6.2.1.
   6. הכנת ספריית ביטוי גנים מאונדקס
      1. העבר 10 מיקרוליטר של cDNA מוגבר (שלב 6.3.3.5) לצינור חדש. הוסף 25 מיקרוליטר של בופר EB ו-15 מיקרוליטר של תערובת פרגמנטציה. ערבב על ידי פיפטינג על קרח. סובבו בקצרה והעבירו את הצינור למחזור התרמי המקורר מראש בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      2. דגירה במחזור תרמי (טמפרטורת מכסה ב-65 מעלות צלזיוס) על ידי הפעלת הפרוטוקול הבא: מחזור אחד של 32 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; מחזור אחד של 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות; 4 מעלות צלזיוס להחזקה.
      3. סלקציה כפולה וניקוי DNA באמצעות חרוזים פרמגנטיים (0.6X, 0.8X) כפי שמתואר בשלב 6.1.3. הוסף 50.5 מיקרוליטר של בופר EB וערבב על ידי פיפטינג. דגרו 2 דקות בטמפרטורת החדר. סובבו בקצרה והניחו את המגנט עד שהתמיסה מתנקה.
      4. העבר 50 מיקרו ליטר של דגימה לצינור חדש. הוסף 50 מיקרוליטר של תערובת קשירת מתאם וערבב באמצעות פיפטינג. סובב לרגע. דגרו במחזור תרמי (טמפרטורת מכסה ב-30 מעלות צלזיוס) עם הפרוטוקול הבא: מחזור אחד של 20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ו-4 מעלות צלזיוס לאחיזה.
      5. טיהור DNA באמצעות חרוזים פרמגנטיים (0.8X) כפי שמתואר בשלב 5.3.5. הוסף 30.5 מיקרוליטר של EB בופר וערבב באמצעות פיפטינג. דגרו 2 דקות בטמפרטורת החדר. סובבו בקצרה והניחו את המגנט עד שהתמיסה מתנקה. העבר 30 מיקרו ליטר מהדגימה לצינור חדש.
      6. מדד PCR של ספריית ביטוי גנים. הוסיפו 50 מיקרוליטר של תערובת מגבר ומוסיפים 20 מיקרוליטר של סט TT דו-אינדקסי בודד A לכל דגימה.
      7. דגרו במחזור תרמי (טמפרטורת מכסה ב-105 מעלות צלזיוס) עם הפרוטוקול הבא: מחזור אחד של 98 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות; סה"כ 11 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס ל-20 שניות, 54 מעלות צלזיוס ל-30 שניות, 72 מעלות צלזיוס ל-20 שניות; מחזור אחד של 72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת; 4 מעלות צלזיוס להחזקה.
         הערה: יש לקבוע את מספר המחזור האופטימלי בהתבסס על סוג התא, תכולת ה-RNA ומספר הגרעינים ההתחלתי. בניסוי זה נעשה שימוש בסך הכל ב-11 מחזורי הגברה.
      8. סלקציה כפולה וניקוי DNA באמצעות חרוזים פרמגנטיים (0.6X, 0.8X) כפי שמתואר בשלב 6.1.3. הוסיפו 35.5 מיקרוליטר של בופר EB לצינור וערבבו באמצעות פיפטינג. דגרו 2 דקות בטמפרטורת החדר. סובבו בקצרה והניחו את המגנט עד שהתמיסה מתנקה.
      9. העבר 35 מיקרוליטר של ספריית ביטוי גנים מטוהרת ומאונדקסת לשפופרת חדשה.
4. ניתוח התפלגות גודל ה-DNA בספריית ביטוי הגנים. מערבבים 1 מיקרוליטר של DNA ספרייה עם 1 מיקרוליטר של בופר TE נמוך. הרץ את ה-DNA המדולל כפי שמתואר בשלב 6.2.1. (איור 3A).
5. הכנת ספריית ברקוד מרחבית מאונדקסת
   1. יש להכין סך של 100 מיקרוליטר של תערובת PCR עם מדגם הדגימה כך: 50 מיקרוליטר של תערובת אמפר (מ-GEM-X Single-Cell 3' Feature Barcode Kit, 25 מיקרוליטר של Buffer EB, 20 מיקרוליטר פריימר מ-Dual Index Plate TT Set A, ו-1 מיקרוליטר DNA ברקוד מרחבי מטוהר (שלב 6.3.4.4) מדולל ב-4 מיקרוליטר של בופר EB.
   2. דגרו במחזור תרמי (טמפרטורת מכסה ב-105 מעלות צלזיוס) עם הפרוטוקול הבא: מחזור אחד של 98 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות; סה"כ 7 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס ל-20 שניות, 54 מעלות צלזיוס ל-30 שניות, 72 מעלות צלזיוס ל-20 שניות; 72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת; 4 מעלות צלזיוס להחזקה.
   3. טיהור DNA באמצעות חרוזים פרמגנטיים (1.2X) כפי שמתואר בשלב 5.3.5. הוסף 35.5 מיקרוליטר של בופר EB לצינור וערבב על ידי פיפטינג. דגרו 2 דקות בטמפרטורת החדר. הנח את הצינור על המגנט עד שהתמיסה נקייה.
   4. העבר 35 מיקרוליטר של DNA ספריית ברקוד מרחבית מטוהרת ומאונדקסת לצינור חדש. אחסן ב-4 מעלות צלזיוס עד 72 שעות או בטמפרטורה של −20 מעלות לאחסון ארוך טווח.
6. בדוק את התפלגות גדלי ה-DNA בספריית הברקוד המרחבי המאונדקס. מערבבים 1 מיקרוליטר של DNA ספרייה מטוהר עם 1 מיקרוליטר של בופר TE נמוך. הרץ את ה-DNA המדולל באמצעות מנתח מקטעים כפי שמתואר בשלב 6.2.1 (איור 3A).

איור 3: הערכות בקרת איכות של ספריות מאונדקסות. (א) פרופילי גודל ב-DNA מוגבר וספריות מאונדקסות. ה-DNA מנותח על ידי מנתח מקטעים כדי להעריך את איכות ה-DNA ואת התפלגות הגודל. מוצגים פרופילים מייצגים לספריית CUT&Tag הממונדקסת, DNA מוגבר המשמש לביטוי גנים ולהכנת ספריית ברקוד מרחבית, ספריית ביטוי גנים מאונדקסת, וספריית ברקוד מרחבית מאונדקסת. (B) ספריית CUT&Tag מנותחת על ידי qPCR כדי להעריך את ההעשרה של אזור גנומי חיובי ל-H3K27ac (כלומר, ACTB) מעל אות הרקע השלילי H3K27ac (כלומר, T1 ומיקום בין-גני). הפרש הקיפול בין אזורים חיוביים/שליליים מחושב כהעשרה²¹. העשרת קיפול מעל 10 נחשבת לאידיאלית במבחן²⁰ זה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

7. רצף הספריות

1. רצף את ספריית הברקוד המרחבית של טרקר בעומק של 5,000 זוגות קריאה לכל גרעין שנלכד.
2. רצף את ספריית H3K27ac CUT&Tag בעומק של 25,000 זוגות קריאה לכל גרעין שנלכד.
3. רצף את ספריית ביטוי הגנים בעומק של לפחות 20,000 זוגות קריאה לכל גרעין שנלכד.

8. ביואינפורמטיקה וניתוח נתונים

1. עיבוד ביטוי גנים וקריאות CUT&Tag באמצעות Cell Ranger ARC v2.0.2 עם --min-atac-count=100 ו--min-gex-count=1000. שלב את פלטי Cell Ranger ARC עם מידע ברקוד של Trekker באמצעות צינור Trekker v1.3.0 עם פרמטרים ברירת מחדל להקצאת מיקומים מרחביים.
2. בצע בקרת איכות באמצעות Signac. תאים שעמדו באחד מהקריטריונים הבאים הוסרו מהניתוח במורד הזרם: עבור CUT&Tag, סך כל הקטעים ≥ 1,000,000 או ≤ 100, והעשרת TSS ≤ 2; לביטוי גנים, סך ה-UMI ≥ 100,000 או ≤-1,000, ומספר הגנים שזוהו ≥ 10,284 או ≤ 200.
3. הסר דאבלטים באמצעות scDblFinder לביטוי גנים ו-AMULET ל-CUT&Tag. תאים שעמדו באחד מהקריטריונים הבאים סווגו ככפולים: (1) ציון scDblFinder ≥ 0.6; (2) דירוג scDblFinder ≥ 0.3 ו-AMULET ≤ 0.01; ו-(3) באשכולות עם אחוז גבוה של דאבלטים.
4. נרמול נתוני ביטוי גנים באמצעות LogNormalize ונתוני CUT&Tag באמצעות TF-IDF. חשב הטבעות RNA PCA ו-CUT&Tag LSI, תוך שימוש במידות LSI 2–50 עבור מודליות הכרומטין. בנה גרף שכן משוקלל באמצעות FindMultiModalNeighbours ויצירת הטמעות UMAP בהתבסס על גרף השכנים הרב-מודלי.
5. הערות על נתוני Trekker לאחר QC באמצעות העברת תוויות Seurat בהתבסס על FindTransferAnchors ואסטרטגיית מיפוי הקרנה PCA עם פרמטרים ברירת מחדל. נתוני scRNA-seq מ-ABC Atlas (גרסה 20230630) שימשו כהפניה. תחזיות סוג תאים שאינן תואמות את אנטומיית הרקמה הידועה הוסרו במהלך הבדיקה הידנית.
   הערה: הסקריפטים לניתוח ביואינפורמטיקה זמינים ב-GitHub: https://github.com/Liuy12/Mouse_Brain_Trekker_Multiome_Cuttag

Results

באמצעות חתך קורונלי (עובי 25 מיקרון, כ-70% כיסוי של אריח מרחבי בגודל 10 × 10 מ"מ) של רקמת מוח עכבר קפואה טרייה, תהליך העבודה המתואר כאן הניב בעקביות 50,100 גרעינים איכותיים (SD = 12,200, n = 8), מספיקים לפרופיל מולטיאומי חד-תאי במורד הזרם (איור 1). לאחר הברקודינג המרחבי של מקטע הרקמה ב-Trekker, הגרעינים בודדו באמצעות ניתוק רקמתי עדין וטוהרו עם ערכת בידוד גרעין יחיד Invent. הליך זה הוביל לפסולת מינימלית ורמות נמוכות של הצטברות גרעינית, מה שיצר הכנות גרעינים המתאימות לבדיקות תא יחיד. תמונות מייצגות של הגרעינים המבודדים מוצגות באיור 2.

במבחני גרעין בודד במורד הזרם, כולל פרופיל מולטי-אום CUT&Tag (CUT&Tag + ביטוי גן), כ-50,000 גרעינים עובדו כאן בדרך כלל. כדי למקסם התאוששות גרעינית, יושם פרוטוקול CUT&Tag פשוט, יעיל עם קלט נמוך, באמצעות מיקוד ותיוג ישיר של נוגדנים–pA/Tn5, ובכך מזעור זמני דגירה ושלבים¹⁹ של שטיפה. באמצעות גישה זו, נאספו כ-25,000 גרעינים מתויגים – תפוקה ממוצעת של 48.3% (SD = 6.1, n = 3). גרעינים אלו שימשו לאחר מכן לברקידוד תא יחיד עם חרוזי ג'ל כרומיום מולטיאום של 10x של Genomics. ליצירת GEM, כ-15,000 גרעינים היו יעדיים עם ציפייה לשחזור~10,000 גרעינים ממוקדסים במרחב לאחר סינון איכותי. בהתבסס על פענוח ברקוד מרחבי של טרקר, ניתן היה להקצות בביטחון 81.3% מהגרעינים (SD = 9, n = 3) ממאגר הנתונים של תא יחיד למיקומים מרחביים בתוך האריח.

תהליך העבודה המרחבי של Trekker–CUT&Tag מייצר שלוש ספריות מאונדקסות: CUT&Tag, ביטוי גנים וספריות ברקוד מרחביות. DNA מקודד מוגבר מראש חולק לשני חלקים, שכל אחד מהם שימש להכנת ספרייה בהתאם לכימיית הלכידה של המטרות על חרוזי הג'ל. ספריות CUT&Tag הוגברו ישירות מ-DNA מוגבר מראש והוצגו התפלגויות גודל מקטעים האופייניות לתיוג CUT&Tag התואמים ל-DNA נטול נוקלאוזום ו-DNA נוקלאוזומי (איור 3A). הספרייה הראתה העשרה טובה של לוקוס ה-Actb החיובי H3K27ac מעל לוקוסי הגנום השלילי H3K27ac^20,21 (כלומר, הפרש פי 68, העולה על הסף של פי 10 שנקבע קודם לכן לניתוח ריצוף-אימונופריסיפיטציה כרומטין של H3K27ac²⁰) (איור 3B). לספריות ביטוי גנים וברקוד מרחבי, DNA מוגברת מראש הוגברה תחילה בהתאם לפרוטוקול הגברת cDNA של 10x Genomics ואז חולקה לשני חלקים לפי גודל השבר באמצעות טיהור חרוזים פרמגנטיים. ספריית הברקוד המרחבי הממוקד הוכנה מהשבר המועשר לקטעים קצרים יותר והציג שיא חד בגודל המקטע הצפוי. ספריות ביטוי גנים הראו התפלגות גודל אופיינית שמרכזה חלקי cDNA מוגברים (איור 3A).

איור 4: ייצוג חד-תאי ומרחב של מבחן רב-יומי Trekker–CUT&Tag ברקמת מוח העכברים. (א) זיהוי סוגי תאים באמצעות ניתוח תא יחיד. גרפים של קירוב והקרנה אחידים של מניפולד (UMAP) מראים אוכלוסיות תאים עם הערות שמקורן ב-H3K27ac CUT&Tag בלבד, ביטוי גנים בלבד, ומערך הנתונים המולטי-אומי המשולב (CUT&Tag + ביטוי גן). (B) ייצוג מרחבי של נתוני מולטי-אום מרחבי של Trekker–CUT&Tag. גרעינים ממאגר הנתונים המולטי-אומי המשולב מוקצים לקואורדינטות מרחביות באמצעות ברקודי טרקר, החושפים התפלגויות אנטומיות מאורגנות של סוגי תאים לאורך רקמת מוח העכבר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

ריצוף ומיפוי של ספריות ביטוי CUT&Tag וגנים בוצעו באמצעות Cell Ranger ARC v2.0.2 בהתאם להנחיות הגנומיקה של 10x, בעוד שספריות ברקוד מרחביות עובדו באמצעות Trekker v1.3.0 בהתאם להמלצות Takara Trekker. אפשרויות המיפוי ATAC-seq החד-תאיות שהוצעו יושמו בספריות CUT&Tag. נוצרו מערכי נתונים חד-גרעיניים עבור CUT&Tag בלבד, ביטוי גנים בלבד, והמולטיאום המשולב (CUT&Tag + ביטוי גן). תאים עם UMI כולל עבור CUT&Tag (≥ 1,000,000 או ≤ 100) או ביטוי גנים (≥ 100,000 או ≤ 1000) סוננו באמצעות Signac²². חיזוי כפול בוצע באמצעות שילוב של scDblFinder²³ לביטוי גנים ו-AMULET²⁴ ל-CUT&Tag. תאים שעמדו באחד מהקריטריונים הבאים הוסרו: 1) scDblFinder.score > 0.6; 2) scDblFinder.score בין 0.3 ל-0.6, ו-amulet.score < 0.01. אנוטציה של סוג תא בוצעה באמצעות FindTransferAnchors²⁵ של Seurat, בהתבסס על נתוני ההפניה²⁶ מ-Allen Brain Cell Atlas. בספריית ביטוי הגנים במחקר זה, ספירת ה-UMI החציונית לתא הייתה 15,378, ומספר הגנים החציוני לתא היה 4,378. בספריית CUT&Tag זוהו 11,860 תאים, עם חציון של 6,631 מקטעים איכותיים לכל תא וציון העשרת TSS של 7.66. בספריית הברקוד המרחבית של טרקר, 92.43% מהגרעינים הוקצו למיקומים מרחביים, ו-51.54% מהגרעינים הוקצו למיקום מרחבי יחיד. נתוני ריצוף גולמיים ונתונים מעובדים מניתוחים משניים זמינים דרך GEO תחת מספר גיוס GSE327406. האובייקט הסופי עם הערות לאחר QC של Seurat זמין בזנודו תחת מספר הגישה 19475899. הטבעות UMAP מייצגות עם הערות מסוג תא מוצגות באיור 4A. על ידי קישור ברקודים חד-תאיים לברקודים מרחביים, גרעינים בודדים הוקצו חזרה למיקומים המרחביים שלהם בתוך הרקמה כדי ליצור מפה מרחבית (איור 4B). מפה זו תואמת במידה רבה את התכונות האנטומיות שנצפו בחתכים סמוכים ומתיישרת עם חתך קורונלי באטלס המוח של אלן²⁷, הפניה סטנדרטית לאנטומיית מוח העכברים. ניתוח משותף של ביטוי גנים מרחבי ופרופילי H3K27ac ברזולוציה של תא יחיד אפשר זיהוי סוגי תאי מוח עיקריים וחשף דפוסים אנטומיים מאורגנים של התפלגות תאית לאורך חתך הרקמה.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר תהליך מולטי-אום מרחבי של Trekker–CUT&Tag המשלב ברקידוד מרחבי, פרופיל CUT&Tag בקלט נמוך של H3K27ac, לכידה סימולטנית של מטרות מולקולריות מרובות על חרוזי ג'ל מולטיאום חד-תאיים של Genomics 10x, והכנת ספרייה לריצוף Illumina. על ידי שילוב אינדוקס מרחבי עם קריאות אפיגנומיות וטרנסקריפטומיות חד-תאיות, גישה זו מתמודדת עם מגבלה יסודית של בדיקות מולטי-אום חד-תאיות קונבנציונליות, שחסרות הקשר רקמתי טבעי. מחקר זה מדגים בהצלחה את ההיתכנות של פרופיל מולטי-אומי מרחבי ב-CUT&Tag (H3K27ac CUT&Tag + ביטוי גן) ומבסס בסיס לקופרופילינג מרחבי של ביטוי גנים ומטרות רגולטוריות כגון סימני היסטונים וחלבונים הקשורים לכרומטין.

בקרת איכות קפדנית בשלבים שונים של זרימת העבודה חיונית ליישום מוצלח של זרימת עבודה זו (איור 1). למרות שההליך המתואר כאן מתחיל בשלבים לאחר החתך, איכות החתך עצמה קריטית לתוצאות מיטביות. יש להתאים את עובי החתך בהתאם לסוג הרקמה ולתאיות הצפויה. במהלך ניתוק רקמות ובידוד גרעינים, מקסום תפוקת הגרעינים תוך שמירה על שלמות גרעינית הוא קריטי לביצועים הכוללים של בדיקות רב-תאיות חד-תאיות מבוססות טרקר. תפוקת גרעינים נמוכה עשויה לנבוע מפירוק רקמתי לא אופטימלי, בידוד גרעינים לא יעיל או עובי חתך לא מספק. שלמות גרעינית ירודה יכולה להיגרם מהפרעות מכניות מופרזות, זמני עיבוד ממושכים או ניתוק יתר. בידוד הגרעינים מהווה נקודת פתרון תקלות מרכזית ביישום מוצלח של זרימת העבודה המולטיאום החד-תאית המבוססת על Trekker. לכן, מומלץ בחום אופטימיזציה ספציפית לרקמה של פרוטוקול בידוד הגרעינים לפני התחלת בדיקת רב-תאי חד-תאית מבוססת טרקר. יש להעריך גרעינים מבודדים באופן כמותי ואיכותי. ספירת גרעינים באמצעות צבעי גרעין מספקת הערכה של תפוקה, בעוד שבדיקה מיקרוסקופית מאפשרת הערכת שלמות ממברנת הגרעין, ההצטברות ונוכחות פסולת לא-גרעינית. לאחר הכנת הספרייה, יש להעריך את כל הספריות מבחינת התפלגויות גודל מקטעים והיעדר דימרים מתאמים. עבור ספריות CUT&Tag, יש להעריך את העשרת האזורים הגנומיים המטרה על רקע באמצעות PCR כמותי, המספק אינדיקציה מוקדמת לספציפיות הבדיקה ולאיכות הספרייה הכוללת לפני הריצוף. בקרת איכות לאחר ריצוף חשובה לא פחות לפרשנות מדויקת של נתוני מולטיאום מרחביים. מדדים כמו שיעורי מיפוי, ספירת מקטעים לכל גרעין, העשרת אתר התחלת שעתוק, ציוני מקטעים בשיא עבור CUT&Tag, מורכבות גנים ועומק קריאה לכל תא צריכים להיבחן בהתאם להנחיות המומלצות של 10x Genomics ו-Takara Trekker. הערכה משותפת של מדדים אלו הן בשיטות אפיגנומיות והן בטרנסקריפטומיה מאפשרת זיהוי חפצים טכניים ומבטיחה אינטגרציה אמינה של מידע מרחבי, אפיגנומי ותעתוק.

בעוד שהיתכנות הגישה המבוססת על טרקר לברקוד-נכנס בשילוב עם מבחן רב-תחומי CUT&Tag חד-תא מודגמת במחקר זה, הגישה המתוארת כוללת גם מגבלות. לדוגמה, השיטה מוגבלת כיום לרקמות שהוקפאו טרייה, והיתכנותה הוכחה רק בפרופילינג של שינוי היסטון יחיד (H3K27ac) בסוג רקמה יחיד (מוח עכבר) ללא שכפולים ביולוגיים. יתרה מזאת, הגישה תלויה בשתי פלטפורמות מסחריות קנייניות (Takara Trekker ו-10x Genomics Next GEM Chromium Single Cell Multiome). יהיה צורך בהערכה נוספת בין סוגי רקמות מגוונים וסימנים אפיגנטיים נוספים כדי להעריך את היישום הרחב יותר, הביצועים, הכללות והשחזוריות של טכנולוגיה זו.

לסיכום, פרוטוקול המולטי-אום המרחבי Trekker–CUT&Tag המוצג כאן מדגים את היכולת לאפיפרופילינג תא יחיד בפתרון מרחבי של תכונות אפיגנומיות וטרנסקריפטומיות. על ידי שילוב ברקידוד מרחבי עם כימיה רב-תאית חד-תאית מבוססת, הוא מאפשר חקירה מכנית של ויסות גנים בתוך ארכיטקטורת רקמה שלמה ומציע פלטפורמה עוצמתית ליישומים עתידיים בביולוגיה מרחבית. שימושים פוטנציאליים בולטים כוללים הערכת השפעת גירויים ניסיוניים וסביבתיים שונים על שליטה אפיגנטית בביטוי גנים בסוגי תאים מסוימים — לדוגמה, השפעות גירויים עצביים ניתנות לניתוח בסוגי נוירונים מסוימים במערכת העצבים המרכזית וההיקפית, או שההשפעה על תאים סמוכים של תאי חיסון פרו-דלקתיים ואנטי-דלקתיים יכולה להתגלות במחלות דלקתיות וסרטן.