הערכת יעילות ההעברה ומיקוד התאים על ידי פפטידים החודרים לתאים בריאה העכבר

סיכום

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה משולבת להערכת יעילות הטרנסדוקציה וספציפיות התא של פפטידים חודרי תאים, תוך שימוש בפפטיד הממוקד לריאות מחזורי R11A (cR11A; KAPWHLSSQYSAT) כדוגמה. תהליך העבודה משלב FACS עם שבר זוגי ואחריו ריצוף RNA חד-תאים, ציטומטריית זרימה בעכברי דיווח AT2, והדמיית z-stack קונפוקלית לאישור מעורבות מטרה של פפטידים הקשור ל-AT2.

תקציר

פפטידים חודרים לתאים (CPPs) הם פפטידים קצרים (5–30 חומצות אמינו) המסוגלים לחצות ממברנות תא ולהעביר מטענים מקרומולקולריים ללא צורך בתגובות טרנספקציה. עם זאת, הגדרת סלקטיביות תאית בחיים דורשת אימות ברמת סוג התא. מוצגת זרימת עבודה משולבת להערכת יעילות ההעברה של CPP מחזורי מסומן ב-Cy5.5, cR11A, בתוך תאי אפיתל אלוואולרי מסוג II (AT2) לאחר הזרקה תוך-ורידית רטרו-אורביטלית בעכברים. הריאות נאספו 15 או 60 דקות לאחר ההזרקה ונותחו באמצעות קריאות משלימות, כולל מיון תאים מופעל-פלואורסצנציה בחלקיקה זוגת-חלקית (FACS) לבידוד תלים בודדים של Cy5.5⁺ ו-Cy5.5⁻ ריאות, ואחריהם ריצוף RNA חד-תאים, ציטומטריית זרימה של תאים בודדים מריאות מ-Sftpc-CreERT2^(+/−); עכברי דיווח ^{LSL-GFP(+/−)} AT2 לכימות אירועי GFP⁺/Cy5.5⁺, והדמיה קונפוקלית של z-stack של כריתת ריאה לאישור קולוקליזציה של cR11A-Cy5.5 עם אות משויך ל-AT2. פרוטוקול זה מספק ראיות תואמות למעורבות סוגי תאים באמצעות מספר קריאות משלימות ומספק מסגרת ניתנת לשחזור להערכת מיקוד ספציפי לתאים של CPPs, עם שינויים לאיברי מטרה שונים.

מבוא

פפטידים חודרים לתאים (CPPs) הם 5–30 פפטידי חומצות אמינו שיכולים לעבור דרך ממברנות התא ולהקל על העברת מטענים מקרומולקולריים תוך-תאיים בצורה שלמה ומתפקדת לחלוטין, ללא צורך בתגובות טרנספקציה ^1,2. עבודות קודמות שהשתמשו במתודולוגיות קומבינטוריות בתצוגת פאג' במבחנה וב-in vivo זיהו פפטיד לכיוון לב (APWHLSSQYSRT) בעל 12 חומצות אמינו שנקלט במיוחד על ידי קרדיומיוציטים תוך כ-5 דקות ^3,4. כדי לחקור את מנגנון ההעברה שלו, נערכה סריקת אלנין, שהובילה לגילוי שני וריאנטים, S7A ו-R11A (APWHLSSQYSAT), שהראו באופן בלתי צפוי העשרה ריאתית ב-vivo. ולכן נקראו פפטידים מכוונים לריאות (LTPs)⁵. יתרה מזאת, הוספת ליזין בקצה ה-N וציקליזציה ראש לזנב יצרה גרסה מחזורית של R11A (cR11A) עם יציבות סרום משופרת משמעותית וספיגה תוך-תאית מוגברת משמעותית בהשוואה לגרסה הליניארית⁵.

ל-LTPs יש פוטנציאל לספק תרופות מדויקות לאוכלוסיות אפיתל ריאתיות דיסטליות, כולל תאי אפיתל אלוואולרי מסוג II (AT2). תאים אלו קריטיים לשמירה על הומאוסטזיס סורפקטנט ומשמשים כמבנים קדומים להתחדשות אלוואולרית⁶. עם זאת, אתגר מרכזי בפיתוח LTP הוא ההערכה הקפדנית של סלקטיביות תאית בתוך החיים. הפצה ביולוגית ברמת האיברים לבדה אינה יכולה להבחין בין טרנסדוקציה תאית אמיתית לבין אות וסקולרי, שמירה חוץ-תאית או פינוי פגוציטי ולכן יש להשלים אותה במדידות חד-תאיות⁷. כדי להתמודד עם מגבלה זו, זרימת עבודה זו משלבת הקצאה טרנסקריפטומית חד-תאית, ציטומטריית זרימה מבוססת מדווח, והדמיית Z-stack קונפוקלית ליצירת ראיות ברמת סוג תא למעורבות פפטידים, מעבר לקריאות פלואורסצנציה או ביו-התפלגות ברמת האיבר ^8,9.

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק זרימת עבודה רב-קריאתית שניתן לשחזור ולאימות יעילות ההעברה ב-in vivo וספציפיות התאים של cR11A המסומן ב-Cy5.5 בריאות הדיסטלית, עם דגש על תאי AT2 לאחר הזרקה רטרו-אורביטלית. הפרוטוקול מגדיר זהות תאית קשורה לפפטידים באמצעות קריאות משלימות ובלתי תלויות, כולל מיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה בחלקיקה זוגת-חלקית (FACS) (Cy5.5⁺ לעומת Cy5.5⁻) ואחריו ריצוף RNA חד-תאי למיפוי אוכלוסיות הקשורות לפפטידים, הערכת קליטה כמותית בריאות מדווח AT2 באמצעות ציטומטריית זרימה, והדמיה קונפוקלית של Z-stack של חתכי קריוסצנציה ריאתיים לאישור קולוקליזציה של cR11A-Cy5.5 עם אות קשור ל-AT2. פרוטוקול זה ניתן להתאמה בקלות ל-LTPs או וקטורי אספקה אחרים ולהחילתו על מערכות הריאה או איברים אחרים כדי להעריך את הספציפיות התאית של CPPים בפיתוח. היא מתאימה במיוחד ליישומים הדורשים אימות ברמת סוג התא של מיקוד CPP ב-vivo, ולא הערכת הצטברות ברמת האיברים בלבד.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית (IACUC) במרפאת מאיו ואושרו תחת פרוטוקול מספר A00006842-22-R25. נעשו כל המאמצים לצמצם סבל בעלי חיים ולהבטיח טיפול אתי בהתאם לתקנות הלאומיות והמוסדיות הרלוונטיות. כלי המחקר המשמשים לפרוטוקול זה מופיעים בטבלת החומרים.

1. בעלי חיים

1. השתמש בעכברים בוגרים מעורבים C57BL/6J (בני 6–8 שבועות) שהתקבלו ממעבדת ג'קסון (זן #000664).
2. לצורך כימות ספציפי ל-AT2, השתמש ב-Sftpc-CreERT2^(+/+) (זן Jax #028054) משולב עם LSL-GFP^(+/+) (זן Jax #007906) ליצירת Sftpc-CreERT2^(+/−); עכברי דיווח ^{LSL-GFP(+/−)} AT2.
3. עכברי בית בכלובים מאווררים בנפרד. ודאו שכל הפרוטוקולים לבעלי חיים מאושרים על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית.
4. ביצוע השראה לטמוקסיפן ב-Sftpc-CreERT2^(+/−); עכברי ^{LSL-GFP(+/−).} כאשר העכברים בני ≥6 שבועות, יש להזריק 100 מ"ג/ק"ג טמוקסיפן מומס בשמן תירס באמצעות גאבאג' דרך הפה למשך שלוש מנות במשך 7 ימים. בצע ניסויים לפחות שבועיים לאחר המנה הסופית כדי לאפשר יעילות מקסימלית של רקומבינציה.

2. הכנת חומרים וחומרים

1. הכינו הרדמה (תערובת עבודה של קטמין/זילאזין).
   1. הכינו תמיסת עבודה של 5 מ"ל: קטמין (1 מ"ל של 50 מ"ג/מ"ל), זילזין (50 מיקרוליטר של 100 מ"ג/מ"ל), ומלח סטרילי (3.95 מ"ל).
   2. תנו 1 מיקרוליטר/גרם משקל גוף דרך .הזרקה תוך-קיצוניים (מינון סופי: 10 מ"ג/ק"ג קטמין ו-1 מ"ג/ק"ג קסילאזין).
2. הכין פפטיד (cR11A-Cy5.5).
   1. קבל CPPs כאבקות ליופיליות. אחסן אבקות בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס למשך עד שנתיים או כתמיסת מלאי ב-DMSO בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים בצינורות מוגני אור. הימנעו ממחזורי הקפאה-הפשרה ומזערו חשיפה לאור. הכינו תמיסת מקור של 10 מ"מ של cR11A-Cy5.5 ב-DMSO.
   2. שקלו את העכבר, מחשבו את המינון, ודיללו את המלאי ל-1 מ"ג/ק"ג במים נטולי נוקלאז לנפח סופי של 100 מיקרוליטר לעכבר.
3. הכינו בופר עיכול (טרי; השאירו על קרח).
   1. הכינו בופר עיכול המכיל 2 מ"ג/מ"ל דיספאז II, 0.1 מ"ג/מ"ל DNase I, DMEM/F12, ו-1% (v/v) פניצילין-סטרפטומיצין.
   2. השתמש ב-3 מ"ל לכל עכבר.
4. הכין בופר שטיפת אנזימים פרוטאז לא ספציפי (שמור על הקרח).
   1. DMEM/F12 המכיל 0.05 מ"ג/מ"ל DNase I ו-1% (v/v) פניצילין-סטרפטומיצין.
   2. השתמש ב-10 מ"ל לכל עכבר.
5. הכינו בופר פירוק תאי דם אדומים (שמרו על הקרח).
   1. מדלל 10× בופר ליזיס ל-1× עם PBS.
   2. השתמש ב-2 מ"ל לכל דגימה.
6. הכינו בופר פרפוזיה.
   1. השתמש ב-DMEM/F12 קר (10 מ"ל לעכבר).
7. הכינו את בופר הכביסה.
   1. השתמש ב-DMEM/F12 עם 2% FBS.
8. צנטריפוגות לפני קירור עד 4 מעלות צלזיוס.

3. מתן רטרו-אורביטלי של cR11A-Cy5.5

1. הרדימו את העכבר באמצעות תמיסת העובדת של קטמין/זילאזין. אשר הרדמה מספקת על ידי היעדר משיכת גפה בתגובה לצביטת האצבע.
2. הזרקו 100 מיקרוליטר של cR11A-Cy5.5 (1 מ"ג/ק"ג) באמצעות הזרקה תוך-ורידית רטרו-אורביטלית באמצעות מזרק אינסולין.
3. הפעל את הטיימר ושמור על העכבר על כרית חימום תחת ניטור מתאים למשך 15 או 60 דקות.

4. איסוף ריאות והזרימה

1. המית את העכבר לפי פרוטוקולים מאושרים (למשל, שאיפת CO₂ ואחריה פריקת צוואר הרחם). הנח את העכבר בשכיבה ורסס את החזה ב-70% אתנול.
2. פתח את חלל החזה כדי לחשוף את הלב והריאות.
3. בצע חתך באטריום הימני כדי לאפשר ניקוז במהלך הפרפוזיה.
4. הכנס מחט של 26 גרם המחוברת למזרק של 10 מ"ל המכיל DMEM/F12 קר כקרח אל החדר הימני. השאר את החתך העלייה הימני פתוח לאורך כל הפרפוזיה כדי לאפשר ניקוז.
5. הפירו ידנית ללא משאבת מזרק על ידי הזרקה איטית ויציבה של 10 מ"ל DMEM/F12 במשך כ-1-2 דקות. שמרו על לחץ נמוך במהלך ההזרקה והימנעו מנפיחות ריאה נראית לעין או דליפה מדופן החדרים. המשך עד שהריאות הופכות לבהירות באופן אחיד.

5. נפיחות ריאות ועיכול

1. קנול את קנה הנשימה עם קטטר IV של 20G ואבטח עם תפר משי 3-0. הטמיעו בופר עיכול של 1 מ"ל באמצעות מזרק של 1 מ"ל כדי לנפח את הריאות.
2. נתח את הריאות כיחידה שלמה אחת והעבר מיד לצלחת 100 מ"מ מקוררת מראש על הקרח.
3. הפרדו את אונות הריאה והעברו לצינור קוני של 15 מ"ל המכיל בופר עיכול קר של 2 מ"ל (ריאה אחת לכל צינור).
4. דגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 20 שעות על נדנדה מסתובבת (10–15 סל"ד).
   הערה: עיין ב-Janas PP. ^{ואח' 10} למתודולוגיה מפורטת.

6. דיסוציאציה של רקמות

1. הניחו מסננת תאים בנפח 100 מיקרון מעל צינור חרוטי בנפח 50 מ"ל ורטיב מראש עם בופר שטיפת אנזימי פרוטאז לא ספציפי של 1 מ"ל.
2. העבר רקמת ריאה למסננת ונתק בעדינות באמצעות בוכנת מזרק סטרילית.
3. שטוף עם 10 מ"ל עם בופר שטיפת אנזים פרוטאז לא ספציפי.
4. צנטריפוגה ב-130 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
5. החזירו את הכדור לתלות ב-2 מ"ל 1× RBC ל-90 שניות בטמפרטורת החדר.
6. פירוק כיבוי עם בופר שטיפה של 10 מ"ל.
7. לסנן דרך מסננת של 40 מיקרון ולשטוף עם בופר שטיפה.
8. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
9. השעתי תאים ב-500–1,000 מיקרוליטר PBS + 2% FBS (≥1 × 10⁶ תאים/מ"ל).
10. העבר דרך מכסה פילטר של 35 מיקרון לתוך צינור FACS.
    הערה: עיין ב-Konishi S. ואח' ¹¹ למתודולוגיה מפורטת.

7. מיון FACS בשבר זוגי

1. בצע מיון באמצעות ציטומטר זרימה.
2. השתמש בריאות שהוזרקו ל-PBS כאמצעי בקרה שלילי כדי להגדיר את שער Cy5.5.
3. יש ליישם גייטינג סטנדרטי: הוצאת פסולת, סינגלטים, ותאי Cy5.5⁺.
4. מיין את אוכלוסיות Cy5.5⁺ ו-Cy5.5⁻ לצינורות נפרדים.

8. הכנת דגימות scRNA-seq

1. שמור דגימות ממוינות על הקרח.
2. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ותושה מחדש בבופר של 500 מיקרוליטר.
3. להמשיך רק אם הכדאיות ≥80%.
4. הכינו ספריות ורצף לפי הצורך.

9. ציטומטריית זרימה בעכברי AT2 Reporter

1. הכינו תליות חד-תאיות לריאות כפי שמתואר בסעיפים 5–6.
2. צבע עם צבע חי/מת שניתן לתיקון (1:1,000) למשך 30 דקות (מגן מאור).
3. שטיפה וצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
4. לסנן ולשמר דגימות על הקרח.
5. אסוף נתונים על ציטומטר זרימה.
6. לבצע גייטינג לזיהוי תאים, בחירת סינגלטים, הוצאת תאים מתים והגדרת אוכלוסיות GFP ו-Cy5.5.
   1. כמת אירועי GFP⁺/Cy5.5⁺ כאחוז של תאי GFP⁺.

10. קיבוע והגנה קריו-

1. נפח ריאות ב-1 מ"ל 4% PFA ואבטח את קנה הנשימה.
2. מקבע ב-10 מ"ל 4% PFA בלילה בטמפרטורה של 4°C.
3. שטוף עם PBS (3×).
4. דגרו ב-15% סוכרוז במהלך הלילה.
5. העבר לסוכרוז 30% ל~48 שעות.

11. הטמעה וקריו-סקציה

1. הכינו תבניות קריו עם OCT ומקמו את הריאות והטמעו ב-OCT.
2. הקפיאו באמצעות חנקן נוזלי. אחסון ב-80 מעלות צלזיוס.
3. חתך בעוצמה של 10 מיקרון לאחר שיווי משקל. מחלקות לייבוש באוויר במהלך הלילה.

12. דימות וניתוח

1. שטוף חלקים עם PBS (3×).
2. התקן עם מדיום DAPI.
3. רכש ערימת Z קונפוקלית.
4. השתמש בהגדרות הדמיה מתאימות.
5. לבצע שחזור תלת-ממדי.
6. כמת את הקולוקליזציה באמצעות ספים עקביים.
   שיטות אופציונליות:
   שיטות אופציונליות אלו אינן נכללות בזרימת העבודה המייצגת אך עשויות להשתלב כדי לאפשר התרוקנות או ניתוח של אוכלוסיית תאי החיסון CD45⁺, המהווים חלק גדול מתאי הריאה¹².
   הערה: השתמש בדלדול או בהדרה של CD45⁺ כאשר הניתוח מתמקד באוכלוסיות ריאות לא חיסוניות, שכן שלבים אלו מסירים או מפרידים אותות קליטה של תאי חיסון ומשנים את הרכב התאים של הדגימה. צביעת CD45 עשויה לשמש גם לניתוח נפרד של אוכלוסיית תאי החיסון של CD45⁺.

13. דלדול אוכלוסיית התאים CD45⁺

1. לאחר דיסוציאציה של הרקמה (שלב 6), השתמשו בנוגדן CD45 המקושר לחרוז מגנטי (Miltenyi Biotech 130-052-301) או בנוגדן CD45 המקושר לפלואורופור התואם ל-Cy5.5, GFP ולכתם חי/מת, לדוגמה CD45-BV605 (BioLegend #103140). לצבוע במשך 20 דקות בטמפרטורה של 4°C בחושך.
2. אם מבצעים דלדול חרוזים מגנטיים CD45, פעלו לפי הוראות היצרן לשימוש בעמודת Lineage Deemption (LD) (Miltenyi Biotech 130-042-901) והמשיכו עם הפרדת תאים מגנטיים (MACS) (Miltenyi Biotech). לאחר מכן ממשיכים למיון FACS בשבר זוג (שלב 7).
3. אם מבצעים דלדול CD45 באמצעות נוגדן מצומד פלואורסצנטי, תחילה שטפו את תליית התא עם בופר שטיפה כדי להסיר נוגדנים עודפים. לאחר מכן המשיכו לשלב 7. לאחר הקמת שערים להוצאת כפילים ופסולת (שלב 7.3), הכנס שער נוסף להוצאת אוכלוסיית CD45⁺ . לאחר מכן המשיכו לשלב 7.4.

14. ניתוח אוכלוסיית התאים של CD45⁺ במהלך ציטומטריית זרימה

1. לאחר שלב 9.3, השתמשו בנוגדן CD45 המקושר לפלואורופור התואם ל-Cy5.5, GFP ולכתם חי/מת, לדוגמה CD45-BV605 (BioLegend #103140). לצבוע במשך 20 דקות בטמפרטורה של 4°C בחושך.
2. שטוף את תליית התא עם בופר שטיפה כדי להסיר נוגדנים עודפים. לאחר מכן המשיכו לשלב 9.4. לאחר הקמת שערים להוצאת דאבלטים ופסולת (שלב 9.6), הכנסת שער נוסף להוצאת אוכלוסיית CD45⁺ לפני השער לקביעת אוכלוסיות ^GFP+ ו-Cy5.5^{+ 12}.

תוצאות

יישום מוצלח של פרוטוקול זה אמור לייצר ראיות תואמות משלוש קריאות משלימות: scRNA-seq עם שבר זוגי, ציטומטריית זרימה מבוססת מדווח, ודימות z-stack קונפוקלי.

בניתוח scRNA-seq עם שברים מזווגים, חלקי תא בודדים ריאתיים Cy5.5⁻ ו-Cy5.5⁺ לאחר מתן סיסטמי של cR11A-Cy5.5 ונותחו בנפרד. ויזואליזציה של UMAP זיהתה אוכלוסיות תאי ריאה עיקריות, כולל תחומים חיסוניים, אנדותליאליים, אפיתליאליים ומזנכימליים (איור 1A, B). למרות שתאי החיסון ייצגו את האוכלוסייה הדומיננטית בשני החלקים הממויינים, שבר Cy5.5⁺ הראה העשרה יחסית של תאים לא חיסוניים, כולל תאי אפיתל (איור 1C). ניתוח תת-קבוצות אפיתל הראה ייצוג גבוה יותר של תאי AT2 בשבר Cy5.5⁺ מאשר בשבר Cy5.5⁻, בעוד שתאי AT1 נשארו נמוכים בשני החלקים (איור 1D). תוצאות אלו מצביעות על כך ש-scRNA-seq עם שבר מזווג יכול לזהות העשרה של תאי AT2 בתוך החלק החיובי של תאי הריאה cR11A-Cy5.5.

ציטומטריית זרימה שימשה לכימות אות cR11A-Cy5.5 בתוך תאי AT2 שהוגדרו על ידי מדווח. השער הייצוגי כלל בחירת תאים כוללים לפי FSC-A/SSC-A, שני שערי סינגלט עוקבים, שער תאים חיים, ו-GFP סופי נגד. ניתוח Cy5.5 (איור 2A–E). בדגימת הביקורת, אירועי GFP⁺/Cy5.5⁺ היו מינימליים, מה שקבע את סף הפלואורסצנציה ברקע. לאחר מתן cR11A-Cy5.5, האירועים החיוביים לדיווח של GFP⁺/Cy5.5⁺ ל-AT2 עלה ל-7.99% בדקה 15 ו-7.41% ב-60 דקות לאחר ההזרקה במאגר הנתונים המייצג הזה (איור 2E). תוצאות אלו תומכות באות cR11A-Cy5.5 שניתן לזהות בתאי AT2 חיוביים לדיווח ב-vivo.

הדמיית Z-stack קונפוקלית מספקת אימות מרחבי של פלואורסצנציה הקשורה לפפטידים בחתכי רקמת הריאה. קבוצת ביקורת שאינה מדווחת נכללה להערכת פלואורסצנציה ברקע והראתה אות מינימלי בערוצי GFP ו-Cy5.5. בריאות מדווח AT2 שטופלו ב-cR11A-Cy5.5, זוהתה פלואורסצנציה של Cy5.5 בקרבת תאים חיוביים לדיווח GFP⁺ AT2, וערוץ הקולוקליזציה שנוצר על ידי אימאריס זיהה חפיפה בין אותות GFP ל-Cy5.5 (איור 3A). ניתוח הקולוקליזציה הייצוגי של אימאריס הראה 89.6% ו-86.8% בקולוקליזציה בתוך תא GFP⁺ AT2 ב-15 דקות ו-60 דקות, בהתאמה (איור 3B).

תוצאות לא אופטימליות עשויות לכלול פלואורסצנציה גבוהה של רקע Cy5.5 בדגימות ביקורת, התאוששות לקויה של תאי אפיתל, חיוניות נמוכה של תאים, או הפרדה חלשה של אירועי GFP⁺/Cy5.5⁺. בעיות אלו בדרך כלל מצביעות על פרפוזיה לא שלמה, הפרעות רקמות מופרזות, פיצוי לא מספק או ספי הדמיה לא עקביים.

איור 1: scRNA-seq עם שבר מזווג מזהה העשרת אפיתל אלוואולרי בחלק הריאתי החיובי cR11A-Cy5.5. השעיות חד-תאיות ריאתיות סווגו לחלקי Cy5.5⁻ ו-Cy5.5⁺ לאחר הזרקת cR11A-Cy5.5 רטרו-אורביטלית, וכל חלק נותח באמצעות ריצוף RNA חד-תא. (א) גרפים של UMAP מציגים אשכולות מסוג תאים בשברים תואמים מעכבר מייצג. (B) שכבת UMAP מציגה את התפלגות תאי Cy5.5⁻ ו-Cy5.5⁺. האזורים המעוגלים ב-(A) ו-(B) מציינים את מחלקת האפיתל המודגשת לניתוח תת-קבוצות אפיתליות. (ג) אוכלוסיות החיסון נפוצות מאוד בשני החלקים, ומהוות מעל 80% מכל אחד. בהשוואה לשבר Cy5.5⁻, שבר Cy5.5⁺ מכיל אחוז גדול יותר של אוכלוסיות אנדותליות, אפיתליאליות ומזנכימליות, מה שמעיד על קליטת cR11A באוכלוסיות אלו. (D) בתוך אוכלוסיית האפיתל, תאי AT2 מיוצגים יותר בשבר Cy5.5⁺ מאשר בשבר Cy5.5⁻, בעוד שתאי AT1 נשארים נמוכים בשני החלקים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: אימות ציטומטריית זרימה של קליטת cR11A-Cy5.5 בריאות מדווח AT2. עכברי דיווח AT2 קיבלו cR11A-Cy5.5 באמצעות הזרקה תוך-ורידית רטרו-אורביטלית, והריאות נאספו 15 דקות או 60 דקות לאחר ההזרקה להכנה לתאי יחיד. מוצג גייטינג מייצג עבור דגימות רכב בקרת PBS (Ctrl) ודגימות שטופלו ב-cR11A-Cy5.5: (A) תאים נבחרו על ידי FSC-A/SSC-A, (B, C) סינגלטים הוגדרו על ידי הדרה מבוססת פיזור, (D) תאים חיים זוהו על ידי הוצאת צבע חיוני, ו-(E) GFP (מדווח AT2) לעומת התאים. Cy5.5 שימש לכימות אירועי GFP⁺/Cy5.5⁺. במאגר הנתונים המייצג הזה, אירועי GFP⁺/Cy5.5⁺ AT2 היו כ-8% הן ב-15 דקות והן ב-60 דקות לאחר מתן cR11A-Cy5.5. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: הדמיה קונפוקלית וניתוח קולוקליזציה Imaris של קליטת cR11A-Cy5.5 בריאות מדווח AT2. (א) שדות מייצגים מוצגים עבור ריאות דיווח AT2 מטופלות ללא דיווח (Ctrl) ו-cR11A-Cy5.5 שנקטפו 15 דקות או 60 דקות לאחר ההזרקה לצורך קריוסגרציה והדמיית Z-stack קונפוקלית. אות GFP (ירוק) מסמן את תאי AT2, ופלואורסצנציה cR11A-Cy5.5 (אדום) מציין אות קשור לפפטידים. לוח "Coloc" מציג פיקסלים או אובייקטים שסווגו כקולוקליזציה על ידי Imaris (צהוב), ותמונות משולבות ממחישות חפיפה מרחבית בין שני הערוצים. קבוצת ביקורת שאינה מדווחת נכללה להערכת פלואורסצנציה רקעית בערוצי GFP ו-Cy5.5. (B) כימות הקולוקליזציה בתוך תא GFP⁺ AT2 מראה ש-89.6% ו-86.8% מהאות GFP התמקמו יחד עם cR11A-Cy5.5 ב-15 דקות ו-60 דקות, בהתאמה. נתונים אלה מצביעים על חפיפה חזקה עם תאי GFP⁺ AT2 בשתי נקודות הזמן, התומכים במעורבות מועדפת של תא AT2 במצב חי. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

פרוטוקול זה מזהה מיקוד פפטידים באוכלוסיות תאים מסוימות באמצעות מספר קריאות עצמאיות הפועלות ברזולוציות משלימות: מיפוי ברמת טרנסקריפטום (scRNA-seq עם שבר מזווג), מדידה מבוססת אירועים כמותית (ציטומטריית זרימת מדווח), ואישור מרחבי (ערימות Z קונפוקליות). יחד, גישות אלו מפחיתות עמימות נפוצה הטמונה במחקרים מבוססי פלואורסצנציה או ביודיפלוגציה נפוצה ברמת האיברים, כגון פלואורסצנציה וסקולרית מבלבלת או שמירה חוץ-תאית, וכן חוסר היכולת להקצות אות קשור לפפטידים לאוכלוסיות תאי ריאה ספציפיות⁷.

כמה שלבים דורשים תשומת לב מיוחדת. איכות הפרפוזיה משפיעה מאוד על פלואורסצנציה ברקע ועל ביצועי מיון במורד הזרם; פרפוזיה מספקת מאופיינת במראה אחיד ולבן שנהב של כל האונות הריאתיות, בעוד שפרפוזיה לא שלמה יכולה להעלות אות Cy5.5 במחלקות שאינן מטרה. לפירוק רקמות, נעשה שימוש בעיכול קר ממושך (4°C, 20 שעות) במקום תנאי עיכול טיפוסיים (37°C, 1–2 שעות) לשימור אוכלוסיות אפיתל ולשפר התאוששות תאים שבירים, במיוחד תאים אלוואאולריים מסוג I (AT1)¹⁰. תאי AT1 אובדים בקלות במהלך בידוד כי המורפולוגיה הגדולה והדקה שלהם הופכת אותם לרגישים מאוד לעיכול מכני. מעבר לפרקטיקות מעבדה סטנדרטיות, כולל עיכול עקבי, פיצוי, גייטינג וסף, ניתוח קולוקליזציה תלת-ממדית מסייע לקבוע האם אות הפפטיד חופף לאות המדווח AT2 במקום להסתמך רק על חפיפה דו-ממדית פלואורסצנציית¹³.

שלב דלדול תאי מערכת החיסון CD45⁺ עשוי להישקל לפני כימות scRNA-seq או כימות ציטומטריית זרימה. תאי החיסון מהווים חלק גדול מאוכלוסיית תאי הריאה ויכולים לספוג CPPs כחלק מתגובה חיסונית טיפוסית לחלקיקים זרים. כדי לכמת בצורה מדויקת יותר את קליטת ה-CPP באוכלוסיות לא חיסוניות, כולל תחום אנדותליאלי, אפיתל ומזנכימלי, דלדול תאי CD45⁺ עשוי לשפר את הרגישות. ניתן להשיג זאת באמצעות התרוקנות מבוססת חרוזים לפני המיון או על ידי הוצאת תאי CD45⁺ במהלך ניתוח ציטומטריית זרימה¹². עם זאת, יש להשתמש בשינוי זה באופן סלקטיבי, שכן הוא מסיר מידע על קליטת תאי החיסון ומשנה את הרכב התאים של הדגימה שנבדקה.

יש לקחת בחשבון מספר מגבלות של תהליך עבודה זה. פלואורסצנציה של Cy5.5 מזהה אות קשור לפפטידים, אך אינה מבדילה בפני עצמה בין פפטיד פנימי לבין אות דבוק לממברנה או אות פרי-תאי. scRNA-seq בשבר זוגי מושפע גם מפירוק רקמות, התאוששות תאים, ספי מיון, ושפע יחסי של כל אוכלוסיית תאי ריאה. לכן, אוכלוסיות נדירות כמו תאי בסיס או יונוציטים עשויות להיות מיוצגות פחות או חסרות. ציטומטריית זרימת עכבר מדווח מספקת הקצאה חזקה יותר לסוגי תאים, אך דורשת קו דיווח מתאים או פאנל נוגדנים מאומת. בנוסף, בקרת כלי רכב באמצעות עכברי דיווח תגדיר טוב יותר את הקולוקליזציה הרקעית בתוך תאי GFP⁺ AT2 בבדיקות הדמיה. לכן, הפרשנות צריכה להסתמך על ראיות תואמות לאורך scRNA-seq, ציטומטריית זרימה ודימות קונפוקלי ולא על קריאה בודדת.

תהליך עבודה זה מודולרי וניתן להתאים אותו לפלואורופורים חלופיים, קווי עכבר מדווחים, משטרי מינון או נקודות קציר. למחקרים המפתחים CPPs נוספים ספציפיים לתאי או איברים, ניתן ליישם את עיצוב scRNA-seq עם שבר משולב עם שינויים באיברים אחרים (למשל, כבד, כליה או מוח). פרוטוקול זה מספק גישה יעילה להשוואת אוכלוסיות הקשורות לפפטידים בתוך איבר יחיד מאותו בעל חיים, ובכך משפר את הפרשנות תוך הפחתת השונות הבין-חיתית. יישומים עתידיים כוללים סינון CPPs נוספים, בדיקת קונוגטיות CPP–מטען, השוואת עיצובים ליניאריים ומחזוריים של פפטידים, ויישום תהליך העבודה על מודלים של מחלות שבהם ארכיטקטורת הרקמה או שפע תאי המטרה משתנים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נוגדן Anti-mouse CD45-BV605	BioLegend	103140	משמש לזיהוי או לדחייה של תאים CD45+
עכברים C57BL/6J	The Jackson Laboratory	Strain #000664	עכברים מסוג Wild-type המשמשים לניסויים
CD45 MicroBeads, עכבר	Miltenyi Biotec	130-052-301	משמש לדחייה מגנטית של תאים CD45+
מונה תאים	Invitrogen	Countess 3; AMQAX2000	ספירה אוטומטית של תאים
חממת CO2	Thermo Scientific	Heracell VIOS 160i; TSH160IDS	דגירה של תאים
מיקרוסקופ קונפוקלי	Zeiss	LSM 980; 1872-551	משמש לרכישת תמונות z-stack
פפטיד cR11A-Cy5.5	Mayo Clinic Proteomics Core	סינתזה מותאמת; אין מספר קטלוג	CPP מסומן פלואורסצנטית המשמש למסירה in vivo
קריו-סטים	Leica Biosystems	Leica CM1950	משמש לחיתוך רקמות
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	אנזים המשמש לעיכול רקמות ריאות
DMEM/F12	Gibco	11330-032	חיץ ניתוק ושטיפת תאים
DNase I	Roche	10104159001	מפחית התקבצות תאים על ידי DNA
ממיין תאים FACS	BD Biosciences	BD FACSAria II, מערכת 4 לייזרים	משמש למיון תאים Cy5.5+ ו- Cy5.5-
FBS	Gibco	A52567-01	נוסף לחיץ לשיפור חיוניות התאים
תוכנת FlowJo	FlowJo	גרסה 10.10.0	ניתוח נתוני ציטומטריה בזרימה
תוכנת GraphPad Prism	GraphPad Software	גרסה 10	ניתוח סטטיסטי ושרטוט
תוכנת Imaris	Oxford Instruments	גרסה 9.9.1	ויזואליזציה תלת-ממדית וניתוח קולקוליזציה
שייקר אורביטלי מודגר	Thermo Scientific	Solaris; 01-258-086	משמש לעיכול רקמות
Ketamine	WestWard (Hikma)	NDC 0143-9508-01
טור LD	Miltenyi Biotec	130-042-901	משמש להפרדת תאים מגנטית (MACS)
טור LD	Miltenyi Biotec	130-042-901
ערכת צביעת תאים מתים פלואורסצנטית חיה	Invitrogen	L34968	משמש לצביעת חיוניות בציטומטריה בזרימה
ערכת צביעת תאים מתים פלואורסצנטית חיה	Invitrogen	L34968
עכברי דיווח LSL-GFP	The Jackson Laboratory	Strain #007906	קו דיווח GFP הניתן להשראת Cre
עכברי דיווח LSL-GFP	The Jackson Laboratory	Strain #007906
צנטריפוגה מיקרוצנטריפוגית	Eppendorf	EPP-5427R	צנטריפוגה של דגימות
צנטריפוגה מיקרוצנטריפוגית	Eppendorf	EPP-5427R
מדיום הרכבה עם DAPI	Abcam	AB104139	צביעת נגד גרעינית להדמיה
מדיום הרכבה עם DAPI	Abcam	AB104139
מים נקיים מנוקלאזות	Qiagen	175034992
מחט הזנה דרך הפה	Braintree Scientific	N-PK 020
PBS	Gibco	10010-023	חיץ שטיפה כללי
PBS	Gibco	10010-023
פניצילין-סטרפטומיצין	Gibco	15140-122	מניעת זיהום חיידקי
פניצילין-סטרפטומיצין	Gibco	15140-122
צנטריפוגה מקוררת	Thermo Scientific	ST16R; TSST16R	פלטת תאים בטמפרטורה מבוקרת
צנטריפוגה מקוררת	Thermo Scientific	ST16R; TSST16R
סליין	Baxter	2F7124
עכברי Sftpc-CreERT2	The Jackson Laboratory	Strain #028054	קו inducible Cre ספציפי ל-AT2
עכברי Sftpc-CreERT2	The Jackson Laboratory	Strain #028054
עכברי דיווח AT2 Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−)	גידול פנימי	נוצרו על ידי חציית עכברי Sftpc-CreERT2(+/+) עם עכברי LSL-GFP(+/+)	משמש לתיוג GFP ספציפי ל-AT2
עכברי דיווח AT2 Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−)	גידול פנימי	נוצרו על ידי חציית עכברי Sftpc-CreERT2(+/+) עם עכברי L