פרמקולוגיה רשת וניתוח מודל עכברים של גלולת יוגווי בדלקת ערמוניתית הנגרמת על ידי קאראג'ינן

סיכום

מחקר זה משלב פרמקולוגיה רשתית וניסויים ב-in vivo כדי לבדוק את ההשפעות האפשריות של כדור יוגווי בטיפול בדלקת הערמונית. ניתוח פרמקולוגיה רשת וטיפול ב-YGP במודל דלקת ערמום בעכברים הצביעו על כך שההשפעות הטיפוליות של YGP עשויות להיות קשורות לוויסות תגובות דלקתיות, מה שמעיד כי YGP מפעיל השפעות אנטי-דלקתיות בדלקת הערמונית.

תקציר

דלקת הערמונית היא הפרעה אורולוגית נפוצה עם אפשרויות טיפול מוגבלות. כדור יוגווי (YGP) הראה ערך טיפולי פוטנציאלי, במיוחד במצבים הקשורים לדלקת. מחקר זה נועד להעריך את השפעותיו ולחקור מנגנונים בסיסיים אפשריים. רכיבים פעילים של YGP נבדקו מ-TCMSP באמצעות קריטריונים לזמינות ביולוגית דרך הפה (OB ≥ 30%) וקריטריונים לדומות תרופה (DL ≥ 0.18), ונאספו מטרות מתואמות. הושגו מטרות הקשורות לדלקת הערמונית מ-GeneCards, ומטרות חופפות נותחו באמצעות רשתות אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI) והעשרת האנציקלופדיה של גנים וגנומים של קיוטו (KEGG). זוהו בסך הכל 126 תרכובות פעילות ו-208 יעדים פוטנציאליים, כאשר 180 מטרות חופפות הקשורות לדלקת ערמונית. ניתוח PPI זיהה את TP53, IL6, AKT1, TNF ו-IL1B כגנים מרכזיים בציר. העשרת KEGG הצביעה על מעורבות של מסלולים הקשורים לדלקת, כולל מסלולי איתות IL-17, TNF, MAPK ו-PI3K-Akt. מודל עכברוש לדלקת ערמונית, הוקם על ידי הזרקה תוך-ערמונית, קראג'ינן. בוצעו בדיקה היסטולוגית ומדידה של פקטור נמק הגידול אלפא (TNF-α) ואינטרלוקין-6 (IL-6) להערכת השפעות טיפוליות. טיפול ב-YGP שיפר את ההיסטופתולוגיה של הערמונית והפחית את רמות TNF-α ו-IL-6 הן ברמות חלבון והן ב-mRNA. ממצאים אלו מצביעים על כך ש-YGP מפעיל השפעות אנטי-דלקתיות בדלקת הערמונית, בעוד שהמנגנונים המולקולריים הספציפיים עדיין לא מאומתים יותר.

מבוא

דלקת הערמונית היא מצב שבו בלוטת הערמונית מתנפחת עם נפיחות וגירוי¹. הוא מהווה כ-25% מהמפגשים הקליניים האורולוגיים העולמיים². המכון הלאומי לבריאות (NIH) חילק את הערסטטה לארבעה קטגורים: חיידקית חריפה, חיידקית כרונית, דלקת ערמונית/תסמונת כאב אגן כרוני (CP/CPPS), וערמונית אסימפטומטית³. מבין אלה, CP/CPPS היא הצורה הנפוצה ביותר והיא קשורה קשר הדוק לדלקת מתמשכת ולחוסר ויסות חיסוני. למרות ההתקדמות בהבנת הטבע הדלקתי של דלקת הערמונית, האסטרטגיות הטיפוליות הנוכחיות נותרות מוגבלות, במיוחד עבור תת-סוגים לא-חיידקיים ^4,5. אנטיביוטיקה משמשת לעיתים קרובות בפרקטיקה קלינית; עם זאת, היעילות שלהם בדלקת ערמונית לא חיידקית שנויה במחלוקת⁶. טיפולים אחרים, החל מחוסמי α ועד תרופות נוגדות דלקת שאינן סטרואידיות (NSAIDs), מכוונים בעיקר להקלה בתסמינים אך לעיתים מראים תוצאות לא מיטביות, עם סיכונים לא מזניחים להפרעות במערכת העיכול, לחץ דם נמוך אורטוסטטי וכדומה 7,8,9,10. מגבלות אלו מדגישות את הצורך בגישות טיפוליות חלופיות שיכולות לווסת ביעילות דלקת בערמונית.

הרפואה הסינית המסורתית (TCM) עשויה להציע מגוון רחב יותר של יתרונות טיפוליים עם פרופיל בטיחות וסבילות מועדפים יותר¹¹. כדור יוגווי (YGP), נוסחה קלאסית המתועדת ב-Jingyue Quanshu, שימש אמפירית במשך מאות שנים למילוי כליות-יאנג ולהקלה על הפרעות קשורות¹². מחקרים קודמים דיווחו שחלק מהרכיבים שלה מפעילים פעילויות אנטי-דלקתיות 13,14,15,16. עדויות קליניות מצביעות על כך ש-YGP יכול להקל ביעילות על תסמיני דלקת הערמונית, אם כי המנגנון הבסיסי עדיין לא ברור¹⁷. פרמקולוגיה רשתית משמשת כגישה עוצמתית ואינטגרטיבית המשלבת ביולוגיה מערכתית ופרמקולוגיה כדי לחשוף את המנגנונים המורכבים של הרפואה המסורתית¹⁸. הועלתה השערה כי YGP עשוי להפעיל השפעות אנטי-דלקתיות על ידי ויסות מטרות מרובות ומסלולי דלקת. תחזיות אלו הוערכו עוד באמצעות מודל דלקת ערמונית, שבו דלקת הערמונית הושרה על ידי הזרקת קאראג'ינן. לאחר הקמת הדגם, בעלי החיים טופלו ב-YGP. רקמות הערמונית נאספו לבדיקה היסטופתולוגית באמצעות צביעת המטוקסילין ואאוזין (HE), וכן להערכה כמותית של סמנים דלקתיים באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים (ELISA) ותגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qRT-PCR).

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת הרפואה הסינית בבייג'ינג (BUCM-2024110107-4103).

איסוף מרכיבים פעילים ומטרות
YGP מורכב מ-Rehmannia glutinosa, Aconitum carmichaelii, Cinnamomum cassia, Dioscorea opposita, Cornus officinalis, Cuscuta chinensis, Angelica sinensis, Eucommia ulmoides, Cervi Cornus Colla, ו-Lycium barbarum. שמות הצמחים הללו הוזנו למאגר הנתונים והניתוח של מערכות הרפואה הסינית המסורתית (TCMSP) כדי לאסוף את התרכובות שלהם. תרכובות פעילות נבדקו באמצעות זמינות ביולוגית דרך הפה (OB ≥ 30%) וקריטריוני דמיון תרופה (DL ≥ 0.18) 19,20,21. היעדים המתאימים של כל תרכובת התקבלו מ-TCMSP וסטנדרדו לסמלי גנים באמצעות מאגר הנתונים UniProt. מטרות הקשורות לדלקת הערמונית נאספו ממאגר GeneCards באמצעות "דלקת ערמונית" כמילת מפתח, וגנים עם ציון רלוונטיות גבוה מהממוצע נבחרו להכללה במחקר.

בניית רשת רגולטורית של YGP נגד דלקת הערמונית
המפגש בין מטרות הקשורות ל-YGP ושל דלקת הערמונית זוהה והוגדר כסט של מטרות טיפוליות פוטנציאליות. מטרות אלו יובאו ל-Cytoscape (גרסה 3.9.1) לבניית רשת מורכבת-מטרה-מחלה. ניתוח טופולוגיית רשת בוצע באמצעות תוסף CytoHubba, ורכיבים מרכזיים זוהו בהתבסס על ערכי מרכזיות קליקה מקסימלית (MCC)²².

ניתוח רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI)
היעדים החופפים יובאו למסד הנתונים של STRING (גרסה 11.5), כאשר האורגניזם מוגדר ל-Homo sapiens. ציון האינטראקציה המינימלי הנדרש הוגדר ≥ 0.7, והצמתים המנותקים הוסתרו²³. נתוני האינטראקציה יוצאו בפורמט TSV והוצגו ב-Cytoscape. גני Hub זוהו בהמשך באמצעות תוסף CytoHubba בהתבסס על דרגת מרכזיות.

ניתוח העשרת מסלול KEGG ו-GO
היעדים המשותפים הועלו לפלטפורמת Metascape עבור אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) לניתוח מסלולים. מיני הקלט והניתוח הוגדרו להומו ספיינס. בוצע ניתוח העשרת מסלולי KEGG. המסלולים עוברו סינון נוסף בהתאם לרלוונטיותם לדלקת ערמונית, כפי שנקבע על ידי ספרות שפורסמה והערות במאגרי נתונים. המסלולים הנותרים דורגו לפי ערכי Log P שלהם. מסלולי KEGG המועשרים ביותר הוצגו באמצעות תרשימי בועה.

עגינה מולקולרית
היעדים המרכזיים נבחרו מרשת PPI בהתבסס על דרגת מרכזיות, והתרכובות הפעילות זוהו מרשת הרגולציה YGP-prostatitis בהתבסס על ערכי MCC לניתוח עגינה מאוחר יותר. מבני החלבון התקבלו ממסד הנתונים של AlphaFold Protein Structure Database בפורמט PDB, ומבני הליגנדים הורדו מ-TCMSP בפורמט mol2²⁴. עגינה מולקולרית בוצעה באמצעות פלטפורמת CB-Dock2^{המקוונת 25}. לפני העגינה, מבני החלבון עובדו אוטומטית מראש על ידי הסרת מולקולות מים, הוספת אטומי מימן והשלמת שאריות חסרות. נרשמו זיקות קשירה, ונוצרו מפות חום באמצעות GraphPad Prism (גרסה 10.1.2). המבנים התלת-ממדיים של קומפלקסים של ליגנד-חלבון עם ציוני Vina הנמוכים ביותר הוצגו באמצעות ChimeraX, ודיאגרמות אינטראקציה דו-ממדיות נוצרו באמצעות LigPlus.

הכנת תמצית מימית של YGP
הרכיבים הצמחיים של YGP הוכנו לפי יחס הנוסחה המסורתי, כולל 24 גרם שורש מעובד של Rehmannia glutinosa (Shudihuang), 6 גרם מהשורש הצדדי המעובד של Aconitum carmichaelii (פוזי), 6 גרם מקליפת Cinnamomum cassia (Rougui), 12 גרם מהשורש של Dioscorea הנגדית (Shanyao), 9 גרם מפרי Cornus officinalis (שנז'ויו), 12 גרם מזרע של Cuscuta chinensis (טוסיזי), 12 גרם מג'לטין קרניים מעובד של Cervi Cornus Colla (לוג'יאוג'יאו), 12 גרם מפרי Lycium barbarum (גוקי), 9 גרם שורש של אנג'ליקה סיננסיס (Danggui), ו-12 גרם מקליפת Eucommia ulmoides (דוז'ונג). כל העשבים, למעט Aconitum carmichaelii ו-Cervi Cornus Colla , הושרו ב-6 פעמים משקלם הכולל של מים מזוקקים למשך 30 דקות, בעוד ש-Aconitum carmichaelii הושרה בנפרד במשקל פי 6 ממשקלו של מים מזוקקים. האקוניטום קרמיכאלי הוטחן תחילה באמצעות מכשיר חימום חשמלי למשך שעה, ולאחר מכן הוספו והוטחו פעמיים במשך שעה בכל מחזור את שאר העשבים, למעט Cervi Cornus Colla. צ'רבי קורנוס קולה הומס לאחר מכן באמבט מים בטמפרטורה של 60–70 מעלות צלזיוס עד שהתמוסס לחלוטין והושלבו בתמצית. לאחר הקירור, הדקוקציה סיננה דרך גזה דו-שכבתית, הוקפאה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות, והפכה לליופילית לקבלת תמצית אבקה.

מודל בעלי חיים ועיצוב ניסוי
זכרי חולדות ספרג-דולי (8 שבועות, משקל 200–220 גרם) הוחזקו בתנאים מסוימים ללא פתוגנים עם מחזור אור/חושך של 12 שעות וגישה חופשית למזון ולמים. לאחר שבוע של הסתגלות, חולקו העכברים באקראי לשלוש קבוצות (n = 6 לכל קבוצה): קבוצות ביקורת, מודל וקבוצות YGP. דלקת ערמונית כרונית נגרמה על ידי הזרקה תוך-ערמוניתת של 3% תמיסת קארגנן²⁶. בקצרה, חולדות הורדמו באיזופלורן (3–4% לאינדוקציה ו-1.5–2% לתחזוקה), ובוצעה חתך בטן אמצעית לחשיפת הערמונית. סך הכל 25 מיקרוליטר של תמיסת קאראג'ינן 3% הוזרקו לכל אונה וונטרלית של הערמונית. קבוצת הביקורת קיבלה הזרקה תוך-ערמונית של תמיסת מלח רגילה (תמיסת מלח פיזיולוגית) בלבד. פניצילין לאחר הניתוח (2.5 ×^{10 5} U/kg) ניתן תוך-שריר במשך 3 ימים.

אבקת תמצית ליופילית של YGP הוכנה מהדקוקציה והוחזרה בתמיסת מלח רגילה סטרילית של 0.9% כדי לקבל תמצית אחידה לגז הפה (10.54 גרם/ק"ג/יום). חולדות בקבוצת YGP קיבלו מתן דרך הפה של תמצית YGP (10 מ"ל/ק"ג), בעוד שקבוצות הביקורת והמודלים קיבלו נפח שווה ערך של 0.9% תמצית רגילה סטרילית. לאחר 4 שבועות, חולדות הורדמו עם נתרן פנטוברביטל (50 מ"ג/ק"ג, הזרקה תוך-פריטוניאלית), ונאספו רקמות ערמונית לאחר הקרבה בהתאם להנחיות האתיות.

בדיקה היסטופתולוגית
רקמות הערמונית קיבעו ב-4% פרפורמלדהיד למשך 24 שעות, יובשו באמצעות אתנול מדורג (75% אלכוהול ל-4 שעות, 85% אלכוהול ל-2 שעות, 90% אלכוהול לשעתיים, 95% אלכוהול לשעה, אתנול מוחלט לשעה), נוקו בקסילן, והוטמעו בפרפין. החתכים (4–5 מיקרון) עברו צביעת HE לפי הנהלים הסטנדרטיים²⁷. לזמן קצר, הקטעים עברו דה-פרפין, הודרו מחדש, צובקו בהמטוקסילין, הובדלו וצבעו ב-אאוזין. לאחר ההתייבשות וההתקנה, נצפו החתכים תחת מיקרוסקופ אור להערכה היסטופתולוגית.

דלקת היסטופתולוגית הוערכה באמצעות מערכת ניקוד חצי-כמותית המבוססת על חדירת תאי דלקת, התרבות פיברובלסטים, מורפולוגיה אצינרית ומצב ההפרשה. חדירת תאים דלקתיים דורגה כ-0 (ללא חדירה), 2 (חדירה קלה), 4 (חדירה בינונית) ו-6 (חדירה חמורה). התרבות הפיברובלסטים דורגה כ-0 (נעדר), 1 (קל), 2 (בינונית) ו-3 (חמורה). המורפולוגיה האצינרית הוערכה כ-0 (לומן אקינרי גדול), 1 (גודל לומן מוקטן במידה בינונית), 2 (גודל לומן מוקטן במידה ניכרת), ו-3 (חסימה או היעלמות אצינרית). סטטוס ההפרשה נקבע כ-0 (הפרשת שפע), 1 (הפרשת בינונית), 2 (הפרשת מועטה) ו-3 (היעדר הפשה). הציון ההיסטופתולוגי הכולל חושב כסכום כל ארבעת הפרמטרים, כאשר ציונים גבוהים יותר מצביעים על פגיעה חמורה יותר ברקמת הערמונית ודלקת²⁸.

אליסה
רקמות הערמונית (100 מ"ג) נשטפו בתמלח קר עם בופר פוספט (PBS) והומוגניזציה בבופר ליזיס בתוספת מעכבי פרוטאז. ההומוגנטים דוגרו בטמפרטורה של 4°C למשך 30–120 דקות וצנטריפוגה ב-5000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לאיסוף הסופרנטנטים. רמות החלבון של TNF-α ו-IL-6 נמדדו באמצעות ערכות ELISA לפי הוראות היצרן. תקנים ודגימות נוספו לפלטות של 96 בארות ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ואחריהם דגירה רציפה עם נוגדנים ביוטיניליים וקונוגטים של אנזימים. לאחר הכביסה, נוספה תמיסת המצע להתפתחות צבע, והתגובה הסתיימה עם תמיסת העצירה. הספיגה נמדדה ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט. ריכוזי הציטוקינים חושבו על בסיס עקומות סטנדרטיות.

qRT-PCR
סך ה-RNA הופק מרקמות הערמונית בשיטה מבוססת עמודה ונמדד על ידי מדידת ספיגה ב-260 ו-280 ננומטר להערכת הטוהר. דגימות RNA הועתקו לאחור ל-cDNA בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות באמצעות ערכת שעתוק הפוך. qRT-PCR בוצע באמצעות תרמחזור בתנאים הבאים: דנאטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, ואחריה 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות ו-60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. רצפי הפריימרים ששימשו במחקר זה מופיעים בטבלה משלימה 1. אותות פלואורסצנציה נאספו במהלך שלב האנילינג/הארכה. רמות הביטוי של TNF-α ו-IL-6 נורמל לגן הייחוס הפנימי GAPDH. ביטוי הגנים היחסי חושב באמצעות שיטת 2^−ΔΔCt .

ניתוח סטטיסטי
כל הנתונים מוצגים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת GraphPad Prism (גרסה 10.1.2). התפלגות הנתונים הוערכה לנורמליות לפני הניתוח. ההבדלים בין קבוצות שונות נותחו באמצעות ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) ואחריו מבחן פוסט-הוק של טוקי להשוואות מרובות. ערך של p < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

תוצאות

זיהוי רכיבים ביואקטיביים וגנים מטרה
זוהו בסך הכל 126 רכיבים ביואקטיביים ב-YGP העומדים בקריטריונים (OB ≥ 30% ו-DL ≥ 0.18). בהתאם ל-208 גנים חזויים של יעד. מאגר GeneCards הניב 9,845 גנים הקשורים לדלקת ערמונית. ניתוח ון חשף 180 גנים חופפים בין היעדים החזויים של YGP לבין גנים הקשורים לדלקת ערמונית, מה שמרמז שמטרות משותפות אלו עשויות לתווך את ההשפעות הטיפוליות של YGP נגד דלקת הערמונית (איור 1). ההתפלגות בין רכיבים צמחיים (הערכים בסוגריים מייצג...

דיון

דלקת הערמונית מוגדרת פתולוגית על ידי נוכחות מוגברת של תאים דלקתיים בתוך הפרנכימה של הערמונית או המזנכימה^28,29. במחקר שנערך על למעלה מ-5 מיליון גברים קוריאנים שנעקבו במשך תשע שנים, קים ואחרים אישרו באמצעות ניתוח רב-משתני כי דלקת הערמונית מעלה משמעותית את הסיכון לפתח סרטן הערמונית³⁰. עם זאת, הניהול הקליני הנוכחי מוגבל, במיוחד בדלקת פרוסטטה לא חיידקית, שבה אפשרויות הטיפול עדיין לא אופטימליות^...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
4% פאראפורמלדהיד	ביוטיים	P0099-3L
מאגר מבנה חלבונים של AlphaFold	מאגר מבנה חלבונים של AlphaFold	https://alphafold.ebi.ac.uk/
BeyoFast SYBR Green qPCR Mix (2X)	ביוטיים	D7260
פלטפורמת ביואינפורמטיקה מקוונת	פלטפורמת ביואינפורמטיקה מקוונת	http://www.bioinformatics.com.cn/
קאראג'ינן	אוריליף	S30559
CB-DOCK2	CB-DOCK2	http://183.56.231.194:8001/cb-dock2/php/blinddock.php
ציטוסקייף	ציטוסקייף	https://cytoscape.org/
ג'ינקארדס	ג'ינקארדס	https://www.genecards.org/
המטוקסילין ואאוסין (H&) ה) ערכת צביעה	ביוטיים	C0105S
מטאסקייפ	מטאסקייפ	https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1
בלסם נייטרלי	סרוויסביו	WG10004160
שעוות פרפין (להטמעה)	סרוויסביו	RP-15
קוקטייל מעכב פרוטאז (100X)	אפיזים	GRF101
ערכת רט IL-6 ELISA	ביוטיים	PI328
Rat TNF-α קיט	בייג'ינג  4A  חברת Biotech בע"מ	CRE0003
ערכת בידוד RNA ארוכה של RNAeasy Animal עם עמוד ספין	ביוטיים	R0026
מיתר	מיתר	https://string-db.org/
TCMSP	TCMSP	https://www.tcmsp-e.com/#/database
יוניפרוט	יוניפרוט	https://www.uniprot.org/