הכנה סטנדרטית של שריר חלק מבודד בתריסיון הארנב להערכה פרמקולוגית במבחנה של פעילות התכווצות

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסטנדרטיזציה של הכנת שריר חלק מבודד של הארנב לצורך הערכה פרמקולוגית במבחנה , תוך שימוש במערכת ניסוי שריר חלק בטמפרטורה קבועה אופקית לרישום נתונים בזמן אמת של פעילות התכווצות.

תקציר

פעילות ההתכווצות המתואמת של שריר חלק במערכת העיכול מהווה את הבסיס הפיזיולוגי לשמירה על תפקודי עיכול, ספיגה והעברה תקינים, כאשר תפקוד לקוי קשור קשר הדוק להפרעות תנועתיות. טכניקת הפרפוזיה המבודדת של איברים מבטלת הפרעות מורכבות בגוף —כגון גורמים עצביים, אנדוקריניים והמודינמיים—ומשמשת מודל קלאסי למחקרים פרמקולוגיים. לשם כך, מחקר זה מפרט פרוטוקול שלב אחר שלב להכנה סטנדרטית של שריר תריסריון מבודד בארנב. תהליך העבודה הפרוצדורלי מדגיש את השלבים הקריטיים של הכנת פתרונות, המתת חסד לארנב, ביצוע לפרוטומיה מדויקת של אמצע הבטן לכריתת רקמות מהירה, השעיית רצועות השרירים החלקות, וכיול מתמרים להקלטת מתח בזמן אמת. בהתבסס על פלטפורמה טכנית זו, אימתנו את השיטה עוד יותר על ידי הערכת השפעות נוזל הפה Huoxiang Zhengqi (HXZQ-OL) על התכווצויות ספונטניות והתכווצויות טטניות הנגרמות על ידי אצטילכולין/בריום כלוריד. לסיכום, פרוטוקול זה מספק מסגרת מתודולוגית איתנה וניתנת לשחזור גבוה, המספקת פלטפורמת סקר חוץ-גופית רחבה להערכה פרמקולוגית של תרופות טיפוליות המתמקדות בתנועתיות מערכת העיכול.

מבוא

פעילות ההתכווצות המתואמת של שריר חלק במערכת העיכול משמשת כבסיס פיזיולוגי לשמירה על תפקודי העיכול, הספיגה וההובלה התקינים¹. תפקוד לקוי שלו קשור קשר הדוק להפרעות קליניות נפוצות שונות, כולל תסמונת המעי הרגיז², דיספפסיה פונקציונלית³, והפרעות תנועתיות במערכת העיכול לאחר ניתוח⁴. הבהרת המנגנונים המולקולריים והפרמקולוגיים המווסתים את פעילות השריר החלק היא קריטית לפיתוח טיפולים פרוקינטיים או אנטי-ספזמודיים חדשים. בתחום מחקר זה, טכניקת הפרפוזיה המבודדת לאיברים משמשת כמודל קלאסי. הוא מציע ערך מעשי על ידי הסרת הפרעות מורכבות ב-vivo כגון גורמים עצביים, אנדוקריניים והמודינמיים, ובכך מאפשר הערכה ישירה ומדויקת של השפעות תרופות או חומרים פעילים על טונוס השריר החלק ^5,6.

הקמת פרוטוקולים יציבים ואמינים להכנת רקמות במבחנה ורישום נתונים חיונית להשגת תוצאות איכותיות וניתנות לשחזור. שיטות ניסוי קיימות בשרירי המעי במבחנה דורשות אופטימיזציה וסטנדרטיזציה נוספת בכמה תחומים: ניהול סטנדרטי של בעלי חיים ניסיוניים, טכניקות ניתוח מדויקות לאיסוף רקמות, שליטה עקבית סביבתית במערכות פרפוזיה, ואיסוף נתונים אוטומטי בשילוב ניתוח סטנדרטי. לדוגמה, טמפרטורת נוזל הפרפוזיה ורמות ה-pH, נזק מכני במהלך קצירת רקמות והגדרות עומס מוקדם של הרקמה יכולים כולם להשפיע משמעותית על חיוניות הרקמה ולגרום לטעויות ניסיוניות. גורמים אלה פוגעים באמינות התוצאות ומקשים על ההשוואה בין מחקרים שונים ^7,8.

לכן, מחקר זה שואף לקבוע ולפתח פרוטוקול סטנדרטי להכנת דגימות שריר חלק מבודדות מארנבים ולביצוע רישום מתיחות בזמן אמת. פרוטוקול זה מתאר באופן שיטתי את כל התהליך, החל מאתיקה ורווחת בעלי חיים ניסיוניים, לפרוטומיה אספטית ובידוד מדויק של מקטעי המעי, ועד להשגת שליטה סביבתית, הגדרות טעינה מוקדמות סטנדרטיות במתח, ואיסוף נתונים מדויק באמצעות מערכת פרפוזיה אופקית משולבת בטמפרטורה קבועה ומערכת קליטת אותות פיזיולוגית רב-ערוצית. בהתבסס על פלטפורמה טכנית סטנדרטית זו, יישמנו גם שיטות מינון מצטברות להערכת כמותית של השפעות נוזל הפה Huoxiang Zhengqi (HXZQ-OL), העומד בסטנדרטים של האיכות של הפרמקופיאה הסינית (מהדורת 2025⁾⁹, על התכווצויות ספונטניות והתכווצויות טטניות הנגרמות על ידי אצטילכולין ובריום כלוריד בשריר חלק מבודד בשריר התריסריון החלק. נוזל הפה Huoxiang Zhengqi (HXZQ-OL), צורת מינון דרך הפה של נוסחת הרפואה הסינית המסורתית הקלאסית Huoxiang Zhengqi, נמצא בשימוש נפוץ בסין לטיפול בהפרעות במערכת העיכול, ומספק את ההיגיון להערכת השפעתו הישירה על שריר חלק מבודד במעי. מחקר זה לא רק מספק ראיות פרמקולוגיות ניסיוניות ישירות שמבהירות את השפעות הרגולציה של השריר החלק במערכת העיכול של HXZQ-OL, אלא גם משמש כמודל מתודולוגי סטנדרטי וניתן לשחזור לסקר פרמקולוגי ולמחקרים במבחנה של שריר חלק במערכת העיכול.

פרוטוקול

ארנבים לבנים ניו זילנדיים בוגרים בריאים מכל מין (במשקל 2.0–2.5 ק"ג) שימשו בעבודה זו. כל ההליכים הניסיוניים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה, ואושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים המעבדתיים של אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית (מספר אישור: [2026070]). נעשו כל המאמצים למזער סבל בעלי חיים ולהפחית את מספר בעלי החיים בשימוש. דיאגרמת זרימת העבודה מוצגת באיור 1.

1. הכנת תמיסה

הערה: כל התמיסות העובדות, כולל תמיסת טירוד, אצטילכולין (ACh), כלוריד בריום, אטרופין וורפמיל, חייבות להיות מוכנות טריות מיד לפני הניסוי.

1. הכינו ליטר אחד מהתמיסה של טיירוד על ידי המסה של 137 מ"מ מ"מ NaCl, 5.4 מ"מ KCl, 1.8 מ"מ CaCl₂, 0.4 מ"מ מ״ר NaH₂PO₄, 1.0 מ״מ מ״מ מ״ג מ״ג׳ מ״ג₂, 12 מ״מ NaHCO₃, ו־5.6 מ״מ מ״ר D-גלוקוז. לפני השימוש, רווי בתערובת של 95% O₂ / 5% CO₂ למשך 15–30 דקות, תוך התאמת ה-pH ל-7.3–7.4 (ראו טבלת החומרים).
2. הכן תמיסה מקורת של 1 mM ACh. קח 20 מיקרוליטר והוסיף ל-20 מ"ל מהתמיסה של הטירוד. מערבבים היטב כדי לקבל תמיסה של 1 מיקרומום ACh.
3. הכינו תמיסת ציר בריום כלוריד (BaCl₂) במשקל 1 מטר. קח 20 מיקרוליטר והוסיף ל-20 מ"ל של תמיסת טירוד. ערבבו היטב כדי לקבל תמיסה של 1 mM BaCl₂.
   הערה: BaCl₂ הוא מאוד רעיל ומעצבן. בעת הטיפול, יש ללבוש ציוד מגן אישי בתוך מכסה אדים ולהיפטר מנוזל הפסולת בהתאם לתקנות.
4. הכינו תמיסת אטרופין סולפט של 10 מ"מ. קח 20 מיקרוליטר והוסיף ל-20 מ"ל של תמיסת טירוד. מערבבים היטב כדי לקבל תמיסת סולפט אטרופין של 10 מיקרומטר.
5. הכינו תמיסת מאגר הידרוכלוריד של 1 מ"מ ורפאמיל. קח 2 מיקרוליטר והוסף ל-20 מ"ל של תמיסת טירוד. ערבבו היטב כדי לקבל תמיסת ורפאמיל הידרוכלוריד של 0.1 מיקרומול.
   הערה: הריכוזים של התמיסות המוכנות נקבעו על ידי התייחסות למחקרים קודמים ^6,10,11 ואופטימיזציה נוספת דרך הניסויים הראשוניים שלנו כדי להבטיח תנאי ניסוי מיטביים.

2. הכנת דגימות שריר חלק של ארנב במבחנה

1. המתת חסד של ארנבים
   1. אבטח את הארנב במכשיר ההגבלה של הארנב (איור 2A, B ואיור 3A). לבצע המתת חסד על ידי מתן מנת יתר של נתרן פנטוברביטל (120 מ"ג/ק"ג) דרך הווריד האוזני בארנבים (איור 2C ואיור 3B).
      הערה: מוות מלא חייב להיות מאושר על פי הקריטריונים הבאים: אישונים מורחבים, היעדר רפלקס אור אישונים, הפסקת הנשימה ודופק הלב, ואובדן רפלקס כף הרגל.
2. הכנה וחיטוי אתר הניתוח
   1. אבטח את הארנב במצב שכיבה על שולחן הניתוחים (איור 2D ואיור 3C). באמצעות מספריים כירורגיים (איור 2E) או מכונת גילוח חשמלית, יש להסיר היטב את כל שיער הבטן כדי לחשוף את העור באזור הניתוחי המיועד (איור 3D).
   2. באמצעות מלקחיים ספוגיים (איור 2E), אחוז בכדור כותנה ספוג ביוד (איור 2F,G). מתחילים במרכז החתך הכירורגי המתוכנן, יש להניח את התמיסה החיטוי בתבנית קונצנטרית ועגולה מבפנים החוצה (איור 3E).
      הערה: אזור החיטוי צריך להימשך מעבר לקצוות החתך כדי להבטיח כיסוי מלא של כל עור שדה הניתוח. לאחר חיטוי, המתינו לפחות 3 דקות כדי לאפשר לחומר האנטיספטי להתייבש באופן טבעי על פני העור.
   3. הניחו וילון סטרילי (איור 2H) מעל אזור הבטן המחוטא כדי לחשוף את שדה הניתוח (איור 3F).
3. מיקום וחתך החתך הבטני
   1. באמצעות סכין מנתח (להב #23) (איור 2E), יש לבצע חתך אורך של 8 ס"מ לאורך קו האמצע של הבטן, מתחת לתהליך הזיקפואיד ועד מעל הסימפיזיס פוביס.
   2. נתח את העור והרקמה התת-עורית שכבה אחר שכבה. לאחר הלינאה אלבה, נתח את המעטפת הקדמית של שריר הרקטוס בטן, סיבי השריר והפריטונאום שכבה אחר שכבה כדי להיכנס לחלל הבטן (איור 3G).
   3. הערה: במהלך ההליך, יש להימנע מפגיעה באיברי בטן תוך שמירה על המוסטזיס כדי למנוע זיהום דם בשדה הניתוח ובאיברי הבטן.
4. הפרדה תריסריונית
   1. פתח את חלל הבטן לאורך החתך (איור 3H). משכו בעדינות את האונות הכבדיות בראש באמצעות גזה מלח לחה (איור 2I) כדי לחשוף לחלוטין את הקיבה והתריסריסריון (איור 3I).
   2. בחרו את המקטע הראשוני של התריסריון (הבולבר או החלק העליון היורד) הממוקם 2–3 ס"מ מהפילורוס כאתר קצירת הרקמה.
   3. הערה: הימנעו מאחיזה ישירה או הידוק של מקטע המעי המטרה ככל האפשר כדי למזער פגיעה מכנית. במקום זאת, השתמשו במלקחיים קהים כדי לאחוז בעדינות במזנטריה הסמוכה, או השתמשו במשטחי כותנה רטובים במי מלח כדי לסדר ולמקם בעדינות את הרקמה.
   4. באמצעות מספריים עיניים סטריליים (איור 2E), יש לכרות במהירות ובדיוק קטע בגודל 1–2 ס"מ (איור 2J) של צינור התריסריון (איור 3J,K).
   5. העבר מיד את מקטע המעי שנלקח לצלחת תרבית (איור 2K) המכילה את תמיסת טירוד מקוררת מראש (4 מעלות צלזיוס) המושפעת ברציפות בגז מעורב (95% O₂ / 5% CO₂).
5. גזירה, ניקוי ואחסון זמני של מקטעי מעי
   1. באמצעות מלקחיים עיניים (איור 2E), נתח בעדינות את המזנטריה ורקמת השומן הסובבת הדבוקה לדופן המעיים.
   2. באמצעות מזרק מלא בתמיסת טירוד הקרה (המצוידת במחט קהה) (איור 2L), מזריק בעדינות את תמיסת החוקן לחלל המעי. שטוף לאט את פנים חלל המעי 2–3 פעמים כדי לנקות היטב את תוכנו.
   3. הניחו את מקטעי המעי הנקיים בתמיסת טירוד הקרירה והחמוצנית הטרייה לאחסון זמני עד לניסויים הבאים.

3. הפעלת מערכת ניסיונית אופקית בשריר חלק בטמפרטורה קבועה והזרקת תמיסה

1. הוסיפו את תמיסת טיירוד לצלחת החימום המוקדם של מערכת ניסויי השריר החלק DSQG-1 בטמפרטורה קבועה אופקית (איור 4B; ראו טבלת החומרים).
2. הפעל את מערכת החשמל, נגע בלוח ההפעלה כדי לכוון את טמפרטורת האמבטיה ל-37 מעלות צלזיוס, והתחל בחימום מוקדם (איור 4C).
3. לחץ על כפתור ההזלבה , והמערכת תזריק אוטומטית 20 מ"ל מהתמיסה של טיירוד למיכל האמבטיה.
4. לחץ על כפתור הניקוז כדי לנקז את הנוזל למיכל איסוף הפסולת לחלוטין.
5. לחצו על כפתור השטיפה , והמערכת תשלים אוטומטית את תהליך הניקוז הראשון של התכולה ואז מילוי מחדש בנוזל.
6. לחצו על כפתור העצירה כדי להפסיק מיד את כל תהליכי ההזליפה, הניקוז והשטיפה המתמשכים.
7. לחצו על כפתור הניפוח כדי להכניס באופן רציף את הגז המעורב (95% O₂ / 5% CO₂) לאמבטיה. כוונו את קצב זרימת הגז לסקאלה 5 כדי להבטיח חמצון רקמתי ניסיוני נוסף.
   הערה: סולם 5 מציין קצב זרימת גז של 100 מ"ל לדקה. קצבי זרימת גז גבוהים מדי עלולים לגרום לעלייה במערבולת התמיסה, ולהשפיע על יציבות הקלטות המתח.

4. חיבור מערכת הקלטה ועיבוד פיזיולוגית רב-ערוצית לבין הפעלת תוכנה

1. חבר את כבל הנתונים של מתמר מערכת ניסויי השריר החלק בטמפרטורה קבועה אופקית לערוץ 1 של מערכת ההקלטה והעיבוד הפיזיולוגית הרב-ערוצית (איור 4D).
2. הפעל את ספק הכוח החיצוני של מערכת ההקלטה והעיבוד הפיזיולוגית הרב-ערוצית והפעל את המחשב. לחצו פעמיים על סמל מערכת ההקלטה והעיבוד הפיזיולוגית הרב-ערוצית RM6240XC בשולחן העבודה כדי להפעיל את מערכת התוכנה הניסיונית (ראו טבלת החומרים).
3. בשורת התפריט, בחר ניסוי | עיכול | מאפיינים פיזיולוגיים של שריר חלק במעי כדי להעמיס את מודול הניסוי המתאים.
4. הגדר את הפרמטרים הבאים: מצב ערוץ למתח, תדר דגימה ל-400 הרץ, רגישות ל-1.5 גרם, קבוע זמן ל-DC, ותדר מסנן ל-30 הרץ.
5. לחצו על כפתור ההתחלה בפינה הימנית העליונה של ממשק התוכנה כדי להתחיל באיסוף והצגת האות בזמן אמת. לחץ על כפתור ההקלטה כדי להציג בו-זמנית את האוסצילוסקופ ולשמור את האות שנרכש בכונן הקשיח בזמן אמת.
6. בשורת התפריט, בחר ניסוי | Rapid Zeroing כדי להתאים את אות המתח לרמת הבסיס.
   הערה: אם האות סוטה מהקו הבסיסי ביותר מיחידת קואורדינטות אנכית אחת, כוון ידנית את נקודת האפס של מתמר המתיחה באמצעות מברג.
7. בשורת התפריט, בחר ניסוי | שיטת הצגת נתונים בזמן אמת | צלחת צפה. בתיבת הדו-שיח שמופיעה, בחרו מדידה רגילה בזמן אמת-מהיר כדילהציג נתוני מתח בזמן אמת של שריר המעי בחלון הצף.

5. הגדרת עומס מוקדם במתלה ומתיחה של רצועת שריר התריסריון

1. כוונו את המרווח הקדמי לאחור של קרסי הרקמה על ידי סיבוב כפתור הבורג האופקי בהתאם לאורך רצועת השריר התריסריון, תוך הבטחה שהוא תואם לאורך הרצועה.
2. שמרו על מקטע המעי בתצורה הגלילית הטבעית שלו, ויישרו את קו הראייה עם פתח החתך המעגלי של הלומן המעיים.
3. באמצעות מלקחיים עיניים, משכו בעדינות את פתח המעי כדי לשמור על היציבות.
4. הכניסו בעדינות את קצה וו הרקמה לתוך לומן המעי.
5. במרחק של 2–3 מ"מ משפת המעיים, יש לנקב את דופן המעי העליונה בשכבה אחת מבפנים החוצה באמצעות קצה וו הרקמה.
   הערה: קרס הרקמה חייב לחדור את שכבת השריר כדי להבטיח עיגון יציב, תוך הימנעות מהידבקות שטחית רק לשכבת הסרוזל, כדי למנוע חיתוך מכני וקריעה של דופן המעי על ידי הקרס בעת יישום העומס המוקדם.
6. הצד השני של דופן המעי זהה לצד הראשון. לאחר זיהוי הנקודה המקבילה המתאימה, חדר רק לדופן המעי החד-שכבתית בנקודה זו (איור 3L).
7. סובב שוב את ידית הבורג האופקי כדי לכוון את מרווח הקרסים, ולוודא שריר התריסריון נשאר רפוי באופן טבעי.
8. הפעילו בהדרגה מתח על ידי כוונון המכוון החד-ממדי הדק עד שהמתח הממוצע של רצועת שריר התריסריון מתייצב ב-0.8 ± 0.1 גרם (איור 4A).
   הערה: בדקו ויזואלית את כל אורך המעי כדי לוודא שהוא נשאר ישר וצילינדרי, נקי מפיתולים, סיבוב או קפלים ספירליים. אם זה לא המצב, הפחיתו מיד את המתח וכוונו מחדש את נקודת ההרכבה בקצה אחד.
9. לפני תחילת הניסוי, איזון רצועת שריר התריסריון בתא הפרפוזיה למשך 60 דקות. במהלך תקופת האיזון הזו, החליפו את תמיסת הטירוד בבופר טרי כל 15–20 דקות עד שהקצב ההתכווצות הספונטני מתייצב.
   הערה: תקופת שיווי המשקל של 60 דקות נחשבה לשלמה רק כאשר מקטעי המעי המבודדים הציגו פעילות התכווצות ספונטנית יציבה למשך לפחות 15 דקות רצופות. הקריטריונים האובייקטיביים לייצוב הוגדרו כמותית כך: (1) סטיית מתח מנוחה בסיסית של < ±5%, (2) שונות במשרעת ההתכווצות הממוצעת של < ±10% לאורך מרווחי 5 דקות רצופים, ו-(3) תנודות תדירות של < ± מחזור אחד לדקה.
10. רשום את עקומת פעילות ההתכווצות הספונטנית של רצועת שריר התריסריון כנתוני ייחוס בסיסיים לניסויים הבאים.

6. רכישת נתונים ניסיוניים

1. לניסויים מתמשכים, בשורת התפריט, בחר כלים | תצוגה מפוצלת לביצוע ניתוח סטטיסטי בזמן אמת על נתוני גל שנלכדו.
2. לקבצי נתונים מאוחסנים, לחץ על כפתור הפתיחה בסרגל הכלים, בחר קובץ נתונים שמור עם סיומת .lsd, וטען רשומות ניסויים היסטוריות.
3. לחץ על סמל המדידה בסרגל הכלים, בחר מצב אזור . הזז את סמן העכבר מעל אזור צורת הגל, החזק את כפתור העכבר השמאלי כדי לבחור שתי נקודות, והמערכת תציג לוח נתונים שמציג את ערך המתח הממוצע בתוך אותו מקטע.
4. לחץ על סמל המדידה בסרגל הכלים, בחר מצב מחזור . באמצעות כפתור העכבר השמאלי, לחצו על חמש פסגות גל שונות (נקודות שיא) רצופות לאורך צורת הגל. לחץ קליק ימני על העכבר, ולוח הנתונים יחשב ויציג את תדירות ההתכווצות (ב-bpm) (איור משלים S1).

תוצאות

פרוטוקול ניסויי זה מתאר את שיטת ההכנה הסטנדרטית לרצועות שריר תריסרי-תריסרי מבודדות של הארנב ואת תהליך רישום המתח הדינמי ושינויים בתדר בזמן אמת באמצעות מערכת פרפוזיה מבודדת לאיברים. בהתאם לפרוטוקול זה, HXZQ-OL נוסף ברצף באמצעות מינון מצטבר באמבט תמיסה של טירוד בנפח 20 מ"ל, והגיע לריכוזי נפח סופיים של 10, 20, 30, 40 ו-50 מיקרוליטר/מ"ל באמבטיה. בהתייחס לסטנדרטים של הפרמקופיאה הסינית (מהדורת 2025), ריכוזים אלו תואמים לפרוסות תרופות גולמיות ברמות 6.6, 13.2, 19.8, 26.4 ו-33.0 מ"ג/מ"ל, בהתאמה. בריכוז הגבוה ביותר של HXZQ-OL שנבד...

דיון

טכניקות רישום איברים מבודדים ורישום מתח מהוות שיטות קלאסיות ללימוד פיזיולוגיה ופרמקולוגיה של שריר חלק. ממצאיהם חשובים מאוד להבהרת המנגנונים הפתופיזיולוגיים שמאחורי הפרעות תנועתיות במערכת העיכול, מחלות כלי דם ותפקוד לקוי ברחם 12,13,14,15. באמצעות מודל תריסרי-תריסרי-ארנב אקס ויבו סטנדרטי, מחקר זה הראה כי HXZQ-OL גורם להרפיה תלויה בריכוז של שריר חלק במעי....

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.5-10 µL Pipette	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101004
10 µL Pipette tips	LABSELECT	T-001-10
10 mL Volumetric flask	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-043804
100 mL Volumetric flask	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-043807
100-1000 µL Pipette	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101014
1250 µL Pipette tips	LABSELECT	T-001-1250
20 mL Volumetric flask	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-010105
200 µL Pipette tips	LABSELECT	T-001-200
50 mL Conical centrifuge tube	LABSELECT	CT-002-50A
5-50 µL Pipette	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101006
Acetylcholine chloride	Supelco	PHR1546
All-in-One Lab Computer	Lenovo	R5-3500U
Atropine sulfate	Macklin	A822893
Barium chloride	Sigma-Aldrich	342920
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	499609
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767
Freezing point osmometer	Shanghai Precision Instruments Co., Ltd.	BS100
Horizontal Constant-Temperature Smooth Muscle Experiment System	Chengdu Instrument Factory	DSQG-1
Huoxiang Zhengqi Oral Liquid	Taiji Group Co., Ltd.	Z50020409
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Multi-Channel Physiological Recording and Processing System	Chengdu Instrument Factory	RM6240XC
New Zealand White rabbits	Pizhou Dongfang Breeding Co., Ltd. (License No.: SCXK[Su]2022-0004)	either sex (weighing 2.0–2.5 kg)
pH meter	Shanghai Leici	PHS-25
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P5405
Povidone-iodine	H&H Medical Co., Ltd.	3180132
Precision balance (0.1 mg)	Sartorius	BCE64i
Saline solution	H&H Medical Co., Ltd.	100014438029
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium dihydrogen phosphate	Supelco	1063700250
Sodium Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761
Verapamil Hydrochloride	Macklin	V820460
Vortex mixer	Kylin-Bell	XW-80A