הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פרוטוקול משולב להערכת לימפות מנינגיאל: הזרקת סיסטרנה מגנה, הדמיית בלוטות לימפה, כריתת מנינגיאל וצביעה שלמה

410 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71140

⸱

29 במאי 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, School of Life Sciences, Shanghai University, 2Institute for Translational Brain Research, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, MOE Frontiers Center for Brain Science, Fudan University, 3Children's Hospital of Fudan University, National Children's Medical Center, 4First Clinical College, Fujian Medical University; Department of Laboratory Medicine, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fujian Key Laboratory of Laboratory Medicine

במאמר זה

סיכום

כאן מוצג פרוטוקול להערכת כלי הלימפה של קרום המוח בעכברים (MLVs), הממלאים תפקיד חשוב במחלות נוירולוגיות מרובות. מטרת הפרוטוקול היא לספק שיטה משולבת המאפשרת הן הערכה פונקציונלית של ניקוז העוקבים והן אפיון מורפולוגי מפורט של רשת ה-MLV הגב.

תקציר

כלי הלימפה של מנינגיאל (MLVs) הפכו לרגולטורים קריטיים של הומאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית (CNS), ותפקוד לקוי של ה-MLV נקבע בהפרעות נוירולוגיות שונות. לכן, הערכה מקיפה של המורפולוגיה והתפקוד של ה-MLV חיונית להבנת תפקידם בפיזיולוגיה ובמחלות של מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתאר שיטה משולבת להערכת MLV בעכברים באמצעות ארבע טכניקות מרכזיות: הזרקת מעקבים פלואורסצנטיים תוך-ציסטרנה (i.c.m), הדמיה חיה של בלוטות לימפה צוואריות (CLNs), כריתת קרום המוח וצביעה שלמה. ראשית, מחט ה-30 גרם מחוברת למזרק ולמשאבת ההזלפה באמצעות צינור פוליאתילן (PE). לאחר הרדמת העכבר, הדורה מאטר נחשפת על ידי כריתה קהה של שרירי הצוואר, ומחט ההזרקה מוכנסת לצירנה מאגנה (CM) כדי להעביר את המעקב לנוזל המוח השדרה (CSF) בשליטה מדויקת. ניקוז טרייסר ל-CLNs ניתן להמחשה בזמן אמת, בעוד שכריתת מנינגיאלית לאחר מכן וצביעה מלאה מאפשרים ניתוח מורפולוגי מפורט של ה-MLV הגביים. כל ההליך יכול להתבצע תוך 3 שעות, הכולל הזרקת ICM, הזרמת רקמות, בידוד גולגולת והנחה בתמיסת קיבוע. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם גם להעברת תרופות תוך-גולגולתית או לשילוב עם ניתוחים מולקולריים, שכן הליך הכריכה של מנינגיאלס תואם לרקמות טריות ובלתי קבועות המתאימות להפקת RNA וחלבון.

מבוא

MLVs ממוקמים בתוך הסינוסים הדורליים ומסוגלים לשאת רכיבי CSF ותאי חיסון מהמערכת המרכזית ל-CLNs 1,2. גילוי ה-MLV אתגר את המושג המסורתי של "פריבילגיה חיסונית" במערכת העצבים המרכזית והפך למוקד מחקרבשנים האחרונות. מחקרים הראו כי תפקוד פגום של MLVs קשור קשר הדוק למחלות שונות, כולל מחלת אלצהיימר, ירידה קוגניטיבית הקשורה לגיל, גידולי מוח וזיהומים במערכת העצבים המרכזית 4,5,6,7. ככל שהמחקר בתחום זה מתקדם, יש צורך גובר בשיטות ניסוי משולבות, ניתנות לשחזור וסטנדרטיות היטב.

רוב הפרוטוקולים הקיימים למחקר כלי לימפה מתמקדים בכלי לימפה פריפריים 8,9,10. במחקרים הקשורים ל-MLVs, מחקר תיאר הליך קנולציה פשוט של CM שמאפשר גישה ישירה ל-CSF מבלי לפגוע בגולגולת או בפרינכימה במוח. בשילוב עם טכניקות הדמיה, שיטה זו יכולה להעריך ביעילות את תפקוד מערכת הגלימפה ודינמיקת נוזל מוחי (CSF). עם זאת, פרוטוקולים ניסיוניים מפורטים לחקר התפקוד והמורפולוגיה של MLVs לא תועדו היטב.

הפרוטוקול הנוכחי משלב הדמיה פונקציונלית עם ניתוח מורפולוגי, ומאפשר רכישת נתוני פונקציית ניקוז ומורפולוגיה מבנית במקביל מאותו בעל חיים, ובכך מפחית את מספר בעלי החיים בשימוש ומשפר את ההשוואה והעקביות של הנתונים. בסך הכל, פרוטוקול זה יכול לשמש לחקר שינויים מבניים ותפקודיים ב-MLV במודלים שונים של מחלה, וכן להערכת השפעות של התערבויות פרמקולוגיות או גנטיות על MLVs. הפרוטוקול מספק תיאורים מפורטים של שלבי התפעול, אמצעי זהירות מרכזיים והנחיות לפתרון תקלות. בנוסף, טכניקת ההזרקה של ה-ICM המתוארת בפרוטוקול זה יכולה להיות מיושמת באופן עצמאי למתן תרופות תוך-גולגולתיות, וההליך של ניתוח קרום המוח תואם לרקמה טרייה להפקת RNA או חלבון לאחר מכן, ומציע גמישות ויכולת התרחבות משמעותית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוצדורות המתוארות בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית (IACUC) של אוניברסיטת שנגחאי (אישור מס' ECSHU 2023-099).

1. הכנת כלים כירורגיים ומנגנים

אזהרה: יש לפעול עם מכסה אדים כימי ולבוש כפפות כדי למזער את הסיכונים האפשריים בעת עבודה עם PFA, חומר רעיל ומסרטן במידה מתונה. כל הפעולות הכוללות אלכוהול איזואמיל חייבות להתבצע במכסה אדים כימי הרחק ממקורות ההצתה, תוך לבישת כפפות ומסכה, כדי להפחית את סיכוני החשיפה.

  1. הכינו כלים כירורגיים, כגון זוג מלקחיים ישרים אחד, שני זוגות מלקחיים מעוקלים עם קצה דק, שני זוגות מלקחיים קהים, זוג אחד של מיקרו-מספריים, וזוג אחד של מלקחיים מיקרו-ישרים עם קצוות חלקים (לא משוננים).
    הערה: נגבו את כלי הניתוח עם 75% אתנול ושמרו עליהם יבשים לפני ואחרי הניסוי.
  2. הכינו מחסנים.
    1. פעם אחת ב-PBS.
    2. 4% תמיסת תיקון פאראפורמלדהיד (4% PFA).
    3. תמיסת חסימה (1x PBS שמכילה 3% אלבומין סרום בקר (BSA), 0.5% טריטון X-100, ו-2% סרום בקר עוברי).
    4. בופר דילול נוגדנים (1x PBS המכיל 3% BSA ו-0.5% טריטון X-100).
    5. מדיום הרכבה נגד פייד.
      הערה: ניתן לאחסן את המגיב המוכן בטמפרטורה של 4°C למשך חודש.
  3. הכינו תמיסת הרדמה 2,2,2-טריברומואתנול (אוורטין, 1.25%, 50 מ"ל)
    1. שקלו 0.625 גרם טריברומואתנול לתוך צינור של 2 מ"ל, הוסיפו 1.25 מ"ל אלכוהול איזואמיל, והמיסו היטב (שייקר של 37 מעלות צלזיוס).
    2. העבר את תמיסת האלכוהול טריברומואתנול-איזואמיל המומסת במלואה לצינור חרוטי של 50 מ"ל, הוסף 1x PBS כדי להביא את הנפח הכולל ל-50 מ"ל, וערבב היטב.
    3. סנן את התמיסה דרך מסנן של 0.22 מיקרון בארון בטיחות ביולוגי.
  4. הכינו אובאלבומין, תמיסת אלקסה פלואור 647 קונוגט (OVA-647) (2 מ"ג/מ"ל). המיס 2 מ"ג של OVA-647 ב-1 מ"ל של נוזל מוח-שדרתי מלאכותי (aCSF).

2. הרכבת מחט ההזרקה וחיבור למשאבת המיקרו-הזרקה

  1. השתמש במלקחיים קהים כדי לשבור את מחט ה-30 גרם ולשמור על קצה11 (קוטר חיצוני 0.30 מ"מ, קוטר פנימי 0.15 מ"מ, אורך 8 מ"מ).
  2. השתמש באורך 30 ס"מ של צינור PE-10 (קוטר חיצוני 0.64 מ"מ, קוטר פנימי 0.28 מ"מ) כדי לחבר את מחט ה-30 G השבורה למחט המיקרו-הזרקה המכילה מחט של 30 גרם (איור 1).
  3. התקן את מחט המיקרו-הזריקה, עם הצינור ומחט 30 ה-G, על משאבת המיקרו-אינגרקציה.

3. הזרקת ICM והדמיה חיה

אזהרה: אם המחט מוכנסת עמוק מדי וחודרת לפרינכימה במוח, הזרקה תועבר לרקמת המוח במקום לתא נוזל הנחוחי, מה שיפגע בדיוק התוצאה ועלול להוביל לתמותת עכברים. במהלך הניתוח, נדרש ניטור פיזיולוגי רציף של העכבר. יש להעריך את עומק ההרדמה כל 15 דקות באמצעות רפלקס צביטת האצבעות כדי להבטיח שהחיה תישאר ללא כאב. יש לשמור על טמפרטורת הגוף ב-37 מעלות צלזיוס ± 0.5 מעלות צלזיוס באמצעות כרית חימום למניעת היפותרמיה והשפעותיה הנלוות על התפקוד הפיזיולוגי. בנוסף, יש לרשום נשימה וקצב לב כל 30 דקות, להערכה על ידי תצפית על תנועות החזה ומישוש הקצה הלבבי. במהלך הזרקת ICM, אם המחט מוכנעת עמוק מדי וגורמת לדימום, זה מעיד על הזריקה כושלת. תסיים את הניסוי ותיתן את החיה.

  1. שקלו את העכבר ונתנו 200 מ"ג/ק"ג אוורטין באמצעות הזרקה תוך-פריטונלית להרדמה לעכבר.
    הערה: ניתן להשתמש בחומרי הרדמה חלופיים (למשל, קטמין/זילזין).
  2. מרחו קרם הסרת שיער על אזור צוואר הרחם כדי להסיר שיער מעל בלוטות הלימפה כאשר רפלקס צביטת האצבעות מפסיק והנשימה הופכת איטית ויציבה.
  3. לגלח את אזור הצוואר הגב.
  4. הנח את העכבר במסגרת סטריאוטקסית על כרית חימום עם הראש מוטה בזווית של 120° לתא המטען (איור 2A).
  5. נקה את האזור ברצף עם פובידון-יוד ו-75% אתנול.
  6. מרחו משחה עינית אריתרומיצין.
  7. בצע חתך בקו אמצעי בעור הצוואר והפריד בצורה גסה את שכבות השרירים.
    הערה: באמצעות שני זוגות מלקחיים קהים, הפרדו את שכבות השרירים כדי למזער דימום.
  8. נתח דרך השריר עם מלקחיים דקים עד שהדורה מאטר השקוף שמעל ה-CM הופך לגלוי  (איור 2B, C).
    הערה: השתמשו במלקחיים מעוקלים עם קצה דק כדי למשוך את השרירים ולשמור על חשיפה עקבית של ה-CM.
  9. מתחת למיקרוסקופ סטריאו, השתמש במלקחיים קהים כדי להחזיק את המחט ולהכניס אותה בזווית של 45° למישור הדורה מטר לעומק של כ-1–2 מ"מ. מקמו את שיפוע המחט במקביל לדורה מאטר כך שיהיה כולו מתחת לדורה מטר (איור 2D).
    הערה: הפעל כוח עדין עם המחט כדי לנקב את הדורה מאטר. ניקור מוצלח מתבטא באובדן מוחשי של ההתנגדות, יחד עם הדמיה של קצה המחט מתחת לדורה מטר ויציאת נוזל נוזל נוזלי (CSF).
  10. השתמש בנייר סופג לייבוש נוזל נוזלי נוזלי נוזלי דולף.
  11. כוון את משאבת המיקרו-הזרקה לספק 1 מיקרוליטר/דקה. הזרקו 5 מיקרוליטר של תמיסת OVA-647 (2 מ"ג/מ"ל) לתוך ה-CM4 (איור 2E).
  12. השאירו את המחט במקום למשך 2 דקות כדי למנוע זרימה חזרה.
  13. מרחו טיפה אחת של דבק ביולוגי על קרום המוח.
  14. סגור את החתך הניתוחי.
  15. בצע הדמיה in vivo של העכבר כדי לעקוב אחרי עוצמת הצבע ב-CLNs בנקודות זמן שונות (30 דקות, 60 דקות). השתמשו בפרמטרי ההדמיה הבאים: זמן חשיפה: 0.5 שניות; מסנן עירור: 640 ננומטר; מסנן פליטה: 680 ננומטר.

4. בידוד החלק הגבי של גולגולת העכבר

הערה: אשר היעדר רפלקס צביטת האצבעות והפסקת הנשימה הספונטנית לפני תחילת הדיסקציה החזה.

  1. המית את העכבר עם מנת יתר של אוורטין (600 מ"ג/ק"ג) וביצוע פרפוזיה לבבית עם 20 מ"ל 1x PBS או סליין רגיל.
  2. ערפו את ראש העכבר כדי לבודד את הראש.
  3. בצע חתך לאורך קו האמצע של הגולגולת כדי לפתוח את הקרקפת.
  4. השתמש בשני המסטטים מעוקלים להפרדת הקרקפת דו-צדדית באמצעות משיכה עדינה. לאחר מכן, מכניסים את ההמוסטטים המעוקלים לתוך הפתחים האורביטליים ומסירים בזהירות את שארית הקרקפת מאזורי האף והפה (איור 3A–C).
    הערה: שיטה זו מאפשרת הפרדה מהירה ומלאה של הקרקפת.
  5. הסר את הלסת התחתונה תוך שמירה על הגולגולת שלמה (איור 3D).
  6. הסרת העצם מבסיס הגולגולת כדי לחשוף את החלק הגחוני של המוח (איור 3E).
  7. הוצאו בזהירות את המוח באמצעות מלקחיים קהים, תוך הימנעות ממגע עם הדורה מטר של עצמות הפריאטל (איור 3F).
  8. טבלו לחלוטין את הגולגולת הגבית ב-5 מ"ל, 4% PFA וקבע ל-24 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (איור 3G).
    נקודות הפסקה: אחסן גולגולות קבועות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר משבוע. הסר את הדגימה מ-4 מעלות צלזיוס ואפשר לה לחזור לטמפרטורת החדר לפני ניתוח קרום המוח.

5. ניתוח קרום המוח מגולגולת העכבר

  1. שטוף את הגולגולת הקבועה עם 5 מ"ל 1x PBS, וחזור על השטיפה שלוש פעמים (10 דקות כל אחת).
  2. הניחו את הצד הגבי של הגולגולת כלפי מטה בצלחת בגודל 10 ס"מ מלאה ב-1x PBS  (איור 4A).
  3. השתמשו בקצה המלקחיים הדקים כדי לאחוז או ללחוץ על הבולה הטימפנית ולהוציא אותה מהגולגולת (איור 4B).
    הערה: הסרת הבולה הטימפנית היא שלב קריטי למניעת קרע קרום המוח הנגרם מהידבקות במהלך הפרדה מהגולגולת.
  4. גזום בצמוד לאורך המשטח הגחוני של הגולגולת למרחק של כ-2 מ"מ עם מספריים להחלקה (איור 4C).
  5. השתמשו במלקחיים דקים, רקמה לבנה שנוקה בקפידה מאזור המפגש של הסינוסים (COS) של קרום המוח (איור 4D).
    הערה: הסרה לא מלאה של רקמה שארית היא סיבה עיקרית לצביעה לא ספציפית בתיוג אימונולוגי.
  6. השתמש במלקחיים מיקרו-עדינים כדי להרים בעדינות קצה אחד של קרום המוח משפת הגולגולת, ואז להרים את הקצה הנגדי (איור 4E, F).
  7. אחז בשפת הקערה של קרום המוח ומשוך כדי להפריד אותו מהגולגולת באזור COS (איור 4G).
  8. הסר את עצם הלסת עם מספריים (איור 4H).
  9. אחזו שוב בשוליים בצורת קערה של קרום המוח ומשכו כדי להפריד את קרום המוח מהגולגולת באזור עצם המצח (איור 4I).
  10. הניחו את קרום המוח השלמים על צלחת 24 בארים המכילה 1 מ"ל 1x PBS, מוכנים לצביעה.
    הערה: אם קרום המוח נקרע במהלך הנתיחה, במיוחד במפגש בין הסגיטל העליון לסינוסים הרוחביים, ייתכן שהדגימה אינה מתאימה לניתוח נוסף. אם נצפית צביעת רקע לא ספציפית גבוהה, יש להוסיף שלב כיבוי לאחר קיבוע PFA (למשל, דגירה עם תמיסת גליצין של 0.1 מיליון למשך 40 דקותו-12 דקות) כדי להפחית עוד יותר את אות הרקע.

6. חסימה, צביעת נוגדנים ראשונית וצביעת נוגדנים משנית

  1. השתמש בפיפטה של 1 מ"ל כדי לשאוב את ה-1x PBS כך שהמנינגות יידבקו לתחתית לוח הבאר.
  2. חסמו את קרום המוח המלאים עם תמיסת חסימה של 200 מיקרולטר בלוח של 24 בארות למשך שעה בטמפרטורת החדר.
    הערה: מרחו בעדינות את קרום המוח במלואם בתמיסת החסימה באמצעות מלקחיים כדי להבטיח חשיפה אחידה.
  3. השתמש בפיפטה כדי להסיר את תמיסת החסימה.
  4. דגרו את כל קרום המוח עם 200 מיקרוליטר של נוגדן אנטי-LYVE-1 מדולל (סמן ספציפילכלי לימפה 13) בדילול של 1:200 (ריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל) במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
  5. השתמש בפיפטה כדי להסיר את תמיסת הנוגדנים.
  6. שטוף שלוש פעמים עם פעם אחת של PBS (10 דקות כל אחת).
  7. דגרו קרום המוח המלא עם DAPI (ריכוז סופי 1 מיקרוגרם/מ"ל) ו-Alexa Fluor 488 נגד חולדות IgG (ריכוז סופי 2 מיקרוגרם/מ"ל) למשך שעה בטמפרטורת החדר ב-1x PBS.
    הערה: להגן מפני אור במהלך דגירה של נוגדנים.
  8. השתמש בפיפטה כדי להסיר את תמיסת הנוגדנים.
  9. שטוף שלוש פעמים עם פעם אחת של PBS (10 דקות כל אחת).

7. התקנה והדמיה

  1. פיפטה 100 מיקרוליטר של 1x PBS למרכז הסלייד.
  2. צפו ופזרו את המנינג'ים המלאים בתוך הטיפה (איור 5A).
  3. שאוף את ה-1x PBS כדי לאפשר לרקמה להיצמד שטוח למחסנית (איור 5B).
  4. מרחו 20 מיקרו ליטר של מדיום התקנה על קרום המוח המלא.
  5. הנח כיסוי מעל הרקמה (איור 5C).
  6. ייבשו את המגלשות בטמפרטורת החדר ואחסנו אותן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    נקודות הפסקה: ניתן לאחסן את השקופיות בטמפרטורה של 4°C עד חודש. הסר את הסלייד מ-4 מעלות צלזיוס ותן לה לחזור לטמפרטורת החדר. הסר כל עיבוי ממשטח הסלייד עם נייר סופג.
  7. השתמש בעדשת אובייקטיב 20x כדי לצלם תמונות של MLV. הגדר את הערוץ ל-FL Green עם אורך גל פליטה של 518 ננומטר וזמן חשיפה של 100 מילישניות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לאחר הזרקת ה-i.c.m של OVA-647, הדמיה בגוף של בעלי חיים קטנים גילתה אותות פלואורסצנטיים בצורת אליפסה מובחנים המפוזרים דו-צדדית באזור צוואר הרחם (איור 6A). בהזרקות מוצלחות, המעקב היה נראה בבירור ב-CLNs לאחר ההזרקה, כאשר עוצמת הפלואורסצנציה הגיעה לשיא של כ-60 דקות (איור 6B). בנוסף, נצפו אותות פלואורסצנטיים בבלוטות הלימפה השטחיות והעמוקות של צוואר הרחם המבודדות (איור 6C). ניתוח חצי-כמותי של עוצ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מספק שיטה מקיפה להערכת תפקוד ומורפולוגיית MLV על ידי שילוב הזרקת i.c.m, הדמיה in vivo של CLNs, כריתת קרום המוח וצביעה מלאה. יתרון מרכזי של גישה משולבת זו על פני שיטות קונבנציונליות הוא שהיא מאפשרת הערכה סימולטנית של תפקוד ניקוז לימפה ומורפולוגיית כלי דם באותו בעל חיים, מה שמבטל את הצורך בקבוצות נפרדות ובכך מפחית את השונות הניסויית תוך שיפור השוואת הנתונים. יתרה מזאת, בהשוואה לשיטות צביעה חיסונית קונבנציונליות שדורשות חתך, צביעה מלאה שומרת על הארכיטקטורה התלת-ממדית של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה במימון תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2023YFC2306500), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82502108) וקרן המדע הפוסט-דוקטורט של סין (2024M760542).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ACSF (Artificial Cerebrospinal Fluid)Tocris  Cat# 3525
Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (1:1000 dilution)InvitrogenCat# A-21208
Antifade Mounting MediumBeyotimeCat# P0126
Blunt-tipped forcepsRWD Life ScienceCat# F12011-10
BSABeyotimeCat# ST023
CoverslipsCITOTESTCat# 80312-3161
Curved sharp forcepsRWD Life ScienceCat# F11003-11
DAPISigma-AldrichCat# D9542
Depilatory creamVeetN/A
Dish-10 cmThermo Fisher ScientificCat# 150464
Disposable intravenous (IV) infusion needleZhejiang Kindly Medical Devices N/A
Ethanol-75%Sinopharm Chemical Reagent Cat# 80176961
Fetal Bovine SerumExcellCat# FSD500
Filter-0.22 µmMerck Millipore Cat# SLGPR33RB
Glass slidesCITOTESTCat# 80340-3610
Isoamyl alcoholSinopharm Chemical Reagent Cat# 10003218
IVIS SpectrumPerkinElmerN/A
Micro forcepsShinva Medical Instrument Cat# ZD372RB 
Micro scissorsShinva Medical Instrument Cat# ZO13056R
Microinjection needle (25 µL)Shanghai Gaoge Industry & Trade N/A
Microinjection pumpVoyage PowerCat# QHZS-001A
Mouse: C57BL/6 wild-type, 8 weeks old, male CavensN/A
Needle-30GZhejiang Kindly Medical Devices N/A
Normal SalineBeyotimeCat# ST341
Ovalbumin, Alexa Fluor™ 647 ConjugateThermo Fisher ScientificCat# O34784
Paraformaldehyde Fix Solution-4%BeyotimeCat# P0099
PE-10 tubingShanghai Qiujing Biochemical Reagent and InstrumentN/A
Phosphate-buffered saline (1x PBS)BeyotimeCat# ST447
Rat anti-LYVE-1 (1:200 dilution)Santa CruzCat# sc-65647
StereomicroscopeJonecCat# JSZ6
Stereotaxic frameRWD Life ScienceCat# 68030
Straight scissorsRWD Life ScienceCat# S12007-10
Syringe-1-mL Zhejiang Kindly Medical Devices N/A
Tissue Adhesive I3M VetbondCat# 1469SB
TribromoethanolSigma-AldrichCat# T48402
Triton X-100 Sigma-Aldrich Cat# T8787
VS120 High-throughput fluorescence imaging systemOlympusN/A

מקורות

  1. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523, 337-341 (2015).
  2. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J Exp Med. 212, 991-999 (2015).
  3. Sandrone, S., Moreno-Zambrano, D., Kipnis, J., Van Gijn, J. A (delayed) history of the brain lymphatic system. Nat Med. 25, 538-540 (2019).
  4. Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and alzheimer's disease. Nature. 560, 185-191 (2018).
  5. Hu, X., et al. Meningeal lymphatic vessels regulate brain tumor drainage and immunity. Cell Res. 30, 229-243 (2020).
  6. Li, X., et al. Meningeal lymphatic vessels mediate neurotropic viral drainage from the central nervous system. Nat Neurosci. 25, 577-587 (2022).
  7. Rustenhoven, J., et al. Age-related alterations in meningeal immunity drive impaired cns lymphatic drainage. J Exp Med. 220, (2023).
  8. Kodama, T., Hatakeyama, Y., Kato, S., Mori, S. Visualization of fluid drainage pathways in lymphatic vessels and lymph nodes using a mouse model to test a lymphatic drug delivery system. Biomed Opt Express. 6, 124-134 (2015).
  9. Banerjee, R., Knauer, L. A., Yang, Y. Protocol for in vivo and in vitro study of lymphatic valve formation driven by shear stress signaling pathway. STAR Protoc. 4, 102141 (2023).
  10. Akwii, R. G., et al. Murine dermal lymphatic endothelial cell isolation. J Vis Exp. (197), e65393 (2023).
  11. Xavier, A. L. R., et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. J Vis Exp. (135), e57378 (2018).
  12. Hsieh, Y. T., Chen, S. L. Visualization and analysis of neuromuscular junctions using immunofluorescence. Bio Protoc. 14, e5076 (2024).
  13. Banerji, S., et al. Lyve-1, a new homologue of the cd44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. J Cell Biol. 144, 789-801 (1999).
  14. Da Mesquita, S., et al. Meningeal lymphatics affect microglia responses and anti-abeta immunotherapy. Nature. 593, 255-260 (2021).
  15. Betsholtz, C., et al. Advances and controversies in meningeal biology. Nat Neurosci. 27, 2056-2072 (2024).
  16. Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathol. 137, 151-165 (2019).
  17. Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high eeg delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Sci Adv. 5, eaav5447 (2019).
  18. Lee, H., et al. The effect of body posture on brain glymphatic transport. J Neurosci. 35, 11034-11044 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

פרוטוקול משולב להערכת לימפות מנינגיאל: הזרקת סיסטרנה מגנה, הדמיית בלוטות לימפה, כריתת מנינגיאל וצביעה שלמה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.