הדמיה בזמן אמת בשני פוטונים של חילוף החומרים של NAD+ באנדותל המוח בעכברים

סיכום

פרוטוקול זה מאפשר ניטור בזמן אמת של חילוף החומרים של ניקוטינמידים אדנין דינוקלאוטיד אנדותליאלי במוח בעכברים חיים, באמצעות ביטוי ביוחיישנים ממוקדים באנדותל, הכנת חלון הגולגולת והדמיה בשני פוטונים.

תקציר

אנו מציגים תהליך עבודה שניתן לשחזר להמחשה בזמן אמת של תגובות ערוץ ביוסנסור ניקוטינמיד-אדנין דינוקלאוטיד (NAD⁺) בתאי אנדותל מיקרווסקולריים במוח בעכברים חיים, באמצעות מיקרוסקופיית חלון הגולגולת עם שני פוטונים וחיישן NAD⁺ פלואורסצנטי ממוקד אנדותליה. הפרוטוקול כולל (1) ביטוי סלקטיבי של חיישן NAD⁺ בתיווך וירוס אדנו-קשור (AAV) באנדותל כלי דם מוחי באמצעות AAV-X1.1 תחת פרומוטר Cdh5 (קדרין אנדותליאלי וסקולרי), (2) הכנה ניתוחית לחלון קורניאלי קורטיקלי יציב בקוטר 3 מ"מ × 3 מ"מ, ו-(3) הדמיה דו-גל-גל דו-פוטונית ללכידת אות ערוץ החיישן הירוק המעורר של 920 ננומטר ו-1040 ננומטר תוך-כלי הדם (TMR)–דקסטרון תוך-כלי הדם המעורר של 1040 ננומטר ערוץ ייחוס. ערוץ TMR–דקסטרן מספק ייחוס ללומן וסקולרי ותומך בבחירת כלי דם, הערכת תנועה והערכת שלמות כלי דם. כדוגמה ליישום, אנו מתארים שינויים הקשורים לניקוטינמיד, מונונוקלאוטיד, בפלואורסצנציה בערוץ החיישן האנדותליאלי לאחר מתן מים לשתייה, לידה אוראלית או תוך-ורידית. פרוטוקול זה מדגיש צעדים קריטיים, שיקולי מינון ויראליים מומלצים ושיקולי טיטר, פתרון תקלות ואסטרטגיות ניתוח כמותי, ומאפשר למעבדות ליישם ניטור בחיים של דינמיקת תעלות ביוחייזר של NAD⁺ במוח וכלי דם למחקרים של נוירומטבוליזם בבריאות ובמחלה. 

מבוא

ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד (NAD⁺) הוא גורם מרכזי לאיזון רדוקס, פעילות מיטוכונדריאלית, תיקון DNA ואיתות תגובה ללחץ. בכלי דם מוחיים, הומאוסטזיס NAD⁺ האנדותליאלי מוכר יותר ויותר כרגולטור פעיל של שלמות מחסום, טון כלי דם וקישור נוירו-וסקולרי, ולא כקריאה מטבולית פסיבית¹. הפרעה במטבוליזם של NAD⁺ האנדותליאלי נקשרה לדליפת מחסום דם-מוח (BBB) הקשור להזדקנות ולפגיעה בהומאוסטזיס הנוירו-וסקולרי, מה שמדגיש את הצורך בשיטות שיכולות לפתור דינמיקה מטבולית אנדותלית ישירות ברקמת מוח חיה².

רוב הגישות הנפוצות כיום לכימות NAD⁺ מתבססות על מדידות ביוכימיות בנקודת קצה, צביעת רקמות קבועות או קריאות חיישנים ex vivo. למרות שהן אינפורמטיביות, גישות אלו אינן שומרות על ארכיטקטורה מיקרווסקולרית שלמה, אינן יכולות להבחין בקלות בשינויים מהירים בתוך בעלי החיים לאורך זמן, ומספקות ספציפיות מוגבלת לסוגי תאים כאשר הן מיושמות על רקמות מוח הטרוגניות. לעומת זאת, הדמיית שני פוטונים כרונית בחלון הגולגולת מאפשרת הדמיה חוזרת של מיקרוכלי דם קורטיקליים בעכברים חיים ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה, מה שהופך אותה למתאימה למעקב אחר אותות אנדותליים מגיבים מטבולית תחת התערבויות פיזיולוגיות או פרמקולוגיות מוגדרות ^3,4,5.

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק זרימת עבודה מקצה לקצה למעקב בזמן אמת אחר דינמיקת NAD⁺ באנדותל המוח במצב חי. השיטה משלבת אספקה מערכתית ^{של חיישן} NAD+ המבוסס על חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP) הממוקד לאנדותליאל, הארוז בנגיף אדנו-קשור (AAV)-X1.1 ומונע על ידי פרומוטר Cdh5, חלון קרניאלי יציב בקוטר 3 מ"מ × 3 מ"מ לגישה אופטית ^6,7,8, ודימות דו-גל דו-קוטוני עם ערוץ ייחוס תוך-כלי דם של טטראמתילרודאמין (TMR)–דקסטרן¹. מנגנון החיישן הובהר כך: קמברון ואחרים. חיישן ביולוגי ציטופלזמי LigA-cpVenus NAD⁺ הוא חיישן cpVenus בתגובה הפוכה מבוסס ונוס. קישור NAD⁺ מפחית פלואורסצנציה דמוית cpVenus/eGFP בקריאת עירור סטנדרטית של 488 ננומטר, בעוד שערוץ עירור של 405 ננומטר משמש כנקודת ייחוס לנרמול רציונמטרי. לכן, פלואורסצנציה ירוקה גולמית אינה צריכה להתפרש כמדד חיובי ישיר לריכוז NAD⁺. ביישום זה של שני פוטונים, עירור של 920 ננומטר משמש לרכישת אות ערוץ החיישן הירוק, בעוד שגירוי של 1040 ננומטר משמש לערוץ ההתייחסות הוסקולרי TMR–dextran; לכן, רכישת 920/1040 ננומטר הנוכחית אינה שווה ערך למדידת יחס מכויל של 488/405 ננומטר. חיישן הביולוגי Cambronne ואחרים נבחר משום שהוא עבר אימות נרחב למעקב אחר דינמיקת NAD⁺ תוך-תאית והוא תואם לתצורת ההדמיה הדו-אורכי גל הנוכחית. למרות שמדדים חדשים כמו FiNad מספקים גישות חלופיות למעקב אחר דינמיקת NAD⁺, יישומם ידרוש שינוי בערוץ הפלואורסצנציה האדום המשמש כיום לתיוג וייחוס כלי דם TMR–dextran. חיישן קמברון מדווח על שינויים יחסיים בזמינות NAD⁺ בטווח דינמי סופי ואומת ביישומים תאיים ותת-תאיים; עם זאת, פירוש האותות עשוי להיות מושפע מרמת ביטוי, pH, הלבנת פוטו, ושונות במסלול אופטי, וכימות NAD⁺ מוחלט דורש כיול או אימות ביוכימי אורתוגונלי. AAV-X1.1 נבחר משום שדווח כי וריאנטים אנדותליים-טרופיקים של AAV משנים את כלי הדם של מערכת העצבים המרכזית ביעילות ^6,7. בהשוואה הראשונית שלנו בין מספר סרוטיפים של AAV, כולל AAV9, AAV-BR1, AAV-ENT ו-AAV-X1.1, תוך שימוש בביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק מוגבר מונחה CAG או Cdh5 כדיווח, AAV-X1.1 יצר את דפוס הביטוי המקושר לכלי דם המועדף ביותר בין הסרוטיפים שנבדקו. הפרומוטר Cdh5 שימש לאחר מכן להגבלת ביטוי הגנים הטרנסג'ניים לתאי אנדותל וסקולריים, בהתאם לדיווחים קודמים שהראו ביטוי טרנסגני סלקטיבי אנדותליאלי ב-vivo⁶.

בהשוואה לבדיקות NAD⁺ אקס ויבו, גישה זו שומרת על רשת כלי הדם השלמה, מאפשרת מדידות אורך באותו בעל חיים, ומאפשרת הערכה סימולטנית של אותות מטבוליים אנדותליים והפניה ללומן וסקולרי. תהליך העבודה שימושי במיוחד למחקרים של הזדקנות, לחץ דלקתי, תפקוד לקוי של BBB ותגובות מהירות להתערבויות מטבוליות כגון מתן ניקוטינמיד מונונוקלאוטיד (NMN) 9,10,11,12,13. שיטה זו מתאימה במיוחד כאשר השאלה הניסויית דורשת הדמיה חוזרת של מיקרוכלי דם קורטיקליים בעכברים חיים ושינויים יחסיים באות ערוץ חיישני אנדותליאלי. היא פחות מתאימה לכימות NAD⁺ מוחלט ללא כיול רציונטרי נוסף או אימות ביוכימי נוסף. מגבלות מעשיות כוללות נגישות אופטית קורטיקלית, מגבלות עומק דימות, תלות בהעברה מוצלחת של AAV באנדותליה, דלקת פוטנציאלית הקשורה לחלון הגולגולת, ודרישה למיקרוסקופ דו-פוטוני דו-אורכי גל. השתלת חלון גולגולת כרונית עלולה לגרום לדלקת מקומית, תגובתיות וסקולרית, גליוזיס, עכירות או שינוי רקמות, שכולם עשויים להשפיע על פיזיולוגיה של אנדותל ומדידות ערוצי חיישנים ^1,3,4. כדי למזער את הגורמים המבלבלים הללו, הפרוטוקול דורש ניתוח אספטי, קידוח לסירוגין עם קירור תכוף, המיסטזיס זהיר, הימנעות ממגע דבק עם הדורה, הקלה על כאבים לאחר ניתוח, ניטור יומי והרחקה של בעלי חיים עם עכירות מתמשכת, פסולת דלקתית, זיהום, מורפולוגיה וסקולרית לא יציבה או יציבות סיגנל בסיסית לקויה.

פרוטוקול

כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של אוניברסיטת מדעי הבריאות והשיקום במסגרת הפרויקט שכותרתו "מחקר מכני של תצפית מבוססת גלאי מטבולי על שלמות מחסום דם-מוח" (מספר אישור KFDX: מס' 2023-1023). לבצע את כל הניתוחים בתנאים אספטיים ולספק הקלה בכאבים סביב ניתוח וטיפול תומך בהתאם לפרוטוקול בעלי החיים המאושר. בתהליך העבודה המייצג, ניתן להזריק בופרנורפין הידרוכלוריד (0.05–0.1 מ"ג/ק"ג, תת-עורית) לפני או מיד לאחר הניתוח ולאחר מכן כל 8–12 שעות למשך 24–48 שעות לפי הצורך. השחזרו עכברים בכלוב מחומם ועקבו אחריהם עד שיחזרו יציבה תקינה, תנועה ספונטנית ונשימה יציבה.

1. סקירה ניסיונית

1. השתמשו בעכברים בוגרים C57BL/6J בגיל 10–12 שבועות ובמשקל 23–25 גרם לניסויים המייצגים.
2. לשמור על עכברים בתנאים מסוימים ללא פתוגנים עם מחזור אור/חושך של 12 שעות, טמפרטורת סביבה של 22°C–24°C, לחות יחסית של 40%–60%, וגישה חופשית למזון ולמים.
3. הסתגל לבעלי חיים לפחות 7 ימים לפני ההליכים.
4. השתמש בשני המינים המתאימים לעיצוב הניסוי. דווח על מין, מספר בעלי חיים והקצאת קבוצות לכל ניסוי. מאגר הנתונים המייצג של ההדמיה המוצג כאן השתמש ב-N = 3 עכברים.
5. נתן תחילה AAV מערכתית ומאפשר תקופת ביטוי של 3–4 שבועות לפני ההדמיה.
6. בצע ניתוח חלון גולגולתי 3–5 ימים לפני ההדמיה.
7. הרדמו עכברים ביום ההדמיה, הזרקו TMR–dextran תוך-ורידי, ובצעו הדמיה לאחר מחזור מעקב מספק.
8. נתן NMN בהתאם ללוח הזמנים הנבחר. מתן תוספי מים לשתייה למשך 5 ימים לפני ההדמיה, ביצוע ניתוח אוראלי במרווח שנקבע מראש לפני ההדמיה, או מתן NMN תוך-ורידי במהלך מפגש ההדמיה לאחר רכישת הבסיס הראשונה.
   הערה: יש להשהות את הפרוטוקול לאחר מתן AAV במהלך תקופת הביטוי של 3–4 שבועות ולשמור על בעלי החיים תחת ניטור שגרתי לבריאות ולתנאי מגורים סטנדרטיים. עצרו את הפרוטוקול לאחר ניתוח חלון גולגולתי במהלך תקופת ההחלמה של 3–5 ימים. לפני הדמיה, ודאו משקל גוף יציב, טיפוח ופעילות תקינה, היעדר זיהום או דלקת מופרזת, וחלון קרניאלי נקי.

2. ניתוח חלון גולגולתי להדמיה קורטיקלית אורך

1. הכנה לפני הניתוח
   1. עקר את כל כלי הניתוח וקבע שדה סטרילי לפני השראת ההרדמה.
   2. כוון את מערכת החימום ההומורמית לשמור על טמפרטורת גוף של 36.5°C–37.5°C, רצוי באמצעות בקר משוב עם גלאי רקטלי.
   3. הכינו ציוד לניטור נשימתי ואשמרו על יציבות הפעולה לפני הניתוח.
   4. הכינו מי מלח סטריליים, דגימות סופגות, חומרים המוסטטיים, כיסוי זכוכית סטרילי מספר 1.5, פלטת ראש מתכתית ומלט דנטלי לפני תחילת ההליך.
   5. השתמש בכיסוי זכוכית סטרילי בגודל 1.5 כדי לכסות לחלוטין את חלון הגולגולת בגודל 3 מ"מ × 3 מ"מ ותשב ישר על שפת הגולגולת.
   6. הכינו מיקרו-קידוח מהיר עם לוח בקוטר 0.5–1.0 מ"מ.
   7. הפעל את המקדח במהירות של כחצי מהמהירות המרבית וודא שניתן להשקיה במלח סטרילית מיד במהלך דילול הגולגולת.
   8. מרחו סליין סטרילי בטמפרטורת החדר עם מטלית כותנה או טפטפת במהלך הקידוח כדי לקרר את הגולגולת ולהסיר אבק עצם.
2. הרדמה, הכנת קרקפת וחשיפה לגולגולת
   1. הרדמו עכברים עם תמיסת עבודה של אוורטין טרייה (1.25%, 12.5 מ"ג/מ"ל) בהזרקה תוך-פריטוניאלית ב-200–250 מ"ג/ק"ג.
      1. הכינו את תמיסת העבודה של אוורטין מ-2,2,2-טריברומואתנול ו-2-מתיל-2-בוטנול לפי נהלי פעולה מוסדיים, הגנו על התמיסה מאור, והשליכו תכשירים המראים משקעים או שינוי צבע.
   2. אשר מישור ניתוחי יציב על ידי אובדן רפלקס משיכת הפדלים ונשימה יציבה.
   3. מרחו משחה עינית לשתי העיניים מיד לאחר השראת ההרדמה.
   4. אם משתמשים בהרדמה בשאיפה, יש לשרות הרדמה עם 3%–4% איזופלורן.
   5. לשמור על הרדמה עם איזופלוראן של 1%–2% בחמצן ב-0.5–1.0 ליטר לדקה ולהתאים בהתאם לנשימה ולרפלקסים.
      זהירות: יש לטפל בחומרי הרדמה בהתאם לנהלי הבטיחות המוסדיים ולהשתמש במערכות הרדמה מתאימות בעת מתן הרדמה בשאיפה.
   6. תקבע את העכבר במסגרת סטריאוטקסית או מחזיק ראש מותאם אישית שמספק גישה יציבה לגולגולת הגב.
   7. שמור על טמפרטורת גוף ב-36.5°C עד 37.5°C באמצעות כרית חימום מבוקרת משוב וגלאי רקטלי כאשר זמינים.
   8. תגלח את הקרקפת ותסיר שיער רפוי משדה הניתוח.
   9. חטא את הקרקפת באמצעות תמיסת פובידון-יוד או יודופור לסירוגין ו-70% אתנול למשך שלושה מחזורים.
   10. הימנע מלהכניס חומר חיטוי לעיניים או לפתח הגולגולת.
   11. בצע חתך בקרקפת באמצע ומשך בעדינות את העור לאחור.
   12. חשפו את הגולגולת מספיק כדי לאפשר גם יצירת חלון גולגולתי וגם קיבוע לוח ראש.
   13. הסר את הפריוסטאום ורקמת החיבור שנותרה באמצעות מלקחיים דקים או להב סכין מנתח.
   14. ייבשו את הגולגולת בעדינות עם מטליות כותנה סטריליות למשך כ-10–20 שניות עד שהמשטח נראה מט ולא רטוב.
   15. הימנעו מהתייבשות מופרזת של רקמות חשופות.
3. סימון קרניוטומיה של 3 מ"מ × 3 מ"מ
   1. זהה את הברגמה והלמבדה תחת מיקרוסקופ כירורגי.
   2. השתמשו בנקודות ציון אנטומיות אלו כדי לכוון את קו האמצע ולאזור הקורטקס המטרה.
   3. סמן ריבוע 3 מ"מ × 3 מ"מ מעל חצי כדור אחד של הקורטקס הסומטוסנסורי הדורסלי.
   4. מקם את הקצה הקדמי כ-0.5 מ"מ אחורי לברגמה ואת הקצה המדיאלי כ-1.0 מ"מ לרוחב לקו האמצעי.
   5. הימנעו מתפרים גדולים של גולגולת וכלי שטח גדולים ככל האפשר.
4. קידוח והסרת מדף עצם
   1. דלל את הגולגולת לאורך ההיקף המסומן באמצעות מגע מקדח לסירוגין במקום לחץ רציף.
   2. מרחו מלח סטרילי שוב ושוב במהלך הקידוח כדי למנוע פגיעה תרמית.
   3. יש לספק כ-20–50 מיקרוליטר סליין סטרילי בכל יישום או מספיק כדי לשמור על לחות וקרירות משטח הגולגולת.
   4. יש לחזור על השטיפה כל 10–20 שניות או בכל פעם שמצטבר אבק עצם או כאשר יש חשד להצטברות חום.
   5. המשיכו לדלל עד שהעצם הופכת לשקופה וגמישה במקצת.
   6. לאשר דילול מספק על ידי תצפית על כלי דם דוראליים נראים לעין, שמירה על פולסיה דוראלית, והיעדר דחיסה קורטיקלית או שינוי צבע תרמי.
   7. הפסיקו לקדוח מיד אם יש הצטברות חום מופרזת, דימום או הפחתת פעימות דוראליות.
   8. השקה את האזור והערכה מחדש לפני שתמשיך.
   9. הרימו בעדינות את מדף העצם מפינה אחת באמצעות מלקחיים דקים או קצה מחט.
   10. לדלל מחדש את ההיקף אם ההתנגדות נשארת.
   11. שמרו על הדורה שלמה במהלך הסרת העצם.
   12. שטוף אבק עצם בעזרת מי מלח סטריליים.
   13. לשלוט בדימום קל באמצעות שטיפה עדינה במי מלח ומטוש סופג.
   14. יש לשקול את הדימום כמקובל אם הוא נעלם תוך 1–2 דקות לאחר השטיפה ומגע עם חומר סופג.
   15. יש להוציא את החיה או להפסיק את ההליך אם הדימום נמשך יותר מ-5 דקות.
   16. יש להוציא את החיה או להפסיק את ההליך אם הדורה נקרעה, מתרחשת דחיסה קורטיקלית, או אם הדם מסתיר את אזור ההדמיה.
       הערה: ניתן להשהות את ההליך זמנית לאחר המוסטזיס מלא ולפני הנחת הכיסוי. שמרו על הדורה החשופה במצב לח באמצעות סליין סטרילי והמשיכו רק לאחר אישור היעדר דימום פעיל.
5. איטום חלון וקיבוע לוח ראש
   1. ודאו שהדורה החשופה נקייה, לחה וללא דימום פעיל.
   2. הניחו כיסוי סטרילי מעל הקרניוטומיה.
   3. מקם את ה-coverslip על שפת הגולגולת שמקיפה את הקרניוטומיה מבלי לדחוס את הדורה.
   4. בדוק את המיקום הנכון על ידי אישור משטח כיסוי שטוח, היעדר בועות אוויר כלואים, שמירה על פולסציה דוראלית ומסלול אופטי ברור.
   5. הכינו דבק דנטלי או דבק מסוג Super-Bond C&B בהתאם להוראות היצרן.
      1. להכנת Super-Bond C&B הייצוגי, מערבבים כף אבקה אחת עם טיפה אחת של קטליזטור ו-4 טיפות מונומר בצלחת קרמית מקוררת מראש הנשמרת בטמפרטורה של כ-20°C מיד לפני היישום.
   6. מרח דבק רק סביב קצה הגולגולת החיצוני שמקיף את הכיסוי.
   7. הימנעו ממגע דבק עם הדורה והימנעו מפתיל קפילרי מתחת לזכוכית.
   8. אפשר לדבק להתקשות כ-5–10 דקות בטמפרטורת החדר.
      זהירות: מלט דנטלי ורכיבי דבק עשויים להכיל כימיקלים נדיפים או מעוררי גירוי. לטפל בהם לפי נהלי בטיחות מוסדיים ולהשתמש באוורור מתאים.
   9. מקמו לוח ראש טיטניום מותאם אישית סביב חלון הגולגולת.
   10. השתמש בלוח ראש עם פתח מרכזי בגודל כ-10 מ"מ התואם למחזיק ראש ההדמיה.
   11. מרכז את חלון הגולגולת בתוך פתח לוח הראש.
   12. מרחו מלט דנטלי רק על אזורים נוגעים בגולגולת מחוץ לחלון האופטיקה.
   13. תנו למלט להתקשות לחלוטין למשך כ-5–10 דקות לפני שמזיזים את החיה.
6. החלמה לאחר ניתוח ובקרת איכות חלונות
   1. לתת הקלה לאחר ניתוח בהתאם לפרוטוקול החי המאושר.
   2. בזרימת העבודה המייצגת, ניתן להזריק בופרנורפין הידרוכלוריד במינון 0.05–0.1 מ"ג/ק"ג תת-עורית כל 8–12 שעות למשך 24–48 שעות.
   3. לשחזר עכברים בכלוב מחומם.
   4. עקב יומיומי אחרי נשימה, יציבה, תנועה, טיפוח ומשקל גוף.
   5. קבל חלונות גולגולת שמציגים משטח זכוכית שקוף, כלי דם קורטיקליים גלויים, דורה שלמה, שאריות דם מינימליות, ללא דבק מתחת לכיסוי, ללא זיהום, וקיבוע ראש יציב.
   6. החריגו בעלי חיים עם אטימות בולטת, דימום מתמשך, פסולת דלקתית, זיהום, הזזת חלונות, ירידה חמורה במשקל (>15%), או טיפוח ופעילות לקויים.
   7. המשך להדמיה לאחר 3–5 ימי החלמה.
   8. אשר פעילות תקינה, התנהגות טיפוח תקינה, משקל גוף יציב, היעדר כאב או זיהום, וחלון קרניאלי שקוף עם כלי דם גלויים לפני ההדמיה.
      הערה: הפרוטוקול עשוי להיות מושהה במהלך תקופת ההחלמה שלאחר הניתוח. שמרו על עכברים בתנאי מגורים סטנדרטיים, עקבו אחרי משקל הגוף ובהירות החלונות מדי יום, וחזרו להדמיה רק לאחר שכל קריטריוני ההחלמה התקיימו.

3. ביטוי חיישני NAD⁺ אנדותליאלי המתווך על ידי AAV

1. מבנה והכנה ויראלית
   1. השתמש בחיישן ביולוגי מקודד גנטית NAD⁺ מבוסס eGFP/cpVenus, המופעל על ידי פרומוטר Cdh5 האנדותליאלי.
   2. השתמש בקמברון ואחרים. רצף ביוסנסר ציטופלזמי של LigA-cpVenus NAD⁺ (לדוגמה, פלסמיד Addgene #186787 או הוספה מאומת ברצף מקביל).
   3. שכפל את פרומוטר Cdh5 במעלה הזרם של רצף הקידוד של חיישן הביולוגי NAD⁺ באמצעות עמוד השדרה הווקטורי CV232.
   4. ארוז את קלטת הביטוי בתוך קפסיד AAV-X1.1 כתכשיר ויראלי מותאם אישית.
      1. רשם את ספק ייצור הוויראלים, שיטת הטיהור, שיטת הכמת הגנום הוויראלי, מספר אצווה הייצור ותעודת ניתוח לכל הכנה ל-AAV.
   5. רשמו את מפת הפלסמידים, תוצאות אימות הרצף, מידע על ייצור ויראלי, מידע טיהור, מדד הגנום הוויראלי ותעודת ניתוח לכל הכנה ויראלית.
      1. רשמו את מפת המבנה, דוח אימות הרצף, מספר אצווה לייצור ויראלי, דוח טיטר של תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR), תיעוד טיהור ותעודת ניתוח עבור כל תכשיר ויראלי ששימש במחקר.
   6. עיין בטבלת החומרים לכל פרטי המבנה.
   7. השתמש בהכנות AAV עם טיטרים גבוהים עם טיטרים ספציפיים ל-qPCR, בדרך כלל גבוהים מ-2 ×^{10 13} vg/mL.
   8. אחסן אליקווטים חד-פעמיים בטמפרטורה של −80°C.
   9. הימנעו ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים.
   10. רשמו את כמות הייצור, מדד qPCR, משך האחסון, והשינוי המקובל בין המגרשים לפני השימוש.
2. ניהול AAV מערכתית
   1. להפשיר אליקו ויראלי על הקרח.
   2. דילל את הווירוס במי מלח סטרילי עם מפופר פוספט (PBS) לנפח הזרקה סופי של 100–200 מיקרוליטר לעכבר.
   3. שמרו על מינון סופי של 2 ×^{10 12} VG לכל עכבר בין בעלי חיים.
      1. חשב את נפח ההזרקה מהמדד הגנום הוויראלי הספציפי למגרש. להכנה מייצגת עם טיטר qPCR של 1.39 × 10¹³ vg/mL, הזרקו כ-144 מיקרוליטר כדי לספק מינון של 2 ×^{10 12} vg לעכבר.
   4. להעביר את הווירוס באמצעות הזרקת סינוס ורידי רטרו-אורביטלי באמצעות מזרק אינסולין סטרילי של 29 גרם.
   5. הזרקו את ההוספנס הוויראלי באיטיות במשך כ-10–20 שניות.
   6. אשר את הלידה המוצלחת על ידי אימות היעדר דליפה, דימום מופרז ופגיעה בעיניים.
   7. אמתו ודווחו על כל מסלול ניהול חלופי בנפרד.
   8. עקבו אחרי העכבר עד שהיציבה התקינה והתנועה הספונטנית ישובו.
   9. אשר נשימה יציבה והיעדר דימום או מצוקה.
   10. החזירו את החיה לכלוב הבית רק לאחר החלמה מלאה.
   11. יש להקדיש 21–28 ימים לביטוי חיישנים לפני ההדמיה.
   12. שמור על מרווח ביטוי עקבי בתוך כל קבוצת השוואה.
   13. אימות מרווחי ביטוי מחוץ לטווח של 21–28 ימים בנפרד.
       הערה: הפרוטוקול עשוי להיות מושהה במהלך תקופת הביטוי של AAV. שמרו על טיפול שגרתי וניטור בריאותי והמשיכו לניתוח חלון גולגולתי רק לאחר שחלף מרווח הביטוי המתוכנן והחיה נשארת בריאה.
3. אימות הגבלת האנדותל
   1. סינון בעלי חיים לפני איסוף נתונים רשמי.
   2. לקבל בעלי חיים כאשר אות ערוץ החיישן הירוק ניתן לזיהוי ועוקב אחרי רשת כלי הדם.
   3. ודאו שהאות מועשר לאורך קירות כלי השיט הסמוכים ללומן TMR–dextran–חיובי.
   4. אשר את היעדר פלואורסצנציה פרנכימלית דיפוזית דומיננטית.
   5. יישמו קריטריוני קבלה זהים על כל קבוצות הניסוי.
   6. עכברים עם PBS ואחריהם 4% פאראפורמלדהיד כאשר נדרש אימות לאחר מכן.
   7. אסוף את המוח והכין חתכים קורונליים או סגיטליים בקוטר 30–40 מיקרון.
   8. כתמי חתכים עם סמנים אנדותליים כמו לקטין עגבניות, CD31, או קדרין אנדותליאלי וסקולרי (VE-קדרין).
      1. רשמו את מקור הנוגדנים, מספר הקטלוג, מספר המנה, מיני המארח, הדילול, תנאי הדגירה ושיטת הזיהוי לכל ניסוי אימות.
   9. הערכת ביטוי ניקוטינמיד-פוספוריבוזילטרנספראז (NAMPT) ופולי(ADP-ריבוז) פולימראז 1 (PARP1) בעת הצורך.
   10. השתמש בדילול נוגדנים ראשוניים המותאמים להכנת הרקמה.
   11. רכוש תמונות פלואורסצנציה או קונפוקליות באמצעות הגדרות רכישה זהות בין קבוצות.
   12. כימות הקולוקליזציה כחלק מהאות החיובי לחיישנים החופף או מיד סמוך לאזורים החיוביים לסמן כלי דם.
   13. להוציא בעלי חיים כאשר האות הניתן לזיהוי ביותר ממוקם מחוץ למבנים וסקולריים.
   14. החריגו בעלי חיים כאשר אין העשרת דופן הכלי.
   15. להוציא בעלי חיים כאשר פלואורסצנציה פרנכימלית לא מדויקת מונעת בחירה אמינה לאזור העניין.
   16. להוציא בעלי חיים כאשר פלואורסצנציה בערוץ החישה רוויה או לא יציבה במהלך רכישת קו הבסיס.

4. הדמיה בשני פוטונים וניתוח כמותי

1. הכנת יום הדמיה ותיוג תוך-כלי דם
   1. הרדמו עכברים עם תמיסת אברטין טרייה (1.25%, 12.5 מ"ג/מ"ל) בהזרקה תוך-פריטונלית במינון 200–250 מ"ג/ק"ג, או השתמשו במשטר ההרדמה המאושר על ידי פרוטוקול בעלי החיים המוסדיים.
   2. אשר יציבות כירורגית על ידי אובדן תחושת משיכת הפדלים ונשימה יציבה.
   3. מרחו משחה עינית מיד לאחר ההשראה.
   4. אם משתמשים בהרדמה בשאיפה, יש לשרות הרדמה עם 3%–4% איזופלורן.
   5. לשמור על הרדמה עם איזופלוראן של 1%–2% בחמצן ב-0.5–1.0 ליטר לדקה ולהתאים בהתאם לנשימה ולרפלקסים.
   6. הכינו 70 קילודלטון TMR–dextran ב-PBS סטרילי ב-10–25 מ"ג/מ"ל.
   7. להגן על תמיסת TMR–dextran מפני אור ולסנן את התמיסה אם נדרש לפי הפרקטיקה המוסדית.
   8. הזרקת TMR–דקסטרן תוך-ורידי במינון של 20 מ"ג/ק"ג.
   9. כוון את נפח ההזרקה לפי ריכוז המלאי. לעכבר במשקל 25 גרם, יש להזריק בערך 0.5 מ"ג צבע כולל.
   10. הכינו את המעקב טרי או שמרו אליקואטים מוגנים מאור לפי המלצות היצרן.
   11. אפשר ל-TMR–dextran להסתובב במשך 5–10 דקות לפני קבלת התמונה.
2. תצורת מיקרוסקופ
   1. השתמש במיקרוסקופ דו-אורכי גל עם שני פוטונים, המותאם לגירוי 920 ננומטר של ערוץ החיישן המבוסס eGFP.
   2. השתמש במסלול עירור של 1040 ננומטר עבור ערוץ ההתייחסות הוסקולרי TMR–דקסטרן.
   3. הדמיה מייצגת בוצעה במיקרוסקופ רב-פוטוני Nikon A1 MP/A1R MP+ שנשלט על ידי תוכנת ניתוח AR/AR של NIS-Elements (גרסה 5.42.06).
   4. רשמו את מקורות הלייזר, פרמטרי הפולס, תצורת שילוב קרניים, סוג הגלאי וגרסת התוכנה לכל מערכת הדמיה.
   5. הגדר ערוצי זיהוי כדי להפריד בין אות ערוץ החיישן לאות TMR–dextran.
   6. השתמשו בגלאי צינור פוטומולטיפלייר (PMT) או גליום ארסניד פוספיד (GaAsP) ללא סריקה.
   7. אסוף פליטת ערוץ חיישנים ירוקה בין כ-500 ל-550 ננומטר.
   8. אסוף פליטת TMR–dextran בין כ-570 ל-650 ננומטר.
      1. במאגר הנתונים המייצג, אספו פליטת ערוץ חיישן ירוקה באמצעות מסנן פליטה 525/50 ננומטר ואספו פליטת TMR–דקסטרן באמצעות מסנן פליטה של 575/25 ננומטר או 610/75 ננומטר.
   9. מזער את הדילוף הספקטרלי בין הערוצים.
   10. שמור על הגדרות הגבר וההזזה של הגלאי קבועים בכל סט השוואה.
   11. אמת הפרדת ערוצים באמצעות בקרות חד-ערוציות כאשר זמינה.
   12. השתמשו ב-Nikon CFI75 Apochromat 25XC W 1300 או שווה ערך (25×, צמצם מספרי 1.10, מרחק עבודה 2.0 מ"מ).
   13. אישור רישום משותף של התעלות באמצעות נקודות ציון וסקולריות קבועות כמו פיצולים וקצוות לומן.
   14. חזרה על אימות רישום משותף לאחר כל התאמת מסלול אופטי.
   15. מדוד את עוצמת הלייזר במישור הדגימה לפני ההדמיה.
   16. שמור על עוצמת לייזר קבועה של 920 ננומטר בכל סט השוואה.
   17. שמור על קבוע הספק לייזר של 1040 ננומטר בכל קבוצת השוואה.
   18. יש להשתמש בכ-10–20 מיליוואט ב-920 ננומטר וב-8–18 מיליוואט ב-1040 ננומטר כטווחי עבודה מייצגים.
   19. כוון את עוצמת הלייזר בהתאם לעומק התמונה ולאיכות חלון הגולגולת.
   20. החריגו שדות שמראים יותר מ-20% אובדן אות במהלך תקופת הבסיס של 120 שניות.
   21. החריגו שדות המראים שינויים פוטוטוקסיים נראים לעין.
3. הגדרות רכישה
   1. בחר שדות ראייה עם חלון אופטי ברור, מיקרו-כלי טיס ממוקדים בחדות ותנועה מינימלית.
   2. קבל חלונות עם כיסוי שקוף, כלי דם קורטיקליים גלויים, דורה שלמה, שאריות דם מינימליות, ללא דבק מתחת לכיסוי, ללא זיהום, וקיבוע ראש יציב.
   3. יש להחריג בעלי חיים עם עכירות בולטת, דימום מתמשך, פסולת דלקתית, זיהום, הזזת חלונות, ירידה חמורה במשקל (>15%), או טיפוח ופעילות לקויה.
   4. רכוש תמונות טיים-לאפס ב-512 × 512 פיקסלים.
   5. רכוש תמונות סטילס מייצגות ב-1024 × 1024 פיקסלים כאשר נדרש פרטים מרחביים גבוהים יותר.
   6. שמור על גודל הפיקסלים, הזום, מהירות הסריקה ושדה הראייה קבועים בכל קבוצת השוואה.
   7. רכישת ערימות z באמצעות גודל צעד של 1–3 מיקרון.
   8. תמונות של מיקרו-כלי דם קורטיקליים בעומקים של כ-200–250 מיקרון מתחת לפני הפיאל.
   9. האריך את עומק ההדמיה לכ-400 מיקרון כאשר איכות החלונות מאפשרת.
   10. שמור על עומק התמונה קבוע להשוואות זוגיות.
   11. רכוש קו בסיס של 120 שניות במרווחים של שנייה לפני התערבויות חריפות.
   12. המשך הרכישה לתקופה שלאחר ההתערבות המוגדרת מראש.
   13. יש לתעד תגובות תוך-ורידיות של NMN למשך כ-10–30 דקות לאחר ההזרקה.
   14. רכישת מערכי נתונים של מי שתייה ו-Gavage אוראלי בנקודות קצה ניסיוניות מוגדרות מראש.
   15. שמור על הגדרות רכישה זהות בכל קבוצות ההשוואה.
4. התערבות NMN (דוגמה ליישום)
   1. המיס NMN במי שתייה סטריליים.
   2. כוונן את ריכוז ה-NMN כך שיספק כ-100 מ"ג/ק"ג/יום.
   3. הגן על בקבוק השתייה מהאור.
   4. החליפו את מי השתייה המכילים NMN כל 24–48 שעות.
   5. פקח על צריכת המים באמצעות מדידות משקל בקבוק.
   6. חישב צריכת NMN מוערכת באמצעות צריכת מים ומשקל גוף.
   7. המשך את התוספים במשך 5 ימים לפני ההדמיה.
   8. הכינו NMN במינון של 1 מ"ג/מ"ל לטיפול בפה.
   9. הזרקו 200 מיקרוליטר לכל עכבר באמצעות מחט גאבאז' באורך 20G, קצה מעוגל של 38 מ"מ.
   10. בצע הדמיה 30–60 דקות לאחר הבדיקה המדינתית.
   11. הכינו NMN במינון של 1 מ"ג/מ"ל למתן תוך ורידי.
   12. הזרקו 100 מיקרוליטר לעכבר דרך הסינוס הוורידי הרטרו-אורביטלי או וריד הזנב.
   13. העבירו את ההזרקה לאט במשך 10–20 שניות.
   14. התחל בהדמיה מיד או תוך 5 דקות לאחר ההזרקה.
   15. רכש מערכי נתונים של מי שתייה לאחר 5 ימים של תוספים.
   16. רכוש מערכי נתונים של אורל-גאבאג' בנקודת זמן קבועה לאחר ה-gavage.
   17. רכשו קו בסיס מיד לפני הזרקה תוך-ורידית.
   18. תעד תגובות חריפות במשך כ-10–30 דקות לאחר הזרקה תוך ורידית.
5. עיבוד תמונה וחילוץ אותות
   1. בצע תיקון תנועה כאשר קיימים ארטיפקטים של תנועה.
   2. השתמש ב-Fiji/ImageJ (גרסה 1.8.0 ומעלה) עם StackReg, TurboReg או אלגוריתם רישום גוף קשיח מקביל.
   3. השתמשו בנקודות ציון וסקולריות בערוץ TMR–dextran כדי להכווין את הרישום.
   4. קבל מערכי נתונים רק כאשר ההעתקה השארית קטנה מכ-1–2 פיקסלים לאחר התיקון.
   5. אשר כי גבולות אזור העניין הווסקולרי (ROI) נשארים יציבים לאורך כל תהליך הרכישה.
   6. השתמשו בערוץ TMR–dextran כדי לקטע את לומן כלי המים.
   7. הגדר ROIs אנדותליאליים מיד ליד הלומן.
   8. בחרו מיקרוכלי דם עם סימון לומן יציב, תנועה מינימלית, ואות ערוץ חיישן נראה.
   9. נתח את קוטר הכלים של כ-5–80 מיקרון.
   10. הגדר ROIs אנדותליאליים כאזורים הקשורים לדופן כלי הדם ברוחב של כ-2–5 מיקרון.
   11. נתחו 3–5 כלי שיט בכל שדה ראייה כאשר הם זמינים.
   12. נתח 1–3 שדות ראייה לכל עכבר כאשר זה זמין.
   13. הגדר ROI רקע באזורים ברקמה שחסרים איתות מעקב וחיישנים.
   14. הצב את תשואה הרקע לפחות 20 מיקרון מהכלים והממצאים המנותחים.
   15. הפחתת עוצמת הרקע הממוצעת מכל ערוץ לפני הנרמליזציה.
   16. יישם את אותה אסטרטגיית חיסור רקע על כל הדגימות.
   17. הפקת ערכי עוצמה ממוצעים בסדרות זמן עבור F_sensor(t).
   18. הפקת ערכי עוצמה ממוצעים בסדרות זמן עבור F_ref(t).
   19. בצע מדידות באמצעות ניתוח AR/AR של NIS-Elements או Fiji/ImageJ.
   20. ייצא קבצי תמונה גולמיים כקבצי ND2.
   21. ייצוא עותקי ניתוח כערימות TIFF של 16 ביט כשאפשר.
   22. ייצוא נתוני סדרת זמן ROI כקבצי CSV.
   23. חשב ערכי פלואורסצנציה מחסרים ברקע לפני הנירמליזציה.
   24. חשב ΔF/_{F 0} באמצעות ΔF/F₀ = (F(t) − F₀)/F₀.
   25. הגדר F₀ כאות הממוצע במהלך תקופת הבסיס של 120 שניות.
   26. חשב נרמליזציה של ייחוס כלי דם כ-F_sensor(t)/F_ref(t).
   27. דווח על שינוי השיא, זמן השיא, שטח מתחת לעקומה, וקינטיקת התאוששות כאשר משך הרכישה מאפשר.
   28. אל תפרש את אות ערוץ החיישן של 920 ננומטר כריכוז NAD⁺ מכויל.
   29. לבצע כיול רציונטרי נוסף או אימות ביוכימי כאשר נדרשות מדידות NAD⁺ כמותיות.
6. סטטיסטיקה ודיווח
   1. הגדר את העכבר כיחידת הניסוי הביולוגי.
   2. מדידות ממוצעות ברמת הכלי בתוך כל עכבר לפני ניתוח ברמת הקבוצה או יישום מודל סטטיסטי מקונן.
   3. השתמש במבחני t זוגיים דו-זנביים להשוואות בתוך עכברים שמפוזרים בצורה נורמלית.
   4. השתמשו במבחני דירוג חתום של זוגות תואמים של וילקוקסון כאשר הנחות הנורמליות אינן מתקיימות.
   5. השתמש במודלים של ANOVA במדידות חוזרות או במודלים מעורבים לניתוחים הכוללים יותר משני מצבים קשורים.
   6. יישם תיקונים מתאימים להשוואה מרובה.
   7. בצע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות GraphPad Prism או תוכנה מקבילה.
   8. הגדר מובהקות סטטיסטית כ-p < 0.05.
   9. דווח על המבחן הסטטיסטי המדויק בכל מפת איור.
   10. קודד קבצי תמונה לפני בחירת ROI וכימות כשאפשר.
   11. שמרו על עיוורון אנליסט עד למדידות תשואה והחלטות בקרת איכות.
   12. השתמש ב-N = 3 עכברים כיחידת הניסוי הביולוגי במאגר הנתונים המייצג אותו.
       הערה: אין להשהות את רכישת התמונה במהלך הדמיית טיים-לאפס פעילה. עיבוד תמונה וניתוח כמותי עשויים להיות מושהים לאחר ייצוא נתונים גולמיים. אחסן קבצי ND2, קבצי ניתוח TIFF, קבצי ROI, מטא-דאטה וטבלאות מדידה של CSV בארכיון מגובה. רשמו את עוצמת הלייזר, הגדרות הגלאי, עומק הדמיה, זיהוי בעלי חיים, הקצאת טיפול והחלטות החרגה לכל מפגש הדמיה.

תוצאות

הכנה מוצלחת מניבה חלון גולגולתי שקוף ויציב מכנית, המתאים להדמיה אורך. איור 1A מסכם את תהליך העבודה הפרוצדורלי מהרדמה וחשיפה לגולגולת ועד קרניוטומיה, מיקום כיסוי, קיבוע ראש והחלמה לאחר הניתוח. איור 1B מציג תמונות סדרתיות מייצגות של השלבים הכירורגיים המרכזיים. חלונות המתאימים להדמיה מציגים מסלול אופטי ברור, כלי דם קורטיקליים נראים לעין, דורה שלמה, שאריות דם מינימליות, אין דבק מתחת לכיסוי, וכיסוי יושב בגובה השוליים של הגולגולת. לעו...

דיון

פרוטוקול זה מספק תהליך עבודה מקצה לקצה למעקב אחר חילוף החומרים של NAD⁺ באנדותל במוח ב-vivo. גורמים מרכזיים להצלחה כוללים: (i) בהירות ויציבות החלון, כולל מזעור נזק תרמי ושליטה בדימום במהלך הקידוח; (ii) ספציפיות אנדותליאלית וביטוי חיישנים מספק שהושגו באמצעות בחירה מתאימה של קפסיד ה-AAV, הפרומטר, המינון ומרווח הביטוי; ו-(iii) הגדרות הדמיה וניתוח עקביות, במיוחד בעת ביצוע השוואות אורך. ערוץ TMR–דקסטרן התוך-וסקולרי מספק ייחוס כלי דם-לומן חזק התומך בבחירת כלי דם, תיקון סטייה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	זהירות: כימיקל רעיל/מזיק. משמש להכנת תמיסת הרדמה של Avertin לניתוח חלון קרני. תמיסת עבודה אופיינית: 1.25% (12.5 mg/mL), מנוהלת בצורה תוך-צפקית בכמות 200–250 mg/kg.
2-Methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463	זהירות: כימיקל רעיל/מזיק. ממס המשמש להכנת תמיסת Avertin מרוכזת. יש לשמור מפני אור ולהשליך תכשירים שמראים משקעים או שינוי צבע.
מטליות ספיגה	Winner Medical	מטליות כותנה רפואיות סטריליות	משמשות להמוסטזה, ייבוש הגולגולת, השקיה ושמירה על שדה ניתוחי.
AAV-X1.1-Cdh5-cytoplasmic NAD+ biosensor-SV40 pA	Shanghai GeneChem Co., Ltd.; מקורות Addgene עבור פלסמידים	מבנה GeneChem GCPV5052075; Addgene #186787; Addgene #196836	חיישן NAD+ ממוקד באנדותל הארוז ב-AAV-X1.1. קאסט ביטויים: מקדם Cdh5–חיישן NAD+ ציטופלזמי–SV40 poly(A). מינון הזרקה מייצג: 2 × 10¹² vg/עכבר. יש לאחסן חלקים ב-−80 °C ולהימנע ממחזורי הקפאה והפשרה חוזרים ונשנים. יש לרשום את תואר ה-qPCR הספציפי לפריט, מספר האצווה, מפת הפלסמיד, אימות הרצף ותעודת ניתוח.
חומר משכך כאבים (בּוּפְּרֵנוֹרפִּין הִידְרוֹכְלוֹרִיד)	MCE	HY-B0071	הרדמה פר-אופרטיבית ופוסט-אופרטיבית. מינון מייצג: 0.05–0.1 mg/kg תוך-עורית כל 8–12 שעות למשך 24–48 שעות.
מערכת מתן הרדמה	RWD Life Science	R500 עם אדים R580	משמשת למתן איזופלורן במהלך ההדמיה. זרימת חמצן אופיינית: 0.5–1.0 L/min.
חומר הרדמה (איזופלורן)	RWD Life Science	סדרת R510-22	משמש להדמיות הרדמה. הגדרות אופייניות: 3–4% השריה ו-1–2% תחזוקה.
כיסוי	מיוצר בהזמנה אישית	אין מספר קטלוגי	כיסוי זכוכית סטרילי מס' 1.5 המיועד לכיסוי מלא של חלון קרני בגודל 3 × 3 מ"מ ולשכיבה צמודה על שפת הגולגולת.
מלט/דבק שיניים	Sun Medical	Super-Bond C&B; VZB/JAP8147	משמש לאטימה של חלון קרני וקיבוע לוחית טיטניום. הכנה מייצגת: 1 כף אבקה, טיפת חומר מזרז ועוד 4 טיפות מונומר. להקשה במשך כ-5–10 דקות בטמפרטורת החדר.
מקדח שיניים	RWD Life Science	מקדח מיקרו 78001	מקדח במהירות גבוהה המשמש לדילול הגולגולת ולקרניטומיה. יש להשתמש בכמחצית המהירות המרבית עם קירור תדיר בסליין.
תמיסת חיטוי	Winner Medical	פובידון-יוד/יודופור ואתנול 70%	משמשת להכנת הקרקפת לניתוח. יש להחיל חיטוי מתחלף למשך שלושה מחזורים.
מלקטים דקים	JZ Brand	JD1050/JD1070	משמשים להסרת פריוסטאום, מניפולציה של רקמות והעלאה של דפנות עצם.
מחט הזנה	RWD Life Science	20G, 38 מ"מ, קצה כדורי	משמשת למתן NMN דרך הפה.
לוחית ראש	מיוצר בהזמנה אישית	אין מספר קטלוגי	לוחית טיטניום עם פתח מרכזי בקוטר של כ-10 מ"מ התואם למחזיק ההדמיה.
משטח חימום/בקר הומוטרמיה	RWD Life Science	69020 עם משטח 69023	משמש לשמירה על טמפרטורת הגוף בכ-36.5–37.5 °C במהלך ניתוח והדמיה.
תוכנת רכישת תמונות	Nikon	NIS-Elements AR/AR Analysis v5.42.06	משמשת לבקרת מיקרוסקופ ורכישת תמונות. הגדרות מייצגות כוללות 512 × 512 או 1024 × 1024 פיקסלים, צעד z של 1–3 µm ומרווח זמן של 1 שניה.
תוכנת ניתוח תמונות	NIH	Fiji/ImageJ v1.8.0 ומעלה	משמשת לתיקון תנועה, בחירת אזור עניין, חיסור רקע, חילוץ עוצמה ויצוא CSV.
חומרים להז