מאמר שיטה

שיטה מבוססת פלואורסצנציה להמחשת דינמיקת טיפות שומן ואברונים במהלך מיטוזה בתאי הפטומה

DOI:

10.3791/71222

⸱

15 במאי 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, Showa Medical University Graduate School of Pharmacy

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מאפשר ויזואליזציה שחזורית של טיפות שומן ודינמיקת האברונים במהלך מיטוזה באמצעות תאי הפטומה מסונכרנים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפות שומן תוך-תאיות (LDs) נפוצות בכל מקום במספר סוגי תאים. ה-LD מאחסנים ליפידים ניטרליים כמו טריאצילגליצרול ואסטר כולסטריל ומשחקים תפקידים חשובים במטבוליזם האנרגיה, האיתות ותגובות לחץ. למרות ש-LDs מוכרים כאברונים תוך-תאיים, התנהגותם במהלך התקדמות מחזור התא נותרה לא ברורה. במהלך מיטוזה, מספר אברונים, כולל מיטוכונדריה ומכשיר הגולג'י, עוברים שיפוץ נרחב והרכבה מחדש, מה שמעלה את השאלה האם גם אברונים חלופיים עוברים שינויים תלויי מחזור התא. מכיוון ש-LD יכולים לשמש כמקורות אנרגיה ומרכזי איתות, הבהרת הדינמיקה שלהם במהלך מיטוזה היא בעלת חשיבות מיוחדת. כדי להתמודד עם זה, אנו מציגים פרוטוקול שמשלב סנכרון מחזור תאים עם צביעת LD פלואורסצנטית בתאי הפטומה. התאים מסונכרנים בגבול G2/M באמצעות גישה מבוססת מעכב קינאז 1 התלויה בציקלין, משתחררים למחזור התא ונאספים בנקודות זמן מסוימות. ה-LDs מסומנים בצבע שומן ניטרלי ומוצגים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שיטה זו מספקת גישה ניתנת לשחזור לבחינת הפצת LD במהלך מיטוזה, וניתן ליישם אותה באופן רחב במחקרים של ביולוגיית אברונים, ויסות מטבולי ופיזיולוגיה של תאי סרטן.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחזור התא הוא אירוע מתואם היטב שמבטיח שכפול והפרדה מדויקים של DNA כרומוזומלי 1,2, שבמהלכו האברונים התוך-תאיים מאורגנים מחדש דינמית3. הוא מורכב מארבעה שלבים עיקריים: G1, S, G2 ו-M 1,2. במהלך מיטוזה, כרומוזומים משוכפלים מתיישרים במישור המשווה של הציר הדו-קוטבי ומועברים לאחר מכן לשני תאי בת4. אברונים כמו מיטוכונדריה ומכשיר הגולג'י עוברים שיפוץ נרחב במהלך מיטוזה 5,6,7,8. האברונים הללו התפצלו לוסיקולות קטנות לפני שהופצו לשני תאי הבת, שם הם מתאספים מחדש במהלך ההתקדמות במחזור התאהבא 3.

טיפות ליפידים (LDs) הן אברונים ניטרליים המכילים ליפידים, המורכבים מליבה של ליפידים ניטרליים המוקפים בשכבה מונופוליפידית. הם קשורים למגוון רחב של חלבונים ונמצאים באופן נרחב בסוגים רבים של תאים, כולל תאים מתרבים 9,10. הרכב החלבון והליפידים של LDs משתנה בהתאם לסוג התא והרקמה11. מבין חלבונים אלו, משפחת הפריליפין (PLIN) נחקרה לעומק, ו-PLIN2 מייצב LDs בהפטוציטים12,13. בנוסף לייצוב מבני, חלבוני משפחת PLIN מעורבים בוויסות דינמיקת LD ובאינטראקציות עם רכיבים תאיים אחרים14. ה-LD משמשים לא רק כמחסני אחסון לטריאצילגליצרול ואסטר כולסטריל, אלא גם כמרכזים למטבוליזם אנרגיה15, מסלולי איתות16, והתאמת לחץ17. במצבים פתולוגיים, כגון דלקת סטיאטוהפטיטיס הקשורה לתפקוד מטבולי (MASH, שנקרא בעבר NASH), הצטברות LD מוגברת משמעותית לעומת קבוצת ביקורת בריאה18,19, מה שמדגיש את חשיבותו בביולוגיה של המחלה. עם זאת, הייתה זמינה רק תצפית מוגבלת על מיקום מרחבי של LDs בתאים מתחלקים, למרות מחקר נרחב על דינמיקת המיטוכונדריה, הרשתית האנדופלזמית ומכשיר גולג'י במהלך מיטוזה. ניתחנו את מיקום LD במהלך מיטוזה, באמצעות השיטה המוצגת כאן. דיווחנו בעבר כי אברונים תוך-תאיים הראו דפוסי התפלגות מרחביים שונים מאלו של אברונים תוך-תאיים אחרים20.

כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לחקר התפלגות של LDs ואברונים תוך-תאיים אחרים במהלך מיטוזה בתאי ההפטומה. השיטה כוללת סנכרון מחזורי תאים וצביעה פלואורסצנטית, המאפשרת הדמיה שכפולה של דינמיקת LD במהלך מיטוזה. תוצאות מייצגות מראות ש-LDs מציגים שינויים תלויי מחזור התא בהתפלגות המרחבית בין אינטרפאזה למיטוזה, מה שמקל על ניתוח השוואתי של מיקום LD במהלך חלוקת התא. גישה זו ניתנת ליישום רחב ללימוד מיקום האברונים, הדינמיקה וויסות מטבולי הן בהקשרים פיזיולוגיים והן בהקשרים פתולוגיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. פתרונות סטנדרטיים הנדרשים לפרוטוקול זה

  1. הכינו תמיסת BSA, ללא חומצות שומן, ללא חומצות שומן, 24% (עם חומצות שומן) מומסת ב-150 מ"מ NaCl.
  2. הכינו תמיסת מלאי RO-3306 של 10 מ"מ (מעכב קינאז 1 סלקטיבי תלוי ציקלין (CDK1)) המוסה ב-DMSO בתנאים סטריליים.
    הערה: תמיסות נפוצות נוספות, כגון NaOH, NaCl, ומלח מפוזר פוספט (PBS), הוכנו בהתאם לשיטות המעבדה הסטנדרטיות. PBS הוכן על ידי המסה של 2.6 גרם NaH₂PO₄·2H₂O, 29 גרם Na₂HPO₄·12H₂O, 80 גרם NaCl, ו-2.0 גרם KCl במים מזוקקים והתאמת הנפח הסופי ל-1 ליטר.

2. הכנת חומצה אולאית בצורת BSA

  1. שים 90 מ"ג חומצה אולאית בבקבוק בנפח 50 מ"ל ומוסיפים 2 מ"ל אתנול (99.5%) כדי להמיס אותה.
  2. הוסף 100 מיקרוליטר של 5 NOH לתמיסה וערבב עד שהם מעורבבים במלואם.
  3. אידוי אתנול תחת זרם של גז חנקן.
  4. הוסיפו 10 מ"ל של 150 מ"מ NaCl ודגרו את התערובת בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  5. הוסף 12.5 מ"ל תמיסת ציר BSA מקוררת בקרח (24% (עם וולט) לתוך תמיסת החומצה האולאית (2.4) וערבב בעדינות ברציפות במשך 10 דקות כדי לאפשר ערבוב הדרגתי ואחיד בטמפרטורת החדר.
  6. כוון את ה-pH ל-7.4 והביא את הנפח הסופי ל-25 מ"ל עם 150 מ"מ NaCl. הריכוז הסופי של חומצה אולאית יהיה 12.8 מ"מ.
  7. סיננו את התמיסה דרך מסנן של 0.22 מיקרון בתנאי סטריליות ואחסנו את התמיסה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים או ב-20 מעלות צלזיוס לאחסון ארוך יותר.

3. סנכרון גבולות G2/M של תאים

  1. הכינו את הבקרות הנדרשות.
    1. הכינו תאים אסינכרוניים לא מטופלים ללא טיפול ב-RO-3306 כבקרה בסיסית.
    2. בתנאים שטופלו בחומצה אולאית, יש להכין תאים שטופלו בחומצה אולאית בלבד ללא סנכרון כבקרה בסיסית.
    3. לצביעה פלואורסצנטית, יש לבצע בקרות צביעה בודדות לכל פלואורופור כדי לאמת את ספציפיות האות ולשלול חפיפה ספקטרלית בין הערוצים (איור משלים 1).
    4. לרכוש תמונות באמצעות הגדרות רכישה רציפות או תצורות פילטר מתאימות כדי למזער חפיפה ספקטרלית ושיחת חלב ערוצים.
      הערה: בקרות אלו חיוניות להבחנה בין שינויים תלויים במחזור התא לבין התפלגות האברונים הבסיסית ולאימות ספציפיות פלואורסצנטית.
  2. לשמור על תאי HuH7 במדיום Eagle's המותאם של Dulbecco, בתוספת 10% סרום בקר עוברי, 100 U/mL פניצילין, ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין בטמפרטורה של 37°C באינקובטור של 5% CO₂.
  3. הניחו כיסויי זכוכית בצלחת תרבית בקוטר 35 מ"מ. זרעים 2 ×10 5 תאים לכל צלחת 35 מ"מ במדיום שתואר לעיל, ודגרו את התאים ללילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% CO₂.
  4. שטפו תאים פעמיים עם PBS ואז דגרו עם מדיום טרי המכיל 9 מיקרומום RO-3306 ו-0.5 מ"מ חומצה אולאית.
  5. דגרו את התאים למשך 20 שעות בתנאי תרבית סטנדרטיים.

4. הסרת תגובת RO-3306 מהתאים המסונכרנים כדי להיכנס לשלב המיטוטי

  1. שטוף תאים (שלב 3.4) שלוש עד חמש פעמים עם PBS.
  2. שטוף תאים פעם אחת עם מדיום תרבית טרי.
  3. דגרו תאים במדיום טרי למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור עם CO₂ של 5% כדי לאפשר כניסה למיטוזה.
    הערה: הסרת RO-3306 מאפשרת לתאים מסונכרנים להיכנס לשלב המיטוטי מגבול G2/M. לאחר שטיפת התגובה, חלק משמעותי מהתאים נכנסים לשלב המיטוטי בתוך כשעה אחת, ובמהלך הזמן הזה, ניתן לזהות תאי מיטוזיה באמצעות עיגול תאים ועיבוי כרומוזומים. התזמון האופטימלי לצפייה בשלב מסוים של המיטוזה עשוי להשתנות בהתאם לסוג התא ולתנאי התרבית.

5. הכנת דגימה של תאים מיטוטיים

  1. תקבע תאים עם 4% פאראפורמלדהיד ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    זהירות: תאי המיטוזה נוטים להתנתק מהצלחת; הימנע מכביסה לפני קיבוע הרכב.
    הערה: לצביעה ב-PLIN3, התאים קיבעו בשילוב של 2% פאראפורמלדהיד ו-2% גלוטראלדהיד.
  2. פרמיאביליז תאים קבועים עם 0.1% (w/v) Triton X-100 ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. חסימת תאים עם 1% (בלי v) BSA ב-PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר.

6. צביעת LDs ואברונים תאיים אחרים

  1. הסר בזהירות את כיסויי הזכוכית מכלי התרבית באמצעות מלקחיים דקים והניח אותם כלפי מעלה בתא לח כדי למנוע ייבוש.
    הערה: בצע את כל שלבי הצביעה הבאים בסביבה לחה ומוגנת אור כדי לשמור על אותות הפלואורסצנציה.
  2. שטפו תאים פעמיים עם PBS ודגרו עם נוגדנים ראשוניים מדוללים ב-PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר.
  3. שטפו תאים פעמיים עם PBS ודגרו עם נוגדנים משניים מדוללים ב-PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר.
  4. שטוף תאים פעמיים עם PBS וצביע עם צבע פלואורסצנטי שומני ניטרלי למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: צבעים בעלי תכונות ספקטרליות מובחנות נבחרו כדי לאפשר הדמיה גמישה רב-צבעונית ולמזער חפיפה ספקטרלית עם סמנים אברונים אחרים.
  5. שטפתי תאים פעמיים עם PBS וצבעתי גרעיני צבע פלואורסצנטי קושר DNA (DAPI: עירור, 350–410 ננומטר; פליטה 420–450 ננומטר) מדולל ב-1:1,000 ב-PBS למשך 5 דקות.
  6. שטפו תאים פעמיים עם PBS, ואז התקינו את הכיסוי על שקופיות זכוכית באמצעות מדיום הרכבה נגד פייד לשמירה על פלואורסצנציה במהלך ההדמיה.
  7. אטום את קצוות הכיסוי עם לק שקוף כדי למנוע ייבוש ותזוזה במהלך ההדמיה.
    הערה: מכיוון שאותות פלואורסצנטיים דועכים בהדרגה, יש לצלם תמונות בתוך שבוע לאחר הצביעה.

7. תצפית על אברונים תוך-תאיים ומיקומם התת-תאי

  1. לצלם תמונות פלואורסצנציה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה רחב-שדה כדי לסרוק במהירות מספר תאים ולבחור תאים מייצגים בין פאזה ומיטוטיים, תוך שימוש בעוצמת עירור נמוכה והגדרות רכישה מהירה כדי למזער את הבהרת הפוטו.
  2. לצלם תמונות של התאים הנבחרים בהגדלה מתאימה לניתוח צביעת פלואורסצנציה.
    הערה: תאי אינטרפאזה מציגים בדרך כלל גרעין יחיד שלם הממוקם במרכז הציטופלזמה. לעומת זאת, תאים מיטוטיים מציגים כרומוזומים מעובים המישורים במישור המשווה של הציר הדו-קוטבי. תכונות מורפולוגיות אלו יכולות לשמש כקריטריונים ויזואליים להבחנה בין תאי בין-פאזה לתאי מיטוזה.
  3. המחישו LDs ומורפולוגיה גרעינית באמצעות מערכות סינון מתאימות לצבעי פלואורסצנציה ניטרליים ליפידיים וצבע פלואורסצנטי קושר DNA באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה רחבת שדה.
    הערה: בחרו מערכות פילטרים בהתאם למפרט של מערכת המיקרוסקופ שבה משתמשים.
  4. לאימות ברזולוציה גבוהה יותר, יש לרכוש תמונות פלואורסצנציה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית המצוידת בעדשת אובייקטיב עם פתח מספרי גבוה (למשל, 60×, NA ≥1.2). זיהוי אותות פלואורסצנציה עבור צבעי פלואורסצנטיים ניטרליים של ליפידים וצבע פלואורסצנטי קושר DNA באמצעות לייזרי עירור מתאימים והגדרות מסנן פליטה. עיבוד תמונות באמצעות תוכנות רכישת וניתוח תמונות נפוצות.
    הערה: בהתאם למערכת המיקרוסקופ, ניתן להשתמש בעדשות אובייקטיביות לטבילה במים או בשמן. בחירת מדיום הטבילה צריכה להתבסס על המלצות היצרן והמטרה הניסיונית. מיקרוסקופ פלואורסצנציה רחב-שדה מתאים לתצפית שגרתית והשוואת התפלגות LD בין תאי אינטרפאזה לתאי מיטוזה, בעוד שמיקרוסקופיה קונפוקלית מומלצת כאשר נדרשת רזולוציה מרחבית גבוהה יותר.

8. כימות מספר וגודל ה-LDs

  1. רכוש תמונות פלואורסצנציה של תאים תחת הגדרות הדמיה זהות לכל המצבים.
  2. פתח את התמונות שנרכשו באמצעות תוכנת ניתוח תמונות.
  3. קבעו ספים מתאימים לזיהוי LD וביצוע ניתוח חלקיקים לכימות מספר ושטח טיפות השומן.
    הערה: יש לשמור על פרמטרי ההדמיה קבועים בכל התנאים כדי להבטיח השוואה מדויקת של מספר ושטח ה-LD.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סנכרון תאי הפטומה בגבול G2/M באמצעות RO-3306

כדי לחקור את הדינמיקה של האברונים התוך-תאיים במהלך מיטוזה, RO-3306, מעכב CDK1 סלקטיבי, שימש לסנכרון התאים בגבול G2/M 20,21. כאשר תאים טופלו במעכב CDK1 במשך 20 שעות ואחריו עוד שעה במדיום טרי, מעל 50% מהתאים היו מסונכרנים בגבול G2/M (איור 1). על ידי הסרת RO-3306, התאים מורשים להיכנס למחזור התא. לפני שטיפלו את התגובה, תאי HuH7 הציגו מורפולוגיה דמוי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההתפלגות המחודשת שנצפתה של LDs במהלך מיטוזה מרמזת שמיקומן אינו אקראי אלא מתואם עם ארגון מחדש של שלד התא והתקדמות מחזור התא. בפרט, ההוצאה של LDs מאזור הציר עשויה לשקף מגבלות מרחביות שמוטלות על ידי הרכבת הציר המיטוטי או מנגנוני הובלה פעילים השומרים על הפרדת האברונים במהלך חלוקת התא. במחקר זה אנו מציגים גישה פשוטה וניתנת לשחזור להכנת תאי מיטוטיה לצביעה באימונופלואורסצנטית, תוך הדמיית תאי LD במהלך חלוקת התאים. לצורך הדמיית LD, השתמשנו בשני צבעי ליפידים ניטרליים מובחנים ספקטרלית (ירוק-פלואורס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים בנוגע לתוכן מאמר זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי מענק אוניברסיטת שוואה לחוקרים צעירים ומענק JSPS KAKENHI מספר 24K10084.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% Trypsin/EDTAWako201-16945Cell dissociation
10 cm dishCorning430167Cell culture
35 mm tissue culture dishIWAKI3000-035Cell culture
6 cm tissue culture dishIWAKI3010-060Cell culture
Anti-PLIN2 (ADRP) antibodyProteintech15294-1-APLipid droplet marker
Anti-PLIN3 (TIP47) antibodyProteintech10694-1-APLipid droplet marker
Anti-α-tubulin antibodySigma-AldrichT6199Mitotic spindle marker
BODIPY 493/503InvitrogenD3922Neutral lipid staining
Bottle-top filter (0.22 μm)NESTWNB343001Sterile filtration of OA–BSA solution
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-AldrichA8022Blocking reagent
Clear nail polishCommercially availableNot applicableSealing coverslips
Confocal microscopeOlympusFV1200High-resolution imaging
DAPIDojindo340-07971Nuclear staining
D-PBS (–)Wako049-29793Cell culture
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)Wako041-30081Cell culture medium
Ethanol (99.5%)Wako057-00456Solvent for oleic acid
Fatty acid–free BSASigma-AldrichA7030Carrier protein for oleic acid
Fetal Bovine SerumGibco10270-106Medium supplement
Fluorescent secondary antibodies (Alexa Fluor–conjugated)Commercially availableNot applicableSpecies-specific secondary antibodies for immunofluorescence
FV10-ASW softwareOlympusNot applicableImage acquisition and processing
Glass coverslips (ϕ15 mm)Matsunami2-176-03Cell seeding for microscopy
Glass microscope slidesMatsunamiSFF-001Glass slides for mounting coverslips
Glutaraldehyde (25% solution)Wako073-00536Alternative fixation for PLIN3
HuH7 cellsJCRB Cell BankJCRB0403Human hepatoma cell line
LipidTOX Red Neutral Lipid StainInvitrogenH34476Alternative lipid droplet stain
Nitrogen gas (N2)Commercially availableNot applicableEvaporation of ethanol
Oleic acidSigma-AldrichO1383For preparation of oleic acid–BSA conjugates
Paraformaldehyde, 4% in PBSNacalai Tesque09154-85Fixation
Penicillin–StreptomycinGibco15140-122Antibiotics
Phosphate-buffered saline (×10)Not applicableNot applicableCan be substituted with any vendor
RO-3306Sigma-AldrichSML0569CDK1 inhibitor for G2/M synchronization
SlowFade Diamond Antifade MountantInvitrogenS36963Mounting medium
Sodium chloride (NaCl)Wako191-01665Preparation of 150 mM NaCl
Sodium hydroxide (NaOH)Wako080-01061Used for saponification of oleic acid
Tali Cellular Analysis SlidesThermoT10794Used for cell cycle analysis
Tali Image-based CytometerThermoNot applicableUsed for cell cycle analysis
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Cell permeabilization
Widefield fluorescence microscopeKEYENCEBZ-9000Rapid screening of mitotic cells

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, G., Jiang, Q., Zhang, C. The role of mitotic kinases in coupling the centrosome cycle with the assembly of the mitotic spindle. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4111-4122 (2014).
  2. Asteriti, I. A., De Mattia, F., Guarguaglini, G. Crosstalk between AURKA and PLK1 in mitotic entry and spindle assembly. Front Oncol. 5, 283(2015).
  3. Gavet, O., Pines, J. Progressive activation of Cyclin B1-CDK1 coordinates entry to mitosis. Dev Cell. 18 (4), 533-543 (2010).
  4. Mardin, B. R., Agircan, F. G., Lange, C., Schiebel, E. Plk1 controls the NEK2A-PP1γ antagonism in centrosome disjunction. Curr Biol. 21 (13), 1145-1151 (2011).
  5. Taguchi, N., Ishihara, N., Jofuku, A., Oka, T., Mihara, K. Mitotic phosphorylation of dynamin-related GTPase DRP1 participates in mitochondrial fission. J Biol Chem. 282 (15), 11521-11529 (2007).
  6. Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (29), 11960-11965 (2009).
  7. Makiyama, T., et al. Trafficking of acetyl-C16-ceramide-NBD with long-term stability and no cytotoxicity into the Golgi complex. Traffic. 16 (5), 476-492 (2015).
  8. Tang, D., Yuan, H., Vielemeyer, O., Perez, F., Wang, Y. Sequential phosphorylation of GRASP65 during mitotic Golgi disassembly. Biol Open. 1 (12), 1204-1214 (2012).
  9. Xia, Y., et al. Silencing of ste20-type kinase TAOK1 confers protection against hepatocellular lipotoxicity through metabolic rewiring. Hepatol Commun. 7 (4), e0037(2023).
  10. Makishima, M., et al. Translation inhibitors induce formation of cholesterol ester-rich lipid droplets. PLoS ONE. 7 (8), e42379(2012).
  11. Krahmer, N., et al. Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence. Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1115-1126 (2013).
  12. Takahashi, K., et al. Glucagon regulates intracellular distribution of adipose differentiation-related protein during triacylglycerol accumulation in the liver. J Lipid Res. 51 (9), 2571-2580 (2010).
  13. Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins. Lipids Health Dis. 16 (1), 83(2017).
  14. Herker, E., Vieyres, G., Beller, M., Krahmer, N., Bohnert, M. Lipid droplet contact sites in health and disease. Trends Cell Biol. 31 (5), 345-358 (2021).
  15. Krahmer, N., et al. Organellar proteomics and phospho-proteomics reveal subcellular reorganization in diet-induced hepatic steatosis. Dev Cell. 47 (2), 205-221.e7 (2018).
  16. Ramosaj, M., et al. Lipid droplet availability affects neural stem/progenitor cell metabolism and proliferation. Nat Commun. 12 (1), 7362(2021).
  17. Cruz, A. L. S., Barreto, E. A., Fazolini, N. P. B., Viola, J. P. B., Bozza, P. T. Lipid droplets: Platforms with multiple functions in cancer hallmarks. Cell Death Dis. 11 (2), 105(2020).
  18. Mashek, D. G., Khan, S. A., Sathyanarayan, A., Ploeger, J. M., Franklin, M. P. Hepatic lipid droplet biology: Getting to the root of fatty liver. Hepatology. 62 (3), 964-967 (2015).
  19. Minami, Y., et al. Liver lipophagy ameliorates nonalcoholic steatohepatitis through extracellular lipid secretion. Nat Commun. 14 (1), 4084(2023).
  20. Makiyama, T., et al. Behavior of intracellular lipid droplets during cell division in Huh7 hepatoma cells. Exp Cell Res. 433 (2), 113855(2023).
  21. Makiyama, T., Higashi, S., Sakane, H., Nogami, S., Shirataki, H. γ-taxilin temporally regulates centrosome disjunction in a NEK2A-dependent manner. Exp Cell Res. 362 (2), 412-423 (2018).
  22. Aizawa, R., Ibayashi, M., Mitsui, J., Tsukamoto, S. Lipid droplet formation is spatiotemporally regulated in oocytes during follicular development in mice. J Reprod Dev. 70 (1), 18-24 (2024).
  23. Ohsaki, Y., Maeda, T., Fujimoto, T. Fixation and permeabilization protocol is critical for the immunolabeling of lipid droplet proteins. Histochem Cell Biol. 124 (5), 445-452 (2005).
  24. Helps, N., Luo, X., Barker, H., Cohen, P. Nima-related kinase 2 (NEK2), a cell-cycle-regulated protein kinase localized to centrosomes, is complexed to protein phosphatase 1. Biochem J. 349 (Pt 2), 509-518 (2000).
  25. O'Regan, L., Blot, J., Fry, A. M. Mitotic regulation by nima-related kinases. Cell Div. 2, 25(2007).
  26. Xie, K., et al. MDT-28/PLIN-1 mediates lipid droplet-microtubule interaction via DLC-1 in Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 9 (1), 14902(2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים