מאמר מחקר

פרמקולוגיה רשתית, למידת מכונה ואימות בחיים של קפסולת דנז'י ג'יאנגטאנג בנפרופתיה סוכרתית

54 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71328

⸱

28 ביולי 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Anhui University of Chinese Medicine

במאמר זה

סיכום

קפסולת דנז'י ג'יאנגטאנג (DJC) עשויה להחליש נפרופתיה סוכרתית (DN), כפי שמעידים שינויים באיתות כימוקינים וסמנים של פירופטוזיס, הנתמכים בביואינפורמטיקה ובאימות in vivo .

תקציר

למרות שקפסולת דנז'י ג'יאנגטאנג (DJC) היא תכשיר צמחי מסורתי סיני המשמש קלינית לטיפול בסוכרת, האופן שבו היא עשויה להגן על הכליה במהלך נפרופתיה סוכרתית (DN) טרם הובהר במלואו. חקירה זו נועדה לחקור מנגנונים פוטנציאליים שבאמצעותם DJC משפיע על DN, עם דגש על מפל האיתות הקשור לפירופטוזיס במשפחת NLR (NLRP3)/Caspase-1/Gasdermin D (GSDMD).

שימשה אסטרטגיה משולבת המשלבת פרמקולוגיה רשתית ולמידת מכונה. מאגר ופלטפורמת הניתוח של מערכות פרמקולוגיה של הרפואה הסינית המסורתית (TCMSP) וכלי ניתוח ביואינפורמטיקה למנגנון מולקולרי של הרפואה הסינית המסורתית (BATMAN-TCM) שימשו לסינון רכיבים ביואקטיביים ומטרות החלבון המקבילות ל-DJC. גנים הקשורים ל-DN נאספו מ-Gene Expression Omnibus (GEO), GeneCards, ו-Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). יעדי המועמדים המרכזיים נבדקו ודורגו באמצעות מספר אלגוריתמים של למידת מכונה. הזיקה בין הרכיבים הפעילים של DJC לבין מטרות הליבה הוערכה באמצעות עגינה מולקולרית. לבסוף, היעילות הטיפולית והמנגנונים החזויים הוערכו בעכברים סוכרתיים עם db/db.

ניתוח פרמקולוגיה רשת זיהה 599 יעדי DJC ו-68 גנים חופפים המשותפים ל-DN. באמצעות אלגוריתמים של למידת מכונה, C-C motif chemokine ligand 2 (CCL2) ו-CASP1 זוהו כיעדים מועמדים מועדפים. עגינה מולקולרית חזה זיקות קשירה חזקות אפשריות בין רכיבים פעילים של DJC לחלבוני הליבה הללו. ניתוחי העשרה פונקציונלית (GO/KEGG) הציעו כי מודולציית DJC קשורה לתגובות דלקתיות ולמסלול MAPK. אימות in vivo הראה שטיפול ב-DJC הפחית פגיעות כליות וסמנים של פיברוזיס. ממצאים אלו מצביעים על כך ש-DJC עשוי להחליש DN בחלקו באמצעות שינויים באיתות הפירופטוזיס הקשורים ל-CCL2/C-C (CCR2) הקשורים לקולטן כימוקין מוטיב CCL2/C-C.

מבוא

הנטל העולמי של סוכרת (DM) ממשיך לעלות, ומציב אתגר בריאותי ציבורי משמעותי. כ-5.2 מיליון מקרי מוות שנתיים נובעים מ-DM ומהסיבוכים הקשורים אליו1. DN נחשב לסיבוך מיקרווסקולרי חמור ותורם מרכזי להתפתחות מחלת כליה בשלב סופי (ESRD), ומשפיע על כ-30-40% מאוכלוסיית הסוכרת 2,3. גורמים רבים המשולבים תורמים להתקדמות פתולוגית של DN, כולל תפקוד מטבולי לקוי, שינוי המודינמי ותגובות דלקתיות מתמשכות. פגיעות פתולוגיות, כולל רמות גלוקוז גבוהות והיפרליפידמיה, מפעילות את מסלול הפירופטוזיס המתווך על ידי NLRP3/caspase-1/GSDMD, וגורמות למוות מתוכנת דלקתי בתאי אפיתל מזנגיאלים וצינוריים בכליות, ואחריהם נגעים tubulointerstitial מתקדמים4. פירופטוזיס מאופיין בקרע בממברנת הפלזמה, שמניע את שחרור IL-1β ו-IL-185. גורמים פרודלקתיים כאלה מגבירים את שעתוק ה-C-C Motif Chemokine Ligand 2 (CCL2), מקדמים חדירת מקרופאגים, ומחזקים עוד יותר את ההפעלה הפירופטוטית, ובכך מחמירים בהדרגה את פגיעת הכליה6. בפרקטיקה הקלינית, מצב זה מתבטא באלבומינוריה מתקדמת וירידה הדרגתית בקצב הסינון הגלומרולרי, שיכולה להוביל לנזק בלתי הפיך לכליות ולהידרדרות משמעותית באיכות החיים של הנפגעים 7,8. למרות ההתקדמות בטיפול הרפואי, האסטרטגיות הטיפוליות הנוכחיות, המתמקדות בעיקר בשליטה קפדנית על הגליקמיה ולחץ הדם, לעיתים קרובות אינן מצליחות לעצור לחלוטין את התקדמות המחלה. בעוד שתרמותרפיות מתפתחות, כולל סוכני חוסם SGLT2, אגוניסטים של GLP-1, וחוסמי קולטני מינרלוקורטיקואידים, כמו גם טיפולים בתאי גזע והתערבויות תזונתיות, זכו לתשומת לב רבה והופכים נפוציםיותר בפרקטיקה, הסיכון השאריתי ל-DN נשאר גבוה. לכן, פיתוח חומרים טיפוליים חדשניים נותר עדיפות מחקרית דחופה, במיוחד אלו מהרפואה המסורתית שעשויים להתמקד במספר מסלולים פתולוגיים בו-זמנית.

קפסולת דנז'י ג'יאנגטאנג (DJC), נוסחה בלעדית לבית החולים שפותחה בבית החולים הראשון המסונף של אוניברסיטת הרפואה הסינית באנחווי (אישור הכנה למוסד הרפואי המחוזי של אנחווי מס' Z20090006; פטנט מס' ZL200310112845.1; אצווה מס' 20220427), היא מועמדת טיפולית מבטיחה. יש לאטום אותו, לאחסן בסביבה יבשה ומאווררת, ולהגן עליו מאור. הנוסחה מורכבת משישה עשבי תיבול סיניים מסורתיים: Pseudostellaria heterophylla (Radix Pseudostellariae), Whitmania pigra (Hirudo), Alisma orientale (Alismatis Rhizoma), Cuscuta chinensis (זרע Cuscutae), Paeonia suffruticosa (קורטקס Moutan), ו-Rehmannia glutinosa (Rehmanniae Radix Praeparata) (5:4:4:3:2:5)10. בפרקטיקה הקלינית, DJC הוכיח יעילות משמעותית בהיפוגליקמיה ויכולת להפחית סמנים של פגיעות כליות אצל חולי סוכרת11. מחקרים קודמים מצביעים על כך ש-DJC עשוי להפעיל אפקטים של הגנת רנופרוטקל על ידי ויסות רמות הגלוקוז בדם ומטבוליזם של שומנים 12,13,14. מחקרים קודמים על DJC התמקדו בעיקר באימות חד-נתיבי עם בחירת יעד לא שיטתית. לכן, שילבנו פרמקולוגיה של רשת ולמידת מכונה כדי לסינן רכיבים פעילים ולזהות גנים מרכזיים של ה-hub, ולאחר מכן אימות ראשוני ב-vivo לחיזוק הניתוח.

פרמקולוגיה רשתית מציעה אסטרטגיה יעילה לניתוח מרשמים צמחיים מסובכים. מסגרת זו משלבת גישות ביואינפורמטיות ושיטתיות ביולוגיות, כימיה חישובית ופרמקולוגיה כדי לפענח את המנגנונים של פעולות התרופות "רב-רכיבים, רב-מטרות ורב-מסלולים" 15,16,17. גישה הוליסטית זו מאפשרת בדיקה מובנית של האינטראקציות המורכבות בין תרכובות צמחיות לרשתות ספציפיות למחלות, וחושפת את ההשפעות הסינרגטיות הטבועות ב-TCM18. עם זאת, פרמקולוגיה רשתית מסורתית יכולה לעיתים ליצור רעש מופרז בנתונים. כדי להתגבר על כך, שילוב אלגוריתמים של למידת מכונה מאפשר סינון מדויק של גנים מאפיינים מרכזיים מתוך מאגרי נתונים בקנה מידה גדול. יתרה מזאת, עגינה מולקולרית מספקת פרספקטיבה אינטואיטיבית ודינמית לחיזוי זיקות אפשריות בין תרופות לביומולקולות19.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

סקר של תרכובות ביואקטיביות ומטרות פוטנציאליות של DJC

תרכובות ביואקטיביות של ששת הצמחים ב-DJC, Pseudostellaria heterophylla (Radix Pseudostellariae), Paeonia suffruticosa (Moutan Cortex), Cuscuta chinensis (Cuscutae Semen), Alisma orientale (Alismatis Rhizoma), Rehmannia glutinosa (Rehmanniae Radix Praeparata) ו-Whitmania pigra (Hirudo) נאספו ממאגר הנתונים של TCMSP. הסקר בוצע על פי פרמטרים פרמקוקינטיים: זמינות ביולוגית דרך הפה (OB) ≥ 30% ודמיון תרופתי (DL) ≥ 0.18. עבור Whitmania pigra, שחסרה נתונים ב-TCMSP, התרכובות והמטרות הפעילות שלו התקבלו מ-BATMAN-TCM, תוך שימוש בציון ≥ 20 וערך P < 0.05 כקריטריוני בחירה. UniProt יושם כדי לאחד את כל המטרות שנאספו לשם גנים סטנדרטי.

רכישת גנים הקשורים ל-DN

גנים הקשורים ל-DN נאספו משלושה מקורות. ראשית, GeneCards ו-OMIM נבדקו באמצעות מונח החיפוש "נפרופתיה סוכרתית". גנים מ-GeneCards עם ציון רלוונטיות > 1 נשמרו. שנית, שלושה פרופילי מיקרו-מערך (GSE30529, GSE104948, GSE96804) התקבלו ממאגר GEO. הדגימות ב-GSE30529 נגזרו מצינורות כליה, בעוד שהדגימות GSE104948 ו-GSE96804 מקורן מגלומרולים כלייתיים. כל החיפושים במאגרי הנתונים נערכו ב-15 בדצמבר 2024. גנים מבוטאים באופן שונה (DEGs) בין מטופלי DN לבין ביקורת בריאה במאגר הנתונים GSE30529 זוהו באמצעות חבילת לימה בתוכנת R. קריטריוני הסינון נקבעו על ערך p מותאם < 0.05 ו-|log2(שינוי קיפול)| > 0.5. גרפי הרי געש ומפות חום הציגו גנים מבוטאים באופן שונה.

זיהוי מטרות טיפוליות משוערות של DJC עבור DN

ניתוח דיאגרמת ון זיהה לוקוסים משותפים בין מאגר היעד של DJC לגנים הקשורים ל-DN מ-GeneCards, OMIM ו-GSE30529 DEGs. לוקוסים משותפים אלו שימשו כגנים טיפוליים מועמדים לכל הליכי המחקר במורד הזרם.

הקמה ופרופיל של רשתות אינטראקציה עם חלבונים (PPI)

לוקוסים טיפוליים משוערים הועלו ל-STRING לבניית רשת אינטראקציה בין חלבון, כאשר נקודת חיתוך אינטראקציה מוגדרת מעל ערך אמון של 0.4. Cytoscape עיבדה את מערכי הנתונים של הרשת להצגה ויזואלית. אינדקסים טופולוגיים כמו Degree חושבו באמצעות תוסף CytoNCA כדי לזהות צמתים מרכזיים ברחבי הרשת.

ניתוח העשרה

כדי להגדיר את התפקידים הביולוגיים ומפלי האיתות הקשורים למטרות מועמדים, נותחה העשרה פונקציונלית ב-R באמצעות חבילת clusterProfiler, באמצעות org. Hs.eg.db להערות ו-ggplot2 להמחשה. מונחי אונטולוגיה גנטית (GO) הוערכו בקטגוריות של תהליכים ביולוגיים (BP), רכיבים תאי (CC) ותפקוד מולקולרי (MF). אנציקלופדיה קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) נשמרה כאשר ערך ההעשרה p היה < 0.05.

יישום אלגוריתם CytoHubba

תוסף CytoHubba ב-Cytoscape שימש לחישוב ארבעה מדדי מרכזיות טופולוגיים לכל צומת רשת. דרגה, מספר השכנים המחוברים ישירות, משקף את רוחב האינטראקציות של כל חלבון. רכיב השכונה המקסימלי (MNC), מדד שמכמת את גודל הרכיב המחובר הגדול ביותר בתת-הגרף של השכונה של הצומת, מודד את ההשפעה הרגולטורית המקומית. רכיב הקצה (EPC) מעריך חשיבות מבנית גלובלית באמצעות הסרת קצה אקראית מדומה וכימות של גודל הרכיב המחובר הממוצע. גנים שדורגו ב-20 הראשונים בכל מדד נחתכו כדי להפיק את הגנים הסופיים של המרכזים.

סינון גנים בסיסי מבוסס למידת מכונה

שלוש גישות למידת מכונה יושמו על פרופילי ביטוי מתוך מאגר הנתונים GSE30529 כדי לזהות גנים אמינים של מרכז בין יעדים מועמדים.

(1) LASSO (אופרטור ההתכווצות והבחירה המוחלטת המינימלית): פרמטר הרגולריזציה λ כוון באמצעות אימות צולב של חמישה פעמים, כאשר הערך האופטימלי נקבע על ידי ביצועים ממוצעים בין קפלים. מאפייני ביטוי גנים בקלט עברו תקנון אוטומטי של ציון Z כדי לבטל השפעות של עוצמת הביטוי. כאשר פרמטר העונש α קבוע ל-1 עבור רגולריזציה טהורה של LASSO, נעשה שימוש בפאנל מוגדר מראש של 100 ערכי λ לסינון. העונש L1 הקטין את המקדמים של תכונות בעלות רלוונטיות נמוכה לאפס, מה שאפשר בחירת תכונות ושליטה במורכבות בו-זמנית, בעוד שעוצמת הרגולריזציה המכוונת על ידי אימות צולב הפחיתה את הסיכון להתאמה יתר.

(2) SVM-RFE (תמיכה במכונה תמיכה-רקורסיב להסרת תכונות): שימש מסגרת אימות צולבת בת שתי שכבות עם 5 פעמים כדי להבטיח סינון תכונות חזק. חמישה תת-קבוצות שאינן חופפות נוצרו על ידי חלוקה סטוכסטית של כל מאגר הנתונים, כאשר ארבע שימשו לאימון ואחת לבדיקה בחמש איטרציות; ממוצע קיפול הפחית הטיה מפיצול בדגימה בודדת. הסרת תכונות רקורסיבית יושמה להפחתת ממדיות התכונות ולהגבלת מורכבות המודל, ולהקל על התאמת יתר. שיעור השגיאות והדיוק של הסיווג שימשו כמדדי ביצועים לקביעת מספר התכונות האופטימלי.

(3) יער אקראי (RF): נבנה יער אקראי ראשוני של 500 עצים, כאשר מספר העץ האופטימלי נקבע לפי שיעור הטעות המינימלי של סיווג מחוץ לתיק כדי לאמן מחדש את המודל הסופי. כל ההיפרפרמטרים שנותרו, כולל גודל תת-הקבוצה האקראי בכל מפצל צומת, נשמרו בהגדרות ברירת המחדל של החבילה. ציוני חשיבות הגנים מהמודל הסופי דורגו בסדר יורד כדי לייצר את מערך הגנים של חתימת המחלה. קבוצת הגנים המרכזיים הסופית נקבעה על ידי הצטלבות התוצאות משלושת האלגוריתמים הללו.

אימות עצמאי מבוסס מערכי נתונים של ביטוי גנים במרכז

שני מערכי נתונים חיצוניים עצמאיים, GSE104948 ו-GSE96804, שימשו לאימות רמות התמלול של גני ההאב. מערכי נתוני ביטוי גנים עברו נרמלות; הבדלי הביטוי בין מקרי DN לנבדקים בריאים צוירו באמצעות ערכות הכלים ggplot2 ו-ggsignif של R.

עגינה מולקולרית

הקונפורמציות התלת-ממדיות של חלבוני המרכז (CASP1, PDB ID: 3E4C; CCL2, מזהה PDB: 7S00) התקבלו ממאגר נתוני החלבונים. קונפורמציות תלת-ממדיות של תרכובות ביואקטיביות נאספו דרך PubChem. חומצה אורסולית, חומצה 3β-הידרוקסיורס-12-en-28-oic וחומצה קוורצטין נבחרו לעגינה משום שפרמקולוגיית הרשת חזה אינטראקציות בין תרכובות פעילות אלו לבין מטרות הליבה CCL2 או CASP1. מבני החלבון טופלו מראש על ידי הסרת ליגנדים מקומיים ומולקולות מים, הכנסת מימנים קוטביים, ולאחר מכן עברו עגינה מולקולרית באמצעות AutoDock Vina. הזיקה הקשירה, המיוצגת על ידי ציון העגינה (בקלור/מול), שימשה להערכת עוצמת האינטראקציות. סף אנרגיית קישור של −5.0 קקלורי/מול נקבע כדי להגדיר אינטראקציות בין-מולקולריות יציבות. קונפורמציות העגינה הוצגו באמצעות PyMOL.

בעלי חיים ועיצוב ניסויים

המחקר הנוכחי השתמש ב-30 עכברים זכרים בני 8 שבועות עם DB/db בדרגת SPF ספציפית (SPF), יחד עם 10 עכברים זכרים עם SPF db/m תואמים לגיל. כל העכברים הניסיוניים גודלו במתקן בדרגת SPF תחת תקופת אור אורה-חושך של 12 שעות ונשמרו בתנאים יציבים: 22 ± 2 מעלות צלזיוס, לחות יחסית של 50–70%, וגישה בלתי מוגבלת לאוכל קבוע ולמי שתייה. אישור אתי לכל פרוטוקולי הניסוי ב-in vivo ניתן על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של אוניברסיטת אנחווי לרפואה סינית (אישור מס' AHUCM-mouse-2023059).

המכרסמים עברו שלב הסתגלות של 7 ימים לפני קיבוצים אקראיים (6 בעלי חיים כל אחד) ו-8 שבועות של התערבות יומית. רמת גלוקוז בצום נמדדה בכל בעלי החיים הניסיוניים; בעלי החיים חולקו באמצעות טבלת מספרים אקראית, והיסטולוגיה, IHC וכימות ווסטרן בלוט בוצעו תחת הערכה עיוורת.

קבוצת ביקורת תקינה (CTL): עכברי db/m שמקבלים סליין באמצעות גג' אוראלי.

קבוצת מודל (M): עכברים db/db המקבלים תמיסת מלח באמצעות גאווג אוראלי.

קבוצת DJC-Medium Dose (DJC-M): עכברים db/db המקבלים DJC במינון 0.78 גרם/ק"ג (שווה ערך למינון היומי הקליני למבוגרים).

קבוצת DJC-High Dose (DJC-H): עכברים עם db/db שקיבלו DJC במינון 1.56 גרם לק"ג (פי שניים מהמינון הקליני היומי למבוגרים).

הכנת מינון

קנה מידה של מינון מאדם לעכברו נגזר באמצעות גישת נורמליזציה של שטח פני הגוף, כפי שמפורט ב-Methodology of Pharmacological Experiments, עם מקדם המרה של 9.1. המינון הקליני היומי של DJC היה 6 גרם למבוגר במשקל 70 ק"ג (0.0857 גרם לק"ג), מה שהניב מינונים מקבילים לעכבר של 0.78 גרם לק"ג (מינון קליני פי אחד) ו-1.56 גרם לקילוגרם (מינון קליני כפול). כל העכברים קיבלו מתן תוך-קיבה בנפח קבוע של 10 מ"ל/ק"ג. אבקת DJC נשקלה בדיוק והושעתה בתמיסת CMC-Na של 0.5% ליצירת תליות אחידות במינון 78 מ"ג/מ"ל (מינון בינוני) ו-156 מ"ג/מ"ל (מינון גבוה).

לאחר 8 שבועות של מתן יומי, הושרה הרדמה בכל העכברים הניסיוניים באמצעות 1% נתרן פנטוברביטל. דגימות דם נאספו דרך האאורטה הבטנית וצנטריפוגה לבידוד הסופרנטנטים לבדיקות ביוכימיות מבוססות קיט. כלובים מטבוליים שימשו לאיסוף דגימות שתן של עכברים. רקמות כליה חלקיות תוקנו ב-4% פרפורמלדהיד עבור המטוקסילין-אאוזין (HE) וצביעת מסון. רקמות הכליה, שהוקפאו בחנקן נוזלי, נשמרו בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס לצורך בדיקות אנליטיות במורד הזרם.

ניתוח היסטולוגי

לאחר קיבוע ב-4% פאראפורמלדהיד, רקמות הכליה עברו ייבוש אתנול מדורג, ניקוי, הטמעת פרפין וחתך סדרתי של 4 מיקרומטר לצביעת HE וטריכרום של מסון. צביעת HE בוצעה לפי פרוצדורות סטנדרטיות (דה-פרפיניזציה, הידרציה מחדש, צביעת גרעיני המטוקסילין, התמיינות וכחול של אתנול מחומצן, צביעת נגד אאוזין, ייבוש, ניקוי והרכבת בלסם ניטרלי) כדי לבחון שינויים היסטופתולוגיים בכליות. החלקים הוטבלו בצבע המטוקסילין למשך 3 דקות, ואחריהם צביעת נגד אאוזין במשך 15 שניות. בצביעת הטריכרום של מסון, החתכים עברו דה-פרפיניזציה, הידרציה, צביעה רציפה, התמיינות והפרדת צבע בחומצה אצטית, ולאחר מכן ייבוש, ניקוי והרכבה להערכת הצטברות קולגן כלייתי ושינויים פיברוטיים. מיקרוסקופיה בשדה בהיר שימשה לבדיקה וצילום כל חתכי הרקמה המוצבעים בהגדלה של 200× הגדלה. חתכים שמוצבעים ב-HE דורגו באמצעות מדד טרשת גלומרולרית (GSI). לצביעת הטריכרום של מסון, הוחל פריסט של מסון טריכרום לבידוד תעלת הקולגן הכחולה, וחישוב היחס בין שטח הקולגן לאזור הרקמה המוכתם באדום.

אימונוהיסטוכימיה (IHC)

לאחר קיבוע של 24 שעות עם 4% פאראפורמלדהיד, דגימות רקמה התייבשו באמצעות גרדיאנטים סדרתיים של אתנול, ולאחר מכן הוטבעו בפרפין ונחתכו לחתכים עוקבים של 5 מיקרון. לאחר דה-פרפיניזציה, החתכים עברו שחזור אנטיגן וחסימת פרוקסידאז אנדוגנית. לאחר החסימה, שקופיות רקמה הוגברו עם נוגדנים ראשוניים מדוללים בטמפרטורה של 4°C במהלך הלילה בתא לח. הסליידים קיבלו דגירה משנית של נוגדנים בטמפרטורת החדר לאחר שטיפות PBS, ואחריה תגובה כרומוגנית של DAB עד להשגת עוצמת צביעה אופטימלית. החתכים עברו לאחר מכן צביעת נגד המטוקסילין ברצף, התמיינות, הכחול, ייבוש, ניקוי, התקנת כיסוי ומיקרוסקופ בשדה בהיר. שליפת אנטיגנים בוצעה באמצעות אוטוקלבינג למשך 10 דקות, ולאחר מכן קירור טבעי לטמפרטורת החדר. לאחר חסימה עם סרום עזים של 5% למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר, הקטעים דוגרו בנוגדן ראשוני (דילול של 1:200) ולאחר מכן נוגדן משני IgG אנטי-ארנב עם HRP (דילול של 1:300) למשך 60 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. התגובה הכרומוגנית של DAB נערכה במשך 3–5 דקות בטמפרטורת החדר, נבדקה במיקרוסקופ, והסתיימה בשטיפה במים מזוקקים. התמונות צולמו בהגדלה של ×200, ואחוז שטח הכתם החיובי נמדד באמצעות ImageJ.

זיהוי ELISA

שלבי הבדיקה עמדו בפרוטוקולים הרשמיים שסופקו על ידי ספקי הערכות. בופר כביסה ותקני מדולל סדרתיים הוכנו מראש. בארות ריקות, סטנדרטיות ודגימה הוטענו בחומרים ודגרו בחושך. הלוחות נשטפו היטב לאחר הדגירה, ואז דגרו עם האנזים הצמוד בחושך. לאחר השטיפה, נוספה מצע כרומוגני לתגובה צבעונית מוגנת מאור, שהסתיימה עם בופר עצירה לאחר שהופיעו גרדיאנטים כחולים מובחנים בבארות הסטנדרטיות. הספיגה (OD) של כל באר נמדדה באורך הגל היעד באמצעות קורא מיקרופלט. ריכוזי הסרום IL-1β ו-IL-18 נמדדו באמצעות עקומות כיול שנוצרו מערכי OD של ריכוזים סטנדרטיים (דגימות סרום לא מדוללות; ספיגה נמדדה ב-450 ננומטר; שמונה בארות שכפול טכניות לכל דגימה). קריאטינין בשתן וחלבון שתן של 24 שעות נמדדו בדגימות שתן לא מדוללות שנאספו באמצעות כלובי מטבוליזם של 24 שעות (ספיגת 546 ננומטר; שמונה שכפולים טכניים לכל דגימה).

PCR כמותי בזמן אמת (RT-qPCR)

סך ה-RNA בודד מרקמות כליות, וטוהרו וריכוזו נקבעו באמצעות ספקטרופוטומטריה. RNA מטוהר עבר תמלול הפוך ליצירת תבניות cDNA. RT-qPCR בוצע על מכשיר PCR בזמן אמת עם תוכנית מחזור תרמי הבאה: 5 דקות לפני דנאטורציה (95 מעלות צלזיוס), ואחריה 40 סבבי הגברה: 15 שניות ב-95 מעלות צלזיוס, דקה אחת ב-60 מעלות צלזיוס. RT-qPCR בוצע בתגובה של 10 מיקרוליטר שכללה 5 מיקרוליטר של SYBR Green Master Mix, 0.2 מיקרוליטר פריימר קדמי, 0.2 מיקרוליטר פריימר הפוך, 1 מיקרוליטר של תבנית cDNA, ו-3.6 מיקרוליטר מים ללא RNase. שעתוק הפוך לסינתזת cDNA בוצע בנפח תגובה כולל של 20 מיקרוליטר. בוצע ניתוח עקומת התכה לאישור ספציפיות ההגברה, וכל דגימה נבדקה בשלושה שכפולים טכניים. רמות התמלול הוערכו על ידי נרמול 2⁻ΔΔCq ל-β-אקטין, כאשר כל רצפי הפריימר מופיעים בטבלה 1.

ניתוח כתמים מערביים

כ-40 מ"ג דגימות רקמת כליה נאספו מכל קבוצת עכברים, טחנו על קרח, והומוגנו לחלוטין בבופר פירוק חלבונים. לאחר סיבוב של 15 דקות ב-12,000 סל"ד ב-4 מעלות צלזיוס, נאסף, הסופרנטנט הכולל המכיל חלבון מהומוגנטים של הרקמה נאסף, הוקרא והוקרא בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס. הסופרנטנט החלבוני עורבב עם בופר טעינה ועובר דנטטורציה על ידי הרתחה באמבט מים. כ-10 מיקרוליטר של דגימת חלבון מנורמלת נטענה בכל נתיב והופרדה על ג'לים SDS-פוליאקרילאמיד 10%. חלבוני המטרה הועברו למסנני ניטרוצלולוז באמצעות אלקטרובלוט רטוב. ההעברה בוצעה בזרם קבוע של 400 mA באמבט קרח למשך 30–45 דקות. לאחר ההעברה, הבלוטים דגרו בחלב קר ודל שומן במשך שעתיים, ואז דגרו במשך לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים של 1:1,000. כתמים שנשטפו כוסו בנוגדנים משניים תואמים (1:10,000) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, ואותות פס זוהר נרשמו וגודלו מתמונות כתמים באמצעות תוכנת ImageJ. עבור GSDMD-N, טובולין שימש כבקרת עומס כי משקלו המולקולרי הצפוי (~35 קילו-דלטון) חופף לזה של GAPDH (~36 קילו-דלטון). כל הניסויים ב-Western Blot בוצעו עם שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים.

ניתוח סטטיסטי

נתונים כמותיים מוצגים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). ההבדלים בין שתי קבוצות נותחו באמצעות מבחן t סטודנט לא מזווג, בעוד שהשוואות בין קבוצות מרובות הוערכו באמצעות ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) ואחריו מבחן פוסט-הוק של טוקי. ערך p < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

רכיב ביואקטיבי וזיהוי מטרות של DJC

סך הכל זוהו 66 תרכובות ביואקטיביות שעמדו בקריטריוני הסקר (OB ≥ 30% ו-DL ≥ 0.18) מתוך ששת הצמחים המרכיבים את DJC. אלה כללו 26 תרכובות מ-Pseudostellaria heterophylla, 6 מ-Paeonia suffruticosa, 8 מ-Cuscuta chinensis, 6 מ-Alisma orientale, 10 מ-Rehmannia glutinosa, ו-10 מ-Whitmania pigra. סטנדרטיזציה של תוויות מטרה והסרת כפילויות הניבה 599 יעדי חלבון מועמדים מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

DN נותר גורם מוביל ל-ESRD, המאופיין בפתוגנזה מורכבת ורב-גורמית שעדיין אינה מובנת במלואה20,21. למרות ש-DJC הראה יעילות קלינית מבטיחה בשיפור DN, המנגנונים המולקולריים הבסיסיים נותרוברובם חמקמקים. במחקר זה השתמשנו בתכנית אנליטית מולטי-אומיקס המשלבת פרמקולוגיה של רשת, כלי למידת מכונה, בדיקות סימולציה של קישור ואימות in vivo כדי לחקור את הפעולות הפרמקולוגיות של DJC. גישה רב-תחומית זו אפשרה לנו לסנן מטר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקטי מחקר מרכזיים של אוניברסיטאות מחוז אנחווי (מענק מס' 2024AH050968).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת בדיקת קריאטינין (CRE)מכון נאנג'ינג ג'יאנצ'נג להנדסה ביולוגיתC011-2-1
ECLBiosharpBL520B
ערכת צביעת אאוזיןServicebioG1002
גוף מצמיד IgG-HRP עכברי מכנגד ארנבתAbbkineA21020
ערכת צביעת המטוקסליןServicebioG1004
ערכת צביעת Masson's TrichromeServicebioG1006
ערכת ELISA ל-IL-1β בעכברMeiMianMM-0040M1
ערכת ELISA ל-IL-18 בעכברMeiMianMM-0169M1
נוגדן ארנבתי כנגד קספאז-1 בעכברAffinityAF5418
נוגדן ארנבתי כנגד CCL2 בעכברAbcamab315478
נוגדן ארנבתי כנגד קספאז-1 מפולג בעכברAffinityAF4005
נוגדן ארנבתי כנגד GAPDH בעכברZenbioR380626
נוגדן ארנבתי כנגד GSDMD-N בעכברAbcamab219800
נוגדן ארנבתי כנגד NLRP3 בעכברAbcamab263899
נוגדן ארנבתי כנגד Tubulin בעכברAffinityAF7011
ערכת שכפול רב-תרבות הפוךBiosharpBL696A
מאגר פירוק RIPABeyotime BiotechnologyP0013
מאגר פירוק RIPALeagenePS0013
חומר מיון RNAServicebioG3013-100ML
תערובת SYBR Green MasterServicebioG3326-05
ערכת כימות חלבונים בשתןמכון נאנג'ינג ג'יאנצ'נג להנדסה ביולוגיתC035-2-1
שם תוכנהגרסה
AutoDock Vina1.2.3
תוכנת Cytoscape3.10.0
GraphPad Prism9.0
ImageJjava 1.8.0_345
PyMOL2.5
תוכנת R4.2.0

מקורות

  1. Demir S, Nawroth PP, Herzig S, Ekim Üstünel B. Emerging targets in type 2 diabetes and diabetic complications. Adv Sci (Weinh). 2021;8(18):e2100275.
  2. Zimmet PZ, Magliano DJ, Herman WH, Shaw JE. Diabetes: a 21st century challenge. Lancet Diabetes Endocrinol. 2014;2(1):56-64.
  3. Liu M, et al. Loss of glomerular aldolase B in diabetic nephropathy promotes renal fibrosis via activating Akt/GSK-3β/β-catenin axis. J Adv Res. 2025;76:207-18.
  4. Wang L, et al. Puerarin reduces diabetic nephropathy-induced podocyte pyroptosis by modulating the SIRT1/NLRP3/caspase-1 pathway. Mol Cell Endocrinol. 2025;595:112409.
  5. Wang Y, et al. C-reactive protein promotes diabetic kidney disease via Smad3-mediated NLRP3 inflammasome activation. Mol Ther. 2025;33(1):263-78.
  6. Liu Y, et al. Role of MCP-1 as an inflammatory biomarker in nephropathy. Front Immunol. 2024;14:1303076.
  7. Bai Z, Huang X, Nie S. Kidney function-related protection of polysaccharides from red kidney bean and small black soybean via urine metabolomics in type 2 diabetic rats. Carbohydr Polym. 2025;355:123311.
  8. Xuan C, et al. Isoquercitrin alleviates diabetic nephropathy by inhibiting STAT3 phosphorylation and dimerization. Adv Sci (Weinh). 2025;12(25):e2414587.
  9. Hu Q, et al. Diabetic nephropathy: focusing on pathological signals, clinical treatment, and dietary regulation. Biomed Pharmacother. 2023;159:114252.
  10. Wu YJ, et al. Danzhi Jiangtang Capsule mediates NIT-1 insulinoma cell proliferation and apoptosis by GLP-1/Akt signaling pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2019;2019:5356825.
  11. Sun M, et al. Danzhi Jiangtang Capsule ameliorates kidney injury via inhibition of the JAK-STAT signaling pathway and increased antioxidant capacity in STZ-induced diabetic nephropathy rats. Biosci Trends. 2018;12(6):595-604.
  12. Fang Z, et al. Radix pseudostellariae of Danzhi Jiangtang capsule relieves oxidative stress of vascular endothelium in diabetic macroangiopathy. Saudi Pharm J. 2020;28(6):683-91.
  13. Xie J, et al. Danzhi Jiangtang capsule reduces renal injury in rats with diabetes induced by high fat diet and streptozotocin via downregulating toll-like receptor 4-nuclear factor-κB pathway and apoptosis. J Tradit Chin Med. 2023;43(2):312-21.
  14. Fang Z, et al. The effects of Danzhi Jiangtang capsule on clinical indices and vascular endothelial function in patients with impaired glucose tolerance of Qi-Yin deficiency type. Ann Med. 2023;55(2):2291185.
  15. Li X, et al. Network pharmacology prediction and molecular docking-based strategy to explore the potential mechanism of Huanglian Jiedu Decoction against sepsis. Comput Biol Med. 2022;144:105389.
  16. Zhao L, et al. Network pharmacology, a promising approach to reveal the pharmacology mechanism of Chinese medicine formula. J Ethnopharmacol. 2023;309:116306.
  17. Li X, et al. Network pharmacology approaches for research of traditional Chinese medicines. Chin J Nat Med. 2023;21(5):323-32.
  18. Zhao N, et al. Integrated chemical composition, transcriptomics, and network pharmacology to reveal the mechanism of Jia-Wei-Si-Miao-Yong-An Decoction in ACS model rats. Phytomedicine. 2025;145:157027.
  19. Wu J, et al. Use of molecular dynamics simulations to study how plant biomolecules help improve environmental health. Sci Total Environ. 2023;869:161871.
  20. Abhirami BL, Krishna AA, Kumaran A, Chiu CH. Targeting NF-κB in diabetic nephropathy: exploring the therapeutic potential of phytoconstituents. Arch Pharm Res. 2025;48(7-8):577-637.
  21. Joumaa JP, et al. Mechanisms, biomarkers, and treatment approaches for diabetic kidney disease: current insights and future perspectives. J Clin Med. 2025;14(3):727.
  22. Shi H, et al. In vivo and in vitro studies of Danzhi Jiangtang capsules against diabetic cardiomyopathy via TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway. Saudi Pharm J. 2021;29(12):1432-40.
  23. Deng Y, et al. Mechanism exploration of Wenshen Jianpi Decoction on renoprotection in diabetic nephropathy via transcriptomics and metabolomics. Phytomedicine. 2025;139:156446.
  24. Li J, et al. Mechanistic investigation of astragalus root in the management of T2DM-NAFLD comorbidity: an integrated network pharmacology, molecular docking, molecular dynamics simulation, and in vitro study. Pharmaceuticals (Basel). 2026;19(2):289.
  25. Li X, et al. Integrating network pharmacology, bioinformatics, and experimental validation to unveil the molecular targets and mechanisms of galangin for treating hepatocellular carcinoma. BMC Complement Med Ther. 2024;24(1):208.
  26. Zhao L, et al. Inflammation in diabetes complications: molecular mechanisms and therapeutic interventions. MedComm (2020). 2024;5(4):e516.
  27. Shen J, et al. Different types of cell death in diabetic endothelial dysfunction. Biomed Pharmacother. 2023;168:115802.
  28. Li J, et al. Investigating the effects and potential mechanisms of astragalus root against diabetic nephropathy based on bioinformatics analysis and in vitro validation. Int J Mol Sci. 2026;27(10):4641.
  29. Tang L, et al. ATP6AP1 drives pyroptosis-mediated immune evasion in hepatocellular carcinoma: a machine learning-guided therapeutic target. Discov Oncol. 2025;16(1):616.
  30. Wu Y, Ma Y. CCL2-CCR2 signaling axis in obesity and metabolic diseases. J Cell Physiol. 2024;239:e31192.
  31. Song Z, et al. The novel potential therapeutic target PSMP/MSMP promotes acute kidney injury via CCR2. Mol Ther. 2024;32(7):2248-63.
  32. Yang Y, et al. CCL2-CCR2 axis in cardiovascular disease: research advances and challenges. Sci Bull (Beijing). 2025;70(6):820-4.
  33. Pozzi S, Satchi-Fainaro R. The role of CCL2/CCR2 axis in cancer and inflammation: the next frontier in nanomedicine. Adv Drug Deliv Rev. 2024;209:115318.
  34. Torices S, et al. Targeting the CCL2/CCR2 axis in HIV-1 infection and ischemic stroke. Stroke. 2026;57(2):538-48.
  35. Scurt FG, et al. Monocyte chemoattractant protein-1 predicts the development of diabetic nephropathy. Diabetes Metab Res Rev. 2022;38(2):e3497.
  36. Xu J, et al. (5R)-5-hydroxytriptolide ameliorates diabetic kidney damage by inhibiting macrophage infiltration and its cross-talk with renal resident cells. Int Immunopharmacol. 2024;126:111253.
  37. Wang X, et al. Discovery of the pharmacodynamic material basis of Danggui Buxue Decoction in the treatment of diabetic kidney disease based on lipidomics regulation. Phytomedicine. 2025;141:156643.
  38. Fu J, Wu H. Structural mechanisms of NLRP3 inflammasome assembly and activation. Annu Rev Immunol. 2023;41:301-16.
  39. Makoni NJ, Nichols MR. The intricate biophysical puzzle of caspase-1 activation. Arch Biochem Biophys. 2021;699:108753.
  40. Shi Y, et al. Inhibition of caspase-1 suppresses GSDMD-mediated peritoneal mesothelial cell pyroptosis and inflammation in peritoneal fibrosis. Small. 2025;21:e2409362.
  41. Broz P. Pyroptosis: molecular mechanisms and roles in disease. Cell Res. 2025;35(5):334-44.
  42. Zhang G, et al. Emodin influences pyroptosis-related caspase 1-GSDMD axis alleviated cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Sci Rep. 2025;15(1):19397.
  43. Ouyang PW, et al. Procyanidin B2 attenuates microvascular dysfunction in diabetic retinopathy via inhibition of caspase-1/GSDMD-mediated pyroptosis. J Ethnopharmacol. 2025;344:119528.
  44. Chen J, et al. Chlorogenic acid attenuates deoxynivalenol-induced apoptosis and pyroptosis in human keratinocytes via activating Nrf2/HO-1 and inhibiting NLRP3/GSDMD pathway. Food Chem Toxicol. 2024;186:113578.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

233233CCL2 CCR2

מאמרים קשורים