מאמר שיטה

בדיקת הדמיה מבוססת לוחות לכימות תגובות פוטופריודיות ב-Neurospora crassa באמצעות התפתחות פרוטופריתציה

DOI:

10.3791/71271

⸱

9 ביוני 2026

 , 
1Center for Computational and Integrative Biology (CCIB) Rutgers, The State University of New Jersey, 2Rutgers University-Camden, Department of Biology Rutgers, The State University of New Jersey, 3Institute for Empowering Equitable Education in STEM (E3-STEM)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבחן פרוטופריתציה מכמת תגובות פוטופרידמיות ב-Neurospora crassa על ידי מדידת היווצרות פרוטופריתציה במחזורי אור–חושך מוגדרים. שיטה מבוססת לוחות זו מספקת גישה פשוטה וניתנת להרחבה להשוואת תגובות התפתחותיות התלויות באור-מחזור בין תנאים ניסיוניים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurospora crassa היא אורגניזם מודל מבוסס היטב לחקר תזמון ביולוגי והתפתחות מבוקרת על ידי אור. מבחן פרוטופריתציה (PPA) הוא שיטת דימות מבוססת לוחות לכימות תגובות פוטופריתציות על ידי מדידת היווצרות פרוטופריתציה כתוצאה התפתחותית. מטרת הפרוטוקול היא לספק זרימת עבודה ניתנת לשחזור וניתנת להרחבה להערכת האופן שבו מחזורי אור–חושך מוגדרים משפיעים על התפתחות המין של פטריות. במבחן זה, תרביות פטריות מגודלות על מדיום חציאה סינתטי בתנאי פוטופריד מבוקרים, ולאחר מכן מוסרת באופן סטנדרטי של קונידיות שטחיות לשיפור הוויזואליזציה. פרוטופריתציות נמדדות על ידי ספירה ידנית מבוססת תמונה, וספירות ממוצעות לכל לוח משמשות להשוואות סטטיסטיות בין תנאי פוטו-פרד. בניגוד לגישות קודמות, ה-PPA משלבת תנאי תרבית סטנדרטיים, חשיפה מבוקרת לפוטו-פרוויד, ודימות מבוסס רבעים, כדי לאפשר השוואות כמותיות שחוזרות בין זנים. תהליך עבודה זה חורג מעבר לפרוטוקול בסיסי על ידי הקמת מסגרת עקבית וניתנת להרחבה למדידת פלט התפתחותי התלויי פוטו-פרוייד בתנאים ניסיוניים מוגדרים. השיטה דורשת כשבוע מהחיסון ועד הניתוח וניתן ליישם אותה על מספר זנים בתנאי סביבה מוגדרים. ה-PPA מספק פלטפורמה פשוטה ונגישה לניתוח השוואתי של התפתחות תלויה בפוטפריד בפטריות בתנאי מעבדה מבוקרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבחן הפרוטופריתציה (PPA) מכמת תגובות פוטופריודיות בפטרייה Neurospora crassa. אורגניזמים רבים מודדים את אורך היום והלילה כדי לתאם תהליכים ביולוגיים בתופעה הידועה בשם פוטופריודיזם 1,2,3,4,5,6,7,8. במבחן זה, התפתחות המבנה המיני הנשי, הפרוטופריתציום, משמשת כפוקסי מדיד התלוי באור לתגובה פוטופורידית. למרות שפוטופריודיזם מאופיין היטב בצמחים באמצעות ניסויים בשעות הלילה3, קיימות פחות גישות סטנדרטיות לכימות תגובות פוטופריודיות באאוקריוטים לא-פוטוסינתטיים כמו פטריות. N. crassa מספקת מערכת מודלים נוחה למטרה זו בזכות הגנטיקה המוגדרת היטב ומסלולי ההתפתחות המגיבים לאור. ויסות תזמון הרבייה התלוי באור-מחזור נצפתה בין אורגניזמים 1,2,3,4,5,6,7,8, מה שתומך ברלוונטיות של תגובות פיזיולוגיות מונעות אור; עם זאת, מחקרים מכניים בפטריות נותרו מוגבלים בשל היעדר בדיקות שכפולות.

פרוטופריתציה הן מבני מין נשיים מוקדמים ב-N. crassa. הם נובעים מאסקוגוניה, שמפתחת טריכוגינים מפותלים המתחברים עם היפאות או קונידיות מסוג9 ההפוך. לאחר האיחוד, גרעינים מהבן הזוג "הזכר" נכנסים לפרוטופריטציום. מספר הפרוטופריתציה המיוצר מוסדר עונתית ומושרה באורבעוצמה 10. ויסות פוטופורידיות הוא מרכזי באקולוגיה, כרונוביולוגיה ופיזיולוגיה של פטריות, מכיוון שתהליכים רבים מבוקרי שעון תלויים באור. האור משפיע על מסלולים גנטיים רבים, כולל קולטני אור, קינאזות ומנגנוני העברת אור הקשורים להתפתחות המינית11. פרוטופריתציה מתאימה למדידת פלט פוטופרוידי, משום שקל לראות אותן במיקרוסקופ ומגיבות ברגישות לאור.

למרות חשיבות הפוטופריתציה בפטריות, קיימות מעט מאוד בדיקות סטנדרטיות וניתנות לשחזור כדי לכמת את ייצור הפרוטופריתציה במחזורי אור מבוקרים. בדיקה מבוססת פלטות בעל תפוקה בינונית היא בעלת ערך משום שפטריות הן אורגניזמים מודליים זולים וקל לתחזוקה, ומאפשרים ניתוח שיטתי של התפתחות מינית ותפקוד גנים המושרה על ידי אור. רוב מחקרי הפוטופריודיזם התמקדו בצמחים, בעוד שמסגרות כמותיות מקבילות למערכות פטריות נשארות מוגבלות. באורגניזמים אחרים, כולל חרקים, תופעות התלויות באור כמו דיאפוזה מאופיינות היטב7, אך חסרות גישות דומות בפטריות. פער זה מגביל השוואה שחזורית של תגובות פוטופריודיות בין זנים ותנאים ניסיוניים.

ה-PPA מבוסס על מחקר משנת 2004 שמדד את ייצור הפרוטופריתציה לאורך אורכי יום הולכים וגדלים, מחושך קבוע לאור קבוע, במוטנט הרצועה (bd) (ras-1bd), ששימש במחקרים צירקדיים 4,12. שינויים תלויים בפוטפריד בייצור פרוטופריתציה נצפו ברקע זה. זרימת העבודה הנוכחית מתאימה ומרחיבה גישה זו באמצעות זן הייחוס FGSC 2489, המקושר לריצוף גנום מלא ולמשאבי הדחפה13,14. המבחן מכמת את המספר הממוצע של פרוטופריטתציה שנוצרה תחת פוטופרדיות מוגדרות לאורך שבוע אחד כמדד לתגובה פוטופריודית. גישה זו מתקנת את תנאי התרבית, הדמיה והכמות, ומאפשרת השוואה שחוזרת בין תנאים ניסיוניים וזנים. התקדמויות מתודולוגיות מרכזיות כוללות תנאי תרבית סטנדרטיים מבוססי פלטות, פרמטרים מוגדרים לחשיפה לפוטופרדיה, הדמיה מבוססת רבעים, ותהליך כימות שניתן לשחזר.

פרוטוקול זה מכמת תגובות פוטופריודיות ב-N. crassa על ידי מדידת היווצרות פרוטופריתציה לאחר חשיפה למחזורי אור–חושך מוגדרים. לכל מצב פוטופריודי, נעשה שימוש בארבעה רפליקטים ביולוגיים, שכל אחד מהם מורכב מלוח חצייה סינתטי (SC) מחוסן באופן עצמאי. ארבע תמונות נאספות בכל לוח וממוצעות ליצירת ערך יחיד לכל שכפול ביולוגי לניתוח סטטיסטי. הלוחות מודגרים במשך שבעה ימים במחזורי פוטו-מדוד מכוילים (למשל, מחזורי אור–חושך של 12 שעות או 8 שעות ו-16 שעות).

מתאם נתונים ממוקם בתוך תא הגידול כדי לרשום באופן רציף את עוצמת האור, הטמפרטורה והלחות, ובכך לאמת תנאי סביבה יציבים. עוצמת האור נשמרת מעל 1,000 לוקס, כאשר רמות נמוכות יותר מפחיתות את ייצור הפרוטופריתציה. תאורה מופרזת נמנעת כדי למנוע עלייה בטמפרטורת התא והשפעות תרמיות מבלבלות. לאחר הדגירה, המאקרוקונידיות מוסרות בעדינות באמצעות מגבת נייר רטובה רוויה ב-70% אתנול. ארבעה רבעים במרווחים שווים בהיקף כל לוח מצולמים בהגדלה של 40× באמצעות מיקרוסקופ סטריאו תחת תאורת שדה בהיר. פרוטופריתציות נספרות ידנית באמצעות חבילת עיבוד תמונה, וספירות ממוצעות לכל לוח משמשת להשוואות סטטיסטיות בין פוטופרקיורדים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הריאגנטים, התוכנה והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת מדיה וחומרים

(זמן משוער: 1–1.5 שעות פעילות פעילות; קירור בלילה אופציונלי)

  1. הכנת מדיה סינתטית (SC)
    1. הכינו מדיום SC: 0.2% סוכרוז, 5 מיקרוגרם/ליטר ביוטין, 1.5% אגר, ומלחים של ווסטרגארד (pH 6.5 עם 1 N NaOH)15.
    2. אוטוקלב של המדיום. נתן לו להתקרר ל-50–55 מעלות צלזיוס עד שהוא מגיע למצב שניתן לשפוך.
      אזהרה: השתמש בכפפות עמידות לחום בעת הסרת בקבוקים מהאוטוקלאב.
  2. צלחות יציקה
    1. פיפט 10 מ"ל מדיום מותך לתוך צלחות פטרי 60 מ"מ באמצעות פיפטה חד-פעמית.
    2. אפשר לצלחות להתגבש בטמפרטורת החדר למשך 30–45 דקות.
    3. אחסון צלחות הפוך בטמפרטורה של 4°C למשך עד 4 שבועות.
      הערה: שמור על הידרציה לצלחת. אין לאחסן צלחות ליותר מ-4 שבועות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  3. הכינו זנים פטרייתיים
    1. גדלו כל זן במבחנות זכוכית קטנות המכילות מדיום מלא או מינימלי שהוכנה לפי הוראות המעבדה15.
    2. דגרו צינורות בחושך קבוע (DD) בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עד שנוצר כיסוי מיצליאלי נראה על פני הצינור (בדרך כלל 2–3 ימים).
      אזהרה: לטפל בתרביות פטריות באמצעות שיטות מיקרוביולוגיות סטנדרטיות ולעבוד בתוך ארון בטיחות ביולוגית כדי למזער זיהום.

2. חיסון לוחות

(זמן משוער: 15–30 דקות לכל סט צלחות)

  1. קונידיה פטרייתית העברה
    1. החסן כל צלחת SC באמצעות טכניקת סטרילית ולולאת חיסון.
    2. הניחו את הקונידיות במרכז הפלטה כדי להבטיח צמיחה אחידה (איור 1A). קונידיה מופיעה כנבגים אבקתיים בהירים המכסים את פני השטח של המושבה.
    3. יש להחיל כ-1–2 מיקרוליטר של תלייה קונידיאלית מרוכזת (או לולאה מקבילה) כדי לתקן את החיסון בין הלוחות.
  2. הכינו צלחות לדגירה
    1. סגור את הלוחות היטב כדי למנוע זיהום תוך מתן החלפת גזים.
    2. סמנו כל פלטה בשם הזן, תאריך ומצב הפוטו-פרוייד.

3. הגדרת טיפול באור

(זמן משוער: 10 דקות הקמה + דגירה של 7 ימים)

  1. כיוון תא הגידול
    1. כוון את טמפרטורת התא ל-25 מעלות צלזיוס.
    2. הגדר לחות ל-50% (טווח מקובל: 40%–60%) כדי למנוע ייבוש צלחות.
    3. מחזורי פוטו-פרוייד בתוכנית: EQ (שוויון שוויוני): 12 שעות אור / 12 שעות חושך ו-SDP (יום קצר): 8 שעות אור / 16 שעות חושך
    4. כוון את עוצמת האור ל->1,000 לוקס ברמת הפלטה באמצעות מד אור מכויל. הימנע מעוצמות שמעלות את טמפרטורת התא מעל 25 מעלות צלזיוס.
      הערה: ודאו שאורות התא לא מתחממים יתר על המידה את הפנים.
      אזהרה: אין להשתמש בשקיות פרפילם או פלסטיק לשמירת הלחות, שכן הן מגבילות את החלפת הגזים ומפריעות לצמיחת הפטריות. אם אין בקרת לחות, יש למקם מאגר מים בתוך החדר.
  2. הצבת לוחות בתא
    1. סדר את הצלחות באופן שווה על המדפים כדי להבטיח חשיפה אחידה לאור אור.
    2. הניחו מתאם נתונים בתוך התא כדי לעקוב באופן רציף אחר טמפרטורה ולחות ולוודא תנאי סביבה יציבים.
  3. התחל את הבדיקה
    1. דגירה של לוחות תחת תקופת הפוטו-מתוכנת למשך 7 ימים ללא הפרעה.

4. ניטור והכנת לוחיות להדמיה

(זמן משוער: 15–20 דקות לכל צלחת)

  1. הסרת לוחות מהתא
    1. הסר את הלוחות לאחר 7 ימי דגירה.
    2. בדוק את הלוחות לצמיחה קונידיאלית והיווצרות פרוטופריתציה.
  2. לוחות נקיים לראות
    1. הסרת קונידיות משטח מכסה הפלטה וממשטח האגר באמצעות מגבות נייר קרועות (איור 1B).
    2. הרטיב מגבת נייר ב-1–2 מ"ל של 70% אתנול. טפחו בעדינות את משטח הפלטה 3–5 פעמים כדי להסיר את הקונידיה. אפשר לפלטות להתייבש באוויר למשך 1–3 דקות לפני ההדמיה (איור 1C).
      אזהרה: אתנול דליק; תתרחק ממקורות חום.
      הערה: הימנע מהפעלת לחץ מופרז. אין לגרור את המגבת על פני האגר, שכן הדבר עלול להזיק לתווך או להפריע לפרוטופריתציה.

5. דימות פרוטופריתציה

(זמן משוער: 5 דקות לכל צלחת)

  1. התכוננו להדמיה
    1. התקן מיקרוסקופ עם תאורה והגדלה עקבית (בדרך כלל 40×).
    2. ודאו שמשטח הצלחת יבש ונקי מפסולת.
  2. צילום תמונות
    1. תמונה של ארבעה רבעים במרווחים שווים בהיקף הלוח באמצעות הגדלה עקבית.
    2. סמן כל תמונה עם עיוות, מצב פוטופרוייד, מספר לוחית ומיקום הרבע.
    3. שמור תמונות בפורמט עקבי (למשל, TIFF) לניתוח.

6. כימות וניתוח נתונים

(זמן משוער: 10–20 דקות לכל לוח לספירה; 15–25 דקות לניתוח)

  1. רוזן פרוטופריתציה
    1. פתח כל תמונה בחבילת עיבוד תמונה.
    2. השתמש בתוסף Cell Counter כדי לספור ידנית פרוטופריתציה. לכלול בועות, ארטיפקטים של קצה ומבנים מעורפלים. ספור פרוטופריתציה מקובצת כיחידות נפרדות ומובחנות.
    3. ספירת רשומות לכל רבע ומחשבת ממוצע לכל לוחית.
  2. ניתוח נתונים
    1. ייבא נתונים כמותיים לתוכנת ניתוח סטטיסטי.
    2. בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות מבחן t של וולש להשוואות המוצגות באיור 2.
    3. יצר גרפים המשווים בין טיפולים, זנים או שכפולים של פוטו-פרד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר חיסון בזן מסוג פראי, הקונידיות כיסו את פני השטח של SC בתוך 36–48 שעות. לאחר 7 ימים של חשיפה לפוטו-פריד, נוצרה שכבת קונידיאלית צפופה והוסרה באמצעות מגבת נייר רטובה רוויה ב-70% אתנול (איור 1). שלב זה חשף את הפרוטופריתציה התחתונה מבלי לשבש את המבנה שלהן. במיקרוסקופיה, הפרוטופריתציה הופיעו כמבנים כהים ועגולים המפוזרים על פני הלוח. מבנים אלו הציגו מורפולוגיה כדורית והיו ניתנים להבחנה מההיפים הסובבים. בתוך לוח, פרוטופריתציות היו בדרך כלל אחידות בגודלן, והתפוצה שלהן השתנתה בהתאם לתנאי הפוטופרי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת ה-PPA היא להשתמש בהתפתחות המינית בפטריות כתחליף לקביעת האם אורגניזם תופס תקופת אור מסוימת. על ידי כימות המספר הממוצע של פרוטופריתציה הנוצרת במחזורי אור שונים, ניתן להעריך ולהשוות תגובות פוטופרידמיות בין תנאים. בהתאם לתצפיות קודמות 4,16, N. crassa מציג ייצור פרוטופריתציה גבוה יותר בתקופות אור דמויות שוויון משקל, בעוד שתנאי יום קצרים מניבים פחות מבנים (איור 2). מבחן זה מספק שיטה לבחינת תג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לקתרין מיינזה, מיו תינזר הטין אונג, איי טינזר טין אונג ומורגן ברטלסון על תמיכתם, עזרתם ותרומתם לפרויקט זה. המחברים גם מודים למחלקה לביולוגיה באוניברסיטת רטגרס–קמדן ולמרכז לביולוגיה חישובית ואינטגרטיבית (CCIB) על מתן תמיכה מוסדית, מתקני מחקר ומשאבים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אגרBD90000-786עבור מדיה מעבר סינתטית/מינימלית
להבת מבער אלכוהולWards470346-104להסטריליזציה של לולאה חיבור
סולפט ברזל אמוניום הקסה-הידרטSupelcoFX0245-1עבור מדיה מעבר סינתטית/מינימלית
אמוניום חנקתי (NH4NO3)BeanTown ChemicalBT134170-250Gעבור מדיה מינימלית
אוטוקלבVWR International76683-456להסטריליזציה של זכוכית וחומרי תרבית
ארון בטיחות ביולוגיThermoFischer Scientific 1323TSלהפחתת זיהום של הצלחות, והמעבדה.
ביוטיןVWR97061-444עבור מדיה מעבר סינתטית
חומצת בור (H3BO3)Electron Microscopy Sciences100503-696עבור מדיה מעבר סינתטית/מינימלית
סידן כלורי (CaCl2)AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLCJT1311-1עבור מדיה מעבר סינתטית
סידן כלורי די-הידרט (CaCl2·2H2O)Sigma-Aldrich223506-25Gעבור מדיה מינימלית
חומצה ציטרית מונוהידרט (C6H8O7·H2O)Sigma-Aldrich1002440500עבור מדיה מעבר סינתטית/מינימלית
סולפט נחושת פנטה-הידרט (CuSO4·5H2O H2O)BeanTown ChemicalBT121245-1KGעבור מדיה מעבר סינתטית/מינימלית
אתנולDecon Labs71001-754משמש להסרת קונדיות ממשטח הצלחת ולהסטריליזציה של לולאה חיבור
FIJI/ImageJהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH)N/Aלניתוח תמונות/ספירה
כפפותSW Safety Solutions76382-944לבטיחות
GraphPad PrismGraphPad Software, LLCN/Aלביצוע בדיקות סטטיסטיות ויצירת דיאגרמות
תא גידולCaron Products & Services6320 & 6340 Seriesניתן לתכנות למחזורי פוטו-פריוד
מרשם נתונים HOBOOnset Computer CorporationMX2202להקלטת עוצמת האור וטמפרטורה
לולאת חיבורVWR International10806-354להעברת חומר פטרייתי לצלחות פטרי
מגנזיום סולפט הפטה-הידרט (MgSO4·7H2O)BeanTown ChemicalBT145380-1KGעבור מדיה מעבר סינתטית/מינימלית
סולפט מנגן מונו-הידרט (MnSO4·H2O H2O)Sigma-Aldrich1059410250עבור מדיה מעבר סינתטית/מינימלית
מיקרוסקופ (Leica S6 D Greenough Stereo Microscope)Leica Microsystems10446297לצילום
Neurospora crassa FGSC 2489Fungal Genetics Stock Center74-OR23-1VA, JCM19069זן פטריות
מגבות ניירKimberly-Clark Professional, Scott ו-Kleenex6666114למזיגת מדיה
מרקר קבועSharpie30072לתיוג צלחות
צלחות פטריVWR International25384-164להצגת מדיה מעבר סינתטית
פיפטותVWR International75816-090למזיגת מדיה
אשלגן די-הידרוגן פוספט (KH2PO4)BeanTown ChemicalBT225070-500Gעבור מדיה מעבר סינתטית/מינימלית
אשלגן חנקתי (KNO3)Sigma-Aldrich221295-100Gעבור מדיה מעבר סינתטית
צינורות בדיקה זכוכית חד-פעמיים קטניםVWR International470211-698לגידול ראשוני של זן פטריות
נתרן כלורי (NaCl)VWR InternationalBDH9286-500Gעבור מדיה מעבר סינתטית
נתרן ציטראט די-הידרט (Na3C6H5O7·2H2O)VWR97061-008עבור מדיה מינימלית
נתרן מוליבדט די-הידרט (Na2MoO4·2H2O)Supelco1.06524.1000עבור מדיה מעבר סינתטית/מינימלית
סוכרוזVWR InternationalBDH9308-500Gעבור מדיה מעבר סינתטית/מינימלית
סולפט אבץ הפטה-הידרט (ZnSO4·7H2O)BeanTown ChemicalBT122545-500Gעבור מדיה מעבר סינתטית/מינימלית

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים