הדמיה כמותית של תאים חיים של צורת גרעין ודינמיקת כרומטין במהלך ההתפתחות ולחץ סביבתי בשורש Arabidopsis thaliana

Summary

תהליך זה עושה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית בשילוב עם גרעין מסומן פלואורסצנטי וקו סמן כרומטין ב-Arabidopsis thaliana כדי לתעד בו-זמנית את דינמיקת הגרעין והכרומטין בשורשי הערבידופסיס ולחקור שינויים בדינמיקה אלו בתגובה לרמזים התפתחותיים וסביבתיים.

Abstract

הגרעין הוא האברון האופייני לאורגניזמים אאוקריוטיים. בניגוד לתפיסה הקלאסית של גרעינים סטטיים, צורת הגרעין דינמית בתאים חיים. צורה גרעינית משתנה או מעוותת היא סימן היכר של סרטן בתאי בעלי חיים ולחץ סביבתי בצמחים. חלבוני מעטפת גרעינית מתקשרים עם כרומטין כדי לווסת את ביטוי הגנים. למרבה הצער, מעט ידוע על השפעת הלחץ האביוטי על צורת הגרעין, תנועה ודינמיקת הכרומטין. כדי להתמודד עם סוגיה זו, פיתחנו צינור באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ותוכנת מעקב אחר חלקיקים לכימות דינמיקת גרעיניים וכרומטינים בשורשי ארבידופסיס תחת שליטה ותנאי לחץ אביוטיים. שיטת הדמיה קונפוקלית זו עושה שימוש בקו סימון כפול פלואורסצנטי – חלבון מעטפת גרעינית וכרומטין – כדי לבצע הדמיה של תאים חיים של שורש בצמח המודל Arabidopsis thaliana בתנאי שליטה ומלח. סרטים אלו מנותחים כדי לכמת דינמיקה גרעינית וכרומטינית באמצעות תוכנת עיבוד תמונה בקוד פתוח Fiji/ImageJ, בעזרת תוסף TrackMate. כדי לאמת שיטה זו, דמיינו וכמתנו את תנועת הכרומטין בשורשים בשליטה ובשורשים במלח, וחשפים ירידה במהירות הכרומטין בתנאי מלח. שיטה זו מאפשרת הדמיה כמותית של תאים חיים של צורת גרעין שורש ודינמיקת כרומטין במהלך התפתחות הצמח ולחץ סביבתי, וכך מאפשרת ניתוח שינויים בדינמיקת הגרעין והכרומטין הנגרמים על ידי לחצים אביוטיים.

Introduction

צורת הגרעין משתנה בין סוגי תאים שונים ובמהלך ההתפתחות בשורשי Arabidopsis thaliana ^1,2. לדוגמה, הצורה הגרעינית היא כדורית באזורים המריסטמטיים המתחלקים באופן פעיל. בניגוד לאזור המריסטמטי, הגרעינים במעבר השורש ובאזור ההארכה הם פחות כדוריים. יתרה מזאת, גרעינים בתאים מומיינים, כמו שערות שורש, עוברים דרך בסיס שערות השורש הצר והופכים באופן פעיל לגרעינים מוארכים ^3,4,5. השינויים הדינמיים בצורת הגרעין ובתנועה הם קריטיים לתפקוד התא ^6,7. פגמים בצורת הגרעין מובילים לפגיעה תפקודית כמו ירידה בתנועת הגרעין ^1,3. בתאים יונקים, שינויים בצורת התא והגרעין קשורים ישירות לשינויים בביטוי גנים ובסינתזת חלבונים⁸.

במהלך אינטרפאזה, ה-DNA של התא מאורגן ככרומטין. ה-DNA בכרומטין עטוף סביב ההיסטונים, מה שיכול להדק ולשחרר את ה-DNA כדי לשנות את הביטוי. באופן דומה, מיקום הכרומטין ביחס למעטפת הגרעין והקרבה להיקף הגרעין חשובים גם הם לביטוי גנים⁹. לחץ סביבתי, כמו לחץ אוסמוטי, משנה את צורת הגרעין ובהתאם לכך משנה את הביטוי של סט גנים רגישים למגע בשורשי A. thaliana ¹⁰. בהקשר זה, חקר צורת הגרעין ודינמיקת הכרומטין באמצעות הדמיית טיימלפס של תאים חיים הוא חשוב. היבט מרכזי בדינמיקה גרעינית הוא מהירות תנועת הגרעין, שכן מיקום גרעיני בתוך התא מניע ביטוי גנים, ושינוי מיקום גרעיני דורש תנועה גרעינית¹¹. מהירות תנועת הכרומטין בתוך הגרעין חשובה באותה מידה, שכן מיקום הגנים בתוך הגרעין קריטי לקביעת ביטוי גנים¹².

בעבר, צורת הגרעין ודינמיקת הכרומטין הועתקו וכימות בנפרד; כתוצאה מכך, הקשר בין צורת הגרעין לדינמיקת הכרומטין נותר בלתי נחקר. על ידי הדמיית גרעינים וכרומטין בו-זמנית, ניתן לצפות במיקומם יחסית זה לזה, מה שעשוי לחשוף תנועות כמו סיבוב גרעיני ותנועת כרומטין תוך-גרעינית, שקשה או בלתי אפשרי להדגים. בשיטה זו, אנו מציגים טכניקת הדמיית תאים חיים להמחשה וכמותית של צורת הגרעין באמצעות חלבון מעטפת גרעיני חיצוני מתויג פלואורסצנטית, WPP אינטראקטיבי בדומיין 1 (^WIP1)13 , וכרומטין באמצעות דינמיקת היסטון H3 (CENH3)¹⁴ הצנטרומרית בו-זמנית תחת תנאי שליטה ומלח, במטרה לאפשר ניתוח שינויים בדינמיקת הגרעין והכרומטין הנגרמים על ידי לחצים א-ביוטיים. כדי לאפשר שיטה זו, יצרנו קו WIP1-GFP/CENH3-mRFP של A. thaliana. בנוסף, חקרנו את דינמיקת הכרומטין באופן כמותי באמצעות תוסף TrackMate של תוכנת ImageJ/Fiji בקוד פתוח. בדקנו טכניקות של קו פלואורסצנטי כפול ודינמיקת כרומטין שהוצגו כאן בתנאי לחץ מלח וגילינו שינוי במורפולוגיה ובדינמיקה של מוקדי המרכז הנובעים מתנאי מאמצים. שיטה פשוטה וניתנת לשחזור זו אידיאלית למעקב בתפוקה גבוהה של דינמיקת גרעין וכרומטין בשורשי ארבידופסיס תחת תנאי מאמץ אביוטיים שונים.

Protocol

1. גידול שתילי A. thaliana

1. הכנת מדיה לצמיחה
   1. הנח 800 מ"ל מים טהורים בכוס של 1 ליטר על צלחת ערבוב. הוסיפו מוט ערבוב לבקבוק.
   2. הפעל את צלחת הערבוב ב-600 סל"ד.
   3. הוסיפו 10 גרם סוכרוז לבקבוק.
   4. הוסיפו 2.16 גרם של מדיום גידול של Murashige ו-Skoog (MS) לבקבוק.
   5. הוסף 5 מ"ג אגר לכל אחד משני בקבוקי מדיה של 1 ליטר.
   6. תייג בקבוק אחד "1/2 MS" ואת השני "100 mM NaCl".
   7. תתייג את שני המכסים עם סרט אוטוקלאב.
   8. הוסף 5.84 גרם NaCl לבקבוק המסומן "100 mM NaCl".
   9. מלאו את הבקבוקון בליטר מים טהורים.
   10. החזירו את הבקבוק למשטח הערבוב וחכו עד שהסוכרוז וה-MS יימסו.
   11. שפוך את תכולת הבקבוק לתוך גליל מדורג בנפח 1 ליטר.
   12. שפוך 500 מ"ל מתוכן הצילינדר המדורג לכל בקבוק.
   13. מדיום גדילה של אוטוקלאב ו-250 מ"ל מים טהורים עם מחזור נוזל של 60 דקות בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס.
       הערה: בעת אוטוקלבינג של מדיה ומים, ודא שהמכסים רפויים כדי למנוע פיצוצים אפשריים.
   14. הברג מחדש את מכסי המדיה לצמיחה.
   15. הפוך בקבוקי מדיה לגדילה 7 פעמים כדי להבטיח שהאגר יתפזר היטב בכל מקום.
   16. אחסן מדיום גידול במקרר של 4 מעלות צלזיוס עד שצריך, וחמם במיקרוגל לנוזל.
2. הצבת לוחות צמיחה וזרעים
   1. במכסה זרימה, השתמשו באקדח פיפטות כדי לפזר 50 מ"ל מדיום גידול לכל אחד מעשר הלוחות (איור 1A).
   2. בזמן שהמדיה מתגבשת, נקה את זרעי WIP1-GFP x CENH3-mRFP על ידי הצפתם בצינור מיקרוצנטריפוגה עם 1 מ"ל של 70% אתנול למשך 10 דקות (איור 1B).
      הערה: בעת טיפול באתנול, ודא שאין להבות פתוחות בסביבה.
   3. לאחר 10 דקות, בתוך מכסה הזרימה, הסר את האתנול ושוטף את הזרעים פעמיים ב-1 מ"ל מים מאוטוקליים (איור 1C).
   4. לאחר שהמדיום התייצב, השתמש בפיפטה של 1000 מיקרוליטר כדי להניח זרעים נקיים על לוחות גידול בשתי שורות של 14 זרעים בכל צלחת (איור 1D).
   5. לסמן את הלוחות עם טוש קבוע ולאטום אותם עם סרט מיקרופור לפני היציאה ממכסה הזרימה (איור 1E).
3. נביטות שתילים
   1. עטפו את לוחות הגידול בנייר אלומיניום ומעטפים אותן בקירור במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מינימום יומיים (איור 1F).
   2. לאחר הסטרטיפיקציה הקרה, יש להוציא את הצלחות מהמקרר ולהשאיר אותן אנכית תחת אורות גידול (~80 מיקרומול/מ^{' 2}/שנייה) למשך מינימום של 4 ימים (איור 1G).
   3. העבר חצי מהלוחות למדיום גידול NaCl של 100 מ"מ במכסה הזרימה, ואז אטום ותייג את הלוחות (איור 1H).
   4. צלחות גידול מתחת לאורות גידול במשך יומיים לפני הדמיה (איור 1I).

2. הדמיית תאים חיים של גרעיני שורש וכרומטין של A. thaliana

1. הכנת שקופית
   1. פיפט של 60 מיקרוליטר מים טהורים על מגלש זכוכית (איור 2A).
   2. הניחו 3 שורשי שתיל של A. thaliana בני 6 ימים במים (איור 2B).
   3. הנח כיסוי החלקה בגודל 22 מ"מ × 22 מ"מ #1.5 מעל השורשים מבלי לכסות את העלים (איור 2C).
2. הגדרות מיקרוסקופ קונפוקלי
   1. הגדר את זמן החשיפה ללייזר ל-1000 מילישניות (1 שנייה).
   2. במשלב הלייזר, כוון את לייזר 488 ננומטר ל-50% עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ואת 561 ננומטר ל-50% לחלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) (איור 2D). תמונה עם עדשת אובייקטיבית של 20× ללא זום אופטי. אם מקליטים יותר מ-10 דקות, הפחיתו את העוצמה כדי להפחית את הבלנת הפוטו.
   3. הגדר את גודל צעד פרוסת Z ל-0.3 מיקרון.
   4. הגדר את המרווח לדקה אחת ואת משך הזמן הכולל ל-10 דקות.
3. הדמיה
   1. אתר שורשים ובחר עד 20 s-slice ולצלם תמונות באורך 16 ביט.
   2. התחל טיימלפס.
   3. שמור טיימלפס כקובץ TIFF באמצעות דחיסה ללא אובדן.
   4. העבר נתונים למחשב לניתוח.

3. מעקב וניתוח נתונים

הערה: תצטרך את גרסת פיג'י של תוכנת הקוד הפתוח ImageJ (מומלץ גרסה 1.54), שמגיעה עם TrackMate מותקן מראש.

1. אתחול
   1. פתח תמונה: ג'/פיג'י.
   2. לחץ וגרר קובץ .vsi אל חלון היישום הראשי של ImageJ/Fiji (איור 3A).
   3. הנחיה בשם Bio-Formats Import Options תופיע; לחץ על אישור בפינה הימנית התחתונה (איור 3B).
   4. תופיע הנחיה בשם Bio-Formats Series Options . ודא שסדרה 1 נבחרה ולחץ על אישור בפינה השמאלית התחתונה (איור 3C).
      הערה: הקובץ עשוי לקחת דקה לטעון, במיוחד אם יש לו הרבה שכבות Z או נקודות זמן.
   5. לאחר שהתמונה נפתחה (איור 3D), חלקו את האותות על ידי ניווט בחלון הראשי של ImageJ לתמונה > צבע > פיצול ערוצים (איור 3E). זה ייצור שני חלונות נפרדים, אחד לגרעינים המסומנים ב-GFP ואחד לכרומטין המסומן ב-RFP (איור 3F).
2. כרומטין עיבוד מוקדם
   1. קבע איזה משני החלונות מתאים לכרומטין.
   2. לחצו על חלון הכרומטין (איור 3F) והחלו את פעולת פרויקט Z על ידי ניווט בחלון הראשי של ImageJ לערימות > תמונה > פרויקט Z (איור 4A).
   3. שנה את סוג ההקרנה ל-Maximum Intensity וודא ש-All Time Frames פעיל, ואז לחץ על אישור (איור 4B).
   4. פתח את תפריט הניגודיות על ידי לחיצה על Ctrl+Shift+C או ניווט בחלון הראשי של ImageJ לתמונה > התאמת בהירות/ניגודיות > (איור 4C).
   5. הזיזו את הסרגל השני (המסומן מקסימום) שמאלה עד שהכרומטין נראה בקלות (איור 4D).
3. כרומטין מעקב
   1. עבר לתוספים (איור 5A).
   2. לחצו על החץ למטה בתפריט התוספים כדי לגלול לאפשרות המעקב (איור 5A).
   3. לחץ על מעקב, ואז TrackMate.
   4. ההגדרות הראשוניות יופיעו. ודא שהגדרות הכיול מדויקות, ואז לחץ על הבא (איור 5B).
   5. בחר בגלאי סף ולחץ על הבא (איור 5C).
   6. בחלון התמונה, עברו לפריים האחרון של הטיימלפס (איור 5D).
   7. ליד סף העוצמה, לחץ על אוטומטי, ואז תצוגה מקדימה.
   8. כוון את סף העוצמה ולחץ על תצוגה מקדימה. כווננו ותצצוגו שוב ושוב את הסף עד שהתצוגה המקדימה כוללת את כל הכרומטין וכוללת מינימום רעש, ואז לחצו על הבא (איור 5D).
   9. יתרחש זיהוי סף ראשוני; לחץ הבא (איור 5E).
   10. סף ידנית עד שרק כרומטין נראה, ואז לחץ על הבא (איור 5F).
   11. דף זה מאפשר סינון של נקודות. התעלם מזה ולחץ על הבא (איור 6A).
   12. בחר במעקב LAP פשוט ולחץ על הבא (איור 6B). עוקב LAP רלוונטי כאשר אובייקטים שנעקבו אינם מתמזגים או מתפצלים.
   13. הגדר את מרחק הקישור המקסימלי ל-5 מיקרון, את מרחק סגירת הרווחים ל-15 מיקרון, ואת מרחק המסגרת המקסימלי לסגירת הרווח ל-1. לחץ הבא (איור 6C).
   14. המעקב יתרחש. רצועות יופיעו בחלון התמונה המקורי. לחץ הבא (איור 6D).
   15. דף זה מאפשר סינון מסלולים. לחץ על כפתור הירוק + בפינה השמאלית התחתונה כדי ליצור פילטר, ואז בחר את מספר המקומות במצב מסלול ולחץ על אוטומטי (איור 6E).
   16. ודא שהמצב מוגדר למעלה. זה יבטל נקודות שמופיעות ונעלמות במהירות.
   17. לחץ הבא (איור 6E).
   18. דף אפשרויות התצוגה מאפשר ייצוא נתונים כקובץ csv. בתחתית הדף, לחץ על כפתור Tracks , ואז ייצוא ל-CSV (איור 7A).
   19. דף זה מאפשר תכנון מובנה; התעלם מזה ולחץ על הבא.
   20. בעמוד האחרון, שמור את הווידאו באמצעות שכבת Capture ולחץ על Execute. לחץ עליו, ואז עבור לקובץ > לשמור כ-GIF > (איור 7B).
4. ניתוח מהירות בסיסי
   1. פתח את קובץ ה-CSV של הטרקים בתוכנת גיליון אלקטרוני.
   2. מחק את כל העמודות למעט TRACK_ID, POSITION_X, POSITION_Y, POSITION_T, FRAME ו-RADIUS.
   3. המקומות בכל מסלול יהיו לא בסדר מסודר. כדי לסדר אותם, קודם להקפיא את ארבע השורות העליונות ואז ליצור עמודה חדשה בשם TRACK_FRAME ולהעתיק ולהדביק את הנוסחה הזו לעמודה: =concatenate(A4, "_", if(E4>9, E4, concatenate("0", E4))).
   4. בחר את עמודת TRACK_FRAME , לחץ עליה קליק ימני, ואז לחץ על מיון גיליון א'–ת'. המקומות בכל מסלול אמורים להיות מסודרים כעת.
   5. כדי לוודא שאין נקודות חסרות באמצע מסלולים, צרו עמודה חדשה והשתמשו בנוסחה זו: =if(E4>E3, E4-E3, "NA"). ודא שהמקום הראשון בכל מסלול מחזיר "NA" והשאר 1.
   6. צור עמודה עבור מהירות (מיקרון/פריים) והדביק לתוכו את הנוסחה הבאה: =if(H4="NA", "NA", sqrt((B4-B3)^2 + (C4-C3)^2)). זה ישתמש במשפט פיתגורס כדי לחשב את המרחק בין שתי נקודות.
   7. כדי לתרגם זאת למהירות (מיקרון/שנייה), צור עמודה חדשה והדביק לתוכו את הנוסחה הבאה: =IF(I5="NA", "NA", I5/(D5/E5)). זה ימצא את השניות/פריימים ויתרגם מיקרון/פריים בהתאם.

Results

הדמיית תאים חיים של מעטפת גרעינית ודינמיקת כרומטין
יצרנו קו סמן פלואורסצנטי כפול, הכולל את חלבון המעטפת הגרעינית החיצונית WIP1-GFP וכרומטין צנטרומרי CENH3-mRFP (איור 8). שתילים בני 4 ימים הועברו ללוח הבקרה או לוחות 100 מ"מ מייל המכילים NaCl למשך יומיים. לאחר יומיים של דגירה נצפה עיכוב ברור של גדילת שורשים בטיפול במלח, כפי שדווח^{קודם לכן 15}. גם שורשים מבוקרים וגם שורשים מטופלים במלח שימשו לביצוע הדמיה של תאים חיים ול...

Discussion

השיטה המוצגת כאן אידיאלית למעקב אחר דינמיקת כרומטין. בהשוואה לשיטות דימות תאים חיים קודמות עם הדמיה נפרדת, הדמיה סימולטנית של גרעינים וכרומטין, מאפשרת לחקור את הקשר בין דינמיקת גרעין לדינמיקת כרומטין. זה עשוי לחשוף תנועות כמו סיבוב גרעיני ותנועת כרומטין תוך-גרעינית שקשה להדגים בדרך כלל.

כשיטת הדמיה של תאים חיים, חשוב ביותר שיהיה קו פלואורסצנטי עם אותות עקביים לאורך כל התהליך. אם הלבנת פוטו-ליצ'ינג משבשת אותות במהלך טיים-לפס, יש לקצר את עוצמת הלייזר וזמן החשיפה...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
½ Murashige and Skoog (MS) media	bioWorld	30630058
3M micropore tapes	Amazon	A-1530-0
Acqusition software	Olympus/Evident	CellSens
Agar	bioWorld	40100072
CENH3-mRFP	ABRC	CS799459
Cover slip	Genesee	29-116
Glass slide	Genesee	29-101
Image/Fiji	Open-source	https://imagej.net/software/fiji/downloads
Microscope	Olympus/Evident	IX83
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-212
Spinning disk	Yokogawa	CSU-W1
Square petri dishes	Simport	26-275
Sucrose	bioWorld	41900152
WIP1-GFP	ABRC	CS39987