מאמר זה מפרט פרוטוקולים מקיפים לתחזוקת מושבה מעבדתית של Carausius morosus, כולל נהלים מרכזיים לגידול בעלי החיים, טיפול בביצים, טיפול בשבבים, מדדי ביצועים מייצגים וסקירה כללית של תוחלת החיים והמאפיינים הביולוגיים של המין.
מאמר שיטה
פרוטוקול סטנדרטי לגידול של Carausius morosus (Phasmatodea, Insecta) בתנאי מעבדה
במאמר זה
סיכום
תקציר
Carausius morosus, מקל ההודו, הוא חרק דקיק דמוי ענף האנדמי להודו. למרות שהוכנס באופן נרחב לשבי ברחבי העולם ומשמש לעיתים קרובות במעבדות או כחיית מחמד ביתית, חסרים פרוטוקולים מעבדתיים סטנדרטיים לגידולו. כאן אנו מדווחים על תנאי תרבית מעבדתיים מפורטים עבור C. morosus. אנו מתחזקים את המטבעים בטמפרטורה של 23 °C, לחות יחסית של 70%, ומחזור אור-חושך של 12:12 שעות. תרבית זו תוחזקה בהצלחה תחת תנאים אלו במשך למעלה משנתיים, עם פרוטוקולים סטנדרטיים למשטר תזונתי ולתנאי הקמת הכלוב. אנו מדווחים גם על שיטות לטיפול בביצים ובצאצאים כדי לתמוך בניסויים שוטפים עם C. morosus. תחת תנאי התרבית שלנו, 105 סבבים מנוטרים של ביצים שהוטלו באותו פרק זמן של 24 שעות בקעו בפרק זמן עקבי של 12 ימים, ו-13.9% מהבקעים הגיעו בהצלחה לבגרות. שיטות סטנדרטיות אלו משפרות את השחזוריות והנגישות, ומאפשרות שימוש רחב יותר ב-C. morosus כמערכת מודל מעבדתית למגוון רחב של מחקרים, כולל ניתוחים של התפתחות, התנהגות ופיזיולוגיה.
מבוא
עם העלייה בעניין במערכות מודל אלטרנטיביות שאינן יונקיות, חרקים מציעים הזדמנות לחקור מגוון רחב של שונות ביולוגית, בעוד שהם מספקים מודלי מחקר בעלות נמוכה יותר, דרישות טיפול פשוטות יותר ומחסומים רגולטוריים מועטים יותר מאשר מודלים של יונקים1. מערכות מודל של חרקים המופיעות כעת מאפשרות לחקור תופעות ביולוגיות ייחודיות, כולל, למשל, פרטנוגנזה בחרקי מקל כגון Carausius morosus (Sinéty, 1901)2. בעוד שזבוב הפירות Drosophila melanogaster עיצב את הבנתנו לגבי תהליכים התפתחותיים וגנטיים מאז תחילת המאה ה-203, מערכות מודל של חרקים אחרים כגון C. morosus מציעות הזדמנות ייחודית לא רק עבור ביולוגיה התפתחותית, אלא גם לחקירת בקרת מוטורית, התניידות ומערכות המנוהלות על ידי נוירוהורמונים4.
בנוסף, בתחום הביולוגיה של ההתפתחות האבולוציונית (evo-devo), חרקים המעבירים התפתחות המימטבולה (התפתחות ישירה) עדיין אינם מיוצגים מספיק, כאשר ה-D. melanogaster ההולומטבולה (התפתחות עקיפה או כזו הכוללת מטמורפוזה) משמשת כחרק המודל הנחקר ביותר. חקר מיני חרקים בעלי התפתחות ישירה כמו C. morosus, העובר מספר שלבי נמפה לפני הגעתו לבגרות מינית5, מאפשר לנו למלא פערים פילוגנטיים מרכזיים במחקרי ביולוגיה של התפתחות אבולוציונית. דבר זה מאפשר השוואה בין חרקים המעבירים התפתחות המימטבולה לאלו המעבירים התפתחות הולומטבולה, אשר נפרדו בשלב מוקדם באבולוציית החרקים אך אינם מיוצגים באופן שווה במערכות מודל מעבדה נוכחיות. השימוש הרחב יותר ב-C. morosus כורגניזם מעבדה הוגבל עקב תנאי גידול לא עקביים ובלתי הדירות, ומחסור במדדים ברורים להתפתחות ולהישרדות. כאן, אנו מפרטים פרוטוקול שלב-אחר-שלב עם תנאי תרבית מוגדרים ותוצאות צפויות שניתן ליישם במעבדות שונות, התומך ביישומים מרובים הכוללים מעקב אחר עובריות, התפתחות לאורך זמן וניסויי תפוקה רבייתית.
C. morosus קלה לגידול בשבי, מה שהופך אותה למתאימה הן למחקר במעבדה והן לסביבות הוראה. יכולתה להתרבות באופן פרתנוגנטי6 מבטלת את הצורך במערכי רבייה מורכבים, מפחיתה את דרישות התחזוקה ומפשטת את ניהול האוכלוסייה. למרות שגידול מוצלח נשען על תנאים סביבתיים מבוקרים, הטיפול בה נותר פשוט וחסכוני בהשוואה למודלים מעבדתיים רבים אחרים. C. morosus ניזונה בקלות מחומרי צמחייה נפוצים כגון קיסוס (Hedera helix), פטל (Rubus fruticosus), או עלי ורד (Rosa spp.). יתרונות נוספים של מערכת זו כוללים אוטוטומיה, יכולת התחדשות של רגליים7, גודל גוף גדול, ויכולת להזין ממגוון צמחים מאכילים. עם זאת, למין זה ישנן גם מגבלות, כולל היעדר רצף גנומי הזמין לציבור, זמן התפתחות ארוך יחסית, ואקסוכוריון עוברי קשיח שעלול להקשות על ביצוע הזרקות8. למרות מגבלות אלה, C. morosus מהווה מודל מעשי ואפקטיבי הן ליישומי מחקר והן ליישומי הוראה.
פרוטוקולי גידול סטנדרטיים עבור C. morosus הם קריטיים להשגת תוצאות עקביות וניתנות לשחזור במחקרי מחקר. למרות שדיווחו בספרות מספר מחקרי מעבדה על C. morosus6,9,10,11,12, למיטב ידיעתנו, לא פורסמו עד כה פרוטוקולים מעמיקים לגידול C. morosus במעבדה. במחקר זה, ביססנו בהצלחה מערכת מקיפה של פרוטוקולים סטנדרטיים לתרביות מעבדה של C. morosus, הכוללים גידול של ביצים, בקיעות ומבוגרים בשליות רבייתיות. באמצעות שיטות אלו, אנו שואפים להפוך חרק זה לנגיש יותר לקהילת המחקר הביולוגית הרחבה.
פרוטוקול
1. תנאי גידול סביבתיים
- החזק את התרבות במעבדה בחדר או באינקובטור עם בקרת אקלים, בהגדרות סביבתיות כדלקמן: 23 °C, רטיבות יחסית 70%, מחזור אור-חושך של 12:12 שעות.
הערה: בתנאים אלו, C. morosus מצפים שהתפוקות יבקעו כ-74–80 ימים לאחר הונחתן.
2. הקמה ותחזוקה של ערכות סורגים
הערה: מומלצים כלואי יתושים עם צדדים מוסככים מבד סינתר על שלושה צדדים לאחסון C. morosusתא בגודל 61 x 61 x 91.5 ס"מ מתאים לשמירה על עד 50 בוגרים או, בעת הקמת קולוניה חדשה, עד 500 גוזלים.
- בחרו כיוון סורג בגודל המתאים. ודאו שהמכסה נקי ומ libero מפסולת לפני הכנסת החיות.
- כדי להקים עדר חדש באמצעות בוגרים בוגרים, יש להציב 25–50 נקבות בוגרות לתוך כלוב סריג נקי במדידות 61 ס"מ × 61 ס"מ × 91.5 ס"מ.
הערה: פתחי הרשת צריכים להיות בטווח של 0.2–1.0 מ"מ כדי למנוע את בריחת הילודים הקטנים של הדור הראשון. - כדי להקים מושבה חדשה באמצעות גוזלים, העבר עד כ-500 גוזלים למבנה סריג נקי בגודל 61 ס"מ x 61 ס"מ x 91.5 ס"מ.
3. הזנה ושימור
- במהלך ניקיון כלובים, יש לאפשר לציפורנים להישאר בתוך הכלוב; להורידם בעדינות מהצמחייה ולשים אותם לתחתית הכלוב הרשתתי בזמן הניקיון סביבם.
הערה: צפוי שהניקיון יימשך כ-10 דקות–20 דקות לכל כלוב. - הספקו עלים טריים פעם בשבוע, כגון גת, סלע או ורד. ודאו שכל החומר הצמחי אינו מטושטש בפести-סידים. שטפו את העלים במים מהברז לפני הוספתם לכלובים, כדי להסיר שאריות וזיהומים משטח העלים.
- גזרו את הגזעים כך שיתאימו לcontainers (כדורים או בקבוקים קטנים) הממולאים במים מברז, כדי לשמור על רטיבות העלים. שימו את העלים המוכנים בתוך התאום, ודאו שהעלים מונחים בגובה ונגישים לחרקים. סגרו בזהירות את התאום לאחר ההצבה.
- במהלך ניקיון כלובות שבועי, הסירו עלים מקומטים או יבשים ושאריות צואה מצטברות מקרקעית התא.
הערה: יש להחליף את העלים כאשר מופיעים סימני דישון, כגון יובש, שבירות, רפיון או שינוי צבע. שימור סביבה נקיה הוא חיוני לבריאות ולרווחת המאגר. - הרטיפו כל תא מגורים קלות מדי יום באיזון 1–2 ספראים של מים מברז מבקבוק ספרא של 250 מ"ל כדי להבטיח הידרציה מתאימה.
הערה: זהו חשוב במיוחד ב- היום הראשון לאחר הבקיעה. צמצמו את הצפיפות אם מתרחש צמצום מהיר של המזון.
4. איסוף ושימור של Carausius morosus אפרוחים
הערה: במחקר זה אנו משתמשים “אפרוח” לתייחס לאנשים מיד לאחר היציאה מהביצה (עדר ראשון), בעוד “נימפה” מתייחס ל- שלבים גלמיים לאחר ה shedding שלאחר העובר.
- השיגו צלחות פטרי בקוטר 6 ס"מ עם גוזלים שנפרדו לאחרונה.
- העבירו בעדינות לא יותר מ-500 גוזלים באמצעות מלקחי פלסטיק עבים לתוך תא מלבני נקי בגודל 61 ס"מ × 61 ס"מ × 91.5 ס"מ בעל רשת.
הערה: לאסוף רק נימפות שצמחו באופן מלא והורחיבו את השלד החיצוני. הפרעה לנימפות לפני שהן צמחו באופן מלא מהביצה עלולה לפגוע בהרחבת הגוף ולהוביל למוות מוקדם. מסיבות דומות, יש לנסות למזער את הטיפול הישיר בנימפות לאחר העברתן לתא סורגי. - הספק עלים טריים כמתואר בסעיף 3.
- תייגו את מטעני הקולוניות החדשים עם המידע הבא: תאריך איסוף אוכלי הביצים (תאריכים), תאריך בקיעה או טווח תאריכי הבקיעה, ומספר הגורים שהוספו.
הערה: מעקב זה מתמקד בגיל הכליאה ומאפשר חיזוי של תחילת הבגרות המינית. - לחותט כל תא מגורים מיד לאחר העברת הגוזלים, וכן מדי יום לאחר מכן, באמצעות 1–2 ספראים של מים מברז מבקבוק ספרא של 250 מ"ל כדי להבטיח הידרציה מתאימה.
הערה: שלב זה קריטי במיוחד ביום הראשון לאחר הבקיעה. הצאצאים יכולים להישאר באותו מכלול לאורך כל תקופת ההתפתחות עד לבגרות. בתנאי מעבדה המתוארים בסעיף 1, כ-13% מהצאצאים שורדים עד לבגרות ב-4–5 חודשים (טבלה 1). - הסרת כל גוזלים מתים או פגועים במהלך ניקיון כלובות שבועי כדי למנוע זיהום.
5. איסוף ושימור של C. morosus ביצים
- פתחו אינקלוז' שמכיל נקבות בוגרות.
- בעזרת יד מכוסה בכפפה, סרקו בעדינות את התווכים בתחתית הכלוב, שמכילים גם ביצים וגם צואה, לכיוון הפתח הקדמי.
- העברו את החומר בזהירות באמצעות יד מכוסה כפפה לطبق פטרי בגודל 15 ס"מ לצורך איסוף הביצים.
6. סיום חיי החרקים וסילוק פסולת התיבה
הערה: כאשר C. morosus אינם עוד נדרשים לניסויים, מתו, או שאינן נדרשים ביצים:
- איטום/השלכת חרקים: העברת חרקים חיים או מתים שאינם נדרשים יותר לתרבית או לניסויים אל שקית פסולת שיכולה לעבור אוטוקלב, ושמירתה ב-20- °מקרר ב- C לפחות 72 שעות.
- הרס ביצים: כדי למנוע עליית אוכלוסין מופרזת, הסר כל ביצים לא יישמרו לניסויים מתוך כלים או צלחות פטרי, יש להכניסם שקית פסולת שאפשר לאייזור, ולשמור ב-20- °C לפחות 72 שעות.
- טיפול בפסולת: הכניסו כל פסולת מזוהמת מקונטיינרים או חומרים ששימשו לאיסוף ביצים או חרקים, שקית פסולת שאפשר לאייץ, וצררו ב-20-°C °C לפחות 72 שעות.
- לאחר הקפאת החומרים, העבר את שקית הפסולת שאפשר לרתך לאוטוקלאב לסל פסולת ביולוגי לצורך סילוק תקין.
הערה: כפי C. morosus בשל היותו מין פולש מחוץ להודו, חשוב לה dese disposing של כל החומרים באופן תקין כמתואר לעיל, כדי למנוע שחרור מקרי לסביבה.
7. איסוף ביצים
- בעזרת מלקחיים פלסטיים עבים, יש להרים בזהירות כל ביצה ולשים אותה לתוך צלחת פטרי נקיה בקוטר 6 ס"מ.
הערה: ביצים בוגרות מוגנות על ידי אקסוכוריאון קשיח ובעלות צבע חום כהה, הן מזכירות עלים של צמחים. שימוש ברקע לבן יכול לעזור להבחין בין צואת לבין ביצים בעת מיון. - סמן את הצלחת עם תאריך ושעת האיסוף למטרות מעקב. השאר את המכסה פתוח במהלך ההתפלה כדי לאפשר שחלוף אוויר.
הערה:طبق פטרי בקוטר 6 ס"מ מספיק לאחסון עד 200 ביצים. - כ-שבוע לפני תקופת הבקיעה הצפויה (74–80 יום לאחר ה產ת הביצים; Kovacikova & Extavour, נתונים לא פורסמו), החלף את מכסה צלחת פטרי.
- התחלו במעקב יומי אחר מיכלי הביצים לפני תאריך הבקיעה הצפוי כדי לצפות ביצאים הנולדים.
8. תוחלת חיים
- לאחר הבקעה, עקבו אחר הפרטים בזמן שהם עוברים חמישה עד שישה שלבי ריסוק לפני שמגיעים לבשלות מינית, שלפיה בתנאי מעבדה המתוארים בסעיף 1, מתרחשת בממוצע 139 ימים לאחר הבקעה (טבלה 1).
- כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, יש להגדיר את זמני ההתפתחות בתנאי תרבות אלו באופן הבא: משך העוברות (הטלה של הביצים עד הבקיעה) הוא 74–80 ימים; הזמן מהבציעה עד зрינות מינית (תחילת ה產ת הביצים) הוא כ-135 ימים, כלומר כ-200 ימים מהלדת הביצים עד зрינות מינית, והאורך הכולל של החיים מהלדת הביצים עד המוות הוא כ-9.5 חודשים.
תוצאות
אספנו נתונים המתעדים גידול מוצלח במעבדה של C. morosus משלב הביצים ועד למבוגרים בשלים להבנייה, בין ספטמבר 2024 לנובמבר 2025. במהלך תקופה זו של 14 חודשים, הקמנו, תחזקנו וניטרנו חמישה כלובים עבור אחד או יותר מהפרמטרים הבאים: תמותת מבוגרים, ביצים שהטלו, עיתוי בקיעת הביצים והישרדות של בוקעים עד לבגרות. השיטה שלנו תומכת בתחזוקה ארוכת טווח של מושבה ללא סימנים גלויים למחלות הקשורות לפתוגנים או לירידה ביכולת הרבייה, אשר כולם היו מהווים תוצאות תת-אופטימליות. במהלך יותר משנתיים של תרבית רציפה, לא צפינו במקרי מוות המוניים גלויים הקשורים לפתוגנים, והייצור של ביצים ובוקעים נותר יציב לאורך הדורות.
הנתונים המוצגים ב- איור 1 ו- איור 2 הצג תצפיות מחמשת הכלובים שנ monitored, החל מההקמה ועד לשלב הבגרות של הבקועים, כולל הביצים שהושקעו ותמותת הבוגרים בכל כלוב. לאחר שהפרטים המייסדים בכל כלוב הגיעו לבגרות מינית והחלו להטיל ביצים, רשמנו את מספר הבוגרים הנוכחים בכל כלוב כדי לקבוע את אוכלוסיית הפתיחה עם תחילת השכבת הביצים. מספר הבוגרים בכל כלוב לאורך זמן מוצג ב- איור 1 ו- טבלה 1אנו מפרשים את הירידה העקבית בהישרדות כשיעורי תמותה תלויי גיל.
ניטרנו במקביל את ייצור הביצים באותם חמישה כלובים שבהם נוטרה הישרדות המבוגרים (איור 1 ו-איור 2). ספירת הביצים היומית לכלוב הייתה הגבוהה ביותר במהלך 30–50 הימים הראשונים של הנחת הביצים ופחתה בהדרגה לאחר מכן. למרות שסך ייצור הביצים השתנה בין הכלובים (טבלה 2), דפוס כללי זה היה עקבי בכל חמשת כלובי החזרות. ניטרנו את דינמיקת בקיעת הביצים לאורך תקופה של 50 יום עבור 105 סבבי ביצים בסך הכל, כאשר כל סבב ביצים הוא קבוצה של ביצים שהוטלו באותו כלוב בתוך פרק זמן של 24 שעות. עבור ניתוחי גודל הסבבים המוצגים ב-איור 3, 75 סבבים חולקו לקטגוריות קטנות, בינוניות וגדולות. מצאנו שברגע שבקע הביץ הראשון בסבב, הגעה ל-90% השלמת בקיעה התרחשה בתוך 12 ימים מהופעתו של הבקיע הראשון (איור 3D), ללא תלות בגודל הסבב (איור 3B). בשימוש במונח "השלמת בקיעה" לתיאור חלקן של הביצים בסבב שבקעו עד לנקודת זמן נתונה לאחר הופעתו של הבקיע הראשון מסבב, ציינו כי התפלגות סבבי הביצים לפי היום של 90% השלמת בקיעה מעידה על כך שרוב הסבבים הגיעו לסף זה בין ימי בקיעה 10 ו-14 (איור 3C) לאחר הופעתו של הבקיע הראשון.
איור 1. דינמיקת תמותה בבוגרים. מסלולי הישרדות לאורך זמן בחמישה כלובים ניסיוניים שחזרו של C. morosus. אחוז ההישרדות מדומה לאורך זמן עבור פרטים בכל כלוב שננטר. ראו מדדי סיכום בטבלה 1. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. דינמיקה של ייצור ביצים. מספר הביצים שנאספו מאותן חמישה כלובים שנされていた באיור 1. כלובים 1 עד 5 נשמרו מדי יום למשך 47, 58, 106, 129 ו-132 ימים, בהתאמה. הגרף מציג נתונים מ-126 הימים הראשונים של השמירה. ראו מדדי סיכום בטבלה 2. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3דינמיקת בקיעת ביצים. (A) הקשר בין סך הביצים לכל סבב למספר הימים הנדרשים להגעה ל-90% השלמת בקיעה. (B) התפלגות מנות ביצים לפי היום שבו הן הגיעו ל-90% השלמת בקיעה, לאורך ימי בקיעה 7–20. (C) התפלגות שיעור הבקיעה של סבבים על פני סבבי ביצים קטנים, בינוניים וגדולים. n = 25 סבבים לכל קטגוריית גודל סבב. (ד') מסלולי בקעה לאורך תקופת איסוף של 70 ימים עבור 75 קבוצות הביצים ששימשו בניתוח גודל הקבוצה. בסך הכל נוטרו 105 קבוצות ביצים; עבור הניתוחים המוצגים כאן, 75 קבוצות חולקו לפי סך מספר הביצים באמצעות נקודות חיתוך של שליש (tercile). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.
איור 4הקשרים בין מספר הבוגרים, תמותת בוגרים והפקת ביצים לכל כלוב. (A) אין קשר מובהק (R2 = 0.025) בין התמותה היומית הממוצעת של מבוגרים לבין מספר המבוגרים המייסדים בכל כלוב. (B) אין קשר מובהק (R2 = 0.017) בין סך ייצור הביצים לבין מספר הפרטים הבוגרים המייסדים בכל כלוב. (C) קיימת מתאם שלילי בינוני (R2 (= 0.411) בין ייצור ביצים יומי ממוצע לבין תמותה יומית ממוצעת של בוגרים. תמותה יומית ממוצעת של בוגרים = (אחוז תמותה כולל) / (סך מספר ימי הניטור). אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.
| מספר כלוב # | מספר כלוב ישן | יום בקיעה ראשון גורים נוספו לכלוב המייסדים | יום בקע אחרון גורי יונקים נוספו לכלוב המייסד | # בקע הוספת גורים לכלוב | טווח ימי הבקיעה נוספו שתילים | זמן ממוצע בין תחילת הכלוב לספירת בוגרים # | היום הראשון של ספירת הבוגרים | ביום הראשון המבוגרים החלו להטיל ביצים | הזמן שחלף בין הבקיעה לבגרות | הזמן שחלף בין הבקיעה להטלת הביצים | מספר מבוגרים התחלתי | הישרדות גוזלים/שבירים עד לבגרות מכסה מגן (מטריה של מxw) | היום האחרון של ספירת הבוגרים | מספר מבוגרים סופי | משך הזמן של מבוגר # שנצפה [ימים] | שיעור תמותה ממוצע במבוגרים לאורך זמן הניטור [%] | שיעור תמותה יומי ממוצע במבוגרים [%] |
| 1 | 7 | 12/7/ 2024 | 12/21/ 2024 | לא מזוהה | 14.00 | 166.00 | 5/29/ 2025 | 5/29/ 2025 | 173.00 | 173.00 | 61.00 | לא הוגדר | 10/9/ 2025 | 9.00 | 133.00 | 85.25% | 0.64% |
| 2 | 8 | 2/10/ 2025 | 3/9/ 2025 | לא זוהה | 27.00 | 130.00 | 7/17 /2025 | 7/17/ 2025 | 157.00 | 157.00 | 42.00 | ND | 11/5/ 2025 | 12.00 | 111.00 | 71.43% | 0.64% |
| 3 | 9 | 4/5/ 2025 | 4/12/ 2025 | לא זוהה | 7.00 | 110.00 | 7/17/ 2025 | 7/27/ 2025 | 103.00 | 113.00 | 45.00 | לא נמצא | 11/5/ 2025 | 36.00 | 111.00 | 20.00% | 0.18% |
| 4 | 10 | 5/8/ 2025 | 5/22/ 2025 | 350 | 14.00 | 121.00 | 9/4/ 2025 | 9/13/2 025 | 119.00 | 128.00 | 36.00 | 10.29% | 11/5/ 2025 | 24.00 | 62.00 | 33.33% | 0.54% |
| 5 | 11 | 5/23/ 2025 | 6/6/ 2025 | 536 | 14.00 | 117.00 | 9/4/ 2025 | 9/24/ 2025 | 104.00 | 124.00 | 86.00 | 16.04% | 11/5/ 2025 | 66.00 | 62.00 | 23.26% | 0.38% |
| ממוצעים | 15.20 | 128.80 | 131.20 | 139.00 | 54.00 | 13.17% | 29.40 | 95.80 | 46.65% | 0.48% |
טבלה 1: דינמיקת הישרדות ותמותה של בוגרים בכלובים ניסיוניים. תוצאות הישרדות בוגרים עבור חמישה כלובים ניסיוניים חוזרים. עבור כל כלוב, אנו מדווחים על טווח התאריכים של הקמת הכלוב, מספר השבולים ששימשו להקמת כל כלוב (עבור 2 מתוך 5 כלובים), הישרדות שבולים לשלב הבגרות (עבור 2 מתוך 5 כלובים), הזמן שחלף בין הקמת הכלוב, תחילת ספירת הבוגרים ותחילת הטלת הביצים, משך ניטור הבוגרים, גודל אוכלוסיית הבוגרים בתחילת ובסוף התקופה, תמותת בוגרים במהלך תקופת הניטור וממוצע תמותה יומי. הישרדות שבולים לשלב הבגרות חושבה רק עבור כלובים עם מספר שבולים ידוע בתחילת הניסוי.
| מספר כלוב | תאריך תחילת איסוף ביצים | תאריך סיום איסוף ביצים | משך איסוף ביצים [ימים] | סך כל הביצים/כלוב | ממוצע ביצים שהוטלו ליום | מספר פרטים בוגרים התחלתי | סך כל הביצים/בוגרים התחלתיים | ממוצע ביצים/בוגר התחלתי/יום |
| 1 | 5/29/2025 | 10/8/ 2025 | 132.00 | 6721.00 | 50.92 | 61.00 | 110.18 | 0.83 |
| 2 | 7/4/2025 | 11/10/2025 | 129.00 | 7333.00 | 56.84 | 42.00 | 174.60 | 1.35 |
| 3 | 7/27/2025 | 11/10/2025 | 106.00 | 9198.00 | 86.77 | 45.00 | 204.40 | 1.93 |
| 4 | 9/13/2025 | 11/10/2025 | 58.00 | 2583.00 | 44.53 | 36.00 | 71.75 | 1.24 |
| 5 | 9/24/2025 | 11/10/2025 | 47.00 | 6104.00 | 129.87 | 86.00 | 70.98 | 1.51 |
| ממוצעים | 94.40 | 6387.80 | 73.79 | 54.00 | 126.38 | 1.37 |
טבלה 2: ייצור ביצים בכלובים הניסיוניים. תפוקת הנחת ביצים של חמישה כלובים ניסיוניים חוזרים המכילים פרטים בוגרים. עבור כל כלוב, אנו מדווחים על תאריכי ההתחלה והסיום של איסוף הביצים, משך הזמן הכולל של איסוף הביצים, ייצור ביצים מצטבר לכלוב, והמספר הממוצע של ביצים שהונחו ליום.
דיון
שיטות הגידול המפורטות כאן מספקות מסגרת פשוטה וניתנת לשחזור לתחזוקת אוכלוסיות מעבדה של C. morosus. למרות ש-C. morosus גודל מזה זמן רב במעבדות או כחיות מחמד, פרוטוקולי גידול למחקר מעבדה השתנו בין מחקרים שונים6,9,10,11,12. הבטחת תנאים סביבתיים עקביים ושיטות הזנה אחידות היא חשובה כדי להפוך את C. morosus לאורגניזם מודל מעבדתי מהימן למחקר התפתחותי, פיזיולוגי ואבולוציוני.
לוח זמני התפתחות ב-C. morosus ביחס לחרקים מודליים אחרים
בהשוואה לחרקים בעלי מטמורפוזה מלאה (holometabolous) כגון זבוב הפירות Drosophila melanogaster, C. morosus מראה קצב התפתחות איטי יותר ושלב ילדות ממושך יותר. בעוד ש-D. melanogaster משלים את האמ בריוגנזה (embryogenesis) תוך ~24 h ומגיע לבגרות רבייתית בתוך 10–12 ימים ב-25 °C13, בתנאי הגידול שלנו, C. morosus דורש 74–80 ימים לאמ בריוגנזה וכ-135–139 ימים לאחר הבקיעה כדי להגיע לבגרות רבייתית, מה שמתבטא בכ-200 ימים מהנחת הביצה ועד לבגרות רבייתית ב-23 °C (נתונים לא מוצגים). לוח זמנים מורחב זה משקף הבדלים פיזיולוגיים ואבולוציוניים בסיסיים בין חרקים בעלי מטמורפוזה חלקית (hemimetabolous) לחרקים בעלי מטמורפוזה מלאה14,15, ונמצא שוב ושוב לאורך סדר ה-Phasmatodea16,17,18. בעוד שחרקים hemimetabolous אחרים, כגון חגב הבית Gryllus bimaculatus, משלימים את האמ בריוגנזה ומגיעים לבגרות מינית בפרק זמן קצר יותר (עשרה ימים ושש שבועות, בהתאמה, ב-29 °C19), ההתפתחות האיטית של C. morosus מספקת הזדמנות ייחודית למחקר הדידקטיבי (reproducible) ולמחקרים אורכיים מפורטים של האמ בריוגנזה והתפתחות שלב הילדות.
מקור העלווה ושיטות ההאכלה
בפרוטוקול זה, אנו מדווחים על שימוש בקיסוס (Hedera helix) כמקור המזון העיקרי עבור מושבת ה-C. morosus שלנו, כאשר העלים נאספו ממיקום קבוע בקמפוס לאורך כל השנה. למרות שקיסוס עשוי שלא להיות נגיש לכל המעבדות, מספר מקורות מזון צמחיים חלופיים דווחו כמתאימים לתחזוקת מושבות של C. morosus, כולל פטל (Rubus spp.), פריבט (Ligustrum spp.), פירקנתה (Pyracantha spp.), ורד (Rosa spp.), שסק (Crataegus monogyna), אלון (Quercus spp.), ואלה (Corylus spp.)20. שיקול חשוב בעת שימוש בעלים שנאספו ממקורות חיצוניים הוא שהתוכן התזונתי פחות נשלט מאשר במערכות מעבדה המסתמכות על תזונה סטנדרטית (למשל, Drosophila melanogaster), דבר שעלול להוביל לשונות תזונתית. כדי לסייע בהגבלת תופעה זו, השתמשנו באותו מין צמח מאותו מיקום בכל העונות, וסיפקנו עלים לכל הכלובים פעם בשבוע במהלך התחזוקה השוטפת של הכלובים. ענפי הקיסוס ששימשו להאכלה הכילו בדרך כלל שילוב של עלים צעירים ובוגרים; לא בחרנו ענפים עבור שלב התפתחות ספציפי של העלה. כל העלים נשטפו לפני הוספתם לכלובים. לוח הזמנים השבועי להחלפה, שבמסגרתו הוסרו כל העלים והוחלפו באותו היום, יושם למען העקביות ולניהול היקף המושבה. עלי קיסוס חתוכים נשמרו בכלי מלאי מים בתוך הכלובים כדי לשמור על הידרציה לאורך השבוע. ברוב המקרים, העלים נשארו במצב טוב למשך שבוע מלא, אם כי לעיתים התרחשו התייבשות או התכלות, ובמקרים אלה החלפנו את העלים בפרק זמן קצר מ-1 שבוע.
גודל מושבה, שיעורי הישרדות ורבייה בבגרות
הקמה נכונה של המושבה וניהול קפדני של צפיפות האוכלוסייה היוו מפתח לשמירה על בריאות המאגרים. שמירה על מקסימום של כ-500 שבלולים בוקעים או 50 בוגרים לכל תא בממדים של 61 cm x 61 cm x 91.5 cm תמכה בתנאים יציבים, בתחזוקת המושבה ובתצפיות התפתחותיות הניתנות לשחזור.
השוואה בין התמותה היומית הממוצעת למספר הפרטים הבוגרים המייסדים בכל כלוב (איור 4A ו- טבלה 1) לא חשף קשר צפוי בין שני הפרמטרים הללו. באופן דומה, לא נמצא קשר ניבוי חזק בין המספר הכולל של הפרטים הבוגרים המייסדים לבין סך ייצור הביצים (איור 4B, טבלה 1ו- טבלה 2). במקום זאת, בכלובים שבהם הייתה תמותה יומית ממוצעת נמוכה יותר של בוגרים, נצפתה נטייה קלה לתפוקת ביצים יומית ממוצעת גבוהה יותר (איור 4C). עם זאת, הבדלים בין הכלובים מרמזים כי ייצור הביצים היה שונה בין הפרטים הבוגרים (טבלה 1 ו- טבלה 2), מה שעשוי להצביע על כך שגורמים מעבר להישרדות המבוגרים תורמים לדפוסי הפוריות, וכי נקבות בודדות עשויות להוות שונות במספר הביצים שהן מטילות בכל יום.
ייצור הביצים בכל הכלובים שנ monitored ירד בדרך כלל במהלך הניסוי (איור 2). ברוב הכלובים נרשמו שיעורי הטלת ביצים יומיים הגבוהים ביותר בשלב מוקדם של התקופה הרבייתית (50 הימים הראשונים), ולאחר מכן הייצור פחת בהדרגה (איור 2). תבנית זו עקבית עם התצפית שלנו שפרטים מגיעים בדרך כלל לבגרות מינית ומתחילים להטיל ביצים בערך 135 ימים לאחר הבקיעה, ושתמותה מתחילה כ-90 ימים לאחר מכן (~225 ימים לאחר הבקיעה; נתונים לא מוצגים).
עיתוי ודינמיקה של הבקיעה
בכל מנות הביצים שננטרו, רוב הבקיעה התרחשה בתוך פרק זמן עקבי של 12 ימים לאחר תחילת הופעת הבוקעים (איור 3D). באופן דומה, לא נמצא מתאם בין גודל המנה לבין העיתוי של השלמת בקיעה של 90% (איור 3A), ורוב המנות הגיעו להשלמת בקיעה של 90% בין הימים 10 ל-14 לאחר הופעת הבוקע הראשון (איור 3B). תקופת בקיעה צפויה זו היא מאפיין שימושי בניהול מושבות של C. morosus, שכן היא מאפשרת לקבץ את הבוקעים לקבוצות (cohorts) בעלות גיל דומה, מה שמשפר את דיוק שלבי ההתפתחות ומפחית שונות ניסויית. הידיעה מתי תתרחש בקיעה המונית מאפשרת גם תכנון טוב יותר של תחלופת הכלובים והקצאת משאבים, כולל הכנה בזמן של הכלובים, העלווה וחומרי המעקב, דבר החשוב במיוחד עבור מחקרים רחבי היקף או מחקרים ארוכי טווח. למרות שנסקרו מיני Phasmatodea בעלי רבייה מינית ומינים בעלי רבייה פרטנוגנטית, איננו מכירים ראיות לכך ששיטת הרבייה לבדה גורמת להבדלים בתזמון האמבריוגנזה. תחת זאת, דווח כי השונות בהתפתחות היא ספציפית למין ומושפעת מתנאים סביבתיים2.
טיפול בביצים ושיקולי תשתית
שיטת הטיפול בביצים שלנו כוללת איסוף ביצים ישירות מרצפת הכלוב והדגרה שלהן בצלחות פטרי מאווררות. גישה זו הופכת את הביצים לניתנות לתצפית קלה, בניגוד למערכות גדלה של חגבים האוספות ביצים בתשתיות כגון סיב קוקוס או פתיליי כותנה21. האקסוכוריון (exochorion) הקשיח של ביצי C. morosus מספק הגנה במהלך הטיפול ומבטיח עמידות מפני התייבשות, מה שמאפשר הדגרה בטוחה בצלחות פטרי ללא תשתית נוספת תחת תנאי התרבית שלנו. יחד, פרוצדורות סטנדרטיות אלו מספקות גישה מובנית לשמירה על אוכלוסיות בריאות של C. morosus לצורך מחקר התפתחותי, התנהגותי, גנטי או פיזיולוגי הניתן לשחזור. בקרות סביבתיות עקביות (23 °C, 70% RH, 12:12 LD), תחזוקה סדירה של הכלוב ולוחות זמנים התפתחותיים צפויים הופכים את C. morosus למודל נגיש וזול. חשוב לציין כי בניגוד למערכות גדלה מסוימות של חגבים שבהן צפיפות, קניבליזם או עומס פתוגנים עלולים לערער את יציבות המושבות במהירות22, קל לתחזק את C. morosus, מה שהופך אותם למתאימים מאוד לניסויים רחבי היקף ומחקרים המקיפים מספר דורות. ככל ש-C. morosus יאומץ באופן נרחב יותר כמין מודל המימטבולי (hemimetabolous), השימוש בשיטות סטנדרטיות אמור לקדם את היכולת לשחזר ולהשוות תוצאות בין מחקרים בתחומים מרובים של ביולוגיה של חרקים.
הישרדות מהבקיעה ועד לבגרות
שיעור ההישרדות משלב הבקיעה ועד לבגרות במחקרנו (~13%) נמוך משמעותית מזה שדווח במחקר כמותי אחר של *C. morosus* הישרדות הנימפות בתנאי מעבדה מבוקרים, שבהם 68% מהפרטים שרדו עד לבגרות תחת הגבלה קלורית, ועד 87% תחת ad libitum האכלה23אנו מעריכים כי שיעור ההישרדות הנמוך יותר שצפינו במושבה שלנו (~13%) ביחס לדיווח הקודם נובע מהבדלים באופן שבו גודלו בעלי החיים, אשר משקפים בתורם את המטרות השונות של הגידול שלנו לעומת אלו של המחקר הקודם. הפרוטוקול שלנו תוכנן כדי לתחזק מושבות גדולות המתרבות באופן רציף, ולא כדי למקסם את ההישרדות של קבוצות בודדות. לפיכך, השארנו את בעלי החיים בצפיפות גבוהה יחסית, בניגוד למחקר הקודם, שבו גודלו בעלי חיים מבודדים מהשלב של הביצה ועד לבגרות בכלובים אינדיבידואליים.23אנו מעריכים כי שיטת התרבית בצפיפות גבוהה המתוארת כאן עשויה להגביר את התמותה בהשוואה לגידולי בידוד, במיוחד בשלבי הנימפה המוקדמים, שבהם פרטים עשויים להיות רגישים יותר לצפיפות או לתחרות. בכלובים הגדולים יותר שלנו, ייתכן שגם השונות באיכות הצמח מילאה תפקיד, בהשוואה לגישה של גידול פרטני, שבה הוזנו הפרטים בדיסקיות בגודל מבוקר שנגזרו מעלי הצמח.23עם זאת, למרות שיעור ההישרדות הנמוך יחסית שלו, המושבה שלנו ייצרה באופן עקבי מספרים גדולים של ביצים ונשרה יציבה לאורך זמן (איור 1, איור 3, טבלה 1ו- טבלה 2). הדבר מרמז כי הגישה המתוארת כאן יעילה לשמירה על תרבית מעבדה לטווח ארוך.
גורמים המשפיעים על ההישרדות ומגבלות הפרוטוקול
מספר גורמים בפרוטוקול זה עשויים להשפיע על שיעור ההישרדות ויש לבקר אותם בקפידה. צפיפות האוכלוסייה היא פרמטר חשוב, שכן צפיפות יתר עלולה להפחית את ההישרדות, במיוחד בשלבי הגוזל (instar) המוקדמים. פרמטר נוסף המשפיע על ההישרדות הוא הידרציה נאותה, בייחוד בשלבי הגוזל המוקדמים. כל ההליכים ותזמון הפעולות המתוארים בפרוטוקול מבוססים על התנאים הסביבתיים הספציפיים ששימשו במחקר זה. עם זאת, שינויים בלחות, בטמפרטורה, בזרימת האוויר או בסוג הצמח עשויים להשפיע על תדירות התזית המים, על תדירות החלפת העלווה, על זמן בקיעת הביצים ועל ההישרדות הכללית. לדוגמה, בתנאי גידול יבשים יותר, ייתכן שיהיה צורך בתזית מים תכופה יותר ובהחלפת צמחים תכופה יותר כדי לשמור על ההידרציה. מינים שונים של צמחים עשויים להשפיע גם על ההזנה וההתפתחות. יש להתאים גורמים אלו בהתאם לתנאי הגידול ולמטרות הניסוייות. עבור יישומים הדורשים שיעור הישרדות גבוה של צעירים, מעקב פרטני או בדיקות התנהגותיות, ייתכן שצפיפויות התחלה נמוכות יותר יהיו עדיפות.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים.
תודות
פרויקט זה נתמך על ידי מענק ה-National Science Foundation מספר IOS 22207477 ל-CGE, שהוא חוקר במכון הרפואי של הווארד יוז (Howard Hughes Medical Institute). אנו מציינים כי Carausius morosus נחשב כמקורו בטאמיל נאדו, הודו, וכי תרביות מעבדה של מין זה מוחזקות מחוץ להודו לפחות מאז 1908. אנו מודים בכנות ל-Stanislav Gorb ו-Thies Büscher (אוניברסיטת קיל) על אספקת קבוצת הבוגרים הראשונית ששימשה להקמת התרבית שלנו, ולכל חברי מעבדת Extavour על תמיכתם, כולל חבר מעבדה לשעבר, ד"ר Upendra Bhattarai (שיוך נוכחי: אוניברסיטת בראון), שהקים את המושבה הראשונית.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שקי פוליפרופילן ניתנים לסטריליזציה באוטוקלאב, 30.5 cm × 61 cm | VWR | 95042-554 | להשמדת פסולת של חרקים, ביצים ומכלי גידול |
| פח פסולת ביולוגית | N/A | N/A | להשלכה לאחר הקפאה |
| פינצטה פלסטית בעלת קצה קהה | Amazon | B07YZ5FB27 | לאיסוף ולטיפול בביצים ובבקיעות |
| חדר מבוקר אקלים או אינקובטור | N/A | N/A | לשמירה על 23 °C, 70% RH, ומחזור תאורה של 12:12 שעות אור-חושך |
| כפפות חד-פעמיות | N/A | N/A | לאיסוף ביצים ולטיפול בפסולת |
| צלחות פטרי חד-פעמיות, 150 × 15 mm | VWR | 25384-326 | לאיסוף ביצים |
| צלחות פטרי חד-פעמיות, 60 × 15 mm | VWR | 25384-092 | לדגירה של ביצים |
| עלים טריים (קיסוס, פטל או עלי ורד) | N/A | N/A | מקור מזון ללא חומרי הדברה |
| מקפיא, -20 °C | N/A | N/A | להדרה/השמדה ולהקפאת ביצים או פסולת לפני השלכה |
| מכלי גידול רשת לחרקים | Amazon | B09GS2CH1G | לגידול חרקים |
| בקבוק התזה, 250 mL | Amazon | B000H88PCU | להרטבת מכלי הרשת |
| מיכל זכוכית גבוה, גובה 18–23 cm | N/A | N/A | להחזקת מים וגבעולי צמחים |
| מי ברז | N/A | N/A | להתזה ולשמירה על לחות העלים |
| משטח מיון לבן או מגש | N/A | N/A | להבחנה בין ביצים להגלמות בזמן המיון |
מקורות
- Adamski Z, et al. Beetles as model organisms in physiological, biomedical and environmental studies: a review. Front Physiol. 2019;10:319.
- Schwander T, et al. On the repeated evolution of parthenogenesis in stick insects. Evolution. 2026;80(3):513-24.
- Arias AM. Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century. Methods Mol Biol. 2008;420:1-25.
- Dürr V, König Y, Kittmann R. The antennal motor system of the stick insect Carausius morosus: anatomy and antennal movement pattern during walking. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 2001;187(2):131-44.
- Roth HL. XIX. Observations on the growth and habits of the stick insect, Carausius morosus, Br.; intended as a contribution towards a knowledge of variation in an organism which reproduces itself by the parthenogenetic method. Trans R Entomol Soc Lond. 1917;64(3-4):345-86.
- Pijnacker LP. The maturation divisions of the parthenogenetic stick insect Carausius morosus Br. (Orthoptera, Phasmidae). Chromosoma. 1966;19(1):99-112.
- Browaeys-Poly E. Extracellular matrix of the regeneration chamber and plasma membranes of the epidermis during leg regeneration in an insect Carausius morosus. Tissue Cell. 1991;23(1):41-55.
- Di Cristina G, et al. Pioneering genome editing in parthenogenetic stick insects: CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in Medauroidea extradentata. Sci Rep. 2025;15(1):2584.
- Cavallin M. [“Substitutive polyembryony” and the problem of germinal line origin in the phasma Carausius morosus Br]. C R Acad Hebd Seances Acad Sci D. 1971;272(3):462-5.
- Giorgi F, Cecchettini A, Masetti M. Changes in the patterns of proteins stored and synthesized by developing embryos of the stick insect Carausius morosus Br. Comp Biochem Physiol B. 1990;95(1):107-13.
- Pijnacker LP, Godeke J. Development of ovarian follicle cells of the stick insect, Carausius morosus Br. (Phasmatodea), in relation to their function. Int J Insect Morphol Embryol. 1984;13(1):21-8.
- Pijnacker LP. Effect of centrifugation of the eggs on the sex of Carausius morosus Br. Nature. 1966;210(5041):1184-5.
- Hales KG, Korey CA, Larracuente AM, Roberts DM. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 2015;201(3):815-42.
- Truman JW, Riddiford LM. The evolution of insect metamorphosis: a developmental and endocrine view. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2019;374(1783):20190070.
- Truman JW, Riddiford LM. The origins of insect metamorphosis. Nature. 1999;401(6752):447-52.
- Bedford GO. Description and development of the eggs of two stick insects (Phasmatodea: Phasmatidae) from New Britain. Aust J Entomol. 1977;15(4):389-93.
- Kim MJ, et al. Development of a phenology model for egg hatching of walking-stick insect, Ramulus mikado (Phasmatodea: Phasmatidae) in Korea. Forests. 2023;14(9):1710.
- Lee J, et al. Temperature-dependent development and oviposition models of Ramulus irregulariterdentatus (Phasmida: Phasmatidae). J Asia Pac Entomol. 2018;21(3):903-13.
- Donoughe S, Extavour CG. Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus. Dev Biol. 2016;411(1):140-56.
- Conle O, Hennemann F, Riquelme PV, Kneubühler B. Phasmatodea [Internet]. 2000. Available from: https://www.phasmatodea.com/
- Ventura MK, Stull VJ, Paskewitz SM. Maintaining laboratory cultures of Gryllus bimaculatus, a versatile orthopteran model for insect agriculture and invertebrate physiology. J Vis Exp. 2022; (184):e63277.
- de Miranda JR, et al. Virus diversity and loads in crickets reared for feed: implications for husbandry. Front Vet Sci. 2021;8:642085.
- Roark AM, Bjorndal KA. Bridging developmental boundaries: lifelong dietary patterns modulate life histories in a parthenogenetic insect. PLoS One. 2014;9(11):e111654.
הדפסות חוזרות והרשאות
