ציטומטריית זרימה רב-מרכזית למחלה שאריתית מדידה של לוקמיה מיאלואידית חריפה עם LAIP/DfN ו-CD34+CD38 - אוכלוסיות מועשירות בתאי גזע לוקמיים

סיכום

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה של ציטומטריה זרימה רב-מרכזית למדידת מחלות שארית מדידה של לוקמיה מיאלואידית חריפה, באמצעות ניתוח LAIP/DfN (אימונופנוטיפ/שונה מהנורמה) הקשור ללוקמיה ואוכלוסיות CD34⁺CD38⁻ המועשירות בתאי גזע בלוקמיה בהגדרה פנוטיפית.

תקציר

מומלץ מעקב אחר מחלה שאריתית מדידה (MRD) להערכת תגובת טיפול בניסויים קליניים של לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) בהתאם להנחיות ELN 2025. מטרת המחקר הייתה ליישם מעקב סטנדרטי אחר מטופלים באמצעות גישת זרימת MRD הרומנית ב-30 מעבדות המטולוגיה צרפתיות המשתתפות בניסויים קליניים של AML. כדי להשיג תוצאות דומות, הרשת קבעה המלצות מהליכים במעבדה רטובה ועד דוחות קליניים. עיצבנו פאנל בן 3 צינורות עם סמנים משותפים חובה ב-8 צבעים לכל צינור, לפי המלצות ELN, כדי לזהות דפוסי אימונופנוטיפ/שונה מהנורמה (LAIP/DfN) הקשורים ללוקמיה בתאי נפח ובאוכלוסיות מועשרות לתאי גזע לוקמיים (LSC) בחלק CD34⁺CD38⁻ . עמוד שדרה של CD34/CD38/CD45/CD117 שימש, שהושלם על ידי סימני שושלת לצינור הראשון, סמנים הקשורים ל-LSC עבור הצינור השני, וסמנים מונוציטיים והתמיינוניים לצינור השלישי. לוח זה יכול לשמש בפורמטים של 8, 10 ו-12 צבעים ומיושם על מספר פלטפורמות ציטומטר זרימה קונבנציונליות. אנו מציעים הגדרות ציטומטר זרימה מותאמות לכל פלטפורמה.

הרמוניזציה של הרגישות בין ארבע הפלטפורמות בוצעה באמצעות חרוזי קשת בענן בעלי 8 פסגות. צביעת חיסון בוצעה לאחר ליזיס בכמויות גדולות. כדי לזהות הטיה בין פלטפורמות, מדד הצביעה נבדק באמצעות דגימות מח עצם טריות ובריאות במקביל בארבע הפלטפורמות. דגימות איכות ובקרת איכות סדירות של מח עצם חולקו בין המעבדות להערכת איכות חיצונית רטובה (EQA) לאימות כל שלבי הפרוטוקול. לבסוף, תקנון אסטרטגיית ניתוח הנתונים שהושגה במרכזים הוערך באמצעות EQA יבש על ידי שיתוף קבצי נתוני MRD FCS. היתכנות הגישה הרב-מרכזית הזו דורשת התאמת רגישות הכלי והכנת הדגימה, וכן הכשרה והכשרה שיטתית של מפעילי אנליזה.

מבוא

מחלה שאריתית מדידה (MRD) מתייחסת למספר קטן של תאי לוקמיה שנשארים במהלך או לאחר הטיפול ואינם ניתנים לזיהוי לפי מורפולוגיה, במיוחד במקרים של הפוגה מלאה עם פחות מ-5% פיצוצים במח העצם. מומלץ לניטור MRD להערכת תגובת טיפול בניסויים קליניים של לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) בהתאם להנחיות ELN 2025¹. מלבד שיטות ביולוגיה מולקולרית, כולל PCR של טרנסקריפטאז הפוך (RT-qPCR) וריצוף מהדור הבא (NGS), ציטומטריית זרימה רב-פרמטרית (MFC) היא גישה נפוצה².

כדי להשיג תוצאות עקביות של MRD, במיוחד בניסויים קליניים, קיימות שתי אסטרטגיות: ריכוז מדידת MRD במעבדה אחת או יישום פרוטוקול שמבטיח שחזוריות בין המעבדות השונות המעורבות בקביעת MRD. מספר הדגימות, גודל הניסוי, ויכולת המעבדות לעבד נפחי דגימות גדולים או קטנים יכולים לקבוע את הבחירה בין האסטרטגיות הללו. אם נבחרת אסטרטגיה רב-מרכזית, יש לטפל בהבדלים בין פלטפורמות הציטומטר ובצורך בניתוח השוואתי בין אתרים.

למטרה זו, אנו מתארים גישה סטנדרטית של זרימת MRD רב-מרכזית ורב-פלטפורמית, המשלבת ניתוח אימונופנוטייפ/שונה מהנורמה (LAIP/DfN) הקשור ללוקמיה וזיהוי מועשר לתאי גזע ללוקמיים (LSC) המוגדרים בפנוטיפית, ומיושמים ב-30 מעבדות המטולוגיה צרפתיות בהתבסס על המלצות ELN ודוחות קודמים ^3,4.

ציטומטריית זרימה מאפשרת להגדיר בעת האבחון את "החתימה" של הלוקמיה הכוללת את הביטוי הספציפי של הסמנים על הפיצוצים של המטופל: LAIP. לאחר הטיפול, זרימת MRD מאפשרת ניטור של LAIPs שזוהו באבחנה. מכיוון שפיצוצים לוקמיים יכולים להתפתח ולשנות את האימונופנוטיפ שלהם תחת לחץ טיפולי, יש ליישם באופן שיטתי אסטרטגיה שנייה: גישת DfN, המתבססת על זיהוי תאים עם תכונות שמבדילות אותם מההמטופואזיס התקין. טכניקה זו יכולה גם לזהות הופעת סמנים חדשים על פיצוצים במהלך המחלה והטיפול בה.

בקבוצת זרימת AML הצרפתית, עיצוב הפאנל התבסס על מחקר HOVON שפורסם קודם לכן על הגדרת דפוסי תאי לוקמי. אין סמן LSC או LAIP אוניברסלי, ולכן תכננו לוח תלת-צינורות המאפשר זיהוי בו-זמני של אוכלוסיות מועשרות ב-LSC ב-LAIP, DfN ו-CD34⁺CD38⁻ . עמוד שדרה המבוסס על CD34/CD38/CD45/CD117 שימש בכל החצוצרות, שהושלם על ידי סמני שושלת בצינור הראשון, סמנים הקשורים ל-LSC בצינור השני, וסמני שושלת מונוציטית או התמיינות בצינור השלישי להשלמת הגדרת LAIP ב-AML עם פיצוצים מונוציטיים. כל שלושת הצינורות נרכשים בעת האבחון ובדגימות מעקב.

בהתחשב בפתופיזיולוגיה של לוקמוגנזה, תשומת הלב עברה מחקר נפח הבלסט לזיהוי החלק הצעיר ביותר כאוכלוסיות מועשירות בתאי גזע לוקמיים. דיק ועמיתיו הדגימו את ההטרוגניות של לוקמיה על ידי תיאור LSCs של CD34⁺CD38⁻ עם פוטנציאל לייצר לוקמיה בעכברים חסרי חיסון ^5,6. בכימות LSC באבחון ובמעקב, נעשים מאמצים לסטנדרטיזציה של פאנלים ואסטרטגיות ניתוח של נוגדנים^במסגרת קבוצת העבודה ^1,7 של ELN DAVID. נכון להיום, שני פאנלים, HOVON ו-ALFA, משתמשים בסמנים דיכוטומיים של LSC כדי להבחין בין אוכלוסיות מועשירות ב-LSC לבין תאי גזע המטופואטיים רגילים במרחב CD34⁺CD38^{− 8,9}.

השיטה המתוארת כאן משלבת הכנת דגימה סטנדרטית, עיצוב פאנל נוגדנים משותף, הגדרות רגישות מותאמות לפלטפורמה, ניתוח מועשר ב-LSC ב-LAIP/DfN ו-CD34⁺CD38⁻ , הערכת איכות חיצונית, ודיווח קליני מתואם למעקב אחר זרימת MRD רב-מרכזית של AML.

פרוטוקול

הפרוטוקול פועל לפי ההמלצות וההנחיות של ועדות האתיקה של מרכזי בתי החולים האוניברסיטאיים הצרפתיים. כל המטופלים חתמו על הסכמה מדעת לפי החוק הצרפתי. פרוטוקול המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה האנושית של CHU ליון ועל ידי ועדת האתיקה של מועצת הביקורת המוסדית של ליל CHU בהתאם להצהרת הלסינקי (מצפה HDF-AML, CNIL 2214454v0). לגבי אלוגרפט, התורמים נכללו במאגר ProMISE האירופי המבוסס באינטרנט ונתנו הסכמה מדעת לאיסוף הנתונים האישיים שלהם. חילוץ וניתוח הנתונים בוצעו בהתאם לוועדת האתיקה המקומית (CNIL2093819). כל קבצי הזרימה של FCS ששימשו לסקירת רשת היו אנונימיים לחלוטין באמצעות סקריפט פייתון.

1. הגדרת ציטומטר

1. קבעו ערכי יעד המותאמים לכל ציטומטר באמצעות חרוזי קשת בענן בעלי 8 שיקים.
2. הגדר כל מכונה לפי ערכי היעד המוצגים בטבלה 1. ודאו שכל ערוץ מגיע לערך היעד ± 5%. בדוק הגדרה זו באופן שיטתי כדי לשמור על הרגישות האורכית של כל פלטפורמה.
3. הקמת מטריצת הפיצוי באמצעות צינורות צבועים בודדים לכל נוגדן, באמצעות חרוזי פיצוי ו/או תאים בהתאם לכל פלטפורמה.
4. שמור את מטריצת ההגדרה והפיצוי כבדיקה או פרוטוקול המזוהה כ-MRD LAIP/DfN, LSC ו-MonoGran (T1, T2, T3). השתמש במבחן או בפרוטוקול זה לרכישה לכימות זרימת AML MRD.

2. הליך מעבדה רטובה

1. שאיפת מח עצם
   1. איסוף 1-2 מ"ל מח עצם EDTA בעת האבחון ובנקודות הניטור, כולל MRD1, MRD2, MRD3, MRD4 וחזרה למח.
   2. שלח את הצינורות למעבדת זרימת הייחוס בתוך 24-48 שעות.
2. הכנת מריחת מח עצם לבדיקה מורפולוגית
   1. הנח טיפה של שאיפה מח עצם על מגלשת זכוכית. מרח בעדינות את הדגימה באמצעות כיסוי או סלייד אחר.
   2. לאחר 30 דקות של ייבוש, יש להכתים את הטשטוש ב-May-Grünwald-Giemsa (קובץ משלים 1).
3. ליזיס בתפזורת
   1. הוסף 15 מ"ל של תמיסת ליזינג NH₄Cl ל-1-2 מ"ל של דגימת מח עצם. ערבבו בעדינות ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. צנטריפוגה ב-450 × גרם בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות והשליכו את הסופרנטנט.
   3. החזירו את כדור התא ל-10 מ"ל של PBS/0.1% BSA. צנטריפוגה בטמפרטורה של 450 × גרם בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות והשליכו את הסופרנטנט.
   4. החזירו את כדור התא בריכוז של 30 × 10⁶ WBC/mL ב-PBS.
4. צביעת חיסון של תליית התא
   1. פזר את הנוגדנים המונוקלונליים בחינורות T1, T2 ו-T3 לפי הפלטפורמה (טבלה 2). ספק את השיבוט, הנפח, הפניה לקטלוג והספק עבור כל נוגדן בטבלת נוגדנים.
      הערה: לכל שפופרת המשתמשת בצבעי סגול ברילינט, השתמשו בבופר צבע בריליאנט לפני הוספת הנוגדנים.
   2. הוסף 2-3 ×10⁶ תאים מפורקים לכל צינור ב-100 מיקרוליטר של תלייה תא. דגרו את התאים בנוגדנים למשך 15 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
   3. שטוף את התאים עם 3 מ"ל של PBS. צנטריפוגה ל-5 דקות ב-450 × גרם וזרקו את הסופרנטנט.
   4. החזירו את התאים הצבועים ב-300 מיקרוליטר של PBS.
      הערה: ניתן להשתמש בקוקטיילים של נוגדנים מעורבים מראש או בחצוצרות נוגדנים יבשות מאומתים.

3. רכישת ציטומטר זרימה

1. פתח את פרוטוקול הבדיקה או הרכישה של MRD עם מטריצת ההגדרה והפיצוי המותאמת למדידת MRD LAIP/DfN ו-LSC.
2. לרכוש מינימום של 500,000 עד 1,000,000 דםי דם לבנים בכל צינור בעת האבחון ובדגימות מעקב ל-MRD כדי לשפר את קיבוץ תאי MRD ואת הביטחון ב-MRD ברמה נמוכה.
   הערה: למדידת LSC, יש לרכוש מינימום של 1,000,000 WBC בצינור 2 כדי לקבל רגישות מספקת לכימות LSC (LOQ 0.002% ו-LOD 0.001%)^10,11.
3. שמור את קבצי הנתונים של FCS מדגימות אבחון ו-MRD. רשמו את תאריך הרכישה וזיהוי המטופל כדי להקל על ניתוח MRD ו-LSC במעקב.

4. אסטרטגיית ניתוח

1. השתמשו בתבנית משותפת וברצף תרשים נקודות משותף הכולל אסטרטגיית שער הרמונית מוגדרת מראש המותאמת לתוכנת הניתוח בכל מרכז.
2. יישמו את אסטרטגיית השער לזיהוי תאי לוקמיה באמצעות שלוש גישות: LAIP, DfN וניתוח LSC במקטע CD34⁺CD38^.
3. לזהות ולהוציא אירועים לא ספציפיים פוטנציאליים ואוכלוסיות פיזיולוגיות תקינות, כולל בזופילים, תאי דנדריט פלזמציטואידיים, המטוגונים, תאי פלזמה, אריתרובלסטים, גושי טסיות, פסולת ואריתרוציטים שלא עברו.

5. הגדרת LAIP/DfN ואוכלוסיות פיזיולוגיות

1. כדי ללכוד LAIP בפיצוצים בתפזות, צייר שער חד-תאי המבוסס על FSC-W לעומת FSC-H.
2. צייר שער תא חי בהתבסס על FSC לעומת SSC.
3. צייר שער פיצוץ על CD45^dim/SSC.
4. צייר את שער הסימון הפרימיטיבי באמצעות CD34/CD117.
5. השתמש בגרפים דו-פרמטריים קבועים כדי לשרטט את שערי LAIP הרלוונטיים, כולל LAIP1, LAIP2, LAIP3, LAIP4, LAIP5, LAIP6, LAIP7 ו-LAIP8.
6. אוכלוסיות פיזיולוגיות
   1. המטוגוני שער באמצעות הרצף הבא: תאים חיים, MNC על גרף הנקודה FSC/SSC, תרשים CD19/SSC, וגרף נקודות CD34/CD38. Backgate באמצעות CD45/SSC.
   2. בזופילים שערים באמצעות הרצף הבא: תאים חיים, MNC על גרף הנקודה FSC/SSC, CD123/CD45RA (CD123⁺+CD45RA^-), ללא המטוגונים של CD19⁺ . Backgate באמצעות CD45/SSC.
   3. תאי דנדריטיים פלזמציטואידיים שער באמצעות הרצף הבא: תאים חיים, MNC בגרף הנקודה FSC/SSC, CD123/CD45RA (CD123⁺⁺CD45RA⁺), ללא המטוגונים CD19⁺ . Backgate באמצעות CD45/SSC.
   4. זהה אריתרובלסטים, גושי טסיות, פסולת ואריתרוציטים שלא עברו באמצעות גרף נקודות CD36/CD45. גייט אחורי באמצעות CD45/SSC ו-FSC/SSC.
7. גישת LAIP
   1. הגדר MRD ב-AML פרימיטיבי CD34⁺ או CD117⁺ באמצעות אופרטורים בוליאניים כדלקמן: LAIP1 ו-LAIP2 ו-LAIP3 ו-LAIP4 ו-LAIP5 ו-LAIP6 ו-LAIP7 ו-LAIP8 ולא CD36^בהיר+/CD45 ותאים בודדים ותאים חיים ו-CD34^+/CD117^+/ סמנים פרימיטיביים ו-(CD45/SSC שער פיצוץ או MNC CD34⁺) (איור 1).
   2. הגדר MRD ב-CD34-CD117^- AML באמצעות אופרטורים בוליאניים כדלקמן: LAIP1 ו-LAIP2 ו-LAIP3 ו-LAIP4 ו-LAIP5 ו-LAIP6 ו-LAIP7 ו-LAIP8 ו-NOT נקי CD36^בהיר+/CD45 ותאים בודדים ותאים חיים ו-CD34CD117 ושער פיצוץ CD45/SSC (איור 2).
8. גישת DfN
   1. השתמשו באותה תבנית כמו בגישת LAIP והחלו את החלל הריק שהוגדר על דגימות מח עצם (טבלה 3).
   2. הגדר אוכלוסיות חריגות כאשר אשכול התאים החריגים מופרד מהתאים הרגילים ב-0.5 עשור בסולם הלוגריתם¹².
   3. כדי ללכוד DfN בפיצוצים בכמויות גדולות, צייר תאים חיים באמצעות FSC/SSC.
   4. צייר תאים בודדים על ידי הסרת דאבלטים בהתאם לשיא FSC/שטח SSC.
   5. צייר את שער ה-MNC באמצעות FSC/SSC.
   6. הפעילו שער ניקוי להסרת לימפוציטים באמצעות CD45/CD36/SSC.
   7. הניחו שער ניקוי להסרת אריתרובלסטים ופסולת באמצעות CD45/CD36.
   8. השתמש בשני שערי קלט, CD34⁺/CD45/SSC ו-CD117⁺/CD45/SSC, כדי להגדיר את התיבות הריקות לפי פרסומים קודמים^12,13.
   9. צייר כל תיבת DfN ריקה לפי אוכלוסיות בקרה פנימיות, כולל לימפוציטים לסמנים חוצי שושלת וקדומים מיאלואידיים רגילים לסמנים של אובדן, ירידה או הבעה יתר.
   10. השוו את הקופסאות הריקות עם דגימות מח עצם ייחוסות, כולל מח עצם מתחדש, דלקתי ובריא של תורם.

6. הגדרת אוכלוסיית ה-LSC CD34⁺CD38^-

1. זיהוי תאים מועשרים ב-LSC באבחון במרחב CD34⁺CD38^- בהתבסס על סמני LSC עם ביטוי דיכוטומי והיעדר ביטוי בתאי גזע המטופואטיים תקינים ממח עצם בריא.
2. הגדר את שער הכניסה של LSC כ-MNC34⁺ באמצעות רצף השער הבא: תאים חיים, תאים בודדים, MNC ו-CD34⁺ בגרף הנקודות CD45/CD34.
3. הגדר את שבר CD34⁺CD38^- (P6) באמצעות סף קפדני המבוסס על רמת פלואורסצנציה מינוס אחד (FMO) של CD38.
4. הגדר תאים מועשרים ב-LSC בצינור 1 בחלק P6 באמצעות אופרטורים בוליאניים כך: P6CD7⁺ או P6CD33⁺ או P6CD19⁺ או P6CD56⁺ ולא CD36 נקיים בהיר⁺ ותאים בודדים ותאים חיים ו-MNC ו-MNC CD34⁺.
5. הגדר תאים מועשרים ב-LSC בצינור 2 בשבר P6 באמצעות אופרטורים בוליאניים כדלקמן: ^P6CD45RA+ או P6MIX⁺ או P6CD123⁺ ולא ניקוי CD36^בהיר+ ותאי יחיד ותאים חיים ו-MNC ו-MNC CD34⁺.
6. השתמש ב-CD36 כדי לנקות אירועים לא ספציפיים בשער ה-LSC הסופי של MRD (איור 3).

7. ^{הגדרת סף} CD38 באוכלוסיית CD34⁺

1. כוון את ערוץ CD38 גבוה מספיק כדי להבחין בין אוכלוסיות CD38^- לאוכלוסיות ^CD38+/ ברזולוציה טובה.
2. הגדר P6 כ-CD34⁺CD38^-, P7 כ-CD34⁺CD38^נמוך, ו-P8 כ-CD34⁺CD38^גבוה.
3. בהתבסס על הגדרת ערוץ CD38 על אוכלוסיות בהירות CD38, זיהוי תאי פלזמה כאוכלוסייה הבהירה ביותר וההמטוגונים בהתאם לטווח המדידה של כל פלטפורמה.
4. הגדר את אוכלוסיית CD34⁺CD38^- (P6) באמצעות גישת FMO של CD38 שאומתה על ידי בקרה איזוקלונית של CD38.
5. הגדר את האוכלוסייה^הנמוכה CD34⁺CD38 (P7) באמצעות רמת ההמטוגון השלילית.
6. הגדר את אוכלוסיית ה-CD34⁺CD38^הגבוהה (P8) באמצעות רמת החיוביות של המטוגון ורמת שלילית של תאי הפלזמה (איור 4).
7. השתמשו באותה ^רמת סף CD38 בכל הקבוצה ההרמונית באמצעות שיטות עמידות כמו CD38-FMO או בקרה איזוקלונית של CD38.
8. השתמש לפחות באימונופנוטיפ חריג אחד במקטע CD34⁺CD38^- כדי להגדיר תאים מועשרים ב-LSC. כלול סימני LSC כמו CLL1/TIM3/CD97/CD45RA/CD123 או סימני שושלת כמו CD7/CD19/CD56/CD33.
9. יש להחיל את הספים הבאים: רגישות לבדיקה LOQ ^10-4 ו-LOD ^10-5; חיוביות ל-LSC באבחון ≥ 1% מפיצוצי CD45/SSC; וחיוביות ב-LSC במעקב אחרי MRD ≥ 0.01% מ-WBC.

8. דוח זרימה קלינית הרמוני

1. ספק את המידע הבא עם כל תוצאה: איכות מח עצם, אסטרטגיה לזיהוי MRD, תיאור LAIP, LOD ו-LOQ, ספים ופרשנות התוצאות.
2. דילול ומייצוג מח עצם
   1. הערכת דילול הדילול עבור כל דוח קליני של זרימת MRD כדי להעריך את עמידות התוצאה.
   2. השתמש באחת משיטות הדילול שתוארו קודם כאשר רלוונטי (טבלה 4)7,14,15,16,17,18,19,20,21.
   3. כגישה משלימה, חשב את ייצוג מח העצם באמצעות יחס CD34/WBC45 שנצפה בהשוואה ליחס הצפוי שנצפה בדגימות מח עצם ייחוס (איור 5).
   4. השתמש בנוסחה הבאה:
      P: טוהר % = 100 × (n/L - s) / (m - s)
      s: שיעור תאי MNC CD34⁺ בדם היקפי תקין: 0.0005
      m: יחס תאי MNC CD34⁺ במח עצם תקין: 0.035
      L: מספר לויקוציטים WBC45⁺ בדגימת מטופל MRD
      n: מספר תאי MNC CD34⁺ בדגימת המטופל ב-MRD
   5. דווח על ייצוג מח עצם כהערכת איכות של המדגם. אל תשתמש בערך זה כדי לנרמל תוצאות MRD.
   6. פירוש ייצוגיות מח עצם כך: 100% עד 10%, השפעה נמוכה על שיעור תאי CD34⁺ ממח עצם; 10% עד 1%, אזהרה לפרשנות תוצאות MRD; ו-< 1%, תוצאה שאינה ניתנת לפרשנות.
3. כימות LSC בעת האבחנה
   1. דווח על הפרופיל המשמש לזיהוי תאים מועשרים ב-LSC, לדוגמה, CD34⁺CD38-CD90-CD45RA⁺MIX⁺(CLL1/TIM3/CD97)CD7⁺CD56⁺.
   2. דווח על תוצאות LSC באבחון כאחוז שנצפה מפיצוצי CD45/SSC.
   3. השתמש ב-LSC ≥ 1% מסך הפיצוצים כסף לתחזית לקויה.
4. המשך MRD על ידי LAIP/DfN
   1. דווח על פרופיל LAIP המשמש לזיהוי MRD, לדוגמה, CD34⁺CD38^dim+CD13^+/-CD33⁺⁺CD117⁺CD7⁺.
   2. דווח על רגישות הניתוח כערך הרגיש הנמוך ביותר בין הסף הטכני לערך החוסן שנצפה בפרופיל LAIP בהשוואה לדגימות מח עצם ייחוס.
   3. השתמש באשכול מינימלי של 50 תאים בין אירועי WBC שנרכשו כגבול הכמות. לדוגמה, עם 500,000 תאי WBC, LOQ הוא 0.01% (1 × ^10-4).
   4. דווח על תוצאות LAIP/DfN כחיוביות, שליליות, ניתנות לזיהוי אך מתחת לסף קליני, או לא ניתנות לזיהוי.
   5. דווח על חיוביות ל-LAIP/DfN כ-0.1% ≥%, מבוטא כאחוז כלל של לויקוציטים של CD45⁺ .
   6. דווח על שליליות LAIP/DfN כ-< 0.1%.
   7. לתוצאות ניתנות לזיהוי אך מתחת לסף, דווח על הערך המייצג וסף הרגישות.
   8. לתוצאות שאינן ניתנות לזיהוי, יש לדווח שהתוצאה נחותה מסף רגישות הניתוח והוסף הערה במידת הצורך, כגון המודלולציה, ספציפיות נמוכה ב-LAIP או סף טכני לא מספק.
5. MRD המשך על ידי LSC
   1. דווח על הפרופיל המשמש לזיהוי תאים מועשרים ב-LSC, לדוגמה, CD34⁺CD38-CD90-CD45RA⁺MIX⁺(CLL1/TIM3/CD97)CD7⁺CD56⁺.
   2. יש להשתמש באשכול מינימלי של 20 תאים בין אירועי WBC שנרכשו כגבול הכמות. לדוגמה, עם 1,000,000 תאי WBC, LOQ הוא 0.002% (2 × ^10-5).
   3. דווח על תוצאות LSC כחיוביות, שליליות, ניתנות לזיהוי אך מתחת לסף קליני, או לא ניתנות לזיהוי.
   4. דווח על חיוביות ל-LSC כ-0.01% ≥%, המובע כאחוז הכולל של לויקוציטים CD45⁺ .
   5. דווח על שליליות LSC כ-< 0.01%.
   6. לתוצאות ניתנות לזיהוי אך מתחת לסף, דווח על הערך המייצג וסף הרגישות.
   7. לתוצאות שאינן ניתנות לזיהוי, יש לדווח שהתוצאה נחותה מסף רגישות הניתוח והוסף הערה במידת הצורך, כגון דילול דם, ספציפיות נמוכה של LSC או סף טכני לא מספק.
6. שלבו את פרשנות זרימת ה-MRD עם נקודות זמן ניטור קודמות. הצביעו על מודולציה של הפרופיל הפנוטיפי במהלך הטיפול והדינמיקה של זרימת MRD, כולל ריפוזיטיביות, עלייה, יציבות או ירידה.
7. העבר את התוצאות לרופא ולחוקר המבקש באמצעות דוח הזרימה הקלינית בהתאם למסגרת הזמן של מעבדת זרימת הייחוס.
8. סיכם את דוח הזרימה הקלינית המאוחד באמצעות הפריטים הבאים: איכות מח עצם, אסטרטגיית זיהוי MRD, תיאור LAIP, LOD ו-LOQ, ספים, ופרשנות כ-MRD חיובי, MRD שלילי עם ערך LOD, או MRD שניתן לזהות אך לא ניתן לכמות.

תוצאות

השתקפות פלטפורמה

בהשוואה הראשונית לשתי פלטפורמות בין CANTO ל-NAVIOS, הגדרות המתח הותאמו על ידי רכישת חרוזי קשת בענן בעלי 8 שיאים ללא פיצוי כדי להגיע לערכי MFI יעד מוגדרים מראש. ערכי היעד מפלטפורמת CANTO הייחוס הועברו לפלטפורמת NAVIOS השנייה באמצעות המרה הבאה: יעד MFI חדש = יעד MFI ייחוס/256²². כדי לזהות הטיה בין הפלטפורמות, נבדקו במקביל 10 דגימות מח עצם רגנרטיביות טריות של EDTA. מדד הצביעה בין אוכלוסיות חיוביות לשליליות הושווה בין דגימות ופלטפורמות והראה הפרדה דומה (קובץ משלים - איור S3).

במהלך המחקר, הפלטפורמות שודרגו בהדרגה מתצורות 8 ו-10 צבעים לתצורות LYRIC ו-DxFLEX עם 12 ו-13 צבעים (קובץ משלים 1). ההשתקפות הורחבה על פני ארבע פלטפורמות באמצעות חרוזי קשת בענן בעלי 8 פסגות ומח עצם בריא מוצבע שנרכש עם אותו פאנל. חפיפת השיא נבדקה על ידי התאמת הסולמות הלוגריתמיים של הייצוג בלבד. לאחר יישום ההגדרות שהוגדרו, דפוסי הצביעה של התאים חפפו, כאשר ההבדל העיקרי היה תרגום ענני התאים לאורך הסולמות הלוגריתמיים (איור 6 ותיקייה משלימים - איור S4 ואיור S5).

הערכת איכות ושחזוריות בין מעבדות זרימה

לאחר יישום הליך ההפעלה הסטנדרטי הראשוני ועדכוניו במהלך שדרוגי הפלטפורמה, בוצעה באופן קבוע הערכת איכות חיצונית רטובה (EQA) באמצעות דגימות מח עצם חדשות ששותפו בין המרכזים המשתתפים. EQA רטוב שימש לאימות פרוצדורת המעבדה הרטובה, הגדרות הפלטפורמה ואסטרטגיית ניתוח השער הנפוצה. האוכלוסיות המדווחות כללו תאי MNC CD34⁺ במכנה CD45⁺ של WBC ותאי P6 CD34⁺CD38⁻ במכנה CD45⁺ של WBC. התוצאות נותחו באמצעות ציון z ו/או ייצוג גרפי (איור 7).

חמישה סבבי EQA רטובים בוצעו מאז 2017, עם 22, 15, 17, 26 ו-25 מעבדות משתתפות, בהתאמה. עבור תאי %CD34⁺CD38⁻ בתאי WBC CD45⁺ ו-%MNC CD34⁺ ב-WBC CD45⁺, התוצאות היו כדלקמן: EQA1, ערכי ממוצע 0.015% ו-1.01% (SD 0.09% ו-0.24%); EQA2, 0.09% ו-1.02% (SD 0.046% ו-0.36%); EQA3, 0.097% ו-1.46% (SD 0.024% ו-0.32%); EQA4, 0.024% ו-2.16% (SD 0.015% ו-0.59%); ו-EQA5, 0.027% ו-1.9% (SD 0.008% ו-0.45%).

כדי להתמודד עם סטנדרטיזציה של אסטרטגיית ניתוח MRD בין מרכזים, EQA רטוב הושלמה על ידי EQA יבש באמצעות קבצי FCS משותפים לאבחון, מעקב אחרי MRD והפניה למח עצם. יותר מ-90% מהנתונים שנותחו מקומית נכללו במרווח המרכזי המבוסס על ממוצע הסדרה ± 2 SD: 95.6% ו-91.3% עבור DryEQA2017, עם 22 מתוך 23 מעבדות משתתפות, ו-100% עבור DryEQA2024, עם 24 מתוך 25 מעבדות משתתפות (איור 8). בוצעו שני סבבים של EQA יבש עבור %MRD LAIP ב-WBC CD45⁺ ו-%MRD LSC CD34⁺CD38⁻ ב-WBC CD45⁺. DryEQA2017 הראה ערך LAIP ממוצע של 11.9% (SD 1.35%) וערך LSC ממוצע של 0.16% (SD 0.05%). DryEQA2024 הראה ערך ממוצע MRD LAIP של 0.35% (SD 0.26%) וערך ממוצע MRD LSC CD34⁺CD38⁻ של 0.18% (SD 0.06%).

דוגמה למדידת זרימת AML MRD רב-מודלית באמצעות אסטרטגיות LAIP/DfN ו-LSC

כדי לכמת את ה-MRD, נעשה שימוש שיטתי בשלוש גישות. הגישה הראשונה קבעה את קרטוגרפיית LAIP של פיצוצים לוקמיים באבחון באמצעות גייטינג בוליאני, וקרטוגרפיה זו יושמה על דגימות מח עצם במעקב (איור 9A). הגישה השנייה השתמשה בניתוח DfN כדי לזהות תאים חריגים עם דפוסי ביטוי לא טיפוסיים שלא נצפו באזורים של "קופסה ריקה" המוגדרים מהתמיינות מיאלואידית תקינה (איור 9B). הגישה השלישית כמת תאים מועשרים ב-LSC בשבר CD34⁺CD38⁻ באמצעות סמנים דיכוטומיים של LSC וגיטינג בוליאני (איור 10).

דגימות מח עצם

נבדקו בסך הכול 135 דגימות מח עצם ייחוסיות, כולל 25 דגימות מח עצם של תורם בריא, 34 דגימות מח עצם דלקתיות, ו-76 דגימות מח עצם מתחדשות. מח עצם בריא מתורמים התקבלו מתורמים בריאים, עם גיל חציוני של 31 שנים וטווח של 21–49 שנים. מח עצם דלקתי התקבל ממטופלים שהופנו לציטופניה, כולל אנמיה, נויטרופניה או טרומבופניה, כאשר שאיפות מח עצם לא הראו ממאירויות המטולוגיות; גיל החציון היה 52 שנים, עם טווח של 25–82 שנים. מח עצם מתחדש התקבל במהלך מעקב AML בנקודות זמן שונות של כימותרפיה, כולל לאחר השראה או קונסולידציה, עם שליליות של הערכת MRD מולקולרית עבור תמלילי NPM1 או CBF; הגיל החציוני היה 54 שנים, עם טווח של 18–65 שנים.

איכות הדגימות הללו אושרה באמצעות בדיקה מיקרוסקופית. האחוז התיאורטי הצפוי של תאי CD34⁺ בדגימות מח עצם לא מדולל חושב גם הוא באמצעות נוסחת ברוימנס, עם תוצאות >90% לכל הדגימות. דגימות אלו שימשו לקביעת סף לניתוח LAIP/DfN ו-LSC ולחישוב נוסחת המודילולציה והטוהר. שונות ב-MFI בביטוי סימן לפי מצב מח עצם נחקרה עבור דגימות מח עצם בריאות של תורם, דלקתי ומשקם (קובץ משלים - איור S6). ערכי ייחוס נקבעו עבור הפרמטרים הרלוונטיים ביותר, כולל %MNC CD34⁺ מ-WBC, %P6 CD34⁺CD38⁻ ב-MNC CD34⁺, %P7 CD34⁺CD38^dim ב-MNC CD34⁺, ו-%P8 CD34⁺CD38^גבוה ב-MNC CD34⁺ (קובץ משלים S6).

הערכת רגישות וליניאריות

הרגישות הוערכה לשערים ספציפיים ל-LAIP/DfN ול-LSC על ידי מדידת מספר האירועים החריגים בקבוצת דגימות מח עצם ייחוס, כולל מח עצם מתחדש, דלקתי ובריא של תורם. דילול סדרתי של מספר ידוע של פיצוצים במח עצם בריא שימש לאימות מגבלת הכימות והליניאריות של מדידת MRD (איור 11 ואיור 12).

איור 1: אסטרטגיית שער לניתוח MRD LAIP ב-AML באמצעות סמנים פרימיטיביים (CD34⁺/CD117⁺) בצינור 1. שורה ראשונה: שער זמן רציף, תאים חיים המבוססים על FSC מול SSC, תאים בודדים המבוססים על FSC-W מול FSC-H, תאי CD45⁺ של WBC על CD45 מול SSC, בלסטים על^{CD45 dim}/SSC, תאים מונוגרליים (MNC) על FSC-A/SSC-A, MNC תאי CD34⁺ בגרף CD45 מול CD34, ושער הסמן הפרימיטיבי בגרף CD34 מול CD117. השורות השנייה והשלישית: גרפים דו-פרמטריים קבועים המשמשים להגדרת שערי LAIP הרלוונטיים ביותר (LAIP1–LAIP8). MRD LAIP הוגדר באמצעות האסטרטגיה הבוליאנית הבאה: זמן ותאים חיים ותאים בודדים AND (blasts OR MNC CD34⁺) וסמנים פרימיטיביים (CD34^+/−CD117^+/−) ו-LAIP1 ו-LAIP2 ו-LAIP3 ו-LAIP4 ו-LAIP5 ו-LAIP6 ו-LAIP7 ו-LAIP8. במקרה המאויר, MRD היה 6.8% מ-WBC CD45⁺, לעומת 0.04% ±-0.03 במח עצם בריא. מימין: שער אחורי של שער ה-MRD הסופי המשמש לכמות, מה שמאפשר ניקוי אירועים לא ספציפיים, אריתרובלסטים ופסולת. קיצורים: AML = לוקמיה מיאלואידית חריפה; MRD = מחלה שאריתית מדידה; LAIP = אימונופנוטיפ הקשור ללוקמיה; FSC = פיזור קדימה; SSC = פיזור צדדי; WBC = תאי דם לבנים; MNC = תאים חד-גרעיניים; hBM = מח עצם בריא. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: אסטרטגיית גייטינג לניתוח MRD LAIP ב-AML באמצעות פיצוצים בוגרים (CD34⁻CD117⁻) בצינור 3. שורה ראשונה: שער זמן רציף, תאים חיים המבוססים על FSC מול SSC, תאים בודדים המבוססים על FSC-W מול FSC-H, תאי CD45⁺ של WBC ב-CD45 מול SSC, בלסטים על CD45^dim/SSC, תאים מונו-גרעיניים (MNC) על FSC-A/SSC-A, MNC תאי CD34⁺ בגרף CD45 מול CD34, ושער הפיצוץ הבוגר בגרף CD34 מול CD117.
השורות השנייה והשלישית: גרפים דו-פרמטריים קבועים המשמשים להגדרת שערי LAIP הרלוונטיים ביותר (LAIP1–LAIP8). MRD LAIP הוגדר באמצעות האסטרטגיה הבוליאנית הבאה: זמן, תאים חיים, תאים בודדים, פיצוצים, CD34⁻CD117⁻ blasts, LAIP1, LAIP2, LAIP3, LAIP4, LAIP5, LAIP6, LAIP7 ו-LAIP8. במקרה המאויר, MRD היה 15% מ-WBC CD45⁺, לעומת 0.09% ±-0.02 במח עצם בריא.
מימין: שער אחורי של שער ה-MRD הסופי המשמש לכמות, מה שמאפשר ניקוי אירועים לא ספציפיים. קיצורים: AML = לוקמיה מיאלואידית חריפה; MRD = מחלה שאריתית מדידה; LAIP = אימונופנוטיפ הקשור ללוקמיה; FSC = פיזור קדימה; SSC = פיזור צדדי; WBC = תאי דם לבנים; MNC = תאים חד-גרעיניים; hBM = מח עצם בריא. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: אסטרטגיית גייטינג לתאי גזע המטופואטיים נורמליים (nHSCs) ותאי גזע מועשרים בלוקמיה (LSC) בחלק CD34⁺CD38⁻ (צינור 2). (א) תאי גזע המטופואטיים תקינים (nHSCs) ו-(B) תאי גזע מועשרים בלוקמיה (LSC) בחלק CD34⁺CD38⁻ (צינור 2). שורה ראשונה: שער זמן רציף, תאים חיים המבוססים על FSC לעומת SSC, תאים בודדים המבוססים על FSC-W מול FSC-H, תאי CD45⁺ של WBC על CD45 מול SSC, בלסטים על CD45dim/SSC, תאים מונוגראליים (MNC) על FSC-A/SSC-A, ותאי MNC CD34⁺ על גרף CD45 מול CD34.
השורות השנייה עד הרביעית: גרפים דו-פרמטריים קבועים המשמשים להגדרת P6 (CD34⁺CD38⁻), P7 (CD34⁺CD38^נמוך), ו-P8 (CD34⁺CD38^גבוה), יחד עם הסמנים הרלוונטיים ביותר של LSC דיכוטומיים, כולל MIX (CLL1/TIM3/CD97), CD123 ו-CD45RA. MRD LSC הוגדר באמצעות האסטרטגיה הבוליאנית הבאה: זמן, תאים חיים, תאים בודדים ובלסטים, MNC, MNC, MNC CD34+ ו-P6 ו-(P6 LSC MIX⁺ או P6 LSC CD123⁺ או P6 LSC CD45RA⁺).
מימין: גייטינג אחורי של שער ה-LSC האחרון של MRD המשמש לכמות, מה שמאפשר ניקוי אירועים לא ספציפיים.
(A) nHSCs בדגימת מח עצם בריאה: nHSCs (אירועים סגולים) היו CD34⁺CD38⁻, MIX⁻ (CLL1/TIM3/CD97), CD45RA⁻, CD123⁻, CD117⁺, HLA-DR⁺, CD36⁻, ו-CD90⁺. החלק של nHSC CD34⁺CD38⁻ ייצג 0.02% מ-WBC CD45⁺, ותאי LSC CD34⁺CD38⁻ היו שליליים. ספי הבדיקה המדווחים היו LOQ 0.0001% ו-LOD 0.001%.
(B) תאים מועשרים ב-LSC בדגימת AML: תאים מועשרים ב-LSC (אירועים כתומים) היו CD34⁺CD38⁻, MIX⁺ (CLL1/TIM3/CD97), CD45RA⁺, CD123⁺, CD117⁺, HLA-DR⁺, CD36⁻ ו-CD90⁺. החלק של LSC CD34⁺CD38⁻ ייצג 3.7% מ-WBC CD45⁺. קיצורים: nHSCs = תאי גזע המטופואטיים תקינים; LSC = תאי גזע לוקמיים; MNC = תאים חד-גרעיניים; WBC = תאי דם לבנים; SSC = פיזור צדדי; MIX = CLL1/TIM3/CD97; HLA-DR = אנטיגן לויקוציטים אנושיים-DR; LOQ = גבול הכמות; LOD = גבול גילוי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4: הגדרת סף CD38⁻ באוכלוסיית CD34⁺ באמצעות ערוץ הפלואורסצנציה מינוס אחד (FMO) של CD38. שורה ראשונה: סגירת אוכלוסיות ייחוס, כולל בלסטים על תאי CD45/SSC, תאי MNC CD19⁺ ותאי MNC CD34⁺ .
שורה שנייה: רמת אות בערוץ FMO של CD38. השורה הראשונה מציגה תאי פיצוץ, השורה השנייה מציגה תאי MNC CD19⁺ , והשורה השלישית מציגה תאי MNC CD34⁺ . הקו הכתום מציין את הסף המגדיר את שער P6 CD34⁺CD38⁻ .
שורה שלישית: רמת אות CD38 PE-Cy7. השורה הראשונה מציגה תאי בלסט, השורה השנייה מציגה תאי MNC CD19⁺ עם רמת המטוגון CD38 המשמשת להגדרת^P8 CD34⁺CD38 גבוה, והשורה השלישית מציגה תאי MNC CD34⁺, עם תאי P6 CD34⁺CD38⁻ בכתום, P7 CD34⁺CD38^{תאים נמוכים} בירוק, ו-P8 CD34⁺CD38^גבוה תאים בכחול. קיצורים: FMO = פלואורסצנציה מינוס אחד; MNC = תאים חד-גרעיניים; SSC = פיזור צדדי; PE-Cy7 = פיקואריתרין-ציאנין 7; P6 = שבר CD34+CD38−; P7 = CD34+CD38שבר נמוך; P8 = CD34+CD38 שבר גבוה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 5: הערכת ייצוג דגימות מח עצם בהתבסס על תאי MNC CD34⁺ . (א) אסטרטגיית שער לתאי MNC CD34⁺ ופרמטרים לחישוב נוסחאות: n, מספר תאי MNC CD34⁺ ; L, מספר תאי WBC CD45⁺ ; s, שיעור תאי MNC CD34⁺ בדם ההיקפי התקין; ו-m., אחוז תאי MNC CD34⁺ שנצפו במח עצם תקין. (ב) ייצוג סכמטי של השפעת דילול מח עצם (BM) על ידי דם היקפי (PB) על מוצא תאי CD34⁺ בדגימות BM. (ג) קריטריונים המשמשים לפירוש טוהר BM. קיצורים: BM = מח עצם; PB = דם היקפי; MNC = תאים חד-גרעיניים; WBC = תאי דם לבנים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 6: השוואת דפוסי ביטוי בארבע פלטפורמות ציטומטר זרימה.
דגימת מח עצם תקינה (BM) נבדקה בו-זמנית על ארבע פלטפורמות ציטומטר תוך שימוש בהגדרות שהוגדרו לכל פלטפורמה והתאמת קנה מידה. השורה הראשונה מציגה תאים MNC בגרף הנקודות CD45/CD33; השורה השנייה מציגה תאי MNC על גרף הנקודה CD34/CD117 הסמן הפרימיטיבי; השורה השלישית מציגה תאי פיצוץ בגרף הנקודות CD34/CD38; והשורה הרביעית מציגה תאי P6 CD34⁺CD38⁻ על גרף הנקודות CD45RA/CD90. קיצורים: BM = מח עצם; MNC = תאים חד-גרעיניים; P6 = CD34⁺CD38⁻ שבר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 7: שכפול EQA במעבדה רטובה בין מעבדות זרימה משתתפות. (A) תרשים כינור המראה את התפלגות תאי %P6 CD34⁺CD38⁻ בתאי WBC CD45⁺ בין חמשת סבבי EQA במעבדה רטובה ומעבדות זרימה משתתפות. (B) תרשים כינור המציג את התפלגות תאי %MNC CD34⁺ בתאי WBC CD45⁺ בחמשת סבבי EQA במעבדה רטובה ומעבדות זרימה משתתפות. קיצורים: EQA = הערכת איכות חיצונית; P6 = שבר CD34+CD38−; WBC = תאי דם לבנים; MNC = תאים מונוגרעיניים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 8: הערכת EQA יבש למדידת LAIP/DfN ו-LSC MRD. (א) תרגיל EQA2017 יבש למדידת LAIP/DfN ו-LSC MRD באמצעות שישה קבצי FCS משותפים מקבוצת פאנל של 8 צבעים, כולל אבחון AML, AML MRD, וקבצי ייחוס תקינים של מח עצם לניתוח LAIP 1 ו-LSC צינור 2. התרגיל שותף עם 23 מעבדות משתתפות. (ב) פעילות EQA2024 יבשה למדידת LAIP/DfN ו-LSC MRD באמצעות שישה קבצי FCS משותפים מקבוצת פאנל של 12 צבעים, כולל אבחון AML, AML MRD, וקבצי ייחוס תקינים של מח עצם לניתוח LAIP 1 ו-LSC צינור 2. התרגיל שותף ל-24 מעבדות משתתפות. (ג) השוואה בין-פלטפורמית של תאי %MNC CD34⁺ ותאי %nHSC P6 CD34⁺CD38⁻ בתאי WBC CD45⁺ שנמדדו במהלך EQA2025 רטוב, בשיתוף עם 25 מעבדות משתתפות. הערכים הצפויים היו 1.6% לתאי MNC CD34⁺ ו-0.02% לתאי nHSC P6 CD34⁺CD38⁻ . קיצורים: EQA = הערכת איכות חיצונית; LAIP = אימונופנוטיפ הקשור ללוקמיה; DfN = שונה מהנורמל; LSC = תאי גזע לוקמיים; MRD = מחלה שאריתית מדידה; FCS = תקן ציטומטריית זרימה; AML = לוקמיה מיאלואידית חריפה; MNC = תאים חד-גרעיניים; nHSC = תא גזע המטופואטי תקין; WBC = תאי דם לבנים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 9: מדידת MRD מייצגת באמצעות גישות LAIP/DfN. (א) דוגמה למדידת MRD באמצעות שיטת LAIP/DfN. הצד השמאלי מציג קרטוגרפיית LAIP של תאי לוקמיה בדגימת האבחנה, והצד הימני מראה יישום של אותה קרטוגרפיית LAIP על דגימת המעקב, כאשר אוכלוסיית ה-MRD מוצגת בשחור. (B) דוגמה למדידת MRD באמצעות שיטת DfN. כל זוג גרף נקודות משווה מח עצם בריא (hBM; תקין, גרף שמאל) עם דגימת מח עצם מעקב MRD (DfN, גרף ימין). אזור ה"קופסה הריקה" מוגדר על מח עצם תקין, ונוכחות תאי לוקמיה בקופסה הריקה מוערכת בדגימת המעקב, כאשר האוכלוסייה החריגה מוצגת בשחור. קיצורים: MRD = מחלה שאריתית מדידה; LAIP = אימונופנוטיפ הקשור ללוקמיה; DfN = שונה מהנורמל; hBM = מח עצם בריא. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 10: מדידה מייצגת של תאי CD34⁺CD38⁻ מועשרים ב-LSC באבחון ובמעקב. (א) דוגמה למדידת תאים מועשרים ב-LSC בדגימת אבחון AML. הצד השמאלי מציג את הפרופיל המועשר ב-LSC, כאשר אוכלוסיית הכתום מבטאת MIX (CLL1/TIM3/CD97), CD123, CD45RA, CD117, HLA-DR ו-CD36 בתוך שבר CD34⁺CD38⁻ .
(B) דגימת מעקב מאותו מטופל שמראה התמדה של תאים מועשרים ב-MRD LSC עם אותו פרופיל אימונופנוטיפי (אוכלוסיית כתום). קיצורים: LSC = תא גזע לוקמי; AML = לוקמיה מיאלואידית חריפה; MRD = מחלה שאריתית מדידה; MIX = CLL1/TIM3/CD97; HLA-DR = אנטיגן לויקוציטים אנושיים-DR. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 11: רגישות אנליטית של זיהוי LSC. (א) הערכת גבול הריקנות (LOB) לזיהוי LSC. הצד השמאלי מציג כימות של אירועי CD34⁺CD38⁻ במיזוג של חמישה קבצי FCS מחמש דגימות מח עצם בריאות (5,148,000 אירועי WBC שנאספו). הצד הימני מציג את מספר האירועים השייכים לשער הבוליאן של LSC המקושר בגרף הנקודות CD45/SSC (14 אירועים), המתאים ל-LOB של <0.0005% (5 × ^10-6). (ב) הערכת ליניאריות לכימות LSC. הצד השמאלי מראה דילול סדרתי על ידי ספייק-אין של תאים מועשרים ב-LSC בדגימת מח עצם בריאה. הצד הימני מציג את המתאם בין ערכי MRD שנמדדו לערכים תיאורטיים, התואם לגבול הכימות (LOQ) של 2 ×-^10-5 (0.002%). קיצורים: LSC = תא גזע לוקמי; LOB = גבול הריק; FCS = תקן ציטומטריית זרימה; WBC = תאי דם לבנים; MRD = מחלה שאריתית מדידה; LOQ = גבול הכמות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 12: טווח ליניאריות וכימות של מדידת MRD LAIP. (א) הערכת הליניאריות לכימות MRD LAIP באמצעות דילול סדרתי של פיצוצים עם LAIPs שונים במח עצם בריא, המראה את המתאם בין ערכי MRD שנמדדו לערכים תיאורטיים, עם LOQ משתנה לפי LAIPs שונים ו-LOQ <0.1%. (B) טווח הכימות לפי LAIPs שונים. הקו האדום מציין את סף קליני של 0.1%. ה-LOQ הגיע לסף הקליני לכל ה-LAIPs שנבדקו. קיצורים: MRD = מחלה שאריתית מדידה; LAIP = אימונופנוטיפ הקשור ללוקמיה; LOQ = גבול הכמות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

פלואורו כרום	פסגה	LYRIC12c	פסגה	DxFlex13c	פסגה	NAVIOS10c	פסגה	CANTO8c
FITC	P8	44618	P6	89916	P7	104	P8	56316
חינוך גופני	P8	84008	P6	110652	P7	136	P8	88803
ECD	x	x	P6	153011	P7	150	x	x
PerCPcy5,5 /PEcy5,5	P7	63610	P6	101791	P7	85	P7	75717
PC7/PEcy7	P8	32412	P6	21381	P8	88	P8	32003
נגמ"ש	P7	111628	P6	192708	P6	181	P7	143946
AA700/AP CR700	P7	25958	P6	237374	P7	182	x	x
A7A750/ APCH7	P8	77444	P6	158729	P7	150	P8	98311
BV421	P6	62031	P6	239208	P6	268	P6	68315
KO/V500	P7	159941	P6	293917	P6	179	P7	124919
BV605	P7	31688	P6	65337	x	x	x	x
BV711/ V660	P8	21816	P6	12107	x	x	x	x
BV786	P8	17560	P6	3795	x	x	x	x

טבלה 1: ערכי יעד לכל פלטפורמה באמצעות חרוזי קשת בענן עם 8 פסגות. ערכי יעד ספציפיים מוצגים עבור כל פלטפורמת ציטומטר (Canto, Lyric, Navios, DxFlex). השיאים שנשמרו נבחרו להיות קרובים ל-MFI שנצפה לתאי הפיצוץ. זה חשוב במיוחד עבור ציטומטרים מבוססי PMT, שבהם עוצמת האות אינה עולה באופן ליניארי עם עלייה במתח PMT. לעומת זאת, בציטומטרים מבוססי APD, עוצמת האות עולה באופן ליניארי עם ההגבר, מה שמאפשר להשתמש באותו שיא לכל הגלאים, בעוד שנדרשים שיאים שונים לכל ערוץ בציטומטרי PMT. קיצורים: MFI = עוצמת פלואורסצנציה חציונית; PMT = צינור פוטומולטיפלייר; APD = דיודה פוטו-מפולתית. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

קנטו 8C /NAVIOS 8c

FITC

חינוך גופני

ECD

PerCPC y5,5

PECy7

נגמ"ש

APC-R700 /AA700

APCH7

BV421

V500

BV605

BV711

BV786

צינור 1 LAIP 8c

CD7 5μL /CD56 5μL

CD13 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

צינור 2 LSC 8c

CD90 5μL

MIX3(2) 0.5μL/Ac)

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

סופל T3 מנטר Gran 8c

CD15 5μL

CD56 5μL

HLADR 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD11b 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

סופלם T3 entaire - Monos 8c

CD36 5μL

CD64 5μL

CD14 10μL

HLADR 5μL

CD34 5μL

CD4 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

MIX3Ac =97 +TIM3+ CLL1

מילים 10-12c

FITC

חינוך גופני

ECD

PerCPCy5,5

PECy7

נגמ"ש

APC-R700

APCH7

BV421

V500

BV605

BV711

BV786

צינור 1LAIP 12c

CD7 5μL

CD13 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD56 5μL

CD10 2μL

CD36 2μL

צינור 2 LSC 12c

CD90 5μL

MIX3(2. 5μL/AC)

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD200 5μL

CD19 5μL

CD36 2μL

סופל T3 מנטר 12c-Monos

CD15 5μL

CD64 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD4 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD14 5μL

CD11b 5μL

CD36 2μL

MIX3Ac =97+ TIM3+ CLL1

NAVIOS 10c

FITC

חינוך גופני

ECD

PEcy5,5

PECy7

נגמ"ש

AA700

AA750

BV421/PB

V500/KO

BV605

BV711

BV786

T1 Navios 10c

CD7 10μL

CD13 10μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD56 10μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T2 Navios 10c

CD90 5μL

MIX3 (2.5 μL/AC)

CD19 5μL

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

סופל T3 מנטר 10c Monos

CD15 5μL

CD4 5μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD11b 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD14 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

MIX3Ac =97+ TIM3+ CLL1

DxFLEX 10 -12/13c

FITC

חינוך גופני

ECD

PEcy5,5

PECy7

נגמ"ש

AA700

AA750

BV421/PB

V500/KO

BV605

BV650

BV786

T1 DxFLEX 12-13c

CD7 10μL

CD13 10μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD56 10μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD36 5μL

CD10 2μL

/

T2 DxFLEX 12-13c

CD90 5μL

MIX3 (2.5 μL/AC)

CD19 5μL

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

/

CD200 5μL

HLADR snv786 (3μL)

סופל T3 מנטר 12c Monos

CD15 5μL

CD4 5μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD14 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD64 5μL

CD11b 5μL

/

טבלה 2: תצורות פאנל נוגדנים לניתוח AML MRD, LAIP/DFN ו-LSC. הטבלה מסכמת תצורות פאנלים עם 8, 10, 12 ו-13 צבעים בהתאם לפלטפורמת הציטומטר. צינור 1 משמש לניתוח LAIP/DfN, צינור 2 לניתוח תאים מועשר ב-LSC ב-CD34⁺CD38⁻ , וצינור 3 לסימני התמיינות מונוציטיים/גרנולוציטיים. נפחי נוגדנים והקצאות פלואורוכרום מוצגים לכל פלטפורמה. MIX3 מתאים ל-CD97, TIM3 ו-CLL1. קיצורים: AML = לוקמיה מיאלואידית חריפה; MRD = מחלה שאריתית מדידה; LAIP = אימונופנוטיפ הקשור ללוקמיה; DfN = שונה מהנורמל; LSC = תאי גזע לוקמיים; MIX3 = CD97/TIM3/CLL1. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

אובדן מוחלט של סמנים המובעים תקין על קדמונים מיאלואידיים

CD13++CD33-/CD34+ או CD117+

CD13-CD33++/CD34+ או CD117+

CD13+HLADR-/CD34+

CD13+CD117+CD34-

ביטוי סמן לימפה חוצה שושלת על קדומים מיאלואידיים

CD7+CD13+/CD34+ או CD117+

CD7+CD33+/ CD34+ או CD117+

CD56+CD13+/ CD34+ או CD117+

CD56+CD33+/ CD34+ או CD117+

CD19+CD117+/ או CD13+ או CD33+

הבעה מופרזת על קודמים מיאלואידיים

CD34++/CD117+

CD117++/CD13+CD33+

ביטוי מופחת על קדמונים מיאלואידיים

CD38loCD34+CD33+CD117+

טבלה 3: הגדרות DfN "קופסה ריקה" מבוססות LAIP. הטבלה מפרטת דפוסי "קופסה ריקה" מוגדרים מראש שונים מהנורמליים (DfN) המשמשים לזיהוי אוכלוסיות פריקוראואידים מיאלידיות חריגות. הקטגוריות כוללות אובדן מוחלט של סמנים מבוטאים תקין, ביטוי סמן לימפה חוצה שושלת, ביטוי יתר של סמנים, וירידה בביטוי הסמנים על קדומים מיאלואידיים. קיצורים: LAIP = אימונופנוטיפ הקשור ללוקמיה; DfN = שונה מהנורמלי. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

הולדרינט ואח' 17
ברולמנס ואח' 15
טוהר מח עצם = (1 − (GRMO/GRSG) x (GBSG/GBMO)) x 100	>80%
Björlund ואח' 19	ממוצע ציונים > 15%
	CD3 < 20%
לוקן ואח' 18	שיא CD16 < 30%
Theunissen ואחרים, 20; Dworzak ואח' 21
זרימה או Ctr DIL ציטולוגי: PNN < 40%, Ebl > 5%, Ly < 20%	CD16++ CD11b++ < 40%
	ממוצע ציונים > 5%
	CD3 < 20%
טוהר BM: MNC 34+/WBC45+	טוהר BM 100-10%

טבלה 4: שיטות בקרה לדילול מח עצם לדיווח זרימת MRD על AML. הטבלה מסכמת שיטות דילול מח עצם ושליטה על ייצוגיות שפורסמו, שעשויות לשמש לדוחות קליניים של זרימת AML MRD. לפחות שיטה אחת לשליטה בדילול צריכה להיות מיושמת לתמיכה בפרשנות תוצאות MRD. גישת טוהר מח עצם CD34/WBC45⁺ כלולה כהערכת איכות משלימה. קיצורים: AML = לוקמיה מיאלואידית חריפה; MRD = מחלה שאריתית מדידה; BM = מח עצם; WBC = תאי דם לבנים; CD34/WBC45⁺ = תאי CD34⁺ בתאי דם לבנים CD45⁺ . אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

קובץ משלים 1: רקע נוסף, הרמוניזציה של פלטפורמה, מח עצם ייחוס, וחומרי תמיכה פרוגנוסטיים. קובץ משלים זה מכיל איורים וטבלאות תומכים הקשורים לזיהוי LSC, הטרוגניות פנוטיפית של AML, השתקפות בין-פלטפורמית, אופטימיזציה ספציפית לפלטפורמה, פרופילי ביטוי של סמן מח עצם, התפתחות פאנלים לאורך זמן, וסף פרוגנוסטי המשמש לכימות LSC בעת האבחון. חומרים אלו מספקים הקשר נוסף לזרימת העבודה של ציטומטריית זרימת MRD רב-מרכזית, כולל ההיגיון להערכת תאים מועשר ב-LSC CD34⁺CD38⁻ , הבסיס הטכני להרמוניזציה של פלטפורמות, ונתונים תומכים המשמשים לפרשנות רקע מח העצם, נדידת פאנלים ובחירת סף קלינית. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

שלבים קריטיים בפרוטוקול

איכות הדגימה היא קריטית לכימות מדויק של MRD ו-LSC. דגימות מח עצם טריות צריכות להיות מועברות בטמפרטורת החדר ולעבד אותן אידיאלית בתוך 24–48 שעות, ואם יש צורך, תוך 72 שעות לאחר איסוף²³ שעות. יש להעריך את הדילול בכל נקודת זמן ולכלול בדוח הזרימה הקלינית. הרופא צריך לציין את נקודת זמן הטיפול, לדוגמה, לאחר האינדוקציה, קונסולידציה, אימונותרפיה ממוקדת, טיפול פחות אינטנסיבי כמו אזציטידין/ונטוקלקס, או אלוגרפט. נוף ההבדלה קשור קשר הדוק לטיפול ולנקודת זמן וחשוב לשלב אותו בפרשנות MRD. במהלך מעקב לאורך זמן, יש לשמור על אותה רגישות ואמינות ניתוח של המכשיר באמצעות בדיקות סדירות של ערכי המטרה עם חרוזי בקרה בענן, EQA סדירה, וסקירה קולגיאלית של קבצי FCS לאורך כל המחקר.

רמת תקינה גבוהה ואמינות בין-מרכזית של כימות זרימת MRD נשמרת באמצעות הכשרה חינוכית מבוססת רשת בקבוצת הזרימה. נערך לפחות מפגש הדרכה מקוון אחד בחודש, ובמהלך שנים אלו נדונו ונבדקו יותר מ-100 מקרים של MRD LAIP/DfN, MRD LSC או כימות LSC אבחני. ההשכלה המתמשכת הזו חשובה משום שפירוש נתוני זרימה דורש ביולוג מוסמך מאוד, במיוחד עבור MRD ברמה נמוכה, אוכלוסיות רקע פיזיולוגיות, מח עצם מתחדש והחלפות פנוטיפיות בטיפול.

כימות אוכלוסיות מועשירות ב-CD34⁺CD38⁻ הוא שלב קריטי נוסף. אין סמן אוניברסלי ללכידת תאי גזע המטופואטיים תקינים. קבוצת HOVON הציגה ניטור LSC באבחון ומעקב של AML באמצעות פאנל של 8 צבעים הכולל סט של סמנים "דיכוטומיים" רלוונטיים של LSC³. סמנים דיכוטומיים מוגדרים ככאלה שאינם מראים ביטוי בתאי גזע המטופואטיים תקינים אך ביטוי חיובי באוכלוסיות מועשירות ב-LSC, עם דפוסים עמומים, בינוניים, גבוהים, הטרוגניים או דו-מודליים. יש עניין לכלול שילוב של סמנים דיכוטומיים ספציפיים של LSC, כגון CLL1, TIM3 ו-CD97, בערוץ יחיד, כי אם רק אחד חיובי, ניתן עדיין לזהות תאים מועשרים ב-LSC. יש להשתמש בסמנים אחרים בנפרד בערוצים מסוימים מכיוון שהביטוי שלהם עלול לחפוף לזה של תאי גזע המטופואטיים תקינים, בהתאם למצב מח העצם, כולל מח עצם²⁴ המתחדש או המתוח. ההגדרה המלאה של תאים מועשרים ב-LSC מבוססת על אופרטורים בוליאניים, כולל ביטוי חריג של סמנים בשבר CD34⁺CD38⁻ . מכיוון שהגדרה זו נשארת פנוטיפית, יש לפרש את האוכלוסייה כתאים מועשרים ב-LSC ב-CD34⁺CD38⁻ ולא כתאים מוכחים תפקודית בכל דגימה. פאנל LSC זה רלוונטי גם למטופלים עם MDS עם עודף בלסטים וב-AML MRC המשתמשים באותו פרוטוקול.

שינויים ופתרון תקלות בשיטה

במהלך התפתחות הפלטפורמה והפאנלים, יש לשמור על גישת התקינה/הרמוניזציה בתוך רשת המעבדה, במיוחד בעת מעבר מפאנלים עם 8 ל-10 צבעים לפאנלים בני 12 עד 13 צבעים. עם התפתחות המכונות, יש צורך לשמור על עמוד שדרה משותף של נוגדנים ורגישות זהה בזיהוי אנומליות פנוטיפיות לאורך כל המחקר הקליני. במהלך התפתחות הפלטפורמה, הפלואורוכרומים של נוגדנים בעמוד השדרה נשארים יציבים ומפוזרים בכל המכונות (CD34/CD38/CD45/CD117). עם זאת, עבור חלק מהערוצים, יש צורך בשינוי פלואורוכרומים בשל בנק האופטיקה הספציפי למכונה, שדורש גישת הרמוניזציה. בעת מעבר מציטומטר גלאי PMT לציטומומטר גלאי APD, יש לקחת בחשבון את הרגישות הגבוהה של גלאי APD באורכי גל גבוהים. לכן, במקרים מסוימים, יש להתאים את בחירת הפלואורוכרומים לנוגדנים מסוימים כדי לשמור על אותו מדד צביעה ולמנוע התפשטות מופרזת בין ערוצים, ובכך לאמץ גישה אופטימיזציה. ציטומטרים קליניים קיימים תומכים בפאנלים של 12 עד 13 צבעים, מה שמגביר את הספציפיות בזיהוי LAIP ומשפרים את הפרשנות באמצעות הוספת סמנים שמבטלים תאים מזהמים בשער ה-MRD. עם זאת, זה גם מעלה את המורכבות של ניתוח²³.

השדרוג מפאנלים עם 8 צבעים ל-12 צבעים שיפר את הרגישות והספציפיות של הערכת MRD במקרים מסוימים (קובץ משלים 1). בצינור 1 נוספו HLA-DR, CD36, CD10 ו-CD56, מופרדים מ-CD7. בצינור 2 נוספו HLA-DR, CD36, CD200 ו-CD19. בצינור 3, CD4, CD64, CD38, CD36 ו-CD14 נוספו. HLA-DR, שמשולב כעת באופן שיטתי עם CD38 בכל צינור, מספק הגדרה ברורה יותר של LAIP ודפוסי הבחנה משתנים. CD36, שכיום כלול באופן שיטתי בכל צינור, הוא סמן מרכזי לזיהוי אריתרובלסטים, תאי אדומים, טסיות ופסולת, ולשיפור שער ה-MRD הסופי. CD19 בצינור ה-LSC גם מסייע בזיהוי המטוגונים. שילוב סמני התמיינות מונוציטים וגרנולוציטים בצינור אחד מאפשר הגדרה טובה יותר של דפוסי התמיינות מונוציטית וגרנולוציטיות ועוזר להבחין בין חריגות לזיהוי LAIP. כאשר עברנו מפאנלים עם 8 צבעים ל-10 צבעים, השיפור העיקרי הגיע מזיהוי LAIP, במיוחד עם הוספת HLA-DR ו-CD56 המופרדים מ-CD7 בצינור 1 ו-HLA-DR ו-CD19 בצינור 2. כאשר עברו מפאנלים של 10 צבעים ל-12 צבעים, השיפור נבע מניקוי טוב יותר של שערי הפיצוץ ושערי ה-LSC עם הוספת CD36 בכל צינור, שהושלם על ידי CD10 בצינור 1 ו-CD200 בצינור 2. זה היה שימושי במיוחד למטופלים עם MRD ברמה נמוכה מעל גבול הזיהוי אך מתחת לגבול הכמות. ביחד, רוב המטופלים עם חיוביות ל-MRD בסף הקליני ≥-0.1% כבר זוהו עם הפאנל בן 8 הצבעים; עם זאת, שימוש ביותר סמנים בחצוצרות שיפר את הספציפיות והפרשנות של הערכת MRD, במיוחד עבור MRD ברמה נמוכה כפי שמוזכר בהנחיות ELN 2025.

מגבלות השיטה

בחירת גישה רב-מרכזית יכולה להיות מאתגרת. היתכנות מושג זה דורשת צעדים חובה לפני יישום זרימת MRD בניסויים קליניים של AML: התאמת רגישות המכשירים והכנת הדגימה, והכשרה וחינוך שיטתי למפעילי אנליטיקה²⁵. ככל שהפלטפורמות מתפתחות, יש להתאים את האסטרטגיה הרב-מרכזית ורב-הפלטפורמית כדי לשמור על עמידות ושחזוריות של התוצאות. זה כולל סטנדרטיזציה, שימוש באותו לוח והגדרות לאותו סוג פלטפורמה; הרמוניזציה, תוך שימוש באותו לוח על פני פלטפורמות מרובות עם הגדרות הרמוניות; ואופטימיזציה, תוך שימוש בלוח והגדרות מותאמות לכל פלטפורמה.

הדילול הוא אחד הנקודות המאתגרות והקריטיות ביותר לכימות זרימת MRD. נוסחת הייצוג של CD34/WBC המתוארת בפרוטוקול זה צריכה לשמש כמדד איכות משלים לדגימת מח עצם ולא לנרמול תוצאות MRD. הפרשנות שלו עשויה להיות מושפעת מהתחדשות מח העצם, השפעות טיפול, מחלות שאריות ומשטרי טיפול פחות אינטנסיביים. באופן דומה, סמנים כמו CD56, CD123 ו-CD45RA לא צריכים להתפרש כסמנים עצמאיים של DfN או LSC. יש לפרש אותם במסגרת אסטרטגיית השער המלאה, שערי הניקוי, רקע מח עצם רפרנס וההקשר הקליני.

חשיבות השיטה ביחס לשיטות קיימות או חלופיות

לפי הנחיות ELN 2025, MRD הוא סמן פרוגנוסטי מרכזי אצל מטופלים עם AML, ללא קשר לטכניקה או לזמן ההערכה. השימוש בטכניקות שונות של זרימת MRD וסמנים הוא משלים מאוד זה לזה. MRD רב-מודלי, כולל ניתוח LAIP/DfN ו-LSC, שימושי בתנאי שהניתוח מתבצע בתוך רשת סטנדרטית עם דיווח מתואם של התוצאות. הערכת MRD מאפשרת הגדרה טובה יותר של תגובה טיפולית ושל הישנות. זרימת MRD רב-מרכזית ורב-מודלית, יחד עם MRD מולקולרי, ישחקו תפקיד אסטרטגי בניסויים קליניים עתידיים בנוף טיפולי מורכב יותר ויותר, הכולל טיפולים ממוקדים חדשים, טיפולים קו ראשון ושני, השתלות אלוגניות וטיפולים בעצימות נמוכה.

חשיבות ויישומים פוטנציאליים של השיטה בתחומי מחקר ספציפיים

קבוצות HOVON ו-ALFA דיווחו כי כימות אוכלוסיות מועשירות ב-CD34⁺CD38⁻ LSC באבחון AML משפיע קלינית (קובץ משלים 1). נראה שחשוב להגדיר סף קליני משמעותי ל-LSC בהתבסס על שיטת הכמות. כפי שדווח בעבר בשיטה המתוארת כאן, סף LSC ≥1% היה קשור לתוצאה שלילית (קובץ משלים 1)²⁶. בניהול AML, אינטגרציה שונה בין MRD, ניטור LSC והמטופואזיס קלונלי עשויה לסייע לחדד את הפרשנות הטיפולית. האתגר המרכזי הוא להבחין בין MRD, שעשוי לדרוש טיפול נוסף, לבין שיבוטים יציבים לפני לוקמיה, שעשויים לא^{להבחין ב-27}. מערכת דיווח משולבת לחישוב אחוז הפיצוצים הומלצה לאחרונה למעקב AML בהנחיות EHA/ELN^{לשנת 2025}. היא משלבת תוצאות MRD עם השוואה מורפולוגית להערכה מתואמת של פיצוצים, וצריכה להקל על דיווח עקבי בניסויים קליניים להגדרת קטגוריות תגובה בחולי AML.

גם מחקר HOVON וגם מחקר ALFA/FILO BIG1 מראים כי ציון המשלב גישות LAIP/DfN ו-LSC אפשר לסווג מטופלים לארבע קבוצות: LAIP⁻/LSC⁻, LAIP⁺/LSC⁻, LAIP⁻/LSC⁺, ו-LAIP⁺/LSC⁺, עם שיעורי הישרדות כלליים שונים לשלוש שנים ^3,26,29. בסך הכול, תוצאות אלו ממחישות את ההשפעה הקלינית הפרוגנוסטית של שילוב MRD LAIP/DfN ומצב LSC. בהקשר של השתלת תאי גזע המטופואטיים אלוגניים, דווח גם על נוכחות תאי CD34⁺CD38⁻ מועשרים ב-LSC כמנבא לכישלון לאחר השתלה, גם כאשר מספר הפיצוצים הכולל קטן מ-5%³⁰. נתונים קליניים אלו תומכים ברלוונטיות של אסטרטגיות זרימת MRD משולבות, אך הפרוטוקול הנוכחי מתמקד בסטנדרטיזציה של זרימת העבודה הטכנית ובדיווח בין מרכזים.

כנקודת מבט, טכנולוגיית זרימה ספקטרלית עשויה להרחיב את פאנל הסמנים שנבדקו בו-זמנית בגישת ציטומטריית זרימה רב-ממדית, ובכך להגדיל את הספציפיות של LAIPs המפוטרים ולהפחית רעש רקע ביולוגי כתוצאה מהתחדשות המטופואטית. הערכת שכפול זרימה ספקטרלית בין פלטפורמות, פאנלים ומרכזים, כפי שהוצע כאן, תהיה מאתגרת ליישום קליני. אלגוריתמים חדשים לניתוח לא מפוקח, כולל FlowSOM, t-SNE ו-UMAP, עשויים להקל על הבחנה בין המטופואזיס תקין לבין מחלקת הלוקמיה, מהחלק העשיר ב-LSC של CD34⁺CD38⁻ ועד לנפח הפיצוץ. לכידת חלקי LSC לעומק יותר יכולה לסייע בשיפור ניטור ההשתלה במודלים של גזנוגרפט שמקורם בחולה^31,32. קבוצות עבודה של ELN הוקמו כדי לאמת ולהתאמת גישות חדשות אלו^33,34.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Antibodies (CANTO 8C-LYRIC12C)	Fluorochrome	Company	Catalog Number
CD90	FITC	BD Pharmingen	555595
CD7	FITC	BD Bioscience	332773
CD13	PE	BD Bioscience	347406
CD33	PerCPCy5,5	BD Bioscience	333146
CD117	BV421	BD Bioscience	563856
CD38	PeCy7	BD Bioscience	335825
CD34	APC	BD Bioscience	345804
CD45RA	APCH7	BD Pharmingen	560674
CD19	APCH7	BD Bioscience	641395
CD45	V500	BD Bioscience	560777
CD97	PE	BD Pharmingen	555774
TIM3(CD366)	PE	BD Pharmingen	563422
CLL1(CD371)	PE	BD Pharmingen	562566
CD123	PerCPcy5.5	BD Pharmingen	558714
CD15	FITC	BD Bioscience	332778
CD64	PE	BD Pharmingen	558592
CD11b	BV711	BD Bioscience	740771
CD4	APCH7	BD Bioscience	641398
HLADR	APC-R700	BD Horizon	565127
CD56	BV605	BD Horizon	562780
CD14	BV605	BD Horizon	564054
CD200	BV605	BD Biosciences	562853
CD10	BV711	BD Biosciences	740770
CD36	BV786	BD Biosciences	745554
CD19	BV711	BD Biosciences	563036
Antibodies (NAVIOS 10C/DxFlex 12C/13C)	Fluorochrome	Company	Catalog Number
CD90	FITC	BD Pharmingen	555595
CD7 FITC	FITC	BC iotest	A07755
CD13	PE	BC iotest	A07762
CD33	PC5.5	BC iotest	B36289
CD117	SNV428	BC iotest	C76813
CD38	PEcy7	BDBioscience	335825
CD34	APC	BC iotest	IM2472
CD45RA	APCH7	BDBioscience	560674
CD19	AA750	BC iotest	A94681
CD45	KromeOrange	BC iotest	B36294
CD97	PE	BD Pharmingen	555774
TIM3(CD366)	PE	BD Pharmingen	563422
CLL1(CD371)	PE	BD Pharmingen	562566
CD123	PC5.5	BC iotest	B20022
HLADR	ECD	BC iotest	B92438
CD36	AA700	BC iotest	B46022
CD19	ECD	BC iotest	A07770
CD4	PE	BC iotest	A07751
CD11b	BV650	Bdhorizon	569704
CD14	AA750	BC iotest	B92421
HLADR	SNV786	BC iotest	C78087
CD56	AA700	BC iotest	B92446
CD64	BV605	Bdoptibuild	569172
CD36	BV605	BD Horizon	563518
CD10	BV650	Bdoptibuild	745390
CD15	FITC	BD	332778
CD200	BV650	Bdoptibuild	743085
BD FACSCanto II  (8-color, blue/red/violet)		BD Bioscience	338962
BD FACSLyric 3-Laser 12-Color Instrument		BD Bioscience	662383
BC NAVIOSNavios 10 Colors, 3 Lasers, B5-R3-V2 Configuration		Beckman Coulter	B47905
BC DxFLEX  13-Colors, 13 Detectors, 3 Laser,  B5-R3-V5		Beckman Coulter	C78505
BC Kaluza Software v 3.1		Bekman Coulter	A82959
BD FACSuite Software v1.6		BD  Bioscience	651360
BD FACSDiva software v 8.0.3 (Win 7 32 bit OS)		BD  Bioscience	659523
BD CST Beads		BD  Bioscience	656505
Multicolor COMPBEADS		BD  Bioscience	552843
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks), 3.0 - 3.4 µm		BD  Bioscience	559123
ClearL Lab Compensation Beads		Beckman Coulter	B99883
PharmLyse NH4Cl 100ml10x conc		BD  Bioscience	555899
DPBS, 1X		CORNING	21-031-CV
Brillant Stain Buffer Plus		BD  Bioscience	566385
MGG (May-Grünwald-Giemsa)		Sigma Aldrich	1014242500