מאמר שיטה

חלון גולגולת שקופה אופטית (HOTS) המותקן על הראש להדמיה עמוקה טרנס-גולגולתית של קליפת העכבר

DOI:

10.3791/71185

⸱

5 ביוני 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center for Biomedical Optics and Molecular Imaging, Shenzhen Key Laboratory for Molecular Imaging, Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Optical Imaging Technology, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, 2University of Chinese Academy of Sciences, 3Key Laboratory of Biomedical Imaging Science and System, Chinese Academy of Sciences, State Key Laboratory of Biomedical Imaging Science and System

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר חלון גולגולת (HOTS) שקוף אופטית המותקן על הראש, המבוסס על הליך ניקוי גולגולת אופטימלי בשני שלבים. גישה זו מניבה גולגולת שקופה מאוד, המאפשרת הדמיה דו-פוטונית של קליפת המוח של העכבר הבוגר לעומקים של עד ~800 מיקרון.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה ברזולוציה גבוהה של שני פוטונים של קליפת המוח של העכבר הבוגר מוגבלת מאוד על ידי פיזור אור מהגולגולת, שמחלישה אותות ומגבילה את עומק ההדמיה ב-vivo. למרות שפותחו שיטות ניקוי גולגולת כדי לספק גישה אופטית לקורטקס דרך הגולגולת השלמה, הביצועים המעשיים שלהן מוגבלים על ידי זמן ניקוי מוגבל וקוקטיילים של ניקוי לא מיטבי. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט ליישום חלון גולגולת אופטית שקוף (HOTS) המותקן על הראש. בגישה זו, השתמשו בכובע על הראש לשמירת תמיסות ניקוי מעל הגולגולת, ובכך נמנע הרדמה ממושכת או ריסון פיזי ואפשר ניקוי גולגולת ממושך (מספר שעות) בעכברים ערים ומתנהגים בחופשיות. בנוסף, בוצע הליך ניקוי דו-שלבי באמצעות תגובות (HOTS-S1: 10% משקל/משקל EDTA, 15% משקל/v D-מנוז, 10% משקל/משקל סולפולן, 0.5% משקל למשקל למשקל בגיל 20; HOTS-S2: 70% משקל/משקל סולפולן, 0.5% משקל/משקל משקל בגיל 20) אופטימיזציה באמצעות סקר כימי שיטתי. אנו מספקים פרוטוקול שלב אחר שלב הכולל חשיפה וייצוב של הגולגולת, יצירה והתקנה של הכובע המותקן על הראש, אספקה ורענון של תגובות ניקוי, והכנת הדמיה לאחר מכן. בעכברים בני 6 שבועות (~20 גרם), פרוטוקול HOTS מייצר באופן שגרתי גולגולת שקופה מאוד התומכת בהדמיה בשני פוטונים של מבנים קורטיקליים לעומקים של עד ~800 מיקרון מתחת ל-pia, ומתקרב לביצועים של חלונות גולגולת פתוחים. חלון ה-HOTS מאפשר הדמיה מבנית בעכברי Thy1-GFP-M ודימות סידן פונקציונלי בעכברי Thy1-GCaMP6s. אנו מאמינים כי, כגישה נוחה ומינימלית פולשנית, חלון ה-HOTS יקל משמעותית על הדמיה עמוקה טרנס-גולגולתית ומניפולציות אופטוגנטיות, פוטופרמקולוגיות ואחרות מבוססות אור ב-vivo.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניטור תוך-חיוני של נוירונים קורטיקליים חיוני להבנת מבנה ותפקוד המוח1. מיקרוסקופיה דו-פוטונית (TPM) היא כלי מרכזילמחקרים ב-vivo 2,3. עם זאת, איכות ההדמיה והעומק שלה מוגבלים מאוד על ידי פיזור אור חזק מהגולגולת האטומה שמעל הקורטקס 4,5.

Open-skull6 ו-Windows 7,8 עם גולגולת דלילה שיפרו משמעותית את הגישה האופטית לקורטקס והם בשימוש נרחב, אך לשתי הגישות יש מגבלות מובנות. חלונות גולגולת פתוחים יכולים לגרום לפגיעת מוח חריפה ותגובות דלקתיות 9,10, בעוד שדילול גולגולת הוא טכנית תובעני וקשה להשיג עובי אחיד11,12.

טכניקות ניקוי אופטי של גולגולת ב-vivo מציעות חלופה זעיר-פולשנית המאפשרת הדמיה בשני פוטונים ברזולוציה אקסונית בעכברים בוגרים. עם זאת, עומק ההדמיה האפשרי נשאר מוגבל (בדרך כלל 150–400 מיקרון מתחת לפיאה) 12,13,14,15. בפועל, ניקוי הגולגולת מוגבל בדרך כלל לתקופה קצרה תחת הרדמה עם קיבוע ראש קשיח, והאופטימיזציה השיטתית של קוקטיילי ניקוי להרכב עצם הגולגולת נותרה לא נחקרה 12,13,14,15.

כדי להתגבר על מגבלות אלו, פיתחנו בעבר חלון גולגולת שקוף אופטית (HOTS) המותקן על הראש, התומך בניקוי גולגולת ממושך, לא מקוון, בעכברים חופשיים (איור 1A)16. גישה זו עושה שימוש בתהליך ניקוי דו-שלבי המשתמש בתגובות (S1 ו-S2), אשר אופטימליזציה באמצעות סקר כימי שיטתי בעבודתנו הקודמת16. אופטימיזציה שיטתית של מגיבי הניקוי ואפיון היעילות של ניקוי, הפיכות, בטיחות ביולוגית וביצועי הדמיה בגוף של חלון HOTS דווחו בעבודתנוהקודמת 16, שגם היא הראתה תגובה אסטרוגליאלית חיובית לאחר טיפול ב-HOTS. כאן אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב להקמת חלון HOTS שיאפשר הדמיה עמוקה בשני פוטונים טרנס-גולגולתית בעכברים בוגרים. בהכנות מייצגות, עומקי ההדמיה מגיעים ~800 מיקרון מתחת ל-pia, כמעט תואמים לאלו שניתן להשיג עם חלונות גולגולת פתוחים. חלון ה-HOTS מאפשר הדמיה מבנית עמוקה בעכברי Thy1-GFP-M ודימות סידן פונקציונלי בעכברי Thy1-GCaMP6s ערים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הטיפול בבעלי חיים ונהלי הניסויים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של מחוז גואנגדונג ובוצעו בהתאם להנחיות ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים של המכון לטכנולוגיה מתקדמת של שנזן, האקדמיה הסינית למדעים. החומרים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה מופיעים בטבלת החומרים.

הערה: פרוטוקול זה מותאם לעכברים בני 6 שבועות (משקל גוף ~20 גרם), שעובי גולגולתם הוא כ-100 מיקרון.

1. הכנת תמיסות ניקוי גולגולת

  1. הכינו תמיסת ניקוי גולגולת S1 (10% משקל/משקל EDTA, 15% משקל/משקל ל-V D-מנוז, 10% משקל/משקל סולפולן, 0.5% משקל למשקל למשקל ב-Tween 20; RI: 1.38; pH סופי: 7.0-7.4)
    1. משקלו 0.35 גרם נתרן הידרוקסיד (NaOH). הוסיפו אותו ל-20 מ"ל מים דה-יוניים בבקבוק וערבבו עד שהוא נמס לחלוטין. דבר זה מעלה את ה-pH של התמיסה, ומקל על פירוק EDTA לאחר מכן.
      הערה: NaOH הוא קורוזיבי. לבש ציוד מגן אישי מתאים (כפפות, חלוק מעבדה, מגן עיניים) וידית במכסה אדים כימית.
    2. הוסף 4 גרם אתילנדיאמינטרטראאצטית (EDTA) לתמיסת NaOH. הנח את הכוסית באמבט מים בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס וערבב ברציפות עד שה-EDTA נמס לחלוטין.
    3. קרר את התערובת לטמפרטורת החדר. הוסיפו 6 גרם D-mannose, 4 גרם סולפולן, ו-0.2 גרם Tween 20 לתמיסה. ערבבו בטמפרטורת החדר עד שכל הרכיבים מומסים לחלוטין.
    4. הוסיפו מים דה-יוניים כדי להגיע לנפח הסופי ל-40 מ"ל. ערבב היטב כדי לקבל S1.
      הערה: ניתן לאחסן את S1 בטמפרטורת החדר במשך מספר חודשים.
  2. הכינו את תמיסת ניקוי הגולגולת S2 (70% משקל/משקל ל-V D-מנוז, 5% משקל/משקל סולפולן, 0.5% משקל למשקל ל-20 בטווין; RI סופי: 1.44; pH סופי: 7.0-7.4)
    1. שקלו 28 גרם D-mannose, 2 גרם סולפולן, ו-0.2 גרם Tween 20 והעבירו אותם לבקבוק נקי.
    2. הוסף מים דה-יוניים לכ-30 מ"ל וערבב בטמפרטורת החדר עד שכל הרכיבים מומסים לחלוטין.
    3. הוסיפו מים דה-יוניים כדי להגיע לנפח הסופי ל-40 מ"ל וערבבו היטב כדי לקבל S2.
      הערה: חימום עדין (25–30 מעלות צלזיוס) וערבוב רציף מאיצים את התמוססות D-mannose. ניתן לאחסן את S2 בטמפרטורת החדר במשך מספר חודשים.

2. הכנה לניתוח

  1. אוטוקלב לכל כלי הניתוח וחטא היטב את סביבת העבודה עם 75% אלכוהול.
  2. הרדמו את העכבר על ידי הזרקה תוך-פריטונלית של 1% (w/v) נתרן פנטוברביטל (150–200 מיקרוליטר ל-20 גרם משקל גוף).
    הערה: ניתן להשתמש בחומרי הרדמה הפיכים אחרים כחלופה לפנטוברביטל נתרן.
  3. יש לעקוב אחרי עומק ההרדמה באמצעות בדיקת רפלקס צביטת האצבעות ולוודא שהעכבר מורדם במלואו לפני תחילת הניתוח.
  4. הנח את העכבר במסגרת סטריאוטקסית ואבטח את הראש עם מוטות אוזניים.
  5. שמרו על טמפרטורת גוף של 37 מעלות צלזיוס באמצעות כרית חימום.
  6. מרחו משחה עינית על שתי העיניים כדי למנוע ייבוש בקרנית.
    הערה: יש לעקוב מקרוב אחרי הנשימה והרפלקסים כדי למנוע מנת יתר של הרדמה ודיכוי נשימתי.

3. ניתוח והתקנת לוח הראש

  1. חשיפה וניקוי גולגולת (איור 1בא)
    1. הסר את הקרקפת על כל פני השטח הגבי של הגולגולת באמצעות מלקחיים דקים ומספריים כירורגיים. גזום את העור לרוחב כדי לחשוף את קצוות השרירים הטמפורליים ואת האחורי לכיוון שרירי הצוואר.
    2. הסר בעדינות את הפריוסטאום משטח הגולגולת באמצעות מלקחיים דקים.
    3. נקה את פני הגולגולת עם אפליקטור עם קצה כותנה לח וייבש את הגולגולת בזרם אוויר עדין.
    4. אם נדרשת מיקום מדויק של אזורים פונקציונליים בקורטקס המוחי, יש לסמן נקודות ייחוס במרחק של 1 מ"מ על פני הגולגולת באמצעות מכשיר סטריאוטקטי.
  2. יישום מלט דנטלי ולוחית ראש (איור 1Bב)
    1. הכינו את המלט הדנטלי לפי הוראות היצרן. מלטים דנטליים בעלי הידבקות חזקה ועמידות טובה, המתאימים לקיבוע ארוך טווח, מומלצים להבטחת חיבור יציב.
    2. מרחו שכבה דקה של מלט דנטלי על פני הגולגולת החשופים והרקמות הסובבות להגנה, והשאירו את האזור המיועד לחלון הניקוי ללא ציפוי.
      הערה: לאחר ערבוב האבקה והנוזלים של המלט הדנטלי ביחס נפח של 1:1, המתינו כ-10 שניות עד שהמלט יידבק לקצה קיסם לפני השימוש. זה מפחית את הזרימה שלו ומשפר את הטיפול. במהלך היישום, יש להניח את המלט מהפריפריה לכיוון חלון הניקוי המיועד, ולשמור על אזור החלון נקי לחלוטין ממלט. האזור המנוקה מוגדר על ידי גבול האיטום הדנטלי (מלט דנטלי וחומר רפידה רך) על פני הגולגולת. לכן, ניתן לכוונן את גודלו, אך הוא מוגבל על ידי התפרים הגולגולתיים או גודל הכובע. ליישום נפוץ בחצי כדור אחד, האזור המנוקה הוא בדרך כלל בקוטר ~3–5 מ"מ.
    3. אבטח לוחית ראש טיטניום קטנה (לקיבוע ראש למחזיק מותאם אישית במהלך ההדמיה הבאה) לגולגולת באמצעות מלט דנטלי.
      הערה: ניתן להשתמש בעיצובים שונים של פלטות ראש לקיבוע ראש. במחקר זה, השתמשו בהצלחה הן בלוחות ראש מסחריים זמינים והן בלוחות טיטניום מותאמים אישית עם שני חורים. ללא קשר לעיצוב, לוח הראש אמור לספק יציבות מכנית מספקת להדמיה נוספת ולא לחסום את חלון הניקוי/ההדמיה המיועד.

4. יצירת חלון HOTS

  1. אטום את הגולגולת בחומר ריפוד רך דנטלי שמתקשה בעצמו (איור 1Bc)
    1. לאחר שהמלט הדנטלי התייבש לגמרי לכ-5 דקות, כסה את שכבת המלט, למעט אזור חלון הניקוי, בשכבה דקה של חומר רך דנטלי ליצירת אטימה רציפה מעל הגולגולת.
      הערה: חומר הריפוד הרך משפר את האיטום ומפחית דליפות במהלך חשיפה ממושכת לחומרי ניקוי.
    2. עצב את חומר הריפוד הרך הדנטלי המתקשה באופן חלק סביב שולי החלון המתוכנן, וליצור משטח איטום שטוח לכיסוי.
  2. התקנת הכובע (איור 1Bd)
    1. חתוך את ראש הפיפטה הפלסטית חד-פעמית (פוליאתילן, PE) כדי ליצור כובע גלילי קטן עם חלק עליון סגור ותחתית פתוחה. PE מציג יציבות כימית טובה ואינו מראה התדרדרות או תגובה נראית לעין עם תמיסות ניקוי S1 או S2 במהלך תהליך הניקוי.
      הערה: הכובע שנחתך מראש נורת פיפטה בהעברה בנפח 1 מ"ל הוא בדרך כלל בקוטר~12 מ"מ ובגובה ~10–14 מ"מ.
    2. הנח את המכסה מעל אזור חלון הניקוי המיועד ולחץ אותו בעדינות על חומר הבטן הרך.
      הערה: הכובע גדול יותר מהאזור שנקרה, וחלק מהגולגולת שמתחת לכיסוי שאינו משמש לאזור הנקי, ניתן להניחה עם אטם דנטלי כדי להגן על הגולגולת מפני ניקוי.
    3. מקבע את המכסה במקום באמצעות חומר ריפוד רך נוסף סביב הבסיס, כדי לוודא שהחיבור בין המכסה לגולגולת אטום לחלוטין.
    4. השתמש במזרק של 1 מ"ל עם מחט של 26 גרם כדי לנקב חור קטן אחד או יותר בדופן הכיסוי שישמש כפתחים להזרקה ולהוצאת תמיסות ניקוי.
    5. תן לחומר הליינר הרך להתייבש לחלוטין. וודא שהמכסה מחובר היטב ושאין פערים נראים לעין בממשק.
    6. הוציאו את העכבר מהמסגרת הסטריוטקסית והניחו אותו בכלוב חם עד להחלמה מלאה מההרדמה.
      הערה: זהו נקודת עצירה מתאימה. בצע את תהליך ניקוי הגולגולת לאחר שהמלט הדנטלי וחומר הריפוד הרך התייבשו לחלוטין. במרפאתנו, ניתן להתקין את חלון ה-HOTS אחר הצהריים, ואחריו ניקוי הגולגולת בבוקר שלמחרת, לאחר שהעכבר החלים לחלוטין מהניתוח. חלופה נוספת היא להתחיל בניקוי הגולגולת כ-15 דקות לאחר התקנת חלון HOTS. במהלך התקנת חלון HOTS, הגולגולת נשארת שלמה מבחינה מבנית, אם כי הפריוסטאום מוסרת.

5. ניקוי גולגולת בעכברים ערים שמתנהגים בחופשיות

הערה: במהלך שלב הניקוי, העכבר נשאר ער ומתנהג בחופשיות בכלוב הבית שלו. השתמש בהרדמה איזופלורנית קצרה בלבד להזרקת תמיסה והחלפה דרך המכסה המותקן על הראש.

  1. טעינה ראשונית של S1
    1. הנח את העכבר בתא השראה וגרם להרדמה קצרה עם 3–4% איזופלורן באוויר בקצב זרימה של 300–500 מ"ל לדקה עד שהעכבר הופך לבלתי נייד. לא בוצעה הרדמה תחזוקתית.
    2. הרסן בעדינות את העכבר ומייצב את הכובע המותקן על הראש ביד.
    3. השתמש במזרק של 1 מ"ל עם מחט של 26 גרם כדי להזריק לאט כ-1 מ"ל S1 למכסה המותקן על הראש.
    4. החזירו את העכבר לכלוב ביתי ותנו ל-S1 לפעול על הגולגולת במשך 2 שעות.
      הערה: במהלך הדגירה של S1 ו-S2, יש לאחסן את העכבר בנפרד בכלוב סטנדרטי.
  2. עונה 1 מרעננת
    1. שעתיים לאחר הטעינה הראשונית של S1, יש להרדים שוב את העכבר בקצרה עם איזופלורן.
    2. שואב S1 מהמכסה באמצעות מזרק של 1 מ"ל.
    3. מלאו את הפקק ב-S1 טרי בעזרת מזרק של 1 מ"ל.
    4. החזירו את העכבר לכלוב ותנו ל-S1 לפעול עוד שעתיים.
    5. חזרו על צעדים 5.2.1–5.2.4 לאחר 4 שעות לאחר הטעינה הראשונית כדי לבצע החלפה שנייה של S1.
    6. לאחר ההחלפה השנייה, יש לאפשר ל-S1 להמשיך לפעול עד שיגיע זמן חשיפה כולל של 6 שעות ל-S1.
      הערה: פרוטוקול זה (1 מ"ל S1 ל-6 שעות) מותאם לעכברים בני 6 שבועות (~20 גרם). לבעלי חיים מבוגרים עם גולגולת עבה יותר, זמן הדגירה של S1 עשוי להיות מוארך בהדרגה. כל התאמה חייבת להיות מלווה במעקב צמוד אחר רווחת בעלי החיים ואיכות הדמיה סופית כדי למנוע ריכוך מופרז של הגולגולת.
  3. יישום S2
    1. לאחר 6 שעות של טיפול ב-S1, יש להרדים את העכבר בקצרה עם איזופלורן.
    2. שואף S1 מהמכסה עם מזרק של 1 מ"ל והחליפו ב-0.7 מ"ל S2.
    3. החזירו את העכבר לכלוב ואפשרו ל-S2 לפעול על הגולגולת במשך שעה כדי לשפר עוד יותר את השקיפות ולספק התאמת מקדם השבירה.
      הערה: בתנאים אלה, שלב הניקוי המשולב של S1 ו-S2 בדרך כלל מסתיים בתוך 7 שעות (6 שעות S1 + 1 שעות S2). ניקוי מוצלח מצוין על ידי משטח גולגולת שקוף לעין ללא דימום. הגולגולת עלולה להתרכך מעט לאחר הניקוי; כאשר נוגעים בעדינות במלקחיים דקים, הוא אמור להראות עמידה קלה אך להישאר שלם. הימנע מלחץ מופרז על פני הגולגולת.

6. הכנה להדמיה

  1. הרדמה וקיבוע ראש להדמיה
    1. בסיום דגירה של S2, יש להרדים את העכבר על ידי הזרקה תוך-צפיקית של 1% (עם וות) נתרן פנטוברביטל ב-150–200 מיקרוליטר ל-20 גרם משקל גוף.
    2. אשר הרדמה מספקת באמצעות בדיקת רפלקס צביטת האצבעות.
    3. תקבע את ראש העכבר על ידי הברגת לוח הראש הטיטניום למחזיק ראש בעיצוב מותאם אישית.
    4. מרחו משחה עינית על שתי העיניים כדי למנוע ייבוש במהלך ההדמיה.
    5. שמרו על טמפרטורת גוף של ~37°C באמצעות כרית חימום.
  2. חשיפת פני השטח של הגולגולת שננקו (איור 1Be,Bf)
    1. שאיפת תמיסת S2 מהמכסה באמצעות מזרק.
    2. חתכו בזהירות את הכיסוי הפלסטי עם מספריים עדינים והסירו אותו בעזרת מלקחיים, כדי למנוע כוח מופרז על הגולגולת.
    3. הסר בעדינות את חומר האייליינר הרך שמקיף את חלון הניקוי כדי לחשוף במלואו את אזור הגולגולת הנקי.
    4. מרחו טיפה קטנה של תמיסת S2 ישירות על הגולגולת המנוקה כדי לשמש כמדיום טבילה תואם מקדם שבירה במהלך ההדמיה.
      הערה: במחקר זה נעשה שימוש במטרות טבילה סטנדרטיות במים, כולל יעד 16×/NA 0.8 (N16XLWD-PF, ניקון) ויעד 25×/NA 1.1 (N25X-APO-MP, Nikon). כאשר משתמשים ב-S2 כמדיום הטמעה, כוון את קולר התיקון של המטרה, אם זמין, להגדרה המתאימה למקדם השבירה של S2 כדי להפחית סטיות כדוריות. בניסויים כאן, הגולגולת המנוקה שמרה על בהירות אופטית מספקת לכ-2 שעות של הדמיית שני פוטונים, ללא ירידה ברורה באיכות התמונה במהלך תצפית על עמוד השדרה הדנדריטית. לאחר כ-2 ימים, נדרש ניקוי מחדש להמשך הדמיה, וזמן הניקוי היה קצר משמעותית מהניקוי הראשוני, מה שאיפשר הדמיה יעילה וחוזרת מאותו חיה.
  3. הדמיית ראש ערה קבועה (אופציונלי)
    הערה: להדמיה ערה, התרגל את העכבר לקיבוע הראש לפני הניסוי. הרדימו את העכבר בקצרה עם איזופלורן, ואז אבטחו את פלטת הראש המושתלת למחזיק למשך 15–30 דקות בכל טיפול, וחזרו על כך במשך 2–3 ימים.
    1. השתמשו בהרדמה איזופלורנית קצרה כדי להקל על הטיפול. קבע רק את לוח הראש המושתל למחזיק הרכב, כדי לאפשר לגוף לנוע בחופשיות על גלגל הרצף או הפלטפורמה.
    2. עקבו אחרי השלבים 6.2.1–6.2.4 לחשיפת פני הגולגולת המנוקים והחלו S2 לפני ההדמיה.

7. התאוששות

  1. לאחר ההדמיה, שאופים בעדינות והסירו כל תמיסת S2 שנותרה מפני הגולגולת.
  2. שטוף את אזור הגולגולת המנוקה עם תמיסת מלח עם זרחן (PBS) מספר פעמים כדי לקדם שיקום הדרגתי של מצב הגולגולת האטום הטבעי.
  3. ייבשו בעדינות נוזלים שנותרו מהגולגולת ומהרקמה הסובבת באמצעות מטשי כותנה סטריליים, כדי למנוע נזק מכני לעצם.
  4. אם החיה נשמרת בחיים לניסויים הבאים, יש להניח שכבה של חומר האיטום הביוקומטיבי Kwik-Cast (WPI) מעל חלון הגולגולת כדי להגן על העצם במהלך תקופת ההישרדות.
  5. תן לשכבת ההגנה להתייבש לחלוטין.
  6. נתק את העכבר ממחזיק הראש והניח אותו בכלוב חם. עקבו אחרי החיה עד שהיא מתאוששת לחלוטין מההרדמה, ואז החזירו אותה לכלוב הבית שלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בהתאם לפרוטוקול, חלון הגולגולת האופטי השקוף (HOTS) המותקן על הראש מאפשר הדמיה עמוקה בשני פוטונים טרנס-גולגולתיים בעכברים בוגרים תוך שמירה על שלמות הגולגולת. הכנה מוצלחת מתבטאת בשתי תוצאות עיקריות: (1) כלי הדם הקורטיקליים נראים בבירור דרך הגולגולת לאחר ניקוי הגולגולת (איור 1Bו), ו-(2) הגולגולת המנוקה מראה שקע קל תחת לחץ עדין, מה שמעיד על דקלציפיקציה יעילה והתרופפות קולגן. חלון ה-HOTS חייב להיות ממוקם מעל הגולגולת השלמה ורחוק מהתפרים כדי למנוע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטת HOTS עושה שימוש בחלון גולגולת שקוף אופטית (HOTS) המותקן על הראש, המשלב כיסוי המכיל תגובות ניקוי עם הליך ניקוי גולגולת דו-שלבי, כדי לשפר את שקיפות הגולגולת בעכברים בוגרים תוך שמירה על שלמות הגולגולת. על פי הפרוטוקול הסטנדרטי (6 שעות ב-S1 ו-1 שעות ב-S2 לעכברים בני 6 שבועות), החלון שנוצר תמך באופן אמין בהדמיה עמוקה של שני פוטונים טרנס-גולגולתיים ואפשר לראות מבנים עד ~800 מיקרון מתחת ל-PIA.

מספר שלבים פרוצדורליים הם קריטיים להשגת חלון יציב ושקוף. הגולגולת חיי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המו"פ המרכזית לחדשנות במדע וטכנולוגיה בצ'ונגצ'ינג (CSTB2024TIAD-STX0004), קרן המחקר הרפואי של שנזן (D2404004), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (62475278, 62305369, 62405351, 92359303); קרן המחקר הבסיסי והיישומי של מחוז גואנגדונג (2024A1515012517, 2020B121201010); אגודת קידום החדשנות לנוער של האקדמיה הסינית למדעים (2023377); תוכנית המחקר היסודי של שנזן (RCJC20200714114433058, RCYX20210609104445093, JCYJ20241202124924033, ZDSY20130401165820357). אנו מודים לפרופ' יאנג ג'אן (מכון לקוגניציה מוחית ומחלות מוח, מכוני הטכנולוגיה המתקדמת של שנזן, האקדמיה הסינית למדעים, שנזן, סין) על סיפוק עכברי Thy1-GFP-M.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פיפטה חד-פעמית בנפח 1 מ"לBeijing Biotopped  Science
  & טכנולוגיה   Co., Ltd.		לא זמין
מלט דנטלישנחאי רונגשיאנג לחומרי שיניים בע"מ.לא זמין
D-mannoseמקליןD813082
EDTAאלדיןEl 16428
איזופלוראןהנעה אחוריתלא זמין
קוויק-קאסטWPIלא זמיןאיטום ביוקומיטיבי
NaOHמקליןS832169
ריפוי עצמי        Dentist          חומר רפידת רךיאנגמהו ביוטכנולוגיה (הבי) בע"מלא זמין
נתרן פנטוברביטלביופייקלא זמין
מכשיר סטריאוטקסיהנעה אחוריתלא זמין
מזרק חד-פעמי סטרילימיננקלא זמין1 מ"ל; מחט 26 G
סולפולןמקליןS817950
עכברי Thy1-GFP-Mלא זמיןמסופק  מאת פרופ' יאנג ג'אן
Thyl-GCaMP6s  עכבריםמעבדת ג'קסון
גיל 20סיגמא-וטקV900548
מטרת טבילה במים ניקוןN25X-APO-MP25×/NA 1.1 יעד 
מטרת טבילה במים ניקוןN16XLWD-PF16×/NA 0.8 יעד 

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

In Vivo
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים