הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר מחקר
* These authors contributed equally
באמצעות מודל עכברים המושרה על ידי תזונה עתירת שומן למחלת כבד סטאטית הקשורה לתפקוד מטבולי לקוי, מחקר זה מעריך את השפעות תוספת שמן מיקרואצות עשירה בחומצה דוקוסהקסנואית (DHA) ומראה כי ההתערבות משפרת את פרופילי השומנים הכבדיים וקשורה לשינויים בהרכב המיקרוביום במעי.
מבחינה מטבולית, מחלת כבד סטיאטי לקוי היא הפרעה מטבולית נפוצה הקשורה לדיסביוזה של מיקרוביוטה במעי ולחוסר איזון שומני כבד. במחקר זה, הוקם מודל עכברים המושרה על ידי תזונה עתירת שומן להערכת השפעות של תוספת שמן מיקרואצות עשיר ב-DHA. עכברים (n = 4 לקבוצה) קיבלו תזונה עתירת שומן במשך 8 שבועות וקיבלו התזנה יומית של שמן מיקרואצות, פרוביוטיקה, או שילוב של שמן מיקרואצות עשיר ב-DHA ופרוביוטיקה. הוערכו פרמטרים מטבוליים, הרכב המיקרוביום במעי (ריצוף 16S rRNA), מסלולים תפקודיים מיקרוביאליים ופרופילים מטבולומיים כבדיים. התוצאות הראו כי שמן מיקרואצות עשיר ב-DHA שיפר את ההומאוסטזיס של השומן, כפי שנראה על ידי ירידה ברמות LDL-c בסרום ורמות טריגליצריד כבד והגברת ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL-c), והייתה קשורה להקלה על פגיעות בכבד ולחץ חמצוני. ניתוח מיקרוביום חשף שינויים סלקטיביים בהרכב המיקרוביאלי במעי, כולל העשרת לקטובצילוס וביפידובקטריה והפחתת טקסונים עתירי שומן הקשורים לתזונה כמו קלוסטרידיום ורומינוקוקוס. פרופילינג פונקציונלי הצביע על שינויים במסלולי מטבוליזם מיקרוביאליים, כולל מחזור חילוץ L-מתיונין ופירוק פנילאתילאמין. ניתוח משולב של מיקרוביום-מטבולום זיהה עוד יותר קשרים בין טקסונים מיקרוביאליים למטבוליטים כבדיים המעורבים במטבוליזם חומצות שומן, מהפכת חומצות מרה ונתיבי חומצות אמינו. ממצאים אלו מצביעים על כך שתוספי שמן מיקרואצות עשירים ב-DHA קשורים לשיפור במטבוליזם של שומנים כבדיים ובהרכב המיקרוביוטה במעי במודל זה, מבלי לרמוז על מנגנון סיבתי ישיר.
מחלת כבד סטיטוטית הקשורה לתפקוד מטבולי לקוי (MASLD) היא מחלה עולמית נפוצה מאוד, המשפיעה על כ-32.4% מאוכלוסיית העולם1. MASLD מוגדר על ידי עודף שומן בכבד, התורם לבעיות בריאות שונות הנלוות. מערכת העיכול האנושית מכילה קהילה מיקרוביאלית מתוחכמת ומאוזנת, הכוללת חיידקים, וירוסים, פטריותוטפילים. עקב האינטראקציה בין קהילה מיקרוביאלית זו לכבד, פרוביוטיקה נחשבת לשיטה מבטיחה למניעה ולטיפול ב-MASLD על ידי ויסות הקשר הקריטיהזה 3. מחקרים מתפתחים מצביעים על כך שפרוביוטיקה עשויה להשפיע לטובה על MASLD על ידי ויסות המיקרוביום של המעי והפחתת דלקת. בפרט, הוכח כי מתן פרוביוטיקה משיב איזון למיקרוביום המעי ומפחית דלקת כבדית4. יתרה מזאת, פרוביוטיקה מסוימת, במיוחד כאלה שיכולות לשפר את חילוף החומרים של חומצות מרה, הוכחו כמקלה על סטיטוזיס כבדי (כבד שומני) ותומכות בבריאות מטבולית כללית אצל אנשים הסובלים מ-MASLD 5,6. יתרה מזאת, ראיות חזקות הצביעו על כך שמטופלים עם MASLD מציגים שינויים משמעותיים בסביבת המעי, מצב הידוע כדיסביוזה 7,8. ממצא קריטי היה הפחתת מגוון אלפא, כלומר המספר הכולל והמגוון של מינים מיקרוביאליים מצטמצם. יתרה מזאת, מיקרוביום המעי של חולי MASLD מאופיין לעיתים קרובות בדומיננטיות של הפילום החיידקי Firmicutes 9,10,11. אנשים עם MASLD נוטים לצרוך תזונה לקויה, בדרך כלל עם צריכה גבוהה של שומנים רוויים וצריכה נמוכה של מיקרונוטריינטים חיוניים12,13. דפוסי האכילה הלא בריאים הללו, הנצפים לעיתים קרובות באוכלוסיות עירוניות, מתקשרים עם יחס גבוה יותר של Firmicutes ל-Bacteroidetes בהשוואה לאנשים החיים באזורים כפריים14. יתרה מזאת, דיאטות עתירות שומן היו מעורבות ישירות ביצירת חוסר איזון עמוק יותר במערכת העיכול. במיוחד, גם מחקרים במודלים בעלי חיים וגם מחקרים על חולים עם מחלת כבד מתקדמת, MASLD, הראו כי צריכת שומן גבוהה קשורה לשינוי בווירום במעי. שינויים אלו כללו עלייה בפעילות הפאג' הליטי, שבסופו של דבר החמירה את הדיסביוזה הקיימתבמעיים 15,16.
חומצות שומן רב-בלתי רוויות אומגה-3 (PUFAs), שנמצאות בדרך כלל בשמן דגים, עשויות לשפר את חילוף החומרים של השומנים ולווסת את המיקרוביוטה במעיים. שמן מיקרו-אצות הפך למקור מבטיח ובר-קיימא ל-PUFAs אומגה-3. במיוחד, שמן מיקרואצות סקיזוכיטריום הוא מקור מסחרי מבטיח כי הוא מכיל ריכוז גבוה של חומצה דוקוסהקסאנואית טהורה (DHA). מחקרים קודמים מקבוצה זו דיווחו כי במודל עכברים עם השמנת יתר הנגרמת על ידי דיאטה עתירה בשומן (HFD), היעילות של שמן המיקרואצות בקידום ירידה במשקל הייתה דומה לזו של שמן דגים ותרופת ההרזיה אורליסטט. חשוב לציין ששמן המיקרואצות הראה את השפעות הירידה במשקל מוקדם יותר משמן דגים או אורליסטאט17. ממצאים קודמים הראו גם ששמן מיקרואצות משפיע באופן מובהק ומועיל על מיקרוביום המעי בהשוואה לשמן דגים מסחרי ואורליסטאט. למרות ששמן המיקרואצות לא שינה באופן משמעותי את המגוון החיידקי הכולל, הוא היה קשור לשפע מוגבר של חיידקים המייצרים חומצות שומן קצרות שרשרת (SCFA) מועילים ולהפחתה במינים פתוגניים, כולל הסוג Desulfovibrio הקשור להשמנה. יתרה מזאת, שמן המיקרואצות שיחזר באופן מרשים את היכולת המטבולית של המיקרוביום במעי, ושיפר מסלולים הקשורים לחומצות אמינו, SCFAs ומטבוליזם חומצות מרה, תוך הפחתת ביוסינתזה של ליפופוליסכריד (LPS). מודולציות אלו ככל הנראה היו אחראיות לשיפור המטבוליזם של השומנים ולהגברת מחסום רירית המעי הגס, מה שמרמז ששמן אצות מיקרו הוא תוסף תזונה מעולה להקלה על השמנת יתר17.
למרות ההתקדמות בקישור דיסביוזה של מיקרוביוטה במעי להתפתחות MASLD, הקשרים הספציפיים בין הרכב המיקרוביאלי, תפקודי מטבוליזם מיקרוביאלי ומטבוליזם של שומנים כבדיים עדיין אינם מובנים במלואם. בפרט, הקשרים הסיבתיים בין שינויים במיקרוביום להתקדמות המחלה נותרו לא ברורים, והאם התערבויות תזונתיות, כמו שמן מיקרואצות עשיר ב-DHA, קשורות לשינויים מתואמים בקהילות מיקרוביאליות במעי ובפרופילים מטבוליים של המארח, לא נחקרו באופן שיטתי. שמן מיקרואצות עשיר ב-DHA הוא מקור בר קיימא ויעיל לחומצות שומן אומגה-3, עם תכולת שמן מיקרואצות עשירה ב-DHA השווה לתוספי תזונה שמקורם בדגים. מחקרים קודמים הציעו כי תוספת שמן מיקרואצות עשירה ב-DHA עשויה לשפר את הסטיטוזה הכבדית ואת הפרמטרים המטבוליים18,19. עם זאת, הקשרים שלה להרכב מיקרוביום המעי ולתפקוד המטבוליזם המיקרובי בהקשר של MASLD נותרו לא ברורים.
לכן, במחקר זה, המחקר הנוכחי השתמש במודל עכברים המושרה על ידי תזונה עתירת שומן כדי להעריך את השפעות תוספת שמן המיקרואצות העשירה ב-DHA על פרמטרים מטבוליים, הרכב המיקרוביום במעיים ופרופילים מטבולומיים כבדיים. הושערה כי תוספת שמן מיקרואצות עשירה ב-DHA תהיה קשורה לשיפור במטבוליזם של שומנים כבדיים ולשינויים מקבילים בהרכב המיקרוביוטה במעי ובמסלולים המטבוליים המיקרוביאליים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרטים על כל בעלי החיים, התזונה, המגבים, הערכות, הכלים, התוכנה וספקי השירות המשמשים בפרוטוקול זה מסופקים בטבלת החומרים. כל המחקרים על בעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות המכון הלאומי לבריאות (NIH) לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה, וקיבלו אישור מוועדת בעלי החיים הניסיוניים של בית החולים הפרובינציאלי שאנדונג (אישור אתי מס' 2022–007, אושר ב-24 בינואר 2022).
זהירות: דם בעלי חיים, דגימות צואה ורקמות יש לטפל בהם כחומרים שעלולים להיות מסוכנים ביולוגית. כל ההליכים הכוללים בעלי חיים חיים, דגימות ביולוגיות, חדים, ממסים אורגניים וראגנטים לבדיקה כימית צריכים להתבצע בהתאם לבטיחות ביולוגית, טיפול בבעלי חיים ותקנות בטיחות כימית מוסדיות. גופות בעלי חיים, רקמות, חומרים מזוהמים בדם ודגימות צואה יש לאסוף במיכלי פסולת ביולוגית ייעודיים ולהיפנה דרך מוסד לבעלי חיים או משרד בטיחות ביולוגית. מחטים, מחטי גוואג', צינורות נימיים וחומרים חדים אחרים יש להשליך מיד לאחר השימוש במיכלים מאושרים. פסולת ממס אורגנית, כולל מתנול, אצטוניטריל ותמיסות המכילות חומצה פורמית, צריכה להיאסף במיכלי פסולת כימית מסומנים ולהיפנה דרך תוכנית הפסולת הכימית המסוכנת המוסדית. יש לאסוף ולזרוק פסולת מבדיקות עומס ביוכימיות וחמצוניות בהתאם לגיליונות הבטיחות של היצרן ולכללי הבטיחות הכימיים המוסדיים.
בעלי חיים ניסיוניים
עכברים זכרים בני שישה שבועות מסוג C57BL/6J (n = 4 לכל קבוצה) נשמרו בתנאים מסוימים ללא פתוגנים (SPF) עם מחזור אור/חושך של 12 שעות בטמפרטורה של 22 ± 2 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של 50–60%. לבעלי חיים הייתה גישה חופשית למזון ולמים, כאשר לכל הכלוב היו מקסימום חמישה עכברים. עכברי הביקורת קיבלו תזונה סטנדרטית שכללה 70% פחמימות, 20% חלבון ו-10% שומן (קלוריות). כדי להקים את מודל העכבר MASLD, העכברים קיבלו תזונה עתירת שומן במשך 8 שבועות שכללה 20% פחמימות, 20% חלבון ו-60% שומן (ק"ל). כל הדיאטות אוחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס וחודשו פעמיים בשבוע. העכברים חולקו באקראי לקבוצות ניסוי באמצעות מחולל מספרים אקראיים, וגודל המדגם נקבע (n = 4 לכל קבוצה) בהתבסס על מחקרים קודמים שהשתמשו במודלים דומים של עכברים מבוססי תזונה עתירת שומן וניסויים ראשוניים. כל הטיפולים ניתנו באותו זמן בכל יום כדי למזער את השונות הצירקדית.
שמן המיקרואצות הופק וטוהר על ידי האקדמיה למדעי החקלאות של שאנדונג, עם טוהר של כ-99%. שמן האצות המיקרו אוחסן בטמפרטורה של −30 מעלות צלזיוס, מוגן מאור. לפני ההזנה, השמן הוכן עם אמולסיפייר וערבב היטב כדי להבטיח הומוגניות. במיוחד, שמן מיקרואצות עשיר ב-DHA עבר אמולסיפיקציה בנתרן קרבוקסי מתילצלולוז 0.5% סטרילי המכיל 0.5% טווין-80 במי מלח רגילים. שמן האצות המיקרו ורכב האמולסיפייר התערבבו ביחס של 1:9 (v/v) והועברו לוורטקס למשך 2 דקות מיד לפני ההערכה כדי לקבל מתלה אחיד. עכברים בקבוצת המיקרואצות שטופלו בשמן קיבלו את התכשיר פעם ביום באמצעות מחט האכלה סטרילית במינון של 10 מיקרוליטר/גרם משקל גוף. נפח הגוואג' הותאם מדי יום בהתאם למשקל הגוף כדי להבטיח עקביות במינון. עכברים בקבוצת הביקורת קיבלו נפח דומה של מי מלח סטריליים רגילים באותם תנאים. המלח ששימש היה הזרקת כלוריד נתרן של 0.9%.
טיפול פרוביוטי כלל נוסחה מורכבת שכללה Lactobacillus plantarum (DY-1), Lactobacillus acidophilus (KDB-03), Lactobacillus casei (KDB-LC) ו-Bacillus coagulans (GIM 1.645). ארבעת הזנים התערבבו ביחס תאים חיוניים שווה של 1:1:1:1. כל זן תרם 2.5 × 107 CFU/mL לנוסחה הסופית, מה שהניב ריכוז חיידקים כולל של 1 × 108 CFU/mL. תערובת הפרוביוטיקה סונתזה על ידי האקדמיה למדעי החקלאות של שאנדונג ואינה זמינה מסחרית. טיפול פרוביוטי כלל מרק תסיסה פרוביוטי מורכב המכיל Lactobacillus plantarum DY-1, Lactobacillus acidophilus KDB-03, Lactobacillus casei KDB-LC, ו-Bacillus coagulans GIM 1.645. ריכוז החיידקים של הנוסחה היה 1 ×10 8 CFU/mL. מרק התסיסה הפרוביוטי נשמר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני השימוש. עכברים בקבוצת הטיפול בפרוביוטיקה קיבלו את נוסחת הפרוביוטיקה פעם ביום באמצעות גבדה אורלית במינון של 0.01 מ"ל לגרם משקל גוף לאורך תקופת הניסוי.
הזנים הבודדים גודלו בתנאים מתאימים ונקטפו בשלב הגידול הבינוני (OD₆₀₀₀ ≈ 0.6), ואז שולבו ביחס המצוין. תרביות חיידקיות צונטרו כדי להסיר את הסופרנאנט, והכדורים הושעו מחדש בתמלח סטרילי עם בופר פוספט (PBS). המתלה החיידקית הטרייה נשמרה בקפאה לפני המתן כדי לשמור על החיוניות. הריכוז הסופי של החיידקים הותאם ל-1 ×10 8 CFU/mL לפני ההעברה. עכברים בקבוצת הפרוביוטיקה קיבלו את הנוסחה באמצעות גאווג' דרך הפה במינון של 0.01 מ"ל/גרם משקל גוף פעם ביום לאורך תקופת הניסוי. לא הוחל טיפול קדם-אנטיביוטי לפני מתן הפרוביוטיקה. כדי להפחית הטיה ניסויית, בוצעה הערכת תוצאות על ידי חוקרים עיוורים במידת הצורך. MASLD אושר באמצעות ניתוח ביוכימי בדם.
ניתוח דם
בסיום תקופת הניסוי, העכברים היו בצום לילה (12 שעות) עם גישה חופשית למים לפני מדידת גלוקוז ואיסוף דם סופי. העכברים הורדמו עמוקות עם איזופלורן באמצעות מאדה הרדמה עד שאובחן אובדן רפלקס הפדלים. דגימות דם סופיות נאספו באמצעות דימום רטרו-אורביטלי. לאחר איסוף הדם, עכברים הושמתו על ידי פריקה צווארית בזמן הרדמה עמוקה, והמוות אושר על ידי הפסקת הנשימה ופעימות הלב. הדם הורשה להיקרש בטמפרטורת החדר ואז צנטריפוגה ב-3,000 × גרם למשך 10 דקות לקבלת סרום. דגימות הסרום נלקחו ואוחסנו בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס עד לניתוח. גלוקוז בסרום, כולסטרול כולל (TC), טריגליצרידים (TG), כולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL-c), כולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL-c), אספרטט אמינוטרנספראז (AST) ואלנין אמינוטרנספראז (ALT) נמדדו באמצעות אנלייזר ביוכימי אוטומטי, בהתאם להוראות היצרן. פרמטרים אלו נמדדו באמצעות בדיקות קולורימטריות אנזימטיות עם ערכות תגובה סטנדרטיות המשולבות במערכת האנלייזרים. כל הפרמטרים הביוכימיים ננורמו לנפח הסרום ובוטאו ביחידות שהוגדרו על ידי היצרן.
בדיקות לחץ חמצוני
סמנים ביולוגיים של לחץ חמצוני נמדדו באמצעות ערכות, כולל אלו של מלונדיאלדהיד, סופראוקסיד דיסמוטאז וקטלז. הבדיקות בוצעו לפי הוראות היצרן. בקצרה, רקמות הכבד עברו הומוגנות בבופר קר וקרח וצנטריפוגה לקבלת סופרנטנטים לניתוח. רמות המלונדיאלדהיד (MDA) נקבעו באמצעות מבחן חומרים תגובתיים בחומצה תיובארבטורית (TBARS); פעילות סופר-חמצן דיסמוטאז (SOD) נמדדה על ידי יכולתו לעכב תגובות מתווכות סופראוקסיד; ופעילות הקטלז (CAT) נמדדה על ידי ניטור קצב הפירוק של מי חמצן. המדידות בוצעו באמצעות קורא מיקרופלט, והערכים חושבו באמצעות עקומות סטנדרטיות או הנוסחאות שסופקו בערכות. סמני לחץ חמצוני ננורמו למשקל רקמת הכבד והובאו לביטוי בהתאם למפרט היצרן.
ריצוף 16S rRNA וניתוח מיקרוביום
דגימות צואה נאספו בסוף תקופת הניסוי ישירות מעכברים בודדים בתנאים סטריליים, הוקפאו מיד בחנקן נוזלי, ואוחסו בטמפרטורה של −80°C עד להוצאת DNA. DNA מיקרוביאלי הופק באמצעות ערכה מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן. אזור V3–V4 של גן חיידקי 16S rRNA הוגבר באמצעות פריימרים 341F/806R. הגברת PCR בוצעה במערכת תגובה של 25 מיקרוליטר שכללה תבניות DNA, 2x PCR master mix, ו-0.2 מיקרומום מכל פריימר. תוכנית ההגברה כללה דנאטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, ואחריה 25 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס ל-30 שניות, ו-72 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, עם הארכה סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. ספריות Amplicon נבנו ורצפו על פלטפורמת Illumina MiSeq באמצעות אסטרטגיית 2 × 250 bp משולבות על ידי ספק שירותי רצף מסחרי. איכות הספריות הוערכה לפני הרצף, וספריות מאוחדות נטענו בצפיפות האשכול המומלצת על ידי היצרן. קריאות באיכות נמוכה עם בסיסים מעורפלים, אורך לא מספק או ציון איכות ממוצע מתחת ל-Q20 הוסרו לפני ניתוח במעבר.
קריאות רצף גולמיות עובדו באמצעות QIIME 2 גרסה 2019.420. בקצרה, קריאות בקצה זוגי עברו דה-מולטי-פלקס, סינון איכות, דה-נויז, מיזוג וסינון כימרה באמצעות DADA2 עם פרמטרים ברירת מחדל אלא אם צוין אחרת. וריאנטים של רצף אמפליקון לא-סינגלטון (ASVs) נשמרו לניתוח במורד הזרם. הקצאה טקסונומית בוצעה באמצעות גרסת מסד הנתונים Greengenes גרסה 13_8 שמיושמה ב-QIIME221. בהתחשב במגבלות הרזולוציה הטבועות בריצוף גנים של 16S rRNA, במיוחד בשימוש במאגר Greengenes, ההערות הטקסונומיות פורשו אך ורק ברמת הסוג. סיווג ברמת המין לא נחשב אמין ולכן לא שימש בניתוחים במורד הזרם, בהשוואות סטטיסטיות או בפרשנויות ביולוגיות. כל התכונות המיקרוביאליות התכווצו לרמת הסוג לפני ההדמיה והניתוח.
נעשה שימוש במדדי אלפא-גיוון (Chao1, מינים נצפים, שאנון, סימפסון, PD של פיית', ואחידות פיילו). השוואות סטטיסטיות של גיוון אלפא בין קבוצות בוצעו באמצעות מבחנים לא פרמטריים מתאימים (למשל, מבחן קרוסקל–ווליס). מרחק ג'אקארד והשוני בין בריי-קרטיס שימשו כמדדי גיוון בטא. גרפים של ניתוח קואורדינטות עיקרי (PCoA), קנה מידה רב-ממדי לא-מטרי (NMDS) וגודל אפקט ניתוח דיסקרימיננטי ליניארי (LEfSe) שימשו להמחשת שינויים בקהילות מיקרוביום, עם סף ציון LDA של 2.0. ניתוח ורב-משתני פרמוטציוני של שונות (PERMANOVA) שימש להערכת מובהקות סטטיסטית בגיוון בטא. ויזואליזציה של נתונים וניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות פלטפורמת GenesCloud (https://www.genescloud.cn).
פרופילים תפקודיים מיקרוביאליים הוסקו מנתוני ריצוף 16S rRNA ולא נמדדו ישירות באמצעות ריצוף מטגנומי או טרנסקריפטומי ברובה ציד. בהתבסס על מסלול מנורמל או טבלת שפע קבוצות פונקציונליות, יחידות פונקציונליות חזויות מופו למסדי נתונים נפוצים, כולל KEGG, MetaCyc ו-COG. שפע מסלולי KEGG סוכם לפי קטגוריות הפונקציונליות ההיררכיות שלו, כאשר סיווגי מסלולים ברמה 2 שימשו להשוואה במורד הזרם. השפע הממוצע של כל קטגוריית מסלולים חושב באמצעות תוכנת R.
ניתוח מטבולומיקה לא ממוקדת של דגימות כבד
רקמות כבד נכרתו במהירות מיד לאחר אישור המוות, הוקפאו מיד בחנקן נוזלי, ונשמרו בטמפרטורה של −80°C לפני הניתוח. כ-50 מ"ג רקמת כבד קפואה עברו הומוגניזציה במתנול:מים קרים (4:1, v/v) בתוספת תקנים פנימיים. יחס הממס בין רקמה להוצאה היה 1:10 (w/v). הדגימות הועברו לוורטקס למשך דקה אחת, סוניקציה על קרח למשך 10 דקות, ואז דגרו בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לשיפור משקעי החלבון. ההומוגנטים עורבבו היטב, עברו סוניקציה על קרח, וצנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסופרנטנטים נאספו בקפידה, התאדו בזרם חנקן קל, והורכבו מחדש ב-50% מתנול לניתוח מאוחר יותר.
דגימות בקרת איכות (QC) נוצרו על ידי איסוף נפחים שווים מכל דגימה ונותחו לסירוגין לאורך כל הריצה להערכת יציבות אנליטית ושחזוריות. ניתוח מטבולומיקה לא ממוקדת בוצע באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד המחוברת לספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה, המופעלת על ידי ספק שירות מסחרי. המטבוליטים הופרדו בעמודת C18 בפאזה הפוכה באמצעות מערכת ממס בינארית המורכבת ממים עם חומצה פורמית של 0.1% ואצטוניטריל עם 0.1% חומצה פורמית. נפח ההזרקה היה 2 מיקרוליטר, טמפרטורת העמודה נשמרה על 40 מעלות צלזיוס, וקצב הזרימה נקבע על 0.30 מ"ל לדקה. תוכנית שחרור גרדיאנט שימשה להשגת הפרדה רחבה בין מטבוליטים. זיהוי ספקטרומטרי מסה בוצע הן במצבי יינון אלקטרוספריי חיובי והן שלילי בטווח m/z של 70–1,000 כדי להשיג כיסוי רחב של מטבוליטים. מתח ריסוס היונים הוגדר ל-3.5 kV במצב חיובי ו-−2.5 kV במצב שלילי. טמפרטורת הנימים נשמרה על 320 מעלות צלזיוס, והנתונים נאספו במצב MS מלא עם רכישת MS/MS תלויה בנתונים לצורך הערות מטבוליטים. הנתונים הגולמיים עובדו באמצעות תוכנת מטבולומיקה ייעודית (MassLynx v4.1) לזיהוי תכונות, יישור ונרמול. זיהוי מטבוליטים בוצע בהתבסס על מסה מדויקת, זמן שימור ודפוסי פיצול בין MS/MS בהשוואה למאגרי מידע ציבוריים, כולל מסד הנתונים של Human Metabolome (HMDB) ואנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) (v2023), כאשר הדבר רלוונטי.
ניתוח רב-משתני וניתוח מסלולים
נתוני מטבולומיקה מעובדים עברו ניתוחים סטטיסטיים רב-משתניים, כולל ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) וניתוח הבחנה חלקית של ריבועים (PLS-DA), כדי להמחיש הבדלים מטבוליים בין קבוצות ניסוי. מטבוליטים שונים זוהו בהתבסס על שילוב של חשיבות משתנה בציוני הקרנה (VIP) (>1.0) ומובהקות סטטיסטית (p < 0.05). מטבוליטים שזוהו מופו עוד למסלולים מטבוליים באמצעות ניתוח העשרת מסלולי KEGG להבהרת תהליכים ביולוגיים הקשורים לתוספי שמן מיקרואצות עשירים ב-DHA.
ניתוח סטטיסטי
הנתונים הוצגו כממוצע ± SEM ונותחו באמצעות ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA), ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של טוקי. המובהקות הסטטיסטית הוגדרה כ-p < 0.05. ניתוח העשרה של מטבוליטים בכבד בוצע באמצעות R (גרסה 4.4.1). אסוציאציות זוגיות בין סוגים מיקרוביאליים למטבוליטים בכבד נותחו באמצעות קורלציות דירוג ספירמן. רק מתאמים משמעותיים (שיעור גילוי שגוי, FDR < 0.05) עם |ρ| ≥ 0.6 נכללו בניתוחי הרשת האינטגרטיבית. עיבוד נתוני מיקרוביום ומטבולומיקה בוצע כפי שתואר לעיל, כולל שימוש בפלטפורמת GenesCloud ונהלי בקרת איכות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
שמן מיקרואצות עשיר ב-DHA משפר את חילוף החומרים של השומנים, פגיעות בכבד ולחץ חמצוני כבדי בעכברי MASLD הנגרמות על ידי HFD
כדי להעריך את השפעת תוספי תזונה על הומאוסטזיס גלוקוז ושומן, נבדקו פרמטרים ביוכימיים בחמש קבוצות: אוכל רגיל (RC), תזונה עתירת שומן (HFD), שמן מיקרואצות עשיר ב-DHA, תוספים פרוביוטיקה, ושמן מיקרואצות עשיר ב-DHA + עכברים עם תוספת פרוביוטיקה. מכיוון שהמטרה העיקרית של מחקר זה הייתה להעריך את השפעות שמן המיקרואצות העשיר ב-DHA, קבוצת...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בשנים האחרונות מספר מחקרים חקרו שינויים במיקרוביום הקשורים ל-MASLD. עם זאת, רוב המחקרים הללו התמקדו בהשוואת אנשים בריאים לחולי MASLD או בבחינת רמות שונות של סטטוסיס24. כתוצאה מכך, עדיין קיימות ראיות מוגבלות המתארות את השינויים הספציפיים במיקרוביום המעי הקשורים לפיברוזיס בכבד ב-MASLD, אף על פי שפיברוזיס היא הגורם הקריטי ביותר בחיזוי תוצאות המטופלים. במחקר זה, אנו מראים ששמן מיקרואצות עשיר ב-DHA שיפר בעיקר את חילוף החומרים של השומנים ולא את ויסות הגלוקוז בעכברים MAS...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
למחברים אין מה לחשוף.
מחקר זה מומן על ידי משרד המדע והטכנולוגיה ("תוכנית המו"פ המרכזית הלאומית של סין" מס' 2021YFA0702100, 2022YFE0132200) ומערכת תעשיית הטכנולוגיה החקלאית המודרנית של מחוז שאנדונג, סין (מספר מענק: SDAIT-26).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 2x PCR Master Mix | Takara Bio Inc., יפן | RR902A | משמש להגברת PCR של 16S rRNA |
| אצטוניטריל | מרק, גרמניה | 100030 | ממס המשמש לשלב נייד של UHPLC |
| מאדה הרדמה | RWD מדעי החיים | R580 | משמש למתן הרדמה איזופלורנית לעכברים |
| אנלייזר ביוכימי אוטומטי | מכון ההנדסה הביולוגית ג'יאן צ'נג, נאנג'ינג, סין | A110-1 & A111-1 | מודד פרמטרים בסרום (גלוקוז, TC, TG, LDL-c, HDL-c, AST, ALT) ורמות שומן כבד |
| Bacillus coagulans (GIM 1.645) | מרכז אוסף תרביות מיקרוביאליות גואנגדונג, סין | GIM 1.645 | זן רכיב בנוסחת פרוביוטיקה |
| קרבוקסימתילצלולוז נתרן (CMC-Na) | סיגמא-אלדריץ', ארה"ב | C4888 | משמש כרכיב אמולסיפייר להכנת שמן מיקרואצות עשיר ב-DHA |
| ערכת בדיקת קטלאז (CAT) | נאנג'ינג קונסטרקשן בע"מ | A007-1-1 | מזהה פעילות CAT (אינדיקטור לקיבולת נוגדי חמצון) ברקמת הכבד |
| חבילת התוכנה DADA2 | צוות הפיתוח של DADA2 | כלול ב-QIIME 2 v2019.4 | משמש להסרת רעש וסינון כימרה של קריאות רצף |
| שמן מיקרואצות עשיר ב-DHA (נגזר ב-Schizochytrium) | - | - | עשיר בחומצה דוקוסהקסנואית (DHA); ניתן מדי יום על ידי Gavage ב-10 דקות ומיקרו; L/g כהתערבות ניסויית |
| בעלי חיים ניסיוניים (עכברים זכרים C57BL/6J) | חברת טכנולוגיית בעלי חיים במעבדת נהר הוויטל בבייג'ינג. | - | בן 6 שבועות, n = 4 לכל קבוצה; שימש להקמת מודל MASLD באמצעות הזנת HFD |
| חומצה פורמית | סיגמא-אלדריץ', ארה"ב | F0507 | תוסף פאזה נייד לניתוח מטבולומיקה |
| מאגר גרינג'נס | גרינג'נס | גרסה 13_8 | משמש להקצאה טקסונומית מיקרואורגנית |
| דיאטה עתירת שומן (HFD) | Research Diets Inc., ארה"ב | D12492 | מורכב מ-20% פחמימות, 20% חלבון, 60% שומן (קלוריות); הונכרתי במשך 8 שבועות כדי לגרום ל-MASLD |
| ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה | תרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב | Q אקסקטיבי אורביטראפ | משמש לזיהוי מטבוליטים במצבים של יונים חיוביים ושליליים |
| מאגר מטבולומים אנושיים (HMDB) | אוניברסיטת אלברטה, קנדה | שחרור 2024 | מאגר נתונים לאנומנטציה של מטבוליטים ציבוריים |
| פלטפורמת Illumina MiSeq | אילומינה, בע"מ, ארה"ב | מערכת MiSeq | משמש לזוגות בקצה 2 & פעמים; רצף של 250 bp |
| איזופלוראן | מרק, גרמניה | PHR2874 | משמש להרדמה בשאיפה בעכברים |
| אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) | מעבדות קנהיסה, יפן | גרסה 2023 | מאגר נתונים המשמש להעשרת מסלולים ולאנוטציה של מטבוליטים |
| לקטובצילוס אסידופילוס (KDB-03) | האקדמיה למדעי החקלאות של שאנדונג, סין | - | זן רכיב בנוסחת פרוביוטיקה |
| לקטובצילוס קסאי (KDB-LC) | האקדמיה למדעי החקלאות של שאנדונג, סין | - | זן רכיב בנוסחת פרוביוטיקה |
| לקטובצילוס פלאנטרום (DY-1) | האקדמיה למדעי החקלאות של שאנדונג, סין | - | זן רכיב בנוסחת פרוביוטיקה |
| חנקן נוזלי | אייר ליקוויד | - | משמש להקפאה מהירה ולשימור דגימות צואה וכבד |
| ערכת בדיקה ל-Malondialdehyde (MDA) | נאנג'ינג קונסטרקשן בע"מ | A003-1 | מזהה MDA (סמן לפרוקסידציה/נזק חמצוני ליפיד) ברקמת כבד |
| תוכנת MassLynx | חברת ווטרס, ארה"ב | גרסה 4.1 | משמש לעיבוד נתונים גולמיים במטבולומיקה, חילוץ תכונות ונירמול |
| מתנול | מרק, גרמניה | 106035 | ממס המשמש להפקת מטבוליטים |
| פלטפורמת ניתוח נתוני מיקרוביום | ג'נסקלאוד | V1 | פלטפורמה מקוונת: https://www.genescloud.cn/home; שימש לניתוחי ויזואליזציה של מיקרוביום PCoA, NMDS, LEfSe ואחרים |
| ערכת DNA קרקע OMEGA & nbsp; | Omega Bio-Tek, נורקרוס, ג'ורג'יה, ארה"ב) | (M5635-02) | בידוד DNA |
| רצפי התייחסות של OTUs | ג'נסקלאוד | מוזכר ממקדונלד ואח' 2012; משמש להקצאת טקסונומיה של וריאציות רצף אמפליקונים (ASVs) | |
| סליין ממוגן בפוספט (PBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, ארה"ב | 10010023 | משמש להשעיית כדורי חיידק |
| פריימר 341F/806R | חברת צ'ינגקה ביוטכנולוגיה בע"מ, סין | - | משמש להגברה של 16S rRNA V3– אזור V4. 341F: 5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′; 806R: 5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′ |
| פרוביוטיקה | - | - | זנים מסוימים שלא הוזכרו במפורש; משמש כהתערבות השוואתית (בעיקר משפר את ההומאוסטזיס של הגלוקוז) |
| תוכנת QIIME 2 | - | 2019.4 | משמש לניתוח ביואינפורמטיקה מיקרוביום (עיבוד ASV, חישוב מגוון אלפא/בטא) |
| תוכנת R | - | 4.4.1 | משמש לניתוח העשרת מטבוליטים בכבד ולניתוח קורלציה של ספירמן של קשרים מיקרוביאליים-מטבוליטים |
| צנטריפוגה מקוררת | אפנדורף, גרמניה | 5810R | משמש לצנטריפוגציה של דגימות סרום ומטבולומיקה. |
| עמודת C18 בשלב הפוך | חברת ווטרס, ארה"ב | 186002350 | משמש להפרדה כרומטוגרפית של מטבוליטים |
| סליין | שיג'יאג'ואנג מס' 4 פארמה | 2211112304 | ניתן מדי יום באמצעות גאווג' לקבוצת הביקורת (לעומת טיפול בשמן מיקרואצות) |
| דיאטת צ'או סטנדרטית | קיאו שיאלי פיד בע"מ, סין | 1016706714625204224 | מורכב מ-70% פחמימות, 20% חלבון, 10% שומן (ק"ל); הוזן לקבוצת הבקרה (RC) |
| מחט האכלה סטרילית | מעבדות אינסטק, ארה"ב | FTP-20-38 | משמש למתן גוואז' דרך הפה |
| ערכת בדיקת סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD) | נאנג'ינג קונסטרקשן בע"מ | A001-3 | מזהה פעילות SOD (אינדיקטור לקיבולת נוגדי חמצון) ברקמת הכבד |
| טווין-80 | סיגמא-אלדריץ', ארה"ב | P4780 | משמש כרכיב אמולסיפייר להכנת שמן מיקרואצות עשיר ב-DHA |
| הומוגניזר אולטרסוני | סיינטז ביוטכנולוגיה, סין | JY92-IIN | משמש לסוניקציה של רקמת הכבד במהלך חילוץ מטבוליטים |
| מטבולומיקה כבדית לא ממוקדת | חברת Metabo-Profile Biotechnology (Shanghai) בע"מ. | קוד הפרויקט: P035Y23A13_SFMU_MJWang_SH | |
| מערבל מערבולת | תרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב | LP Vortex Mixer | משמש להומוגניזציה ואמולסיפיקציה של דגימה |
מאמר זה פורסם
הסרטון יגיע בקרוב