מאמר מחקר

הקשר בין ביטוי MPO לבין המיקרו-סביבה החיסונית בסרטן השד: תובנות מניתוחים ביו-אינפורמטיים ובניתוחים של תא בודד

38 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71189

⸱

14 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Traditional Chinese Medicine, Aerospace Center Hospital, 2Third Affiliated Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 3China Academy of Chinese Medical Sciences, 4Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, 5College of Traditional Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מציג תהליך עבודה (workflow) הניתן לשחזור בתחומי הביואינפורמטיקה והניתוח ברמת התא הבודד (single-cell), במטרה לבחון קשרים בין ביטוי של myeloperoxidase (MPO) לבין מאפיינים חיסוניים/מיאלואידיים בסרטן השד. מכיוון שהניתוחים מבוססים על מאגרי נתונים ציבוריים ושיטות in silico, הממצאים מפורשים כחקרים ראשוניים המיועדים להצבת היפותזות.

תקציר

סרטן השד נותר סיבה מרכזית לתמותה הקשורה לסרטן, ותזרימי עבודה חישוביים גששיים יכולים לסייע בתעדוף סמנים הקשורים למערכת החיסון לצורך חקירה מעמיקה. כאן, השתמשנו בנתוני טרנסקריפטומיקה מסוג bulk של סרטן שד פולשני ממאגר ה-cancer genome atlas (TCGA-BRCA) ובמאגר הנתונים הציבורי של תאים בודדים GSE161529 כדי לבחון קשרים בין ביטוי של myeloperoxidase (MPO), תוצאים קליניים, חדירה חיסונית, מתילציה, הערות של רגולטורים במעלה הזרם, דפוסי ביטוי בתאים בודדים, תוצאי רגישות ל-knockdown וירטואלי, אחזור אינטראקציות תרופה-גן, והערות של ספיגה, התפלגות, מטבוליזם, הפרשה ורעילות (ADMET). ביטוי MPO היה נמוך יותר ברקמות סרטן השד מאשר ברקמות סמוכות שאינן גידוליות. ביטוי MPO גבוה יותר היה קשור למרווח ארוך יותר ללא התקדמות המחלה, בעוד שהקשרים שלו להישרדות כוללת ולהישרדות ספציפית למחלה לא היו מובהקים סטטיסטית. ניתוח של עקומת מאפייני תגובה (ROC) העלה הפרדה בין גידול לרקמה נורמלית בתוך מאגר הנתונים הציבורי שנבדק, אך אין לפרש זאת כתיקוף אבחנתי קליני. ניתוחי דה-קונבולוציה חיסונית והעשרה הצביעו על כך שביטוי MPO עקב בעיקר אחר מאפיינים טרנסקריפציונליים הקשורים למערכת החיסון ולתאי מיאלואיד, ולא ביסס רגולציה פנימית של הגידול על המיקרו-סביבה החיסונית. ברזולוציה של תאים בודדים, אות ה-MPO היה דליל, כאשר זוהו רק 85 תאים חיוביים ל-MPO לפני הרחבת השכונה המבוססת על k-nearest neighbor (KNN). אות MPO גילוי ומדדים הקשורים ל-MPO פורשו בזהירות כיוון שהם עשויים להיות מושפעים מביטוי דליל, אי-ודאות באנוטציה של סוג התא, dropout, doublets או RNA סביבתי. knockdown וירטואלי In silico העלה שינויים טרנסקריפציונליים מועמדים הקשורים למערכת החיסון ולדלקת, אך תוצאות אלו נחשבו לגששיות ודורשות תיקוף. אחזור תרופה-גן המבוסס על מאגר נתוני אינטראקציות תרופה-גן (DGIdb) ואנוטציית ADMET שימשו רק כאנוטציות כימיות ראשוניות ולא פורשו כראיות טיפוליות. באופן כללי, מחקר זה מספק תזרימי עבודה ב-in silico הניתנים לשחזור להצבת היפותזות לגבי מאפיינים חיסוניים/מיאלואידיים הקשורים ל-MPO בסרטן השד, אשר דורשים תיקוף בקוהורט חיצוני ואישור ניסויי.

מבוא

סרטן השד הוא ממאירות קשורה למערכת החיסון ההטרוגנית מאוד1. התקדמות המחלה, הסיכון לחזרה ולגרורות, והתגובה לטיפול קשורים באופן הדוק להרכב ולמצב התפקודי של המיקרו-סביבה החיסונית של הגידול (TIME)2. למרות אופטימיזציה מתמשכת של אסטרטגיות טיפול מקיפות, חלק מהמטופלים עדיין חווים התקדמות או חזרה של המחלה, מה שמדגיש את הצורך הדחוף בזיהוי סמנים ביולוגיים מולקולריים המאפיינים את מצב ה-TIME ותומכים בסיווג סיכונים, תוך הבהרת המנגנונים שבבסיסם.

מיאלופרוקסידאז (MPO) הוא פרוקסידאז המכיל ההם, המבוטא בעיקר בניוטרופילים, ובמידה פחותה יותר, במונוציטים ובמקרופאגים. באמצעות ייצור של חומצה היפוכלורית ומחמצנים ריאקטיביים אחרים, MPO תורם להגנה אנטימיקרוביאלית אך עשוי גם לקדם פגיעה חמצונית ברקמות ודלקת כרונית. בסרטן, נראה כי המשמעות הביולוגית של MPO תלויה בהקשר3. מצד אחד, עקה חמצונית המתווכת על ידי MPO נקשרה לקרצינוגנזה ולהתקדמות הגידול באמצעות נזק ל-DNA, חמצון של ליפידים וחלבונים, איתות דלקתי ועיצוב מחדש של המיקרו-סביבה הגידולית4,5,6. מצד שני, חדירה של תאי מערכת חיסון מולדת או תאי מיאלואיד חיוביים ל-MPO נקשרה לפרוגנוזה חיובית או לפעילות חיסונית אנטי-גידולית בהקשרי גידולים מסוימים7,8,9. ממצאים סותרים לכאורה אלו מרמזים כי המשמעות הקלינית והביולוגית של MPO עשויה להיות תלויה בסוג הגידול, בשלב המחלה, במקור התאי של ה-MPO ובהרכב החיסוני של המיקרו-סביבה הגידולית. עם זאת, דפוס הביטוי והרלוונטיות הפרוגנוסטית של MPO בסרטן השד, במיוחד ברמת התא הבודד, טרם אופיינו במלואם.

מיקרו-סביבת החסינות של הגידול (TIME) מכילה מדורים הטרוגנים של תאי מיאלואיד, לימפואיד, סטרומה ואפיתל10. MPO מקושר באופן קלאסי לנויטרופילים ולתאים אחרים משושלת המיאלואיד, ולכן אותות הקשורים ל-MPO בפרופילים של גידולים ב-bulk עשויים לשקף את הרכב תאי החיסון ולא את פעילות פנימית של תאי הגידול10. בסרטן השד, התפלגות אות ה-MPO במאגרי נתונים של bulk ושל תא בודד, הקשר שלו להערכות של חדירת תאי חיסון, ומגבלות השחזור של ניתוחים חישוביים המשכיים נותרו לא מאופיינים מספיק. לכן, מחקר זה מתייחס ל-MPO כסמן הקשור למערכת החיסון לצורך פיתוח תהליכי עבודה חקוריים, ולא כווסת סיבתי מוכח של ה-TIME או כמטרה טיפולית מאומתת. בהשוואה לניתוחי ביטוי דיפרנציאלי של קוהורט בודד או הערכות חדירת תאי חיסון מפלטפורמה בודדת, תהליך עבודה משולב המשלב טרנסקריפטומיקה של bulk, דקונבולוציה חיסונית, אנוטציית מתילציה, מיפוי של תא בודד ופרטורבציה חישובית, יכול לספק מבט חקורי רחב יותר על ההקשר החיסוני הקשור לגן. גישה זו שימושית לתיעדוף סמנים מועמדים וליצירת היפותזות הניתנות לבדיקה, במיוחד כאשר מאגרי נתונים ניסיוניים עדיין אינם זמינים. עם זאת, אינטגרציה חישובית כזו אינה יכולה כשלעצמה לקבוע מקור תאי, סיבתיות, פעילות פרמקולוגית או תועלת קלינית. עם התקדמותן של קוהורטות סרטן ציבוריות רחבות היקף וטכנולוגיות טרנסקריפטומיקה של תא בודד, ניתן להשתמש בגישות ביו-אינפורמטיות כדי לבחון קשרים בין ביטוי גנים, תוצאים קליניים, הרכב תאי חיסון ומצבים טרנסקריפציונליים הן ברמת האוכלוסייה והן ברמת התא הבודד11. שיטות פרטורבציה חישוביות המבוססות על רשתות ויסות גנים של תא בודד עשויות לספק מידע נוסף ליצירת היפותזות בנוגע לרגישות טרנסקריפציונלית הקשורה לגנים12,13. לפיכך, מחקר זה נועד לאפיין את דפוס הביטוי, הקשר להישרדות, ההקשר החיסוני/מיאלואידי, פרופיל המתילציה, ההתפלגות בתא בודד ופרופיל הפרטורבציה החישובית החקורי של MPO בסרטן השד. תהליך העבודה הכולל מוצג ב-איור 1.

פרוטוקול

רכישת נתונים ממאגר ה-TCGA

נתוני ריצוף RNA ומידע קליני עבור קוהורט ה-TCGA breast invasive carcinoma (TCGA-BRCA) הושגו מפורטל ה-genomic data commons14. נתוני RNA-seq בפורמט transcripts per million (TPM) מתוך תהליך העבודה של STAR הופקו יחד עם הערות קליניות תואמות. דגימות RNA-seq שחסר עבורן מידע קליני תואם הוצאו מהניתוח. עבור ניתוחים מבוססי ביטוי, ערכי ה-TPM הומרו ל-log2(TPM + 1). ביטוי MPO הופק באמצעות סמל הגן MPO ומזהה הגן של Ensembl המספר ENSG00000005381.8. עבור ניתוחים הדורשים חלוקה לקבוצות MPO-high ו-MPO-low, נכללו רק דגימות גידול של TCGA-BRCA, ודגימות נורמליות סמוכות הוצאו מהקצאה לקבוצות. דגימות הגידול חולקו לפי ערך החציון של ביטוי MPO שהומר ל-log2(TPM + 1) בקרב דגימות גידול של TCGA-BRCA. דגימות עם ביטוי MPO הגבוה או השווה לחציון הוקצו לקבוצת MPO-high, בעוד שדגימות שערכן היה נמוך מהחציון הוקצו לקבוצת MPO-low. אסטרטגיית חלוקה זו המבוססת על חציון שימשה לניתוח הישרדות, ניתוח ביטוי דיפרנציאלי, ניתוח העשרה, חלוקה לפי מתילציה והשוואות העשרה של תאי חיסון, אלא אם צוין אחרת. מאפיינים פתולוגיים קליניים, כולל מין, גיל, מוצא אתני, שלב T פתולוגי, דרגה היסטולוגית, תת-סוג PAM50, שלב פתולוגי, סטטוס הגידול, ונקודות קצה של הישרדות, כולל הישרדות כוללת (OS), מרווח ללא התקדמות (PFI) והישרדות ספציפית למחלה (DSS), נותחו באמצעות R גרסה 4.2.1.

שליפת תמונות אימונוהיסטוכימיה ציבוריות

תמונות מייצגות של צביעה אימונוהיסטוכימית (IHC) ל-MPO מרקמת שד נורמלית סמוכה ומרקמת סרטן השד שימשו כרפרנסים איכותיים לרמת החלבון. תמונות אלו לא נכללו בניתוחים מורפומטריים כמותיים או בניתוחים סטטיסטיים. האזורים המסוגרים בריבוע מצביעים על אזורים המוצגים בהגדלה גבוהה יותר. סרגלי קנה מידה מציינים 100 µm בתמונות בהגדלה של 20× ו-50 µm בתמונות בהגדלה של 40×.

ניתוח מתאם ביטוי

מערך הנתונים TCGA-BRCA שימש לבחינת גנים בעלי ביטוי משתנה במקביל לביטוי של MPO בסרטן השד. מקדמי מתאם פירסון (Pearson correlation coefficients) ברמה הגנומית חושבו בין MPO לבין גנים מקודדי חלבון, ו-30 הגנים בעלי המתאם החיובי הגבוה ביותר ו-30 הגנים בעלי המתאם השלילי הגבוה ביותר נבחרו להצגה חזותית. עבור ניתוחי מתאם הכוללים מספר גנים שנבדקו, ערכי p נומינליים הותאמו באמצעות שיטת שיעור התגליות השגויות של Benjamini-Hochberg. רשת אינטראקציות חלבון-חלבון (PPI) הקשורה ל-MPO נבנתה באמצעות מסד הנתונים של כלי החיפוש לאחזור גנים/חלבונים באינטראקציה (STRING), כאשר זוגות חלבונים שהפגינו ציוני אינטראקציה הגבוהים מ-0.40 נשמרו להצגה חזותית15.

ניתוח העשרה פונקציונלית

גנים בעלי ביטוי Differentially expressed genes (DEGs) זוהו על ידי השוואה בין קבוצות הגידולים MPO-high ו-MPO-low של TCGA-BRCA, תוך שימוש בסף של |log2FC| > 1 וערך p-value מתוקנן לפי Benjamini-Hochberg של < 0.05. ניתוח העשרה פונקציונלית של ה-DEGs בוצע באמצעות חבילת ה-R שנקראת clusterProfiler גרסה 4.4.4, וכלל ניתוחים של תהליכים ביולוגיים, רכיבים תאיים ותפקודים מולקולריים של gene ontology (GO), וניתוחי מסלולים של Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG)16,17,18,19,20. מונחי GO ו-KEGG מועשרים נחשבו למשמעותיים כאשר ערך ה-p-value המתוקנן היה < 0.05.

ניתוח העשרה של קבוצות גנים (GSEA) בוצע באמצעות רשימת גנים מדורגת מראש על בסיס סטטיסטיקות של ביטוי דיפרנציאלי בין קבוצות MPO-high ו-MPO-low. נעשה שימוש באוסף הנתיבים הקנוניים c2.cp.all.v2022.1.Hs.symbols.gmt מתוך MSigDB C2, המתאים ל-MSigDB v2022.1.Hs ומכיל 3,050 קבוצות גנים21,22. מונחים מועשרים נחשבו למשמעותיים בהתאם לערך p מתוקנן לפי Benjamini–Hochberg של < 0.05, ערך FDR q של < 0.25, ו- |normalized enrichment score| > 1. במידת הרלוונטיות, חישובי Z-scores עבור מונחים מועשרים באופן משמעותי בוצעו באמצעות חבילת GOplot לצורך ויזואליזציה.

ניתוח של העשרה של תאי חיסון בגידוליים

רכיבים חיסוניים וסטרומליים בקוהורט ה-TCGA-BRCA הוערכו באמצעות אלגוריתם ESTIMATE שיושם בחבילת R‏ estimate גרסה 1.0.13. נתוני ביטוי שעברו טרנספורמציה של Log2(TPM + 1) שימשו כקלט, וחושבו מדד חיסוני (immune score), מדד סטרומלי (stromal score) ומדד ESTIMATE עבור כל דגימת גידול. TIMER/TIMER2.0 שימשו להערכת הקשרים בין ביטוי MPO לרמות חדירה מוערכות של אוכלוסיות תאי חיסון עיקריות בקוהורט ה-TCGA-BRCA, כולל תאי B, תאי CD8+ T, תאי CD4+ T, מקרופאגים, נויטרופילים ותאים דנדריטיים23,24,25. תוצאות מבוססות TIMER פורשו כהערכות חדירה חיסונית שהופקו מהמשאב המקוון התואם. לצורך ניתוח העשרה של תאי חיסון בקרב 24 סוגי תאי חיסון, בוצע ניתוח העשרת קבוצות גנים לדגימה בודדת (ssGSEA) באמצעות חבילת R‏ GSVA גרסה 1.46.026. מטריצת חתימת תאי החיסון LM22 ששימשה לדה-קונבולוציה מבוססת CIBERSORT של 22 סוגי תאי חיסון מופיעה ב-Supplementary Table 1. מתאמים בין ביטוי MPO למדדי העשרה של תאי חיסון הוערכו באמצעות מתאם הדרג של Spearman. הבדלים במדדי העשרה של תאי חיסון בין קבוצות הגידולים שהוגדרו כמסמנות MPO-high ו-MPO-low לפי החציונה הושוו באמצעות מבחן סכום הדרגים של Wilcoxon. עבור ניתוחים הכוללים מספר סוגי תאי חיסון, ערכי ה-p תוקנו באמצעות שיטת Benjamini–Hochberg לשיעור התגליות השגויות (false discovery rate).

מתילציה של ה-DNA בגן MPO

דפוסי מתילציה של DNA בתוך הלוקוס של MPO הוערכו באמצעות MethSurv. ערכי בטא של מתילציית CpG וקשרים להישרדות עבור TCGA-BRCA הופקו מפלטפורמת MethSurv. אתרי CpG נבחרים הקשורים ל-MPO הוצגו ויזואלית, והקשרים שלהם לתוצאות הישרדות הוערכו באמצעות פלטי ניתוח ההישרדות שסופקו על ידי MethSurv27. עבור ניתוחים הכוללים מספר אתרי CpG, ערכי ה-p הותאמו על פני אתרי ה-CpG הנבדקים הקשורים ל-MPO באמצעות שיטת Benjamini-Hochberg לשיעור התגליות השגויות (false discovery rate). ניתוחי מתילציה אלו פורשו כאנוטציות אפיגנטיות גישושיות.

בניית רשת PPI וניתוח מתאמים של גנים הקשורים לנויטרופילים

כדי לבחון את הקשר בין MPO לביולוגיה הקשורה לנויטרופילים, בוצע ניתוח רשת סיסטמטי. קבוצת גנים הכוללת מתווכים ידועים של הפעלת נויטרופילים ותהליכים דלקתיים נלווים נבחרה מתוך הספרות המחקרית העדכנית. רשימת הגנים המלאה הקשורה לנויטרופילים מופיעה ב-Supplementary Table 2. סמלי הגנים הותאמו לסמלים הרשמיים, כפילויות הוסרו, והגנים הזמינים הופגשו עם מטריצת הביטוי של TCGA-BRCA לפני ניתוח STRING/PPI, תיעדוף גני מפתח (hub genes) וניתוח מתאם בין MPO לגני המפתח. רשת ה-PPI בין גנים אלו נבנתה באמצעות מאגר הנתונים STRING (גרסה 11.5) עם סף ציון אינטראקציה ברמת ביטחון בינונית (>0.40). גני מפתח ברשת זו תועדפו באופן אלגוריתמי על בסיס מרכזיות דרגה (degree centrality), המכמתת את מספר האינטראקציות הישירות לכל צומת. 20 הגנים בעלי ציוני הדרגה הגבוהים ביותר נבחרו לניתוח מתאם המשך.

בהמשך, פרופילי הביטוי של גני ה-hub הללו ושל MPO הופקו מתוך מערך הנתונים הטרנסקריפטומיים TCGA-BRCA. הקשר בין MPO לבין כל גן hub הוערך סטטיסטית באמצעות מתאם דרג של Spearman. כדי לאפיין את דפוסי המתאם בין גני ה-hub עצמם, חושבה מטריצת מתאם Spearman בזוגות עבור כל דגימות הגידול. ניתוחי מתאם אלו סיפקו את הבסיס הכמותי לוויזואליזציות הבאות, כולל תרשים lollipop של מתאמי MPO-hub gene ותרשים מיתרים/מפת חום (chord diagram/heatmap) המתארים את דפוסי המתאם בין גני ה-hub.

חיזוי של גורמי שעתוק ומולקולות miRNA במעלה הזרם המכוונים ל-MPO

בסיס הנתונים KnockTF (https://bio.liclab.net/KnockTF/index.php)28,29, בסיס הנתונים ChIP (http://chip-atlas.org/)30,31, ובסיס הנתונים GTRD32,33 (https://gtrd.biouml.org/#!) שימשו לחיזוי ה-TFs שהם מטרות של MPO. בנוסף, בסיס הנתונים TargetScan (https://www.targetscan.org/vert_80/) נוצל לחיזוי אתרי קישור פוטנציאליים של miRNA המכוונים ל-MPO. דיאגרמות ון נוצרו באמצעות אתר MicroBioinformatics (https://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html)34.

ניתוח של תא בודד של MPO

סט הנתונים הספציפי GSE161529 מקורו ב-Gene Expression Omnibus (GEO). בעיבוד המקדים של הנתונים בוצע תחילה סינון ברמת התא כדי להוציא תאים באיכות נמוכה — תאים שענו על אחד מהקריטריונים הבאים: ביטוי של גנים מיטוכונדריאליים העולה על 25%, ספירת מזהה מולקולרי ייחודי (UMI) כוללת נמוכה מ-5000, או פחות מ-2500 גנים שזוהו. לאחר מכן, תוקנו זיהומי RNA סביבתיים ואפקטים טכניים של אצוות (batch effects)35. ניתוח רכיבים ראשיים (PCA) בוצע לצורך הפחתת ממדים כדי להעריך דמיון תאי, ולאחריו UMAP לצורך קיבוב (clustering) וויזואליזציה של תאים. לאחר מכן, בהתאם לגנים המסמנים (marker genes) הטיפוסיים של תאים, קובצו שונים סווגו לסוגי תאים11. סט הגנים הקשור ל-MPO ששימש לדירוג חתימה של תא בודד מופיע ב-Supplementary File 1. לפני הדירוג, סמלי הגנים הותאמו לסמלי גנים רשמיים, רשומות כפולות הוסרו, והגנים הזמינים נחפפו עם מטריצת הביטוי של GSE161529. AUCell, Seurat AddModuleScore ו-ssGSEA שימשו לחישוב ציוני MPO עבור כל תא. הציונים משלושת השיטות עברו נורמליזציית Z-score, נסקלו לטווח בר-השוואה, ושולבו כדי ליצור ציון MPO משולב עבור ניתוחים תיאוריים המשכיים. רשתות של אינטראקציה בין תאים נבחנו כדי להשוות דפוסי תקשורת משוערים של ליגנד-רספטור המערבים תאי גידול אפיתליאליים המחולקים לפי אות MPO-associated וסוגי תאי שותפים מגוונים. תוצרים אלו פורשו כדפוסי תקשורת תיאוריים ולא כראיה לכך שתאים המבטאים MPO מתווכים באופן ישיר תקשורת בין-תאית.

השתקה וירטואלית ברמה התאית של MPO ו- ניתוח העשרה של מסלולים באמצעות scTenifoldKnk

ביצוע השהתקה וירטואלית של MPO ברמה של תא בודד בוצע על ידי שילוב של Seurat ו-scTenifoldKnk. לאחר בקרת איכות סטנדרטית (200–6,000 גנים לתא; פракציה מיטוכונדריאלית < 10%), הנתונים עברו נורמליזציה לוגריתמית, ו-2,000 גנים עם שונות גבוהה נבחרו לצורך הפחתת ממדים ואשכול (clustering). כדי להעשיר את ההקשרים הרלוונטיים ל-MPO, נשמרו תאים שקיבלו ציון ב-50% העליונים עבור מודול גנים של myeloid/neutrophil. מתוך תאים אלה, הוגדרה תת-קבוצה של שכנות MPO על ידי הרחבה מגרעיני MPO-חיוביים באמצעות k = 40 השכנים הקרובים ביותר במרחב PCA. תת-הקבוצה המורחבת לא נחשבה כאוכלוסייה טהורה של MPO-חיוביים, ולא הוסקו מסקנות לגבי פרופורציות של סוגי תאים משלב הרחבת ה-KNN זה. תת-קבוצה זו הועברה לניתוח השהתקה וירטואלית באמצעות scTenifoldKnk, תוך שימוש באיחוד של הגנים בעלי השונות הגבוהה ו-MPO (המבוטא ב-≥25 תאים) כקבוצת הגנים. גנים שהשתנו באופן מובהק זוהו (FDR < 0.05, לאחר תיקון BH). הגנים שהתקבלו נותחו בהמשך להעשרה פונקציונלית ב-GO Biological Processes ובנתיבי KEGG ‏(q < 0.05).

אחזור גנתי-תרופתי גשש ו הערת ADMET

בצעו שאילתה במאגר DGIdb כדי לקבל רשומות ראשוניות של אינטראקציות תרופה–גן או כימיקל–גן הקשורות ל-MPO. מכיוון שרשימות אינטראקציות המופקות ממאגרי נתונים עשויות לכלול רשומות הנתמכות בסוגי ראיות הטרוגניים ועשויות שלא להתאימה באופן ישיר לסוכנים טיפוליים בעלי רלוונטיות קלינית, התרכובות שהושגו טופלו כהערות מחקריות (exploratory annotations) ולא כמועמדים מועדפים לטיפול. לאחר מכן נעשה שימוש ב-SwissADME וב-ADMETlab כדי לסכם תכונות פיזיקו-כימיות, פרמקוקינטיות ורעילות חזויות. הערות in silico אלו שימשו כדי לספק הקשר ראשוני לפירוש ברמת התרכובת ולהדגיש את הצורך באוצרות (curation) פרמקולוגית, טוקסיקולוגית וקלינית נוספת לפני שניתן יהיה לשקול רלוונטיות טיפולית כלשהי36.

תוצאות

דפוסי ביטוי של MPO וקשרי הישרדות גששים בסרטן השד

כדי לתאר את דפוסי הביטוי של MPO במאגרי נתונים של סרטן, ניתחנו נתוני RNA-seq של MPO ממאגר ה-TCGA pan-cancer והבחנו בביטוי MPO נמוך יותר ברקמות גידול של קרצינומה אורותליאלית של השלפוחית (BLCA), קרצינומה פולשנית של השד (BRCA), גליובלסטומה מולטיפורמה (GBM), קרצינומה של תאי קשקש של הראש והצוואר (HNSC), כליה כרומופובית (KICH), קרצינומה הפטוצלולרית של הכבד (LIHC), אדנוקרצינומה של הריאה (LUAD), קרצינומה של תאי קשקש של הריאה (LUSC), אדנוקרצינומה של הלבלב (PAAD), אדנוקרצינומה של הערמונית (PRAD) וקרצינומה של הבלוטה התריס (THCA), וביטוי MPO גבוה יותר באדנוקרצינומה של המעי הגס (COAD), קרצינומה פפילרית של תאי הכליה (KIRP) וברקמות אחרות (איור 2A). לאחר מכן הערכנו קשרים בין ביטוי MPO לבין תוצאים קליניים בכל סוג סרטן. בקוהורט TCGA-BRCA, הן השוואות לא מזווגות והן השוואות מזווגות הראו ביטוי MPO נמוך יותר ברקמת הגידול מאשר ברקמה נורמלית/סמוכה (איור 2B,C). לאחר שחלוק את דגימות הגידולים מ-TCGA-BRCA באמצעות ערך סף של חציון ביטוי ה-MPO בגידול, ניתוח קפלן-מייר (Kaplan-Meier) הראה כי למטופלים עם ביטוי MPO גבוה יותר היה מרווח ארוך יותר ללא התקדמות המחלה (יחס סיכון (HR) = 0.67, p = 0.028) (איור 2D). הישרדות כוללת (OS) (p = 0.296; איור משלים 1A) והישרדות ספציפית למחלה (DSS) (p = 0.18; איור משלים 1B) לא היו מובהקות סטטיסטית. עקומת ה-ROC של גידול לעומת רקמה נורמלית הצביעה על הפרדה בין קבוצות הרקמות במערך נתונים זה (איור 2E), אך אין לפרש ניתוח זה כתיקוף לאבחנה קלינית. הבחנה חוקרת זו עשויה להיות מושפעת ממקור הדגימות התקינות, מאפקטי אצווה (batch effects), מטוהר הגידול וממהבדלים בהרכב הרקמה. ביטוי MPO נמצא קשור גם לשלב T פתולוגי (איור 2F) והתפלגות תתי-הסוגים של PAM50 (איור 2Gתמונות מייצגות של אימונוהיסטוכימיה (IHC) ל-MPO מרקמת שד נורמלית סמוכה ומרקמת סרטן השד נכללו כנקודות ייחוס איכותניות לרמת החלבון (איור 2H). האזורים הממוסגרים מצביעים על אזורים המוצגים בהגדלה גבוהה יותר. תמונות הסקירה ב-20× כוללות 100 µm סרגי קנה מידה, בעוד שתמונות בהגדלה גבוהה יותר של 40× כוללות 50 µm סרגי קנה מידה.

ניתוח מתאמים והעשרה של MPO בקוהורט ה-TCGA-BRCA

ניתוח מתאם פירסון זיהה את 30 הגנים בעלי המתאם החיובי הגבוה ביותר עם MPO, אשר הראו עלייה מתואמת בביטוי לאורך גרדיאנט הביטוי של MPO (איור 3A), בעוד ש-30 הגנים בעלי המתאם השלילי הגבוה ביותר הראו דפוס ביטוי הפוך (איור 3B). ברמת המסלולים, ביטוי MPO נמצא קשור באופן מובהק וחיובי למספר מדדי חתימה הקשורים לגידולים, כולל חתימת התגובה הדלקתית (r = 0.41; איור 3C), סממני EMT (r = 0.264; איור 3D), ומדד קבוצת הגנים הקשורה לרדיקלי חמצן חופשיים (ROS) (r = 0.415; איור 3E), מה שמרמז כי ביטוי MPO עוקב אחר מצבים תעתוקיים דלקתיים/חמצוניים ודמויי מזנכימה בקוהורט TCGA-BRCA.

אשכולה (clustering) לא מפוקחת של גנים הקשורים ל-MPO ביצעה סיווג נוסף של הגידולים לדפוסי ביטוי שתואמו עם הערות קליניות, כולל שלב T פתולוגי ותתי-סוגים אינטרינזיים של PAM50 (איור 3F). כדי לבחון קישוריות אפשרית בין גנים הקשורים ל-MPO, בנינו רשת אינטראקציית חלבון-חלבון (PPI) באמצעות STRING, אשר חשפה מודול מקושר בין מספר גנים המתואמים עם MPO (איור 3G). ברשת ה-PPI, הגנים ESR1, FOXA1, XBP1, GATA3 ו-KRT18 הראו קישוריות רשת גבוהה בתוך מודול זה שנגזר מהמתאם. תוצאות אלו מזהות גנים המשתנים יחד עם ביטוי MPO, אך אינן מבססות פתוגנזה הקשורה ל-MPO או כיווניות. ניתוח ביטוי דיפרנציאלי בין קבוצות ה-MPO-high וה-MPO-low חשף הבדלים טרנסקריפטומיים המסוכמים בתרשים הภูלקנו (איור 3H). בסך הכל זוהו 1,159 גנים עם ביטוי מוגבר (upregulated) ו-854 גנים עם ביטוי מופחת (downregulated), אשר סיפקו נתונים לניתוחי העשרה עוקבים.

בשלב הבא בחנו את הרלוונטיות התפקודית של הגנים בעלי הביטוי הדיפרנציאלי (DEGs) בין הקבוצות בעלות רמות MPO גבוהות ונמוכות באמצעות חבילת clusterProfiler ב-R. ניתוח העשרה של אונטולוגיית גנים (GO) העיד כי גנים אלו היו מעורבים בעיקר בתהליכים ביולוגיים הקשורים למערכת החיסון, כולל ויסות של סיגנלינג של קולטנים על פני התא הקשורים לתגובה חיסונית וחסינות המתווכת על ידי לימפוציטים, כאשר העשרה נצפתה גם ברכיבים תאיים כגון קומפלקס הקולטן של תאי T ותפקוdims מולקולריים הקשורים לפעילות של מפעיל קולטנים (איור 4A). באופן עקבי, ניתוח מסלולי KEGG הדגיש מסלולים הקשורים למערכת החיסון ולדלקת, כולל אינטראקציה בין ציטוקינים לקולטני ציטוקינים, סיגנלינג של כימקינים, סיגנלינג של קולטן תאי T, ציטוטוקסיות המתווכת על ידי תאי NK, דיפרנציאציה של Th1/Th2 ו-Th17, סיגנלינג של NF-κB, אי-חיסון ראשוני, והרשת החיסונית במעי לייצור IgA (איור 4B).

כדי לשלב באופן מעמיק יותר את כיוון הביטוי עם מונחים פונקציונליים, נעשה שימוש בתרשים GO לחישוב מדדי Z-scores ברמת המונח על בסיס ערכי ה-DEG |log2FC|, אשר הדגישו שוב תוכניות שעתוק המועשרות במערכת החיסון, כגון תגובה חיסונית הומורלית, חסינות המתווכת על ידי לוקוציטים/לימפוציטים, הפעלת תגובה חיסונית והעברת אותות (איור 4C). ניתוח העשרה של קבוצות גנים (GSEA) המבוסס על רשימת גנים מדורגת הראה גם העשרה של מסלולים במערכת החיסון, כולל מערכת החיסון האדפטיבית, אינטראקציית ציטוקין-קולטן לציטוקין ודה-גרנולציה של נויטרופילים (איור 4D–G). מכיוון ש-MPO הוא גן הקשור לתאים מיאלואידיים/נויטרופילים, העשרות הללו מפורשות כראיה לכך שדגימות עם ביטוי גבוה של MPO מציגות אותות שעתוק חיסוניים/מיאלואידיים חזקים יותר, ולא כראיה לכך ש-MPO עצמו מעצב מחדש את המיקרו-סביבה החיסונית.

מתאם בין ביטוי MPO לבין חדירה של תאי מערכת החיסון בסרטן השד

הערכנו את הקשר בין ביטוי MPO למאפייני מיקרו-סביבת הגידול בקוהורט TCGA-BRCA. יישום אלגוריתם ESTIMATE חשף מתאמים חיוביים מובהקים בין ביטוי MPO לבין מדד ESTIMATE (R = 0.347, p < 0.001), מדד חיסוני (immune score) (R = 0.361, p < 0.001), ומדד הסטרומה (stromal score) (R = 0.232, p < 0.001) (איור 5A). התפלגות מדדים אלו בין הדגימות מוצגת ב-איור 5B. ניתוח באמצעות משאב TIMER/TIMER2.0 הצביע על כך שביטוי MPO היה קשור לרמות חדירה מוערכות של אוכלוסיות תאי חיסון עיקריות, כולל תאי B, תאי CD8+ T, נויטרופילים, תאי CD4+ T, מקרופאגים ותאים דנדריטיים בקוהורט TCGA-BRCA (איור 5C). תבנית קשר זו הוערכה עוד יותר באמצעות מדדי העשרה של תאי חיסון מבוססי ssGSEA עבור 24 סוגי תאי חיסון. לאחר תיקון שיעור התגליות השגויות של Benjamini–Hochberg, ביטוי MPO הראה קשרים חיוביים עם מספר מדדי העשרה של תאי חיסון, כולל תאי T, תאי B, תאים ציטוטוקסיים, תתי-סוגים של תאים דנדריטיים, מקרופאגים, תתי-סוגים של תאי T מסייעים, תאי T רגולטוריים, תאי CD8+ T, תאי NK, תאי מאסט ונויטרופילים (איור 5D). ממצאים אלו מפורשים כקשרים בהרכב החיסוניים ולא כראיה לכך ש-MPO שולט באופן ישיר על חדירת תאי חיסון. מפת חום (heatmap) נוצרה כדי להציג באופן חזותי את תבניות העשרת תאי החיסון ברמת הדגימה בכל קוהורט TCGA-BRCA (איור 5E). לאחר מכן השווינו בין מדדי העשרת תאי חיסון מוערכי ssGSEA בין קבוצות גידולים שהוגדרו כ-MPO-high ו-MPO-low על בסיס החציון. מספר מדדי העשרה של תאי חיסון היו שונים בין שתי הקבוצות, כולל תאים דנדריטיים מופעלים (aDC), תאי B, תאי CD8+ T, תאים ציטוטוקסיים, נויטרופילים, תאי T, תאי Tregs, תאי Th1, תאי Th2, תאי Th17, תאי γδ T, תאי T מסייעים פוליקולריים (TFH), תאי גנים בעלי שונות גבוהה (HVG), תאי T זיכרון אפקטוריים, תאי T זיכרון מרכזיים ותאי T מסייעים (איור 5F,G). בנוסף, בוצע דקונבולוציה מבוססת CIBERSORT באמצעות מטריצת החתימה LM22 כדי להעריך את הפרופורציות היחסיות של 22 סוגי תאי חיסון, ותבניות הרכב תאי החיסון שהתקבלו מוצגות ב-איור 5H.

ניתוח מתילציה של DNA של MPO בקוהורט ה-TCGA-BRCA

תוך שימוש באותה נקודת חיתוך עבור ביטוי MPO חציוני בגידול, דגימות TCGA-BRCA חולקו לקבוצות MPO-high ו-MPO-low, ודפוסי מתילציה של ה-DNA הוצגו ויזואלית עבור כל קבוצה (איור 6A). אתרי CpG נבחרים בתוך הלוקוס של MPO הראו קשרים להישרדות בניתוח MethSurv, כולל cg22331200, cg14619064 ו-cg11151395 (איור 6B–G). תוצאות אלו הקשורות למתילציה פורשו כהערות אפיגנטיות גששיות והן דורשות תיקוף עצמאי לפני שניתן יהיה להסיק מסקנות פרוגנוסטיות או מכניסטיות.

הקשר בין ביטוי MPO לבין רשתות גנים הקשורות לנויטרופילים בסרטן השד

קוהורט ה-TCGA-BRCA שימש לבחינת הקשר בין ביטוי של MPO לבין גנים הקשורים לנויטרופילים. רשת PPI מבוססת-STRING נבנתה עבור גנים הקשורים לנויטרופילים, וגני מפתח (hub genes) תועדפו בהתאם לטופולוגיית הרשת (איור 7A). לאחר מכן, 20 גני המפתח המובילים נבחנו לגבי המתאם שלהם עם ביטוי של MPO. כפי שמוצג בתרשים ה-lollipop, MPO הפגין מתאמים חיוביים בעיקר עם מתווכים מרובים הקשורים לנויטרופילים, כאשר קשרים חזקים יותר נצפו עבור מרכיבי סיגנלינג של כימוקינים/מערכת חיסון מולדת כגון CCL5, CCL2 ו-TLR2, וכן TLR4, CXCR4, TNF ו-MMP9 (איור 7B).

כדי לאפיין יותר את דפוס הבקרה המשותפת (co-regulation) בין גני המפתח (hub genes) הללו, ויזואליזנו את הקשרים הזוגיים שלהם באמצעות דיאגרמת חבלים (chord diagram) ומפת חום של מתאמים (correlation heatmap), אשר חשפו מתאמים חיוביים נרחבים בין הגנים ברחבי מודול המפתח, באופן העולה בקנה אחד עם תוכנית שעתוק מתואמת הקשורה לדלקת/נויטרופילים (איור 7C,D). יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך שביטוי גבוה יותר של MPO מלווה בביטוי מתואם של רשת גנים הקשורה לנויטרופילים בסרטן השד.

אנוטציה של גורמי שעתוק מועמדים עבור MPO

כדי לחקור גורמי שעתוק מועמדים שייתכן שהם קשורים ל-MPO, בוצעו שאילתות והצלבות של משאבי גורמי שעתוק ציבוריים, כולל KnockTF, ChIP-Atlas ו-GTRD. גורמי שעתוק מועמדים סוכמו בהמשך באמצעות תיעוד בעדיפות מבוססת רשת וניתוח קורלציה. סיכום גרפי מוצג ב-איור משלים 2, והתוצאות הטבלאיות המלאות מופיעות ב-קובץ משלים 2. מכיוון שמאגרי נתונים אלו משלבים ראיות מהקשרים ניסיוניים הטרוגניים, חפיפת מאגרי הנתונים ודרגת הרשת שימשו רק לצורך אנוטציה ותיעוף של המועמדים. תוצאות אלו לא פורשו כראיה פונקציונלית לוויסות שעתוק ישיר של MPO בסרטן השד. גורמים מועמדים, כולל MYC, מוצגים לפיכך כאנוטציות חקירתיות משלימות ולא כווסתים שסבבים מאושרים.

אשכולות של תאים בודדים ואנליזת תקשורת תא-תא תיאורית בשכבות לפי אות MPO

כדי לבצע אנוטציה של סוגי התאים, ביצענו תחילה ניתוח ביטוי ספציפי לאשכולות (clusters) בהתבסס על סממנים קנוניים עבור כל שושלת. רמות הביטוי הממוצעות ואחוז התאים המבטאים גנים מרכזיים אלה לאורך האשכולות מוצגים ותומכים באנוטציה העוקבת (איור 8A). בהתאם לכך, אשכולות התאים שעברו אנוטציה מוצגים בגרף קירוב ומקרבה של רב-גבולי אחיד (UMAP), שבו כל אוכלוסייה מסומנת בצבע לפי הסוג שזוהה, כולל תאים דנדריטיים פלסמציטואידיים, תאי אנדותל, תאים מיו-אפיתליים, תאים אפיתליים במחזור תאי, תאי פלזמה, תאי T ציטוטוקסיים, תאי גידול אפיתליים, תאי B, תאי CD4 T מופעלים, מונוציטים-מקרופאגים, פיברובלסטים ותאי T קונבנציונליים (איור 8B). מפת החום (heatmap) מציגה את רמות הביטוי של גנים נבחרים לאורך אשכולות התאים (C1-C8). כל שורה מייצגת גן, וכל עמודה מייצגת אשכול תאים. מדרג הצבעים מציין את רמות הביטוי, כאשר אדום מציין ביטוי גבוה וכחול מציין ביטוי נמוך. הדנדרוגרמה משמאל מקבצת גנים בעלי דפוסי ביטוי דומים (איור 8C). הניקוד הקשור ל-MPO חושב עבור כל תא באמצעות מערכת הגנים הקשורה ל-MPO המסופקת ב-Supplementary File 1. לצורך חישוב הניקוד לתא בודד נעשה שימוש ב-AUCell, Seurat AddModuleScore ובניתוח העשרה של מערכי גנים לדגימה בודדת (ssGSEA). הניקוד משלוש השיטות עבר נורמליזציית Z-score, נסה scales לטווח בר-השוואה, ושולב כדי להפיק ניקוד MPO משולב לצורך ניתוח תיאורי המשכי (איור 8D).

ניתוח אינטראקציה זה בין תאים השווה דפוסי תקשורת מוערכים של ליגנד-רצפטור בין קבוצות תאים שחולקו לפי אות הקשור ל-MPO, כולל רשת האינטראקציה, מפות חום של דפוסי אותות, תרשים בועות של אותות יוצאים ותרשים בועות של אותות נכנסים (איור 8E–H). מכיוון שאות ה-MPO היה דליל ברמת התא הבודד, וייתכן שההפצה הגלויה בין סוגי התאים המסומנים הושפעה מ-dropout, RNA סביבתי, doublets ואי-ודאות בסימון, יש לפרש תרשימי תקשורת אלה כתוצרי זרימת עבודה תיאוריים. הם אינם מוכיחים שתאים המבטאים MPO מתווכים או שולטים בתקשורת בין-תאית. אות MPO ניתן לזיהוי במספר מוגבל של תאים, כולל תאי גידול אפיתליים מסומנים ומונוציטים-מקרופאגים (איור 8I). בהינתן ש-MPO קשור באופן קנוני לשושלות נויטרופילים/מיאלואידים, דפוס זה דורש תיקוף במאגרי נתונים עצמאיים של תאים בודדים או באמצעות שיטות ניסיוניות אורתוגונליות.

ניתוח רגישות Exploratory scTenifoldKnk המבוסס על תאים חיוביים ל-MPO דלילים

דגימות מרובות של 10x Genomics שולבו, ולאחריהן בוצעו נורמליזציה ובחירת HVG, הפחתת ממדים מבוססת PCA, בניית גרף k-nearest neighbor ואשכולה לפי שיטת Louvain. דפוסי ביטוי של גני-סמן קנוניים בין האשכולות סוכמו באמצעות DotPlot, מה שתמך באנוטציה של סוגי התאים שבוצעה בהמשך (איור 9A). ויזואליזציית UMAP הציגה את אוכלוסיות התאים הבודדים המאנוטטיות בסט הנתונים המשולב (איור 9B). סמני שושלת קנוניים (למשל, EPCAM ו-KRT8/KRT18 לתאים אפיתליאליים; PTPRC לתאי מערכת החיסון; MS4A1 לתאי B; LST1/S100A8/S100A9 לתאי מיאלואיד; PECAM1 לתאים אנדותליאליים; ו-COL1A1 לשושלות של פיברובלסטים/שריר חלק) הראו דפוסי ביטוי ספציפיים לאשכולות, מה שתמך באנוטציה של סוגי התאים (איור 9C). תרשימי עמודות מוערמות המופרדים לפי דגימה הצביעו על כך שכל דגימה הכילה מספר אשכולות עם שונות מוגבלת בין הדגימות (איור 9D).

הביטוי של MPO היה דליל יחסית במערך הנתונים של תא בודד, כאשר רק 85 תאים חיוביים ל-MPO זוהו בתחילה (איור 9E). בהתחשב במספר מוגבל זה, הרחבת שכנות מבוססת KNN שימשה רק להגדרת תת-קבוצת שכנות MPO מקומית עבור ניתוח רגישות גשש. אין לפרש תת-קבוצה מורחבת זו כאוכלוסייה טהורה חיובית ל-MPO, כיוון שהיא עשויה לכלול תאים שכנים בעלי ביטוי MPO נמוך או כזה שאינו ניתן לגילוי. בתוך תת-קבוצת שכנות MPO זו, בוצע knockdown וירטואלי של MPO באמצעות scTenifoldKnk כניתוח רגישות חישובי. תרשים הרקיע (volcano plot) שהתקבל, ניתוח הסטה של המניfold, ויזואליזציה של יישור המניfold, תוצאות העשרה של GO/KEGG והגנים בעלי ההסטה הגבוהה ביותר (איור 9F-N) הדגישו תוכניות שעתוק מועמדות הקשורות להצגת אנטיגן, הפעלת מיאלואידים/לימפוציטים, ייצור ציטוקינים ומסלולים הקשורים לפגוזום. יש לפרש תוצאות אלו כפלטי רגישות שעתוקית גששית ולא כראיה ישירה לכך ש-MPO מווסת באופן מכניסטי מסלולים אלו בסרטן השד. מערכי נתונים עצמאיים של תא בודד ותיקוף ניסיוני אורתוגונלי, כגון אימונוהיסטוכימיה, ציטומטריה זורמת, qPCR או בדיקות תפקודיות, יהיו נחוצים כדי לאשש תצפיות אלו.

שליפה חקרנית של אינטראקציות תרופה-גן ואנוטציית ADMET

כהמשך חקרני של הניתוח המתמקד ב-MPO, מידע על אינטראקציות בין תרופות לגנים נשגב מ-DGIdb. סיכום גרפי מוצג ב-Supplementary Figure 3, ותוצאות ברמת התרכובות מופיעות ב-Supplementary Table 3. השאילתה ב-DGIdb החזירה קבוצה הטרוגנית של רשומות כימיות הקשורות ל-MPO, כולל תרכובות עם סבירות קלינית מוגבלת או פרופילים רעילים שאינם רצויים. לפיכך, תרכובות אלו שהופקו מבסיס הנתונים לא נחשבו למועמדות טיפוליות לסרטן השד על בסיס הניתוח הנוכחי. מידע הקשור ל-ADMET סוכם כדי לספק אנוטציה ראשונית של תכונות פיזיקו-כימיות, פרמקוקינטיות ורעילות חזויות. שליפת תרכובות מבסיסי נתונים ואנוטציית ADMET אינן שקולות לתעדוף תרופות שעבר עיבוד קליני. לפיכך, תוצאות אלו משמשות רק כאנוטציות כימיות ברמת סינון, וממחישות את הצורך בסינון פרמקולוגי, רעיל וקליני קפדני לפני שניתן יהיה לשקול תרכובת כלשהי למחקר טיפולי. הממצאים העיקריים של מחקר זה מתמקדים בקשר בין ביטוי MPO למאפיינים שעתוקיים הקשורים למערכת החיסון ולתאי myeloid.

זמינות נתונים:

נתונים טרנסקריפטומיים וקליניים מ-TCGA-BRCA התקבלו מפורטל Genomic Data Commons (https://portal.gdc.cancer.gov; הורדו ב-26 באוגוסט 2025; גרסת נתונים 202208). מערך הנתונים של תאים בודדים GSE161529 התקבל מ-Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE161529). לא הופקו נתוני רצף חדשים במחקר זה. סקריפטים של ניתוח זמינים באופן ציבורי בכתובת https://github.com/tengfeitcm/MPO.

תרשים זרימה של אנליזת מולטי-אומיקה, תקשורת תאית, ביטוי MPO, ושילוב נתונים קליניים.
איור 1: תרשים זרימה של תהליך איסוף הנתונים והאנליזה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

מחקר על סרטן השד; תרשימי עמודות של ביטוי MPO, עקומת הישרדות, ROC, ניתוח תמונות היסטולוגיות.
איור 2: דפוסי ביטוי של MPO וקשרי הישרדות גששיים בסרטן השד. (A) רמות ביטוי של MPO נותחו ב-33 סוגי סרטן נבדלים וברקמות נורמליות סמוכות להם באמצעות מאגר הנתונים TCGA. (B) דגימות לא מזווגות נבחרו מתוך מערך הנתונים TCGA-BRCA כדי לנתח את ביטוי ה-mRNA של MPO בסרטן השד וברקמות נורמליות. (C) דגימות מזווגות נבחרו מתוך מערך הנתונים TCGA-BRCA כדי לנתח את ביטוי ה-mRNA של MPO בסרטן השד וברקמות נורמליות. (D) ניתוח Kaplan-Meier של PFI בחולים שחולקו לפי ערך חציוני של ביטוי MPO בגידול בקוהורט TCGA-BRCA. (E) עקומת ROC גששית להערכת ההבחנה בין גידול לרקמה נורמלית על בסיס ביטוי MPO במערך הנתונים הטרנסקריפטומי הציבורי שנותח. (F) ביטוי MPO לאורך שלבי T פתולוגיים שונים. (G) ביטוי MPO לאורך תתי-סוגים מולקולריים של PAM50, כאשר תוויות תתי-הסוגים מוצגות. (H) תמונות מייצגות של אימונוהיסטוכימיה (IHC) ל-MPO של רקמת שד נורמלית סמוכה ושל רקמת סרטן השד. האזורים המסוגרים בריבוע מצביעים על אזורים המוצגים בהגדלה גבוהה יותר. תמונות הסקירה של 20× כוללות סרגלי קנה מידה של 100 µm, בעוד שתמונות ההגדלה הגבוהה של 40× כוללות סרגלי קנה מידה של 50 µm. תמונות אלו מוצגות כסימוכין איכותניים לרמת החלבון ולא שימשו לניתוח מורפומטרי כמותי או לניתוח סטטיסטי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

תרשימי ניתוח ביטוי גנים ודיאגרמת רשת, מפות חום, תרשימי פיזור ותרשימי הרי געש.
איור 3: ניתוח מתאם וביטוי דיפרנציאלי הקשורים ל-MPO בסרטן השד. (A) 30 הגנים המקודדים בעלי המתאם החיובי הגבוה ביותר עם ביטוי MPO ברמת ה-mRNA, בהתבסס על מקדמי מתאם פירסון ממאגר הנתונים TCGA. (B) 30 הגנים המקודדים בעלי המתאם השלילי הגבוה ביותר עם ביטוי MPO ברמת ה-mRNA, בהתבסס על מקדמי מתאם פירסון. (C) תרשימי פיזור הממחישים מתאמי ספירמן בין MPO וגנים בעלי ביטוי מוגבר בתגובה דלקתית. (D) תרשימי פיזור הממחישים מתאמי ספירמן בין MPO וגנים בעלי ביטוי מוגבר על ידי סממני EMT. (E) תרשימי פיזור הממחישים מתאמי ספירמן בין MPO וגנים בעלי ביטוי מוגבר על ידי ROS. (F) מפת חום של מקבצי גנים הקשורים ל-MPO בהתבסס על מובהקות קלינית (T stage ו-PAM50). (G) רשת PPI שנחזתה באמצעות מאגר הנתונים STRING עבור חלבונים הקשורים ל-MPO. (H) תרשים הרי געש של גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי בין קבוצות גידולים שהוגדרו כ-MPO-high ו-MPO-low על בסיס החציון בקוהורט TCGA-BRCA. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיאגרמות של ניתוח העשרה גנטית עם מסלולים וקטגוריות אונטולוגיה; תרשימי עמודות וגרפים קוויים.
איור 4: ניתוח העשרה של MPO בסרטן השד. (A) ניתוח העשרת Gene Ontology של 2,013 הגנים שהובעו באופן דיפרנציאלי בין קבוצות MPO-high ל-MPO-low. (B) ניתוח העשרת מסלולים של Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes עבור 2,013 הגנים שהובעו באופן דיפרנציאלי. (C) ויזואליזציה משולבת של העשרת Gene Ontology המשלבת מונחים מועשרים עם כיוון הביטוי הדיפרנציאלי וערכי |log2FC|. (D) תרשים העשרת GSEA מייצג עבור סט גנים הקשור למערכת החיסון והקשור ל-MPO; שם סט הגנים, ציון ההעשרה הנורמלי (normalized enrichment score) וערך ה-FDR q-value מוצגים בפאנל. (E) תרשים העשרת GSEA מייצג עבור סט גנים נוסף הקשור למערכת החיסון והקשור ל-MPO; שם סט הגנים, ציון ההעשרה הנורמלי וערך ה-FDR q-value מוצגים בפאנל. (F) תרשים העשרת GSEA מייצג עבור סט גנים נוסף הקשור למערכת החיסון והקשור ל-MPO; שם סט הגנים, ציון ההעשרה הנורמלי וערך ה-FDR q-value מוצגים בפאנל. (G) תרשים העשרת GSEA מייצג עבור סט גנים נוסף הקשור למערכת החיסון והקשור ל-MPO; שם סט הגנים, ציון ההעשרה הנורמלי וערך ה-FDR q-value מוצגים בפאנל. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשימי ניתוח ביטוי גנים, תפקיד MPO בחדירת תאי מערכת החיסון, מתאם וויזואליזציה של נתונים.
איור 5: מתאם בין העשרה של תאי מערכת החיסון לבין ביטוי MPO בסרטן השד. (A) תרשימי פיזור המראים מתאמים בין ביטוי MPO לבין מדד ESTIMATE, מדד חיסוני (immune score) ומדד סטורמלי (stromal score). (B) תרשימי קופסא המראים הבדלים במדד ESTIMATE, במדד החיסוני ובמדד הסטורמלי בין קבוצות גידולים שהוגדרו כ-MPO-high ו-MPO-low על סמך החציון. (C) ניתוח מבוסס TIMER/TIMER2.0 המראה קשרים בין ביטוי MPO לבין חדירה מוערכת של אוכלוסיות עיקריות של תאי מערכת החיסון. (D) תרשים סוכריות (Lollipop plot) המראה מתאמי Spearman בין ביטוי MPO לבין מדדי העשרה המוערכים על ידי ssGSEA עבור 24 סוגי תאי מערכת החיסון. ערכי P ממתאמים של תאי מערכת חיסון מרובים הותאמו באמצעות שיטת Benjamini–Hochberg לשיעור התגליות השגויות (FDR). (E) מפת חום הממחישה דפוסי העשרה של תאי מערכת החיסון ברמת הדגימה על פני קוהורט TCGA-BRCA. (F) תרשימי קופסא המראים את הסט הראשון של הבדלים במדדי העשרה של תאי מערכת החיסון המוערכים על ידי ssGSEA בין קבוצות גידולים שהוגדרו כ-MPO-high ו-MPO-low על סמך החציון; השוואות בין קבוצות בוצעו באמצעות מבחן Wilcoxon rank-sum עם תיקון Benjamini–Hochberg. (G) תרשימי קופסא המראים את הסט השני של הבדלים במדדי העשרה של תאי מערכת החיסון המוערכים על ידי ssGSEA בין קבוצות גידולים שהוגדרו כ-MPO-high ו-MPO-low על סמך החציון; השוואות בין קבוצות בוצעו באמצעות מבחן Wilcoxon rank-sum עם תיקון Benjamini–Hochberg. (H) תרשים עמודות נערמות המראה פראקציות של תאי מערכת החיסון המוערכות על ידי CIBERSORT בהתבסס על מטריצת החתימה LM22 עבור 22 סוגי תאי מערכת החיסון בקבוצות גידולים שהוגדרו כ-MPO-low ו-MPO-high על סמך החציון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מפת חום של דפוסי מתילציה של DNA וגרפי ניתוח הישרדות עבור מחקר ביטוי גנים.
איור 6: ניתוח מתילציה של DNA של הגן MPO בסרטן השד. (A) מפת חום המציגה דפוסי מתילציה של MPO בקבוצות MPO-high ו-MPO-low שהוגדרו על פי החציון. (B) עקומת הישרדות קפלן-מייר המדגימה את המשמעות הפרוגנוסטית של מתילציה באתר cg27456487. (C) עקומת הישרדות קפלן-מייר המדגימה את המשמעות הפרוגנוסטית של מתילציה באתר cg02668773. (D) עקומת הישרדות קפלן-מייר המדגימה את המשמעות הפרוגנוסטית של מתילציה באתר cg07110356. (E) עקומת הישרדות קפלן-מייר המדגימה את המשמעות הפרוגנוסטית של מתילציה באתר cg11151395. (F) עקומת הישרדות קפלן-מייר המדגימה את המשמעות הפרוגנוסטית של מתילציה באתר cg14619064. (G) עקומת הישרדות קפלן-מייר המדגימה את המשמעות הפרוגנוסטית של מתילציה באתר cg22331200. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח רשת ביטוי גנים; דיאגרמה, תרשים, תוצאות קורלציה; נתוני אינטראקציית חלבונים.
איור 7: ניתוח קורלציות של MPO וגנים הקשורים לנויטרופילים ברמת ה-mRNA באמצעות מאגר הנתונים TCGA. (A) ויזואליזציה של רשת אינטראקציית החלבונים, המתארת אינטראקציות בין חלבון הליבה לחלבונים אחרים. (B) ניתוח קורלציה של 20 הגנים המובילים הקשורים לנויטרופילים עם MPO, המציג את מקדמי הקורלציה והתפלגויות ה-P-value עבור גנים שונים. (C) דיאגרמת מיתרים (Chord diagram) של קורלציות בין 20 הגנים המובילים הקשורים לנויטרופילים, המייצגת באופן ויזואלי את עוצמת וכיוון הקשרים הגנטיים. (D) מפת חום (Heatmap) של קורלציות עבור 20 הגנים המובילים הקשורים לנויטרופילים, המציגה מקדמי קורלציה ורמות מובהקות באמצעות מדרגי צבעים וסימונים סטטיסטיים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

צבירים תאיים ואנליזת ביטוי; גרפים, מפות חום ודיאגרמת רשת; נתוני ריצוף RNA.
איור 8: צבירה של תאים בודדים ואנליזת תקשורת תא-תא הקשורה ל-MPO במערך נתונים של תאים בודדים מסרטן השד. (A) DotPlot של גנים מסמנים קנוניים על פני צבירים לצורך אנוטציה של סוגי תאים. (B) ויזואליזציית UMAP של אוכלוסיות תאים שעברו אנוטציה. (C) מפת חום של גנים מסמנים נבחרים על פני צבירי תאים. (D) DotPlot המסכם ציונים הקשורים ל-MPO על פני סוגי תאים שעברו אנוטציה, שחושבו באמצעות AUCell, ssGSEA ו-Seurat AddModuleScore בהתבסס על סט הגנים המסופק בקובץ משלים 1. (E) רשת אינטראקציות תא-תא המתארת תקשורת בין תאי גידול אפיתליאליים המדורגים לפי אות הקשור ל-MPO לבין סוגי תאים אחרים; רוחב הקו מייצג את עוצמת האינטראקציה וגודל הצומת משקף את פעילות האינטראקציה הכוללת. (F) מפות חום המראות דפוסי איתות יוצאים ונכנסים בין סוגי תאים. (G) Bubble plot של מסלולי איתות יוצאים מתאי גידול אפיתליאליים המדורגים לפי אות הקשור ל-MPO לעבר סוגי תאים אחרים. (H) Bubble plot של מסלולי איתות נכנסים מסוגי תאים אחרים לעבר תאי גידול אפיתליאליים המדורגים לפי אות הקשור ל-MPO. (I) התפלגות ביטוי MPO על פני סוגי תאים שעברו אנוטציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיאגרמות אשכולות UMAP, מפת חום של ביטוי גנים, תרשימי עמודות וגרף הרי געש לניתוח נתונים.
איור 9ניתוח אטלס של תאים בודדים וביצוע knockdown וירטואלי גשש של פלט רגישות ל-MPO. (A(תרשים נקודות (DotPlot) המראה את הביטוי של גנים מסמנים קנוניים במקבצי תאים בודדים; גודל הנקודה מייצג את אחוז התאים המבטאים כל מסמן, ועוצמת הצבע מייצגת את רמת הביטוי הממוצעת. (Bויזואליזציה של UMAP של אוכלוסיות תאים בודדים שעברו אנוטציה, כאשר כל צבע מייצג סוג תא או קלאסטר נפרד.C) ויזואליזציה ב-UMAP של ביטוי גנים מסמנים מרכזיים, המציגה את התפלגות הביטוי של גנים מסמנים עבור סוגי תאים, כולל תאי מיאלואיד. (ד'(תרשים עמודות מוערמות של פרופורציות צבירי תאים בין דגימות. (ה_(ויזואליזציה של UMAP של ביטוי הגן MPO. (פ(תרשים כינור המציג מדדי בקרת איכות של ריצוף תא בודד. (ג( תרשים מקבצים (Clustering plot) של גני סימון מרכזיים. (הּ) DotPlot של גנים מסמנים קנוניים ברמת האשכול. (I(תרשים הภูקנו (Volcano plot) של גנים שהשתנו בניתוח רגישות של השתקה וירטואלית. (J) תרשים פיזור של העתקה לעומת מובהקות. (K(תרשים חיצים של יישור יריעות)L) ניתוח העשרה של GO BP עבור גנים מתוך פלט ה-virtual knockdown. (מ'(ניתוח העשרה של מסלולי KEGG עבור גנים מתוך פלט ה-virtual knockdown).N) 20 הגנים בעלי ההעתקה המניפולדית (manifold displacement) הגבוהה ביותר לאחר החרגת MPO. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

איור משלים 1: ניתוחי הישרדות נוספים עבור MPO בקוהורט TCGA-BRCA. (A,B) קובץ זה מכיל ניתוחי הישרדות משלימים של Kaplan-Meier עבור (A) הישרדות כללית ו-(B) הישרדות ספציפית למחלה, בחלוקה לפי ערך חיתוך של חציונה של ביטוי MPO בגידול. ניתוחים אלו מסופקים כניתוחי תוצאה משלימים לאיור 2D ולא היו בעלי מובהקות סטטיסטית בקוהורט הנוכחית.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ.

איור משלים 2: אנוטציה חקירתית של גורמי שעתוק מועמדים עבור MPO. (A) דיאגרמת ונ המראה את החפיפה של גורמי שעתוק מועמדים משלושה מאגרי מידע ציבוריים של גורמי שעתוק. (B) פלט השוואת ביטוי של MYC. (C) מפת חום של קורלציה בין גורמי שעתוק עם תוויות לשורות ולעמודות. (D) פלט קורלציה בין MPO ל-MYC. (E) פלט ניתוח הישרדות של MYC. (F) פלט ROC של MYC. פלטים הקשורים ל-MYC מוצגים רק כאנוטציות משלימות של גורמי שעתוק מועמדים ואינם משמשים לתמיכה במסקנות לגבי רגולטורים רחוקים (upstream) מכניסטיים.אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: פלט של אחזור תרופה-גן חקרני מ-DGIdb עבור MPO. צמתים אפורים מייצגים את הגן MPO, צמתים כתומים מייצגים רשומות של מולקולות קטנות שאוחזרו, וקוים מקשרים מצביעים על קשרי תרופה-גן שנחזו על ידי מסד הנתונים.אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

טבלה נלווית 1: מטריצת חתימת תאי החסינות LM22 ששימשה לניתוח דה-קונוולוציה (deconvolution) של 22 סוגי תאי חסינות מבוסס CIBERSORT. סמלי הגנים הותאמו, כניסות כפולות הוסרו, והגנים הזמינים הועברו לחיתוך (intersection) עם מטריצות הביטוי המתאימות של TCGA-BRCA או GSE161529 לפני ניתוחים המשכיים.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

טבלה משלימה 2: רשימת הגנים הקשורים לנייטרופילים ששימשה לניתוח STRING/PPI, לתיעדוף גנים מרכזיים (hub-genes) ולניתוח קורלציה בין MPO לגנים מרכזיים. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ.

טבלה משלימה 3: תוצאות אחזור תרופות-גנים מחקרים ראשוניים ב-DGIdb ואנוטציות ADMET עבור MPO. קובץ זה מכיל רשומות של אינטראקציות כימיות-גניות הקשורות ל-MPO שאוחזרו מ-DGIdb, ואנוטציות שנחזו ברמת התרכובת עבור תכונות פיזיקו-כימיות, פרמטריות פרמקוקינטיות ותכונות רעילות. תוצאות אלו מסופקות כאנוטציות כימיות ראשוניות בלבד ואין לפרשן כרשימות של מועמדים טיפוליים. הן אינן מהוות הוכחה לעיכוב של MPO, קישור למטרה (target engagement), ספציפיות של ליגנדים, סלקטיביות, בטיחות, יעילות טיפולית או התאמה קלינית. הערכים בטבלה זו מייצגים פרמטרים פיזיקו-כימיים ופרמטרי דמיון-לתרופה (drug-likeness) שנחזו עבור התרכובות הרשומות. המשקל המולקולרי מבוטא בגרמים למול (g/mol). ערכי מקבלי קשרי מימן ומעניקי קשרי מימן מציינים את המספרים שנחזו של מקבלי ומעניקי קשרי מימן, בהתאמה. מקדם חלוקת אוקטנול-מים של Moriguchi מציין ליפופיליות שנחזתה. הפרות חוקי ליפינסקי מציינות את מספר הקריטריונים של "חוק החמישה" של ליפינסקי שלא קוימו על ידי כל תרכובת. ציון הזמינות הביולוגית מייצג ציון שנחזה הקשור לזמינות ביולוגית経 oral, ושטח פנים טופולוגי מתייחס לשטח הפנים הפולרי הטופולוגי שנחזה.אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 1: רשימת הגנים הקשורים ל-MPO ששימשה לדירוג חתימה של תא בודד באמצעות AUCell, Seurat AddModuleScore ו-ssGSEA. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 2: פלטי אנוטציה של מועמדים גששיים לגורמי שעתוק ו-miRNA עבור MPO. קובץ זה מכיל תוצאות אנוטציה של מועמדים לגורמי שעתוק ו-miRNA שהופקו ממאגרי נתונים המבוססים על משאבים ציבוריים, כולל KnockTF, ChIP-Atlas, GTRD ו-TargetScan. אנוטציות אלה מסופקות למטרת תיעדוף מועמדים גששי בלבד ואינן נחשבות כראיה פונקציונלית לוויסות upstream של MPO בסרטן השד.אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

מחקר זה מציג תהליך עבודה גישוש המבוסס על מאגרי נתונים ציבוריים ובחינה in silico לבדיקת קשרים בין ביטוי MPO למאפיינים חיסוניים/מיאלואידיים בסרטן השד. ניתוחי TCGA-BRCA הראו כי ביטוי MPO היה נמוך יותר ברקמות גידול מאשר ברקמות סמוכות שאינן גידול, וכי ביטוי MPO גבוה יותר היה קשור למרווח ארוך יותר ללא התקדמות המחלה. עם זאת, הישרדות כללית והישרדות ספציפית למחלה לא היו בעלות מובהקות סטטיסטית. לכן, אין לפרש את MPO כסמן פרוגנוסטי חסון או מבוסס על סמך הראיות הנוכחיות. מחקרים עתידיים צריכים להעריך את MPO באמצעות מודלים של רגרסיית Cox רב-משתנית המותאמים למשתנים קליניקו-פתולוגיים מבוססים, קבוצות תיקוף עצמאיות וניתוחים מרובדים לפי תת-סוגים.

בהשוואה לאנליזה קונבנציונלית של ביטוי Differental-expression בקוהורט בודד או להערכת חדירה חיסונית (immune-infiltration) בפלטפורמה בודדת, תהליך עבודה זה הממוקד ב-MPO משלב טרנסקריפטומיקה של bulk, העשרה חיסונית, אנוטציה של מתילציה, מיפוי של תא בודד ופרטורבציה וירטואלית כדי לספק מבט חקר רחב יותר על מאפיינים חיסוניים/מיאלואידיים הקשורים ל-MPO. עם זאת, תהליך עבודה זה נותר משלים, ולא תחליף, לתיקוף של קוהורט חיצוני, תיקוף מרחבי או ברמת החלבון, ומבחני פרטורבציה ניסויים.

יש לפרש את תוצאות חדירת התאיים החיסוניים (immune-infiltration) וההעשרה כהקשר חיסוני הקשור ל-MPO, ולא כעיצוב מחדש של המערכת החיסונית המונע על ידי MPO. ביטוי של MPO מופיע בעיקר בנייטרופילים ובתאים אחרים משושלת המיאלואידים37. לפיכך, מתאמים חיוביים בין ביטוי MPO לבין מדדי ESTIMATE, מדדי חיסון, מדדי העשרה של תאי חיסון, גנים הקשורים לנייטרופילים, מסלולי ציטוקינים, חתימות של הצגת אנטיגנים או מסלולי דגרנולציה של נייטרופילים הם סבירים מבחינה ביולוגית ועשויים לשקף במידה רבה הבדלים בשפע תאי החיסון/המיאלואידים בתוך דגימות גידול בשיטת bulk. פרשנות זו עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים שהראו כי חדירת נייטרופילים חיוביים ל-MPO קשורה לפרוגנוזה חיובית בסרטן השד, וכי MPO מעורב בתפקוד של תאי דנדריטיים ובדלקת רקמות המונעת על ידי תאי T38,39. נתוני Bulk RNA-seq אינם יכולים לקבוע האם ל-MPO יש פעילות פנימית בתוך תאי הגידול, או האם האות שנצפה משקף בעיקר תאי חיסון חודרים. כדי להבהיר את המקור התאי ואת התפקוד, נדרשים מאגרי נתונים עצמאיים של תא בודד (single-cell), פרופיל מרחבי, אימונוהיסטוכימיה, ציטומטריית זרימה או מודלים ניסיוניים מבוססי הפרעה (perturbation).

הניתוח של תא בודד מספק מידע תיאורי נוסף, אך נותר מוגבל עקב זיהוי דליל של MPO. בתחילה זוהו רק 85 תאים חיוביים ל-MPO לפני הרחבת השכנות המבוססת על KNN. למרות שהרחבת KNN אפשרה ניתוח רגישות של תאים בשכונה השעתוקית המקומית של תאים חיוביים ל-MPO, הליך זה עשוי לכלול תאים שאינם מבטאים MPO באופן ישיר. בהתאם לכך, יש לפרש את פלט ה-virtual knockdown של scTenifoldKnk כניתוח רגישות חישובי גשש ולא כראיה לוויסות של מסלולים המתווכים על ידי MPO40. תידרש וולידציה במאגרי נתונים עצמאיים של תאי סרטן שד בודדים ובבדיקות ניסוייות אורתוגונליות לפני שניתן יהיה להסיק מסקנות מנגנוניות.

יש לפרש את ניתוח גורמי השעתוק בזהירות. חפיפה בין התחזיות של KnockTF, GTRD ו-ChIP-Atlas, ולאחריה תעדוף מבוסס דרגה (degree-based prioritization), יכולה להצביע על גורמי שעתוק מועמדים, אך אינה יכולה לבסס בקרה שעתוקית פונקציונלית של MPO בסרטן השד. לכן, MYC וגורמים מועמדים אחרים נשמרו רק כהערות הסבר מסוג סריקה ראשונית (exploratory annotations). מכיוון שפעילות של גורמי שעתוק תלויה מאוד בהקשר ועשויה להשתנות בהתאם לתת-סוג הגידול, להרכב התאי, לפלטפורמת הבדיקה ולאסטרטגיית העיבוד המקדים, תידרש תיקוף ספציפי להקשר בטרם יוצמד תפקיד בקרה במעלה הזרם (upstream regulatory role) לכל גורם מועמד. תיקוף כזה צריך לכלול ChIP-qPCR או ChIP-seq, בדיקות של רפורטר פרומוטור (promoter reporter assays) והפרעה לגורמי שעתוק, ולאחריה מדידה של ביטוי MPO.

יש לפרש בזהירות גם את אחזור התרופות-גנים ואת הערות ה-ADMET. DGIdb עשוי להחזיר קשרי כימיקליים-גניים הטרוגניים, כולל תרכובות שאינן ליגנדים סלקטיביים של MPO ועשויות להיות בעלות סבירות קלינית מוגבלת או תכונות רעילות לא רצויות36. תחזיות ADMET מספקות הערות כימיות ראשוניות אך אינן מבססות מעורבות של מטרה (target engagement), עוצמה, סלקטיביות, בטיחות או יעילות טיפולית41. לכן, אין להשתמש בתוצאות הנוכחיות ברמת התרכובת כדי להסיק על פוטנציאל טיפולי. הערכה תרגומית משמעותית תדרוש סט מאושר של מעכבי MPO או גששים (probes) רלוונטיים פרמקולוגית, השוואה עם תרכובות מבוססות המכוונות ל-MPO, ותיקוף באמצעות בדיקות ביוכימיות, תאיות ופרמקולוגיות. יש לשקול גם את התפקיד התלוי-הקשר ואת התפקיד הכפול הפוטנציאלי של MPO בסרטן בעת פירוש ממצאים הקשורים לתרופות. MPO עשוי לתרום לתהליכים המעודדים גידול באמצעות עקה חמצונית, יצירת מחמצנים רהאקטיביים, נזק ל-DNA, דלקת כרונית ועיצוב מחדש של מיקרו-סביבת הגידול. במקביל, ביטוי של MPO במאגרי נתונים של גידולים (bulk tumor datasets) עשוי לשקף חדירה של נויטרופילים או תאי חיסון מיאלואידיים אחרים, אשר בהקשרים מסוימים עשויים להיות קשורים למיקרו-סביבה פעילה חיסונית ולתוצאות קליניות חיוביות יותר39,42. לפיכך, הפרשנות הביולוגית של MPO תלויה בסוג הגידול, במקור התאי, בשלב המחלה ובהרכב תאי החיסון.

גם ממצאי מתילציית ה-DNA בתוך לוקוס ה-MPO נחשבו לחקרים ראשוניים. אתרי CpG נבחרים הראו קשרים להישרדות בניתוח ה-MethSurv, אך תוצאות אלו דורשות תיקוף עצמאי לפני שניתן יהיה להסיק מסקנות פרוגנוסטיות או מכניסטיות. ויסות אפיגנטי של MPO עשוי להקיים אינטראקציה עם קישור של גורמי שעתוק וויסות ברמת הכרומטין, אך אינטראקציות כאלה נותרות השערתיות ללא נתוני כרומטין תפקודיים או נתוני הפרעה43.

יש לפרש את ההשלכות הקליניות של ביטוי MPO בזהירות. התוצאות הנוכחיות אינן מבססות את MPO כסמן ביולוגי בעל יישום קליני או כסמן שיכול להנחות כעת החלטות על אימונותרפיה בסרטן השד. במקום זאת, MPO עשוי לשקף הקשר חיסוני הקשור למיילואידים/נויטרופילים בתוך הסביבה המיקרוסכקולית של הגידול. במחקרים עתידיים, ניתן יהיה להעריך את ביטוי MPO יחד עם סמנים מוכרים הקשורים לאימונותרפיה, כולל לימפוציטים חודרי גידול, ביטוי PD-L1, ביטוי של גנים של נקודות בקרה חיסוניות, תת-סוג מולקולרי וחתימות חיסוניות מתוקפות. ניתוחים כאלו צריכים לכלול קהלות בלתי תלויות, מודלים רב-משתנים ומאגרי נתונים של תגובה לטיפול בטרם ניתן יהיה לשקול את MPO לצורך סיווג חולים או קבלת החלטות על אימונותרפיה.

מספר שלבים בתהליכי העבודה הם קריטיים עבור השחזור, כולל עיבוד מקדים עקבי של נתוני TCGA-BRCA, חלוקה לקבוצות MPO-high/MPO-low המבוססת על חציוני גידול בלבד, ספי סף סטטיסטיים שהוגדרו מראש ותיקון לבדיקות מרובות, אלגוריתמים ומערכי חתימות להעשרת תאי חיסון, בקרת איכות ואנוטציה של תאים בודדים, הרחבת שכנות MPO מבוססת KNN, וטיפול גשש בפלטי של knockdown וירטואלי ושל פלטי DGIdb/ADMET. שינויים בפרמטרים אלו עשויים להשפיע על התוצאות והפרשנות במדרג הבא; לפיכך, יש לדווח עליהם ולשחזרם בקפידה. לצורך פתרון בעיות, יש לטפל בפלטים לא עקביים על ידי בדיקת מקור הדגימה, נורמליזציה של ביטוי, סף החלוקה לקבוצות, תיקון לבדיקות מרובות, מערכי חתימות של תאי חיסון, בקרת איכות ואנוטציה של תאים בודדים, הגדרת שכנות KNN, ספי סף ל-knockdown וירטואלי, ספי סף להעשרה, ורשומות תרכובות הטרוגניות ב-DGIdb/ADMET.

יש להכיר במספר מגבלות של מחקר זה. ראשית, מחקר זה התבסס על ניתוחים רטרוספקטיביים של מאגרי נתונים ציבוריים תוך שימוש ב-TCGA-BRCA ובנתוני תא בודד (single-cell) הזמינים לציבור, ולכן הוא עשוי להיות מושפע מהטרוגניות של הקוהורט, הבדלים במקור הדגימות, אפקטי אצווה (batch effects), אנוטציה קלינית חלקית והבדלים בהרכב הגידול. שנית, הממצאים הנוכחיים נגזרים בעיקר מקשרים טרנסקריפטומיים ומניתוחי in silico, וחסרה להם תיקוף ניסיוני ישיר. לכן, אין לפרש את הקשרים שנצפו בין ביטוי MPO, מאפיינים חיסוניים/מיאלואידיים, אנוטציות מתילציה, מועמדים לגורמי שעתוק ותוצאי knockdown וירטואלי כמנגנונים סיבתיים. שלישית, זיהוי MPO במערך נתוני התא הבודד היה דליל, כאשר זוהו רק 85 תאים חיוביים ל-MPO לפני הרחבת השכנות המבוססת על KNN. תת-קבוצת שכנות ה-MPO המורחבת עשויה לכלול תאים עם ביטוי MPO נמוך או בלתי ניתן לזיהוי, ואין להתייחס אליה כאוכלוסייה טהורה חיובית ל-MPO. רביעית, מכיוון ש-MPO קשור בעיקר לנויטרופילים ולתאים אחרים משושלת המיאלואיד, סיגנלים הקשורים ל-MPO בנתוני bulk RNA-seq עשויים להיות מושפעים משכיחות תאי חיסון, טוהר הגידול והרכב תאי, במקום לשקף פעילות פנימית של תאי הגידול. לבסוף, שליפת התרופות והגנים המבוססת על DGIdb ואנוטציית ADMET היו אנוטציות כימיות גששיות בלבד. תוצאות אלו אינן מבססות עיכוב של MPO, קישור למטרה (target engagement), סלקטיביות, בטיחות, יעילות טיפולית או התאמה קלינית. מחקרים עתידיים המשתמשים בקוהורטים עצמאיים, תיקוף מרחבי או ברמת החלבון וניסויי תפקוד נדרשים כדי לאשר את הרלוונטיות הביולוגית והקלינית של ממצאים אלה.

לסיכום, ניתוחי מאגרי הנתונים הציבוריים הנוכחיים תומכים בקשר בין ביטוי MPO לבין מאפיינים תעתוקיים חיסוניים/מיאלואידיים בסרטן השד, כאשר ביטוי MPO גבוה יותר נמצא קשור למרווח ארוך יותר ללא התקדמות המחלה בקוהורט שנבדק. הממצאים נותרים בגדר מחקר ראשוני ומייצרים היפותזות. הם אינם קובעים כי MPO מווסת באופן סיבתי את המיקרוסביבה החיסונית של הגידול, כי MYC מווסת תפקודית את MPO, או כי התרכובות שזוהו הן בעלות רלוונטיות טיפולית. התרומות העיקריות של מחקר זה הן זרימת עבודה חישובית הניתנת לשחזור וקבוצה של היפותזות הניתנות לבדיקה, אשר דורשות תיקוף בקוהורטים חיצוניים ואישור ניסיוני.

גילויים

המחברים מדווחים על היעדר ניגודי עניינים בעבודה זו. כלי לעריכה לשונית מבוסס בינה מלאכותית שימש אך ורק לסיוע בליטוש השפה האנגלית ובשיפור הקריאות במהלך תיקון כתב היד. הכלי לא שימש לתכנון המחקר, לניתוח נתונים, ליצירת איורים, לפרשנות התוצאות, לבחירת מקורות או להסקת מסקנות מדעיות. כל הניתוחים, התוצאות, הפרשנויות, המקורות והטקסט הסופי נבדקו, סקרו ואושרו בקפידה על ידי המחברים, הנושאים באחריות מלאה לתוכן כתב היד.

תודות

המחברים מודים על התמיכה הכספית מקרן המחקר המדעי של בית החולים במרכז האירונאוטיקה (YN202530).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
CellChatחבילת R/קוד פתוחhttps://github.com/sqjin/CellChatניתוח תקשורת בין תאים
ChIP-Atlasמאגר נתונים ציבוריhttps://chip-atlas.org/סריקת מטרות TF; עדכון 2021 
clusterProfilerBioconductorhttps://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/ניתוח העשרה GO/KEGG; גרסה v4.4.4
CytoscapeCytoscape Consortiumhttps://cytoscape.org/ויזואליזציה של רשתות וניתוח טופולוגיה
DGIdbאוניברסיטת וושינגטון/מאגר נתונים ציבוריhttps://www.dgidb.org/שליפת אינטראקציות תרופה-גן
GDC/TCGA-BRCAהמכון הלאומי לסרטןhttps://portal.gdc.cancer.gov/מקור לנתונים קליניים וטרנסקריפטומיים ב-Bulk
Gene Expression Omnibus: GSE161529NCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/מקור למערכי נתונים של תא בודד (Single-cell)
GSEA/MSigDBBroad Institutehttps://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdbניתוח העשרה של קבוצות גנים ומאגר ייחוס לקבוצות גנים; גרסה 3.0 
GSVABioconductorhttps://bioconductor.org/packages/GSVA/ניקוד וריאציית קבוצות גנים/ssGSEA; גרסה 1.46.0
GTRDמאגר נתונים ציבוריhttp://gtrd.biouml.org/סריקת מטרות TF; 2021 
KnockTFמאגר נתונים ציבוריhttp://www.licpathway.net/KnockTF/index.htmlמשאב להפרעות TF; גרסה 2.0 
RR Foundation for Statistical Computinghttps://www.r-project.org/סביבת מחשוב סטטיסטי
scTenifoldKnkחבילת R/קוד פתוחhttps://github.com/cailab-tamu/scTenifoldKnkניתוח Knockdown וירטואלי
Seuratחבילת R/קוד פתוחhttps://satijalab.org/seurat/עיבוד מקדים וצבירה (Clustering) של תאים בודדים
STRINGELIXIR/מאגר נתונים ציבוריhttps://string-db.org/ניתוח אינטראקציות חלבון-חלבון; גרסה v11 
SwissADMESIB Swiss Institute of Bioinformaticshttp://www.swissadme.ch/הערכת דמיון לתרופה (Drug-likeness); גרסת 2017/כלי רשת 
TIMERמשאב רשת ציבוריhttps://timer.cistrome.org/ניתוח חדירה חיסונית; TIMER2.0 
UCSC Xena או פורטל TCGA מקושרUCSChttps://xenabrowser.net/גישה ואימות נתונים גששים 

מקורות

  1. Onkar SS, et al. The great immune escape: Understanding the divergent immune response in breast cancer subtypes. Cancer Discov. 2023;13(1):23-40.
  2. Quail DF, Park M, Welm AL, Ekiz HA. Breast cancer immunity: It is time for the next chapter. Cold Spring Harb Perspect Med. 2024;14(2):a041324.
  3. Valadez-Cosmes P, Raftopoulou S, Mihalic ZN, Marsche G, Kargl J. Myeloperoxidase: Growing importance in cancer pathogenesis and potential drug target. Pharmacol Ther. 2022;236:108052.
  4. Ohshima H, Tatemichi M, Sawa T. Chemical basis of inflammation-induced carcinogenesis. Arch Biochem Biophys. 2003;417(1):3-11.
  5. Davies MJ, Hawkins CL. The role of myeloperoxidase in biomolecule modification, chronic inflammation, and disease. Antioxid Redox Signal. 2020;32(13):957-981.
  6. Gomez-Mejiba SE, et al. Myeloperoxidase-induced genomic DNA-centered radicals. J Biol Chem. 2010;285(26):20062-20071.
  7. Eruslanov EB, et al. Tumor-associated neutrophils stimulate T cell responses in early-stage human lung cancer. J Clin Invest. 2014;124(12):5466-5480.
  8. Däster S, et al. Absence of myeloperoxidase and CD8 positive cells in colorectal cancer infiltrates identifies patients with severe prognosis. Oncoimmunology. 2015;4(12):e1050574.
  9. Droeser RA, et al. High myeloperoxidase positive cell infiltration in colorectal cancer is an independent favorable prognostic factor. PLoS One. 2013;8(5):e64814.
  10. Gerber-Ferder Y, et al. Breast cancer remotely imposes a myeloid bias on haematopoietic stem cells by reprogramming the bone marrow niche. Nat Cell Biol. 2023;25(12):1736-1745.
  11. Xu H, et al. Single-cell transcriptomics reveals CCL3+ classical monocyte subset linked to autoimmune pathogenesis. J Inflamm Res. 2025;18:16273-16291.
  12. Jiahao S, Cong W, Xin L, Xu C, Wenpeng X, et al. BCAT1 mediates the carcinogenic effects of environmental bisphenol exposure: mechanistic discoveries in osteosarcoma and pan-cancer analysis. Mol Divers. 2026. doi:10.1007/s11030-026-11566-7.
  13. Huo Z, Sun W, Lou C, Yang T. Integrated single-cell and spatial mapping coupled with machine learning unveils core stemness landscapes and regulatory drivers in triple-negative breast cancer. Discov Oncol. 2026;17(1):602.
  14. Das SC, et al. Comprehensive bioinformatics and machine learning analyses for breast cancer staging using TCGA dataset. Brief Bioinform. 2024;26(1):bbae628.
  15. Szklarczyk D, et al. STRING v11: protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Res. 2019;47(D1):D607-D613.
  16. Yu G, Wang LG, Han Y, He QY. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 2012;16(5):284-287.
  17. Ashburner M, et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 2000;25(1):25-29.
  18. Kanehisa M, Goto S. KEGG: Kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 2000;28(1):27-30.
  19. Chen GY, et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of gubitong recipe in the treatment of osteoarthritis. Comput Math Methods Med. 2022;2022:7858925.
  20. Chen GY, et al. Prediction of Rhizoma Drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evid Based Complement Alternat Med. 2021;2021:5233462.
  21. Liberzon A, et al. Molecular signatures database MSigDB 3.0. Bioinformatics. 2011;27(12):1739-1740.
  22. Subramanian A, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(43):15545-15550.
  23. Li B, et al. Comprehensive analyses of tumor immunity: implications for cancer immunotherapy. Genome Biol. 2016;17(1):174.
  24. Li T, et al. TIMER: A web server for comprehensive analysis of tumor-infiltrating immune cells. Cancer Res. 2017;77(21):e108-e110.
  25. Li T, et al. TIMER2.0 for analysis of tumor-infiltrating immune cells. Nucleic Acids Res. 2020;48(W1):W509-W514.
  26. Hänzelmann S, Castelo R, Guinney J. GSVA: gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data. BMC Bioinformatics. 2013;14:7.
  27. Modhukur V, et al. MethSurv: a web tool to perform multivariable survival analysis using DNA methylation data. Epigenomics. 2018;10(3):277-288.
  28. Feng C, et al. KnockTF: a comprehensive human gene expression profile database with knockdown/knockout of transcription factors. Nucleic Acids Res. 2020;48(D1):D93-D100.
  29. Feng C, et al. KnockTF 2.0: a comprehensive gene expression profile database with knockdown/knockout of transcription co-factors in multiple species. Nucleic Acids Res. 2024;52(D1):D183-D193.
  30. Oki S, et al. ChIP-Atlas: a data-mining suite powered by full integration of public ChIP-seq data. EMBO Rep. 2018;19(12):e46255.
  31. Zou Z, Ohta T, Miura F, Oki S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Res. 2022;50(W1):W175-W182.
  32. Kolmykov S, et al. GTRD: an integrated view of transcription regulation. Nucleic Acids Res. 2021;49(D1):D104-D111.
  33. Yevshin I, Sharipov R, Kolmykov S, Kondrakhin Y, Kolpakov F. GTRD: a database on gene transcription regulation—2019 update. Nucleic Acids Res. 2019;47(D1):D100-D105.
  34. Tang D, et al. SRplot: A free online platform for data visualization and graphing. PLoS One. 2023;18(11):e0294236.
  35. Wang Y, et al. Immunological profiling of rheumatoid factor-positive primary Sjögren's syndrome by single-cell RNA sequencing. Front Immunol. 2026;17:1822615.
  36. Daina A, Michielin O, Zoete V. SwissADME: a free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of small molecules. Sci Rep. 2017;7:42717.
  37. Lin W, Chen H, Chen X, Guo C. The roles of neutrophil-derived myeloperoxidase MPO in diseases: The new progress. Antioxidants. 2024;13(1):132.
  38. Odobasic D, et al. Neutrophil myeloperoxidase regulates T-cell-driven tissue inflammation in mice by inhibiting dendritic cell function. Blood. 2013;121(20):4195-4204.
  39. Zeindler J, et al. Infiltration by myeloperoxidase-positive neutrophils is an independent prognostic factor in breast cancer. Breast Cancer Res Treat. 2019;177(3):581-589.
  40. Osorio D, et al. scTenifoldKnk: An efficient virtual knockout tool for gene function predictions via single-cell gene regulatory network perturbation. Patterns. 2022;3(3):100434.
  41. Li X, Tang L, Li Z, Qiu D, Yang Z, et al. Prediction of ADMET properties of anti-breast cancer compounds using three machine learning algorithms. Molecules. 2023;28(5):2326.
  42. Scandolara TB, et al. Anti-neutrophil antibodies anti-MPO-ANCAs are associated with poor prognosis in breast cancer patients. Immunobiology. 2020;225(6):152011.
  43. Gilbert J, Gore SD, Herman JG, Carducci MA. The clinical application of targeting cancer through histone acetylation and hypomethylation. Clin Cancer Res. 2004;10(14):4589-4596.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

TCGA BRCA
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.