פלטפורמת רשת לכימות אוטומטי מבוסס תמונה של איים מבודדים בבני אדם ומכרסמים

סיכום

פרוטוקול זה מתאר דגימה סטנדרטית, צביעה, רכישת תמונה וכימות אוטומטי מבוסס רשת של איים מבודדים בבני אדם ומכרסמים באמצעות ניתוח תמונה בסיוע למידה עמוקה ובקרת איכות ויזואלית.

תקציר

מטרת פרסום זה היא לספק פרוטוקול וידאו כתוב וחי, שלב אחר שלב לשימוש סטנדרטי ב-IsletNet, פלטפורמה מבוססת רשת לכימות אוטומטי של איים מבודדים בלבלב בתמונות, החל מדגימה ורכישת תמונות ועד העלאת תמונות, אימות ויזואלי ויצירת דוחות אוטומטית. הפלטפורמה פותחה להערכה סטנדרטית ואוטומטית של תמונות מיקרוסקופיות דו-ממדיות של איים מבודדים בלבלב, כדי לתמוך בתהליכי עבודה קליניים וניסויים בבידוד האיים. סגמנטציה מבוססת למידה עמוקה של תמונות משמשת לזיהוי איים קטנים ורקמות אקסוקריניות מהן מוציאים קווי מתאר לניתוח תמונה. אלגוריתמים חישוביים מכימים לאחר מכן את מספר האיים, נפח וטוהר האיים. כלי בקרת האיכות הוויזואלית תומך באימות מקצועי של ניתוחים אוטומטיים של תמונות בכך שהוא מאפשר למשתמשים לקבל, לתקן ידנית או להוציא תמונות לא תקפות. מודול Clinical Islet Isolation תומך בניתוח אצווה של טוהר-שבר ומייצר דוחות PDF אוטומטיים יחד עם קבצי נתונים להורדה של תמונות וטבלאות לשמירת וניתוח רישומים. מודול ההשוואה הפשוטה משווה הערכות אוטומטיות לתוצאות ייחוס שהושגו מקומית והוגשו יחד עם תמונות המדגם המתאימות כדי להעריך את ההתאמה של תמונות סטנדרטיות מקומית לניתוח אוטומטי. הפרוטוקול גם מפרט המלצות לאימון מחדש באמצעות תמונות סטנדרטיות שנוצרו מקומית בעת הצורך. נתונים מייצגים מבידוד מכרסמים ואיים אנושיים, כולל דוגמאות מאתגרות, מראים שיפור בביצועי ניתוח אוטומטי לאחר אימון מתאים.

מבוא

השתלת איים מבודדים בלבלב למקבלי סוכרת מפחיתה או מבטלת את הצורך במתן אינסולין חיצוני¹. תהליך הבידוד של האיים מתורמים גופות או חיים נתון להטרוגניות ביולוגית ופרוצדורלית, המשתקפת בשינויים בתפוקה ובאיכות. נפח האיים הכולל מייצג את הקלט העיקרי לקביעת מינון ולקבלת החלטות קליניות בנוגע להתאמת להשתלה². היסטוגרמת גודל האי ומספר אינדקס האי מתחשבים בהבדלים ביעילות הקשורה לגודל³. לכן, מוקדש תשומת לב לאיים קטנים בודדים בנוסף לנפח הכולל, שמשמש כיום כסמן חלופי לתכולת תאי בטא. איים אנושיים מבודדים הם פחות צפופים מאיי מכרסמים ולעיתים קרובות אינם מופרדים היטב מרקמות אקסוקרין. כתוצאה מכך, קשה יותר להבחין בהם אלא אם כן הם מוכתמים. אומצה שיטת צביעת אבץ מהירה ופשוטה באמצעות דיתיזון, שבה אור אדום עז מוחזר מגרגרי אינסולין מועשרים באבץ⁴. בהינתן האטימות של הרקמה, נאסף רק אור המוחזר מהשטח, מה שמאפשר שימוש במכשירים פשוטים של סטריאו או מיקרוסקופיה הפוכה, המצוידים במקור אור ומצלמה.

נעשו ניסיונות רבים להפחית שונות בין-מעבדתית באמצעות כלי ניתוח תמונות דיגיטליים 5,6,7,8,9,10,11,12, אך לגישות אלו יש מספר מגבלות. בשיטות אלו, סגמנטציה של איים קטנים ורקמות אקסוקריניות מתבססת או על סף ידני, הנוטה לשגיאה סובייקטיבית 5,6,7,8,9,10, או משתמשת בגישות סגמנטציה אוטומטיות ^{מלאות 11,12}. בנוסף, התקנת תוכנה מקומית נדרשת^{לעיתים קרובות} 5,6,7,8,9,10,11 ויכולה להיות מוגבלת לחומרה ספציפית^10,11, מה שמגביל נגישות כללית ותקנון.

המטרה הכוללת של הפרסום הנוכחי היא לספק זרימת עבודה סטנדרטית לכימות אוטומטי של איים מבודדים בלבלב בתמונות באמצעות פלטפורמת למידה עמוקה מבוססת רשת בפיקוח מומחים אנושי. IsletNet מתמודד עם מגבלות הקשורות הן לזמינות והן לאמינות של ניתוח תמונות האיים. במאמר זה אנו מציגים הנחיות מומלצות לדגימת שתלי איים, יצירת תמונות מיקרוסקופיות מתאימות ושימוש נכון בכלי IsletNet . הפרוטוקול מציג את מושג הפיקוח האנושי על תוצאות שנוצרות אוטומטית ומציג תהליכי עבודה למשתמשים פוטנציאליים ומבוססים (איור 1). כלי ההשוואה הפשוטה מאפשר למשתמשים פוטנציאליים להשוות תוצאות IsletNet ישירות לשיטות ייחוס שהושגו מקומית (איור 1A). מכיוון שתמונות סטנדרטיות שנוצרות מקומית עשויות להיות שונות באופן מהותי בין מרכזים, IsletNet עשויה לדרוש הכשרה מחדש לפני שניתן יהיה לבצע ניתוח אמין (איור 1B). כדי להקל על תהליך זה, ניתנות המלצות לצביעה סטנדרטית ורכישת תמונות. למשתמשים ותיקים, כלי Clinical Islet Isolation נועד לתמוך בזרימת העבודה של בידוד האיים האנושיים (איור 1C). דוחות להורדה יחד עם טבלאות נוספות והדמיות שנוצרו על ידי IsletNet מתוארים בטבלה 1, בעוד שהפרמטרים המרכזיים המחושבים מסוכמים בטבלה 2.

איור 1: זרימת עבודה עבור משתמשים פוטנציאליים וותיקים של הפלטפורמה. (א) זרימת עבודה של אימות מקומי באמצעות מודול השוואה פשוטה. (ב) אימון מחדש דורש קבוצה המייצגת תמונות סטנדרטיות מקומית. (ג) זרימת עבודה שגרתית באמצעות מודול בידוד האיים הקליניים. שלבי זרימת העבודה המרכזיים מסוכמים להעלאת תמונות, ניתוח, בקרת איכות ויזואלית (vQC) ויצירת דוחות. פסי משקל אינם חלים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

טבלה 1: קבצי תוצאות להורדה שנוצרו על ידי הפלטפורמה. רשימת קבצי פלט להורדה שנוצרו על ידי כלי Clinical Islet Isolation and Simple Comparison, מקובצים לפי פורמט קובץ וקטגוריית פלט. הטבלה כוללת קבצי דוחות, פלטי תמונה מקוטעים, קבצי ויזואליזציה וייצוא גיליון אלקטרוני לניתוחי ספירת איים, נפח, טוהר והיסטוגרמות. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 2: פרמטרים מרכזיים הכלולים בדוחות להורדה ובפלטי גיליונות אלקטרוניים. רשימה מפורטת של מטא-דאטה, הגדרות שהוגדרו על ידי המשתמש ופרמטרי ניתוח כמותי הכלולים בקבצי XLSX ו-CSV להורדה שנוצרו על ידי כלי Clinical Islet Isolation and Simple Comparison. הפרמטרים כוללים מטא-דאטה של סשן, הגדרות רכישת תמונה, ומדדי כימות איים לתמונות ואיים בודדים. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

פרוטוקול

נהלי בעלי חיים אושרו על ידי משרד הבריאות של הרפובליקה הצ'כית (אישור מס' 49/2023) בהתאם להנחיית מועצת הקהילות האירופית 86/609/EEC. נהלי בידוד ושימוש באיים אנושיים אושרו על ידי המכון הממלכתי לבקרת תרופות (אישור מס' sukls111286/2023). תמונות מיקרוסקופיות סטנדרטיות של הכנות עכברושים ואיים אנושיים נותחו באמצעות כלי Simple Comparison ו-Clinical Islet Isolation כדי להשוות ניתוח אוטומטי לספירה ידנית. טבלת ההמרה הסטנדרטית (הקצרה)¹³ שימשה הן לחישובים ידניים והן לחישובים אוטומטיים למקביל לאיים.

1. פיקוח אנושי

1. מבט ראשוני על תוצאות הפריימריז (איור 2)
   1. המתינו שהערכים שנוצרים אוטומטית עבור ספירת האיים, הנפח והטוהר, יחד עם ההדמיה הגרפית של ההערות האוטומטיות המתאימות (למשל, קווי מתאר או סגמנטים), יופיעו בחלון תוצאות האצווה.
   2. צפה בתוצאות מסוכמות של תמונת הדגימה הנוכחית בלוח המידע השמאלי (איור 2A).
   3. הצג ערכי שכפול (איור 2B) וממוצעי אצווה (איור 2C) בטבלה הימנית.
   4. דפדף בתצוגה מקדימה של התמונה (איור 2D,E) באמצעות הקישורים (איור 2F). לחצו קליק ימני על תצוגת התמונה ועקבו אחרי תפריט הקופץ כדי להוריד תמונה אחת במידת הצורך.
   5. עיין בתמונות דגימות באמצעות חיצי הניווט (איור 2G) או בחר ישירות מהטבלה.
   6. פתח את חלון הבדיקה על ידי לחיצה בתוך התצוגה המקדימה הנוכחית של התמונה (איור 2D) כדי להעריך את איכות קווי המתאר שנוצרו אוטומטית ולאמת את התוצאות.
2. בקרת איכות ויזואלית
   1. הזיזו את התמונה וזומים (איור 3A) פנימה או החוצה כדי לבדוק את קווי המתאר לאיתור שגיאות אפשריות.
   2. החלף בין הקוטור (רק האיים הספורים כוללים אותו), תמונה מקורית ותצוגות ויזואליזציה נוספות.
      הערה: התצוגות הזמינות מופיעות ב-Legend בצד ימין של החלון (איור 3B) וניתן לגשת אליהן באמצעות קיצורי המקלדת או הקישורים בשורת הניווט העליונה (איור 3C; טבלה 3).
   3. המשיכו לתמונה הבאה על ידי לחיצה על מקש החץ למטה אם הקווים מתאימים (טבלה 3).
   4. תקן שגיאות קונטורינג ידנית כשאפשר. אם איים לא זוהו, חלקית או מזויפים עדיין קיימים, סווגו את התמונה כלא תקפה והוציאו אותה מהניתוח.
      הערה: תמונות שהוצאו מסומנות בחלון תוצאות אצווה (איור 2J) ובכל הקבצים שהורידו.
3. שגיאות ניתנות לתיקון: איים סמוכים לא מופרדים
   1. הפרדו את האיים הסמוכים ידנית כשצריך.
   2. לחץ שמאלי מחוץ לאיים כדי להתחיל קו הפרדה (איור 3D).
   3. הוסף קליקים שמאליים ביניים כדי להנחות את קו ההפרדה בין האיים הסמוכים (איור 3E).
   4. לחץ קליק ימני מחוץ לאיים כדי להשלים את קו ההפרדה (איור 3F).
   5. הגיש את שורת ההפרדה לעדכון התוצאה (איור 3G).
      הערה: הפעל או כבה את הוויזואליזציה של קווי הפרדה נוספים לפי הצורך (איור 3H).
4. שגיאות ניתנות לתיקון: איים מזויפים
   1. השתמש בכלי ההפרדה כדי לחלק אי מזויף למספר אובייקטים קטנים מסף גודל האי.
   2. הימנעו מספירת קטעי איים קטנים על ידי קביעת סף גודל האי המינימלי שמוגדר מראש (בדרך כלל 50 מיקרון). אם יש צורך להתאים את הסף בהתאם לפרקטיקות המעבדה המקומיות.
   3. לחץ קליק ימני על כל נקודה בשורה ובחר את האפשרות המתאימה מתפריט הקופץ כדי להסיר אחד או את כל שורות ההפרדה שנוספו ידנית (איור 3I).
5. שגיאות בלתי ניתנות לתיקון: איים חסרים, חלקים חלקית או שגויים
   1. הפוך את תצוגת הסגמנטציה כדי לוודא אם האיים זוהו.
   2. החריגו מחישוב ממוצע אצווה כל תמונה לא תקפה המכילה איים לא מזוהים, חלקית או מרובים שגויים (איור 3J).
6. שגיאות בלתי ניתנות לתיקון: עצמים מסווגים בטעות
   1. יש להוציא את התמונה מההערכה אם רקמות אקסוקריניות, ארטיפקטים ברקע או בועות מסווגים בטעות כאיים קטנים (איור 3J).

איור 2. חלון תוצאות באצווה. (א) סיכום תוצאות מדגם נוכחי. (B) תוצאות לתמונות דגימה משוחזרות. (ג) ערכי ממוצע באצווה רק מתמונות מקובלות. (D, E, F) תצוגות גרפיות עם קישורים. (ז) דוגמת חיצי ניווט. (H, I, J) תמונות שונאו, התקבלו והוחרגו. (K) פס הניווט העליון של IsletNet . (L, M) כותרת ותחתון חלון תוצאות אצווה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3. חלון בדיקה לתיקון vQC ותיקון קווי מתאר ידני. (א) תצוגת זום תמונה. (ב) רמזים לאגדה וניווט. (ג) סרגל הניווט העליון של חלון הבדיקה. (D–G) בניית והגשת קו הפרדה ידני לאיים סמוכים. (H) מתג להצגת או הסתרת קווי הפרדה ידניים. (I) הסרת קווי הפרדה ידניים. (J) מתג למניעת תמונה מסטטיסטיקות. פסי קנה מידה אינם מוצגים בתצוגת הממשק הזו. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

טבלה 3: מצבי צפייה, קיצורי מקלדת ובקרות ניווט הזמינות בחלון הבדיקה. סיכום מצבי הדמיית תמונה, קיצורי מקלדת ופונקציות ניווט הזמינות במהלך vQC וסקירה ידנית של תוצאות הסגמנטציה בחלון הבדיקה. הטבלה כוללת שכבות קונטור, תצוגות סגמנטציה, ויזואליזציה של היסטוגרמות, ובקרות ניווט תמונה המשמשות בכלי Clinical Islet Isolation ו-Simple Comparison Technique. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

2. ניווט בפלטפורמה

1. גרסת צפייה ומידע טכני
   1. בדוק את גרסת התוכנה הנוכחית ואת תאריך האימון האחרון שמופיע בסרגל הניווט העליון (איור 2K).
   2. פתח את מדור הבית כדי לגשת לתיאור הטכני ולמידע המקור הנלווה.
2. הערכה ראשונית של תמונות מקומיות
   1. קבע האם ניתן כבר לנתח נכון תמונות סטנדרטיות שנוצרו מקומית על ידי הפלטפורמה, בהתבסס על קריטריוני השגיאה המתוארים בשלבים 1.2.4 ו-1.5.2, או האם נדרש אימון מחדש לתמונות סטנדרטיות מקומיות (איור 1A  ו-1B).

3. השוואה פשוטה והכשרה חיצונית עם תמונות מקומיות

1. השוואה פשוטה
   הערה: השתמש בכלי ההשוואה הפשוטה להשוואת תוצאות ניתוח אוטומטי עם שיטת ייחוס מקומית, בדרך כלל ספירה ידנית סטנדרטית¹³, טבלאות חלופיות ^7,11,18 או מודלים ^5,6. העלה תמונות סטנדרטיות שנוצרו מקומית יחד עם ערכי ההתייחסות המתאימים וסוג שיטת ההתייחס. הפלט כולל טבלאות להורדה, תמונות ודוחות PDF (טבלה 1).
   1. פתח את לוח המחוונים של Simple Comparison מסרגל הניווט העליון (איור 4A ו-4B).
   2. עיין בסעיף הרמזים לתכונות התמונה הנדרשות (איור 4C).
   3. הורד את תבנית form.xlsx (איור 4D).
   4. ספור איים קטנים במספר דגימות באמצעות שיטת ייחוס מקומית.
   5. רכוש תמונות מיקרוסקופיות סטנדרטיות המתאימות לדגימות שנספרו.
   6. ודא שכל האיים שנספרו כלולים במלואם במסגרת התמונה.
   7. הזן את שמות הקבצים המדויקים של התמונה וערכי הפרמטרים המתאימים לתבנית form.xlsx באמצעות נקודות עשרוניות באנגלית (איור 4E).
   8. העלה את הגיליון האלקטרוני המלא ואת קבצי התמונה המתאימים באמצעות גרירה ושחרור או באמצעות כפתורי ההעלאה (איור 4F).
   9. בחר את טבלת ההמרה או המודל המשמש להערכת נפח האיים (איור 4G).
   10. לחץ על שלח אצווה כדי ליצור את ההשוואה זו לצד זו.
   11. חכה לתוצאות הניתוח שיגיעו.
   12. פתח את חלון הבדיקה כדי לבצע אימות חזותי של קווי המתאר.
   13. החריגו תמונות מהניתוח אם קווי המתאר אינם נכונים (איור 3J).
       הערה: עריכת קווי גובה ידנית אינה זמינה בכלי Simple Comparison.
   14. הורד את התוצאות כטבלאות, תמונות ודוחות PDF (טבלה 1).
2. אימון IsletNet לתמונות סטנדרטיות מקומית
   1. ניתן ליצור קשר עם צוות הפיתוח במכון לרפואה ניסיונית (IKEM) בטלפון info@isletnet.com.
   2. שתפו תמונות מייצגות המכסות את טווח איכות התמונה שנרכשו כיום מקומית.
   3. דונו בדרישות איכות התמונה עם צוות הפיתוח.
      הערה: פרמטרים מרכזיים באיכות התמונה כוללים ניגודיות מספקת, הכללה מלאה של איים קטנים בתוך מסגרת התמונה, וחפיפה מינימלית בין האיים הסמוכים. צבע האיים עשוי להשתנות מאדום לורוד או סגול, בתנאי שההבחנה מהרקמה החיצונית נשארת ברורה.
   4. צור סט תמונות אימון המכסה את טווח הטוהר הצפוי של האיים, ההגדלות והשונות בצבעים.

איור 4. כלי השוואה פשוט, לוח מחוונים וזרימת עבודה. (א) פס ניווט עליון. (ב) לוח מחוונים להשוואה פשוטה. (ג) העלאת רמזים והוראות. (D, E) form.xlsx תבניות להורדה והעלאת ויזואליזציה של פרמטרים. (ו) אזור העלאה בגרירה ושחרור עבור תמונות וגיליונות אלקטרוניים. (ז) בחירת המרת גודל לאי לנפח. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

4. דגימה

הערה: האיים הקטנים משקעים במהירות ובאופן דיפרנציאלי בהתאם לגודל ולצורה, מה שעלול להטות את תוצאות הדגימה.

זהירות: בצע את כל הליכי הטיפול באי בתוך מכסה זרימה למינרי, תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים.

1. השתמש בצינורות של 50 מ"ל או 250 מ"ל למתלים של האי.
2. קבעו את שיעור הדגימה הנדרש בהתאם לנפח וטוהר הכדורים שנצפו באמצעות נהלי הפעלה סטנדרטיים מקומיים.
3. ערבבו היטב את מתלה האי על ידי הפיכת הצינור חמש פעמים מיד לפני איסוף הדגימות.
4. שלפו את הדגימה מיד באמצעות קצה פיפטה גדול כדי למנוע חסימה על ידי רקמה אקסוקרינית ולהפחית נזק לאיים.

5. אופטימיזציה של רכישת תמונות באיים

1. הכנת דיתיזון
   הערה: נדרש צביעת דיתיזון עקבית כדי להבטיח ניגוד מספק בין האיים לרקמות אקסוקריניות. שתי שיטות הכנה נפוצות מתוארות להלן.
   אזהרה: דיתיזון הוא רעלן רבייתי חשוד. דימתיל סולפוקסיד (DMSO) הוא רעיל וחדור לעור. נתרן הידרוקסיד הוא חומר קורוזיבי מאוד ועלול לגרום לכוויות כימיות חמורות. לטפל בכל הכימיקלים תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים, להימנע ממגע עור ולהשליך פסולת בהתאם לנהלים מוסדיים לפסולת מסוכנת.
   1. השעיה מחדש ב-DMSO¹³
      1. שקול 50 מ"ג אבקת דיתיזון.
      2. המיס את הדיתיזון ב-5 מ"ל DMSO.
      3. דגרו את התמיסה בטמפרטורה של 37°C ודחפו את המערבולת בעוצמה במשך דקה אחת כל 5 דקות עד להשלמת המיסה.
      4. דיללו 1 מ"ל מהתמיסה המקורית עם 20 מ"ל של תמיסת המלח המאוזנת של Hank's המכילה 2% סרום בקר עוברי להכנת תמיסת העבודה.
      5. סנן את התמיסה דרך מסנן מזרק של 0.22 מיקרון.
      6. עטוף את הצינור בנייר אלומיניום כדי להגן על התמיסה מאור.
         הערה: השתמש בתמיסה הפועלת בתוך כ-12 שעות.
   2. השעיה מחדש בתמיסה אלכוהולית אלכוהולית (חלופה להפניה 8)
      1. שקול 50 מ"ג אבקת דיתיזון.
         הערה: הכינו אליקווטים מראש אם תרצו.
      2. הוסף 800 מיקרוליטר של 70% אתנול לדיתיזון.
      3. הוסף 400 מיקרוליטר של תמיסת נתרן הידרוקסיד של 1 מ' ומערבולת היטב עד להשלמת ההמיסה.
      4. דילל את התמיסה עם תמיסת מלח מפופר פוספט המכיל 0.2 מ"ג/מ"ל אלבומין אנושי לנפח סופי של 20 מ"ל.
      5. סנן את התמיסה דרך מסנן מזרק של 0.22 מיקרון.
      6. עטוף את הצינור בנייר אלומיניום כדי להגן על התמיסה מאור.
         הערה: השתמש בתמיסה הפועלת בתוך כ-12 שעות.
2. צביעת האיים
   1. הוסיפו 25 מיקרוליטר של תמיסת עבודה דיתיזון למרכז צלחת בקוטר 35 מ"מ.
   2. הוסיפו 50 מיקרוליטר של איים תלויים בתמיסת המלח המאוזנת של האנק המכילה אלבומין, מדיום תרבית מלא או מדיום השתלה.
      הערה: נפח הדגימה בפועל נע בין 20-50 מיקרוליטר, תלוי בפלט הטוהר-שבר, עם ריכוז סופי של דיתיזון של 0.85 מ"ג/מ"ל עד 1.37 מ"ג/מ"ל.
   3. הפיפט את המתלה פנימה והחוצה שלוש פעמים, תוך שימוש בעצירה הראשונה באיטיות כדי לערבב את התמיסות בעדינות תוך הימנעות מהיווצרות בועות.
   4. דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 20°C–25°C למשך 1–2 דקות תוך ניטור ויזואלי של הצביעה תחת המיקרוסקופ עד שהאיים הקטנים נראים אדומים בוהקים. חלק מההכנות עשויות להכיל איים מוכתמים בצורה גרועה, שגם IsletNet מאומנת עבורם.
   5. השתמשו במזרק של 10 מ"ל כדי להזריק במהירות 4 מ"ל של מלח עם בופר בפוספאט בתוספת 0.2 מ"ג/מ"ל אלבומין ישירות לדגימה המוכתמת, תוך הימנעות מבועות והתזות.
   6. מיד סובב את המנה בתנועה מעגלית כדי לערבב את התמיסות, מזיז את האיים הקטנים למרכז לפני שהם מתיישבים.
      אפשרות 1: להוסיף בזהירות 4 מ"ל של PBS/אלבומין, להשאיר את האיים בדיתיזון ללא הפרעה. לאחר מכן, סובבו בעדינות את המנה בתנועה מעגלית כדי לערבב את התמיסות תוך שמירה על האיים במרכז. חכה עד שהדיתיזון יתפזר בצלחת.
      אפשרות 2 (מתאימה לסטריאומיקרוסקופ): במקום לדלל את האיים, יש לפזר את טיפת האי הדיתיזון לשכבה דקה באמצעות קצה פיפטה או מחט במקום דילול כדי להפחית את ההחזרות.
   7. בדקו את הדגימה תחת המיקרוסקופ והחזירו מיד את האיים המוזזים לשדה המצלמה בעדינות על ידי סיבוב התמיסה הסובבת עם קצה פיפטה.
   8. התחל ברכישת תמונה מיד כדי למזער ציטוטוקסיות ושינויים בנפח האיים.
3. רכישת תמונות
   הערה: השתמש במיקרוסקופ סטריאו או הפוך המצויד במטרה בהגדלה נמוכה ומקור אור יציב. הגנו על הצלחת ממקורות אור נוספים, כמו תאורת חדר.
   1. הדליקו את מקור האור ותנו לנורה ההלוגן להתחמם במשך 5 דקות.
   2. קבע עוצמת אור סטנדרטית כדי להימנע מסנוור וחשיפה נמוכה. הטווח המדויק תלוי בחומרת ההדמיה שבה משתמשים.
      הערה: עוצמת האור האופטימלית עשויה להשתנות בהתאם להגדלה ולטוהר הדגימה.
   3. בחר את הגדרת המטרה והזום שמאפשרת לכל האיים להישאר בשדה הראייה של המצלמה.
   4. שמור על אותה הגדלה לכל הדגימות בתוך אצווה ורצוי בכל אצוות הטוהר.
   5. כייל/י את איזון הלבן באמצעות סלייד לבן מנורמל במידת הצורך. אם איכות התמונה נשארת לא מספקת בגלל מאפיינים ייחודיים של הכנת האי, יש להתאים ערכי RGB ו/או הגדרות גמא.
   6. כוונן את זמן החשיפה ואם יש צורך, את עוצמת התאורה או הרווח באמצעות היסטוגרמה של הצבע, כדי למנוע חשיפה יתר.
      הערה: דגימות המכילות רקמות אקסוקריניות רבות עשויות לדרוש הגדרות מצלמה או תאורה שונות בגלל אור מוחזר מרקמה שאינה אי. כדי להבטיח שחזוריות, שמור את הפרמטרים הללו כקובץ קונפיגורציה נפרד לעיון עתידי.
   7. ללכוד את התמונה ולשמור את הקובץ בפורמט נתמך, כולל JPG, PNG, TIFF או BMP.
      הערה: כלול את התאריך, שיעור הטוהר, גודל ההגדלה או הפיקסל, ודילול בשם הקובץ כדי לאפשר ניתוח חוזר עתידי (למשל, iz260105_H1_obj1.25x_1000x.jpg).
   8. רכוש תמונה של מיקרומטר השלב באמצעות אותן הגדרות הגדלה וזום המשמשות להדמיית דגימות.

6. כלי בידוד קליני לאיים

הערה: שלבי זרימת העבודה המרכזיים מסוכמים באיור 1C. נתחו תמונות באצווה של שבר טוהר ככל שהדגימות זמינות.

1. הגדרת גודל הפיקסל
   הערה: גודל הפיקסל המחושב נשאר תקף רק כאשר תמונת המיקרומטר של הבמה נרכשת באמצעות הגדרות ההגדלה והזום זהות לאלו של הדגימות שנבדקו.
   1. פתח את לוח הבקרה של בידוד האיים הקליניים .
   2. לחץ על העלאת מיקרומטר שלב ובחר את תמונת המיקרומטר של השלב.
   3. צייר את נקודות קצה קו המדידה האדום לאורך מרחק ידוע על הסרגל הדיגיטלי.
      הערה: השתמש במרחק כיול ארוך יותר ככל האפשר כדי לשפר את דיוק המדידה.
   4. הכירו את המרחק הידוע במיקרומטרים (μm).
   5. הגש את גודל הפיקסל המחושב.
      הערה: הפלטפורמה שומרת על גודל הפיקסל המחושב עד לשינוי ידני.
2. העלאה באצווה של תמונות עם שבר טוהר
   הערה: השתמש ב-3–4 דגימות שכפול כדי להבטיח חישוב אמין של ערכי הממוצע והסטיית התקן של האצווה. השתמש באותו דילול לכל הדגימות באצווה אחת.
   1. גרור ושחרר תמונות המייצגות דגימות משוכפלות של אותו חלק טוהר לאזור ההעלאה.
      הערה: הפלטפורמה מונעת שימוש חוזר באותה תמונה בהתבסס על זיהוי שם הקובץ.
   2. שנו את גודל הפיקסל במידת הצורך.
   3. הזן את סף גודל האי המינימלי.
   4. הזן את ערך הדילול של המדגם (למשל, 1000).
   5. הכנס את נפח הכדור במיליליטרים שהוקלט מהבקבוק המקורי.
   6. הכנס את ראשי התיבות של האופרטור.
      הערה: ראשי התיבות של המפעיל מופיעים בדוח שנוצר.
   7. הזן את מזהה המושב המייצג את הליך הבידוד הנוכחי.
   8. הזן את מזהה האצווה (למשל, 1 טוהר גבוה).
      הערה: הפלטפורמה מסדרת שברים אלפאנומריים לפי מזהה אצווה.
   9. לחץ על 'שלח אצווה ' כדי להתחיל את הניתוח.
3. סקירה וסיום תוצאות האצווה
   הערה: סגור את חלון תוצאות האצווה הקודם על ידי לחיצה על הכותרת במידת הצורך (איור 2L).
   1. המתינו לתוצאות המספריות והגרפיות שיופיעו בחלון תוצאות האצווה.
   2. פתח את חלון הבדיקה על ידי לחיצה כפולה על התצוגה המקדימה של התמונה בחלון תוצאות האצווה.
   3. בדוק ואם יש צורך, לתקן את קווי המתאר כפי שמתואר בשלב 1.
   4. המשיכו לתמונה הבאה באמצעות מקש החץ למטה אם הקונטרים מתאימים.
   5. הוסף עוד אצווה או המשך לסיכום הסשן באמצעות הכפתורים הממוקמים בתחתית החלון (איור 2M).
4. עריכת אצווה
   הערה: הפלטפורמה שומרת שמות קבצי תמונה לאורך כל הסשן כדי למנוע שימוש חוזר בטעות באותה תמונה. זה כולל גם תמונות שהוסרו. שנה את שמות התמונות לפני השימוש החוזר במידת הצורך.
   1. לחץ על Edit Batch כדי להוסיף או להסיר תמונות, לתקן מפרטי דגימה, או לשנות את שם האצווה (איור 2L).
      הערה: רשמו את שמות הקבצים לפני שינוי האצווה אם צפוי שימוש חוזר בתמונה.
   2. לחץ על הסרת אצווה כדי למחוק את האצווה לחלוטין (איור 2L).
5. צפייה בסיכום ויצירת דוחות
   1. לחץ על הצג סיכום כדי להציג את סקירת המפגש (איור 2M).
      הערה: חזרו לקבוצות קודמות וערוך אותן במידת הצורך.
   2. צפה בערכי סך ספירת האיים, הנפח ונפח הכדורים עבור הסשן יחד עם ערכי האצווה הממוצעים המתאימים.
6. הורד את הדו"ח.
   הערה: הדוח הקצר כולל את סך ספירת האיים, נפח, טוהר, ערכי כדורים, היסטוגרמות וסיכומי שיעור טוהר. הדוח המלא כולל בנוסף מידע גרפי עבור כל תמונת מדגם, כאשר ערכים מקובלים מוצגים באדום וערכים שהוצאו מוצגים בשחור.

תוצאות

איי העכברוש הטהורים

בניסוי הראשון, נאספו 36 תמונות המייצגות 12 דגימות שכללו בסך הכל 249 איים מטוהרים של חולדות במהלך ארבעה סשנים עצמאיים. התמונות נוצרו באמצעות סטריאומיקרוסקופ בשלושה תנאי תאורה סטנדרטיים אך שונים, תוך שימוש במקורות אור הלוגן ודיאודה פולטת אור (LED) יחד עם הגדרות מצלמה שונות. סגמנטציות אמת קרקעית (GT) נוצרו ידנית עבור שלוש תמונות מייצגות על ידי מומחה הדרכה של IsletNet .

כאשר התמונות נותחו באמצעות הגרסה הזמינה לציבור של כלי ההשוואה הפשוטה, אף אחד מהקווים שנוצרו אוטומטית לא עבר בקרת איכות ויזואלית (vQC, איור 5F). הפלטפורמה עברה לאחר מכן אומנה מחדש באמצעות תמונות מקומיות מייצגות, וכל הקווים שנוצרו על ידי הגרסה הניסויית המאומנת עברו את vQC (איור 5C).

היחס בין הערכות נפח אוטומטיות לידניות של האיים הראה ביצועים עקביים בשלושת תנאי ההדמיה לאחר אימון מחדש, עם ערכי חציון של 1.03, 0.98 ו-0.94 בתנאי תאורה A, B ו-C, בהתאמה (איור 5A). תוצאות אלו ייצגו שיפור משמעותי בהשוואה למודל האימון המקורי (איור 5B).

השוואה פיקסלית לבין סגמנטציות GT הראתה התאמה קרובה בין קווי המתאר האוטומטיים לאלו שנוצרים ידנית לאחר אימון מחדש (איור 5D), בהתאם למיקום מדויק של קווי מתאר בתמונות מייצגות (איור 5C). לעומת זאת, מודל האימון המקורי הראה שיעור מוגבר של פיקסלים שליליים-שקריים (איור 5G) ומיקום מוטוב לא מדויק (איור 5F), מה שהוביל למעבר לקטגוריות איים קטנות יותר בהיסטוגרמות גודל האיים המתאימות (איור 5E לעומת 5H).

איור 5. הערכת אימון מחדש של פלטפורמה באמצעות שלוש מערכות הדמיה והכנות לאי עכברים. (א) השוואה בין הערכות IsletNet לבין השוויון הידני לאי (IEQ) לאחר אימון מחדש באמצעות שלוש מערכות הדמיה. (ב) השוואה בין הערכות IsletNet והערכות IEQ ידניות באמצעות מודל ההכשרה הציבורית המקורי. (C, F) מיקום קונטור מייצג באמצעות כלי ה-vQC לאחר ולפני אימון מחדש של המודל, בהתאמה. ראשי חץ לבנים מציינים מיקום קווי מתאר נכון וראשי חץ מג'נטה מציינים מיקום לא נכון של קווי מתאר. (D, G) השוואה פיקסלית מול אמת הקרקע לאחר אימון מחדש ועם מודל האימון המקורי, בהתאמה. אזורים חיוביים אמיתיים, חיוביים שגויים, שליליים שגויים ושלילי אמיתיים מצוינים באגדה. (E, H) היסטוגרמות בגודל האי הייצוגי לאחר אימון מחדש ועם מודל האימון המקורי, בהתאמה, בהשוואה לספירה ידנית. הגדרת תמונה 1 = תאורת LED; הגדרת הדמיה 2 = תאורת הלוגן; הגדרת הדמיה 3 = תאורת שדה חשוך של LED. פסי קנה מידה = 100 מיקרון. גרשי הקופסה מוצגים לפי קונבנציה של טוקי; שפמים מגיעים לנקודות נתונים בטווח בין-רבעוני של 1.5 × בין הרבעון הראשון והשלישי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

הכנות קליניות לאי האדם

בניסוי השני, 17 תמונות המייצגות הליך בידוד של אי אנושי יחיד עם שלושה זוגות טוהר-שבר נותחו באמצעות הגרסה הזמינה לציבור של הפלטפורמה. דגימה אחת אבדה. לאחר vQC, כל התמונות המייצגות שברי טוהר בינוני ונמוך הוצאו מהמחנה של זיהוי שגוי של איים (הנתונים לא מוצגים). הפלטפורמה עברה לאחר מכן הכשרה מחדש באמצעות תמונות מקומיות מייצגות.

לאחר אימון מחדש, כל התמונות עברו את vQC לאחר הוספת שלושה קווי הפרדה ידניים. השוואה לפי אצווה לספירה ידנית הראתה הערכת חסר כוללת של ≤5% עבור סך כל האיים וההערכות הנפח. דגימות מדוללות בין 2,000 ל-4,000 פעמים כללו בין 80 ל-4 איים קטנים בהתאם לשבר הטוהר. התרומה היחסית של חלקי טוהר בודדים להכנה הסופית מוצגת באיור 6A. חלק טוהר גבוה 1VC2 תרם בעיקר לאיים קטנים יותר בהשוואה לשבר טהור בינוני 2SC1. ההיסטוגרמה הכוללת של גודל האי שנוצר אוטומטית על ידי הפלטפורמה מוצגת באיור 6B.

איור 6. כימות וניתוח של דגימות בידוד איים אנושיים. (א) הערכות ספירת איים ונפח שקול לאי באמצעות IsletNet ושיטות ספירה ידניות על פני חלקי טוהר של השתל המלא. (B) היסטוגרמה סופית של גודל האי שנוצרה על ידי IsletNet באמצעות ערכי ממוצע אצווה. (ג) השוואת IsletNet והערכות ידניות לספירה ונפח על פני 17 תמונות בודדות. (D) פירוט תמונה מייצג מדגימה 3NC1 המציג את התמונה המקורית ומיקום הקונטור שנוצרו על ידי IsletNet מאומן מחדש. (ה) השוואה פיקסלית בין סגמנטציה של IsletNet לבין האמת הקרקעית שנוצרה על ידי מומחה הספירה הידנית לעומת מומחה האימון של IsletNet (GT1 מול GT2). אזורים חיוביים אמיתיים, חיוביים שגויים, שליליים שגויים ושלילי אמיתיים מצוינים באגדה. (F) היסטוגרמה מייצגת של גודל האי עבור אותה תמונה, השוואה בין IsletNet לתוצאות ידניות. ראשי חץ מג'נטה מציינים שינוי קטגוריית קווי מתאר ואי קטגוריה. פסי קנה מידה = 100 מיקרון. גרשי הקופסה מוצגים לפי קונבנציה של טוקי; שפמים מגיעים לנקודות נתונים בטווח בין-רבעוני של 1.5 × בין הרבעון הראשון והשלישי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

הערכות אוטומטיות וידניות הושוו לאחר מכן לכל התמונות הבודדות (איור 6C). היחסים החציוניים בין הערכות אוטומטיות לידניות היו 1.00 עבור ספירת האיים ו-0.93 לנפח האיים, עם מספר חריגים שנצפו. בדגימה מייצגת עם טוהר נמוך (3NC1), הפלטפורמה זיהתה את אותו מספר איים כמו ספירה ידנית (חמישה איים) אך העריכה נפח איים נמוך ב-29%. נקודות נתונים אלו מסומנות על ידי ראשי חץ באיור 6C.

האי הגדול ביותר, הכלוא חלקית ברקמה אקסוקרינית, מהתמונה המייצגת הזו, מוצג באיור 6D, כולל התמונה המקורית ושכבת הקונטור שנוצרת אוטומטית. השוואה פיקסלית לבין סגמנטציות GT שנוצרו באופן עצמאי על ידי שני מומחים מוצגת באיור 6E. ההיסטוגרמות המתאימות לגודל האי הראה שינוי בהתפלגות הגודל בין סגמנטציה ידנית לאוטומטית (איור 6F).

ביצועים תפעוליים של ניתוח אוטומטי

הביצועים התפעוליים של כלי ההשוואה הפשוטה ובידוד האיים הקליניים הוערכו בתנאי אינטרנט סטנדרטיים עם מהירויות הורדה והעלאה ממוצעות של 50 Mbps ו-30 Mbps, בהתאמה. חמש קבוצות תמונות שכללו כל אחת 12 תמונות נותחו באמצעות גדלי תמונות שנעו בין 0.5 MB קבצי JPEG ועד 20 MB קבצי TIFF. משך ההורדה נמדד עבור חבילות תוצאות ZIP מלאות.

זמני הדמיית הניתוח ומשך ההורדה גדלו בהדרגה עם גודל התמונה בשני הכלים (טבלה 4). כלי Clinical Islet Isolation דרש זמני עיבוד ארוכים יותר מאשר כלי Simple Comparison עבור מערכי תמונות מקבילים. תוצאות אלו מדגימות את הקשר המעשי בין רזולוציית התמונה, פורמט הקובץ וקצב הניתוח במהלך הפעלה שגרתית.

טבלה 4: זמני הוויזואליזציה של ניתוח וזמני הורדה עבור כלי בידוד האיים הקליניים וההשוואה הפשוטה. השוואת זמני עיבוד הנדרשים להמחשת תוצאות והורדת קבצים באמצעות אצוות תמונות בגדלים ופורמטים שונים. המדידות התקבלו באמצעות אצופים המכילים 12 תמונות ומדווחות כזמן שחלף מהגשת האצווה ועד ההמחשה של התוצאה או השלמת ההורדה. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

דיון

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את זרימת העבודה המעשית עבור משתמשים פוטנציאליים ומבוססים של IsletNet, עם דגש על שני מאפיינים קריטיים של הפלטפורמה: vQC מומחים ואימון מחדש של רשתות עצביות. התוצאות המייצגות מראות כי כימות אוטומטי מדויק תלוי לא רק בביצועי סגמנטציה של התמונה, אלא גם ביכולת המשתמש להעריך באופן ביקורתי את מיקום הקונטור והתאמת התמונה לפני קבלת התוצאות. שני כלים מתקדמים נוספים, Pixel-to-Pixel Comparison ו-My Segmentations, שימשו ליצירת תוצאות אימות נבחרות; עם זאת, כלים אלו מיועדים בעיקר לתמיכה באימון רשתות עצביות ולכן אינם כלולים בתהליך העבודה של הפרוטוקול.

IsletNet פותח ככלי ייחוס שיתופי ונגיש לניתוח תמונות איים סטנדרטי במעבדות. הרשת העצבית אומנה ואומתה באמצעות סגמנטציות GT ידניות עם הערות של תמונות מיקרוסקופיות דו-ממדיות מקוריות של איים מבודדים של בני אדם וחולדות 14,15,16. נוצרו שני מודלים נפרדים להכנות מוכתמות בדיתיזון, ומודל מחקר נוסף לאיי חולדה לא מוצבעים, עם גישה זמינה לפי בקשה. גרסת הפלטפורמה ותאריך ההדרכה מוצגים בממשק המשתמש. IsletNet מחלק אוטומטית את האיים והרקמות האקסוקריניות, ובהמשך מחשב את מספר האיים, הנפח והטוהר באמצעות גודל הפיקסל שהוגדר על ידי המשתמש וסף גודל האי המינימלי. בחירת סף גודל האי תלויה באיכות התמונה ובמטרת הניתוח (השוואה צמודה לספירה ידנית לעומת חקר איים קטנים) ולא במינים. בהינתן הרזולוציה של מיקרוסקופיה קונבנציונלית, גודל האי המינימלי המשמעותי הוא 50 מיקרון 7,8,9,12, אך ניתן להקטין אותו עד 10 מיקרון עבור תמונות המתקבלות עם מכשיר מתאים ¹⁰. הערכות נפח האיים נוצרות באמצעות טבלת המרה סטנדרטית מבוססת כדור¹³ וכן טבלאות המרה חלופיות ^7,18,19, כולל קירוב אליפסה מותאם ^5,6 ומודלים מבוססי קונטור של ספינקל^{וספירקל 17}. הערכים המתקבלים מדווחים במקבילות איים וננוליטרים, בעוד שהטוהר מחושב לפי שטח הרקמה או נפח הרקמה המוערך. שלב קריטי בפרוטוקול הוא רכישת תמונות מיקרוסקופיות סטנדרטיות המתאימות לסגמנטציה אוטומטית. IsletNet עברה הכשרה באמצעות תמונות שצולמו באמצעות מיקרוסקופים סטריאו והפוכים המצוידים במגוון מצלמות מתכת תחמוצת למחצה משלימה ומערכות תאורה. מטרות בהגדלה נמוכה (1–2×) הן יתרון משום שהן מאפשרות לדגימה המלאה להישאר בשדה הראייה תוך שמירה על גודל פיקסל התואם לזיהוי אמין של איים קטנים. תאורה עקבית, איזון לבן יציב והימנעות מחשיפת יתר לתמונה הם חיוניים ליצירת קווי מתאר אמינים. התוצאות המייצגות מראות כי אימון מחדש באמצעות תמונות מקומיות מייצגות יכול לשפר משמעותית את ביצועי הסגמנטציה בתנאי הדמיה הטרוגניים. כהנחיה מעשית, תמונות מתאימות בדרך כלל לאימון IsletNet כאשר גבולות האיים והרקמות האקסוקריניות מובחנים בבירור לצופה מנוסה. יש להימנע מתמונות המכילה איים מקובצים או חופפים מאוד ככל האפשר.

הפרוטוקול גם מדגיש מספר מגבלות ושיקולי פתרון תקלות הקשורים לניתוח תמונות אוטומטי. בעוד ש-IsletNet מעלה משמעותית את קצב התפוקה, האובייקטיביות והשחזוריות בהשוואה לספירה ידנית מלאה, השיטה נשארת רגישה לאיכות התמונה. מיקום לא נכון של קווי מתאר (זיהוי שגוי של איים וכישלון להפריד בין איים סמוכים) עלול להתרחש לעיתים ועלול להשפיע על הכימות במורד הזרם. בדיקת vQC שגרתית נשארת חיונית לפני קבלת תוצאות אוטומטיות. יישום מיידי באתר ל-IsletNet הוא יתרון משום שתמונות לא מתאימות יכולות להיקלט מחדש באמצעות פרמטרי הדמיה מותאמים. תיקון ידני של קווי המתאר האוטומטיים אפשרי בתוך חלון הבדיקה למעט איים חסרים או מספר איים מזויפים. בנוסף, אלגוריתם ההפרדה האוטומטי מבוסס על גאומטריית קונטור וסטטיסטיקת התפלגות גודל האיים, ולכן עשוי להיות שונה מהפרשנות הראשונית של מומחה בודד, תוך שמירה על קבלת הניתוח.

אמינות IsletNet נקבעת בעיקר על ידי עקביות בין איכות התמונה המקומית למאגר הנתונים של האימון ולא לפי מין בלבד. למרות שסט האימון הנוכחי כולל איים אנושיים בטוהרים שונים ואיי חולדות טוהרים גבוהים, ניתן להרחיב את הפלטפורמה למינים אחרים בתנאי שמאפייני התמונה נשארים עקביים לנתוני האימון. לדוגמה, איי חזיר שטוהרו על ידי תרבות עשויים להידמות לאיים אנושיים מוטמעים הנמצאים במאגר הנתונים של האימון. לעומת זאת, איים מגודלים בגידול נרחב עם צביעת דיתיזון חלשה לא הוצגו במהלך האימון ועלולים לדרוש אימון נוסף. לכן, כלי ההשוואה הפשוטה תומך בשלב אימות חשוב עבור משתמשים חדשים או תצורות הדמיה חדשות. התוצאות המוצגות כאן מדגישות כיצד פרשנויות מומחים שונות לאיים מוטמעים יכולות להשפיע על יצירת ה-GT והערכת נפח במורד הזרם. כדי להתמודד עם היעדר קונצנזוס רחב של מומחים במחקרים רב-מרכזיים עתידיים, פותח יישום IsletSwipe²⁰ כדי להקל על הערות תמונה מבוססות קונצנזוס.

בהשוואה לספירה ידנית קונבנציונלית תחת מיקרוסקופ, IsletNet מספקת קצב העברה גבוה בהרבה, תיעוד דיגיטלי קבוע ותפוקות כמותיות סטנדרטיות, תוך הפחתת שונות תלויה במפעיל. ספירה ידנית עשויה עדיין לספק ביטחון רב יותר בזיהוי רקמות במקרים גבוליים, אך היא מוגבלת על ידי הערכת גודל סובייקטיבית, יכולת הרחבה נמוכה יותר ודרישות הכשרה נרחבות לצוות. כשירות מבוסס רשת, IsletNet מאפשר השוואה בין מעבדות באמצעות ניתוח מרכזי אך אנונימי. מהירות הניתוח נשארת תלויה ברוחב הפס המקומי של האינטרנט, בגודל קובץ התמונה ובמורכבות התמונה. קבצי TIFF גדולים יותר עשויים לשפר את איכות התמונה אך דורשים זמני העלאה והורדה ארוכים יותר בהשוואה לתמונות JPEG דחוסות.

בסך הכל, התוצאות המוצגות כאן מראות שניתן להשיג כימות אוטומטי אמין כאשר רכישת התמונה המקומית נשארת ניתנת לשחזור ועקבית עם מערך ההדרכה. מומלץ למשתמשים לשלב vQC בשגרה ולשקול אימון מחדש בכל פעם שמתרחשים שינויים משמעותיים בתנאי ההדמיה המקומיים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
35 mm Petri dishes	Sigma-Aldrich	P5481	Unsterile
200 µL pipette tips, wide-bore	Sigma-Aldrich	AXYT205WBCRS	For islet suspension dispensing before staining
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	GC grade or cell culture grade
Dithizone (DTZ)	Sigma-Aldrich	D5130	Powder
Ethanol, 70%	Local supplier	N/A	(v/v) in H2O; for DTZ preparation
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10270106	Heat-inactivated, qualified
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	H6648	With or without phenol red (specify based on assay)
Human albumin	Grifols	61953-0001-2	High-concentration solution (200 g/L)
Infinity 1-3C	Lumenera	3-1URC	CMOS, 3 MP
Infinity Capture	Lumenera	N/A	Standard image acquisition software
Inverted microscope CKX41	Olympus	N/A	1.25x and 2x objectives
LED-High-Power-Spots (2-arm)	Photonics	10068	LED light source; dual gooseneck guide
Light source Highlight 2000	Olympus	5-HL2000	Halogen light source (14.5 V, 90 W); manual intensity control; dual gooseneck guide
Laboratory essentials	Various	N/A	Pipettes, tubes, needles, syringes, laboratory timers, standard PPE
MicroCam software	Bresser	N/A	Standard image acquisition software
MikroCam 3.0M	Bresser	86000180	CMOS, 3.1 MP camera
Millex-MP filter unit	MilliporeSigma	SLMP025SS	0.22 µm pore size, PES membrane
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010023	pH 7.4
Promicam Pro 3-5 CP	Promicam	E61MPR937	CMOS, 5 MP, high-dynamic-range camera
QuickPHOTO	Promicra	N/A	Standard image acquisition software
Sodium hydroxide (1 M NaOH)	Local supplier	N/A	For pH adjustment and solubilization during DTZ preparation
Stage micrometer	Thorlabs	R1L3S1P	10 mm length; 50 µm divisions for calibration
Stereo microscope SZH10	Olympus	N/A	1x apochromat objective