כימות ציטוטוקסיות של תאי NK המועצמת על ידי קולטני אנטיגן כימריים ונוגדנים טיפוליים באמצעות הדמיית תאים חיים וציטומטריית זרימה

סיכום

פרוטוקול זה מספק תהליך עבודה מאוזן במבחנה למדידה עקבית של ציטוטוקסיות טבעית, מתווכת קולטני אנטיגן כימריים ותלויה בנוגדנים של תאי רוצח טבעיים אנושיים, באמצעות הדמיית תאים חיים וציטומטריית זרימה.

תקציר

תאי רוצח טבעיים (NK) הם לימפוציטים מולדים הממלאים תפקיד קריטי בהגנה מפני פתוגנים תוך-תאיים שונים וסרטן. תפקידם העיקרי הוא להרוג תאי מטרה שנדבקו, עברו טרנספורמציה ממאירית או מצופים בנוגדנים באמצעות ציטוטוקסיות תאית תלויה בנוגדנים (ADCC). תאי NK יכולים גם להיות מהונדסים גנטית כדי לבטא קולטני אנטיגן כימריים (CARs) המאפשרים זיהוי ממוקד של אנטיגנים ספציפיים. מדידה כמותית של ציטוטוקסיות של תאי NK חיונית להערכת תפקוד בסיסי ולהערכה פרה-קלינית של נוגדנים מונוקלונליים ואסטרטגיות הנדסת CAR. עם זאת, בדיקות תפקודיות במבחנה נותרות משתנות מאוד בין מעבדות שונות בשל הבדלים בהכנת התאים, תאי היעד, יחסי אפקטור למטרה, זמני הדגירה משותפים ושיטות קריאה, מה שמגביל את השחזור והשוואות בין מחקרים. מאמר זה מציג פרוטוקול סטנדרטי להערכה כמותית של ציטוטוקסיות תאי NK באמצעות ציטומטריית זרימה ודימות בזמן אמת של תאים חיים. תאי NK אנושיים ראשוניים ותאי NK-92 המבטאים CAR הוערכו בשל יכולתם להרוג תאי סרטן ותאי מטרה מצופים נוגדנים בפורמט של 96 בארות למדידת ציטוטוקסיות טבעית, הריגה בתיווך CAR ו-ADCC. הישרדות תאי המטרה נמדדה ברציפות באמצעות הדמיה של תאים חיים או בנקודת זמן מוגדרת באמצעות ציטומטריית זרימה, שאפשרה גם אפיון פנוטיפי של תאי NK ותאי המטרה. פרוטוקולים אלו מספקים מסגרת איתנה באמצעות שיטות שגרתיות של תרבית רקמות, הדמיה וציטומטריית זרימה, כדי לאפשר כימות שכפול של פונקציות אפקטור תאי NK למחקרים של חיסון מולד ואימונותרפיות מבוססות תאי NK.

מבוא

תאי רוצח טבעיים (NK) הם לימפוציטים מולדים הממלאים תפקיד מרכזי במעקב חיסוני נגד תאים נגועים וממאירים, ומפגינים ציטוטוקסיות מהירה ועוצמתית¹. בניגוד לתאי B ו-T, תאי NK אינם מבטאים קולטנים ספציפיים לאנטיגן, אלא מסתמכים על מערך של קולטנים מפעילים ומעכבים כדי לזהות אובדן ביטוי של קומפלקס מחלקה I בהיסטוקומפיציה עיקרית או לחץ תאי. דבר זה מאפשר להם לתווך ציטוטוקסיות ישירה על ידי שחרור גרגירי ציטוטוקס המכילים פרפורין וגרנזימים או, במקרים מסוימים, על ידי הפעלת קולטני מוות 1,2,3,4. בנוסף לציטוטוקסיות טבעית, תאי NK מבטאים את FcγRIII (CD16), קולטן שמזהה את חלק ה-Fc של האימונוגלובולין G (IgG) ומתווך ציטוטוקסיות תאית-נוגדנים (ADCC) נגד תאי מטרה מצופים IgG ^5,6.

בזכות המנגנונים הציטוטוקסיים הפנימיים שלהם ופרופיל הבטיחות המועדף, תאי NK הפכו למועמדים מבטיחים לאימונותרפיה תאית. עם פוטנציאל לשימוש אלוגני, תאי NK יכולים לפעול כטיפול "מוכן מהמדף עם סיכון מינימלי למחלת שתל מול מארח", מה שמאפשר יישום קליני רחב יותר והפחתת עלויות⁷. התקדמות אחרונה הרחיבה עוד יותר את הפוטנציאל הטיפולי של תאי NK באמצעות אסטרטגיות הנדסה גנטית, כולל הכנסת קולטני אנטיגן כימריים (CARs) שמפנים את תאי NK לזהות אנטיגנים ספציפיים לגידול. תאי CAR-NK הראו יעילות אנטי-גידולית במודלים של זנוגרפט in vivo וניסויים קליניים, עם רעילות מופחתת בהשוואה לתאי CAR-T ^8,9,10. לכן, יש עניין גובר בפיתוח פלטפורמות תאי NK מהונדסות ואסטרטגיות טיפוליות מבוססות נוגדנים. בהקשר זה, מדידה מדויקת וכמותית של יכולת ההרג של תאי NK חיונית להבנת הביולוגיה של תאי NK, להערכת יעילות טיפולי CAR או טיפולים מהונדסים אחרים לתאי NK, ולהערכת נוגדנים מונוקלונליים התלויים ב-ADCC.

מגוון בדיקות חוץ-גופיות שימשו באופן נרחב במעבדות להערכת ציטוטוקסיות של תאי NK. שיטות נפוצות כוללות בדיקות שחרור כרומיום-51 רדיואקטיביות, בדיקות שחרור לקטט דה-הידרוגנאז, ובדיקות שחרור קלציאן–אצטוקסיתיל^11,12. בעוד ששיטות מסורתיות אלו שימשו רבות למדידת ציטוטוקסיות, הן מסתמכות על קריאות עקיפות של מוות תאים, מספקות מדידות קצה במקום נתונים קינטיים, ומציעות רגישות וטווח דינמי מוגבלים. הם גם אינם מספקים מידע על הפנוטיפ או מצב ההפעלה של תאי אפקטור. בשנים האחרונות, פלטפורמות הדמיה של תאים חיים וציטומטריית זרימה אומצו יותר ויותר, משום שהן מאפשרות כימות ישיר של הישרדות תאי היעד, ניטור הרג לאורך זמן, וניתוח פנוטיפי סימולטני של תאי אפקטור ומטרה^13,14. עם זאת, גם בין הגישות החדשות הללו, קיימת שונות משמעותית בין מעבדות ומחקרים שפורסמו, כולל הבדלים בהכנת תאי היעד, יחסי אפקטור למטרה (E:T) וזמני דגירה משותפים, מה שמגביל את השחזוריות והשוואות בין מחקרים, במיוחד בהערכות פרה-קליניות של אימונותרפיות מבוססות תאי NK.

מאמר זה מציג תהליך עבודה סטנדרטי להערכה כמותית של ציטוטוקסיות של תאי NK באמצעות שתי פלטפורמות עצמאיות ומשלימות: הדמיה בזמן אמת, תאי חיים (IncuCyte SX5) ובדיקות נקודת קצה מבוססות ציטומטריית זרימה. הדמיה של תאים חיים מאפשרת ניטור רציף של הישרדות תאי המטרה במהלך קו-קולטורציה עם תאי אפקטור, ומאפשרת הערכה קינטית של ציטוטוקסיות ביחס E:T מרובי ותנאים ניסיוניים עם מניפולציה מינימלית^{של בדיקה 15}. לעומת זאת, ציטומטריית זרימה מספקת מדידת קצה רגישה מאוד של מוות תאי המטרה, יחד עם אפיון פנוטיפי בו-זמני של תאי NK ותאי המטרה באמצעות לוח צביעה רב-סמני.

בנוסף, פרוטוקול זה משלב פרמטרים ניסיוניים סטנדרטיים, כולל יחסי E:T, תנאי דגירה, פורמט לוח ותהליכי עבודה אנליטיים, כדי לשפר את השחזוריות ולהקל על השוואת מדידות ציטוטוקסיות בין מעבדות ומחקרים. תהליך העבודה מאפשר הערכה כמותית של פונקציות אפקטוריות NK מרובות, כולל ציטוטוקסיות טבעית, הריגה מתווכת CAR, ו-ADCC, ותואמת לתאי NK אנושיים ראשוניים ולקווי תאי NK. פרוטוקול זה מספק מסגרת מעשית ללימודי ביולוגיה של תאי NK ולהערכה פרה-קלינית של פיתוח אימונותרפיה מבוססת תאי NK.

פרוטוקול

השימוש בדגימות התורמים האנושיים למחקר אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית ונעשה בהתאם להנחיות מוסדיות (אישור #2022P000699).

1. בדיקת הרג בזמן אמת של דימות תאים חיים

1. לוחות מעילים
   1. הוסיפו 50 מיקרוליטר לבאר פולי-די-ליזין (0.1 מ"ג/מ"ל במי מלח מפוזר-זרחן [PBS]) לרשת של 6 × 10 בפלטת תחתית שטוחה עם 96 בארות. נער בעדינות את הצלחת כדי לוודא שתחתית כל באר מכוסה במלואה.
   2. דגרו את הפלטה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר (RT; 18°C–26°C) עם המכסה פתוח.
   3. שטיפת בארות 3× עם PBS של 200 מיקרוליטר/באר וזרוק את הסופרנטנט.
      הערה: לוחות מצופים ניתנים לאטום בפראפילם ולאחסן בטמפרטורה של 4°C עד שבוע עם הוספת 200 מיקרו-ליטר PBS לכל באר. ודא שהלוחות נשארים סטריליים, השליכו PBS, ואפשרו להם לאזן את ה-RT לפני השימוש.
2. הכינו תאי מטרה
   1. הכינו 10 מ"ל של 2× SYTOX Orange (200 ננומטר) על ידי דילול תמיסת SYTOX Orange (250 מיקרומולר ב-DMSO) לתוך מדיום תרבית NK-92 (הוסף 8 מיקרוליטר ל-10 מ"ל נפח כולל) בצינור צנטריפוגה קוני באורך 15 מ"ל.
      הערה: מדיום התרבית לתאי NK-92 כולל מדיום RPMI-1640 מתקדם, 10% סרום בקר עוברי (FBS), 2 מ"מ L-אלניל-L-גלוטמין, 100 מיקרוגרם/מ"ל פרימוצין, ו-500 U/mL IL-2 אנושי.
      אזהרה: SYTOX Orange הוא צבע פלואורסצנטי ועלול להוות סיכון לחשיפה לעור או לעיניים. לטפל בציוד מגן אישי מתאים ובהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות.
   2. ספירת תאי מטרה באמצעות שיטת ספירת תאים מבוססת הדרת צבע (למשל, כחול טריפן) או שיטה מאומתת מקבילה (למשל, מונה תאים אוטומטי).
      הערה: במבחן זה, תאי המטרה היו תאי רמוס, קו תאי לימפומה של תאי B המבטא אנטיגן (BCMA⁺) של תאי B, אותו תכננו לבטא את חלבון הפלואורסצנטי הקרוב באינפרא-אדום (NIR) emiRFP670.
   3. העבר את הכמות הנדרשת לצינור צנטריפוגה קוני בקוטר 15 מ"ל.
   4. צנטריפוגה (5 דקות, 300 × גרם, RT, תאוצה = מקסימום; האטה [בלם] = מקסימום).
   5. זרוק את הסופרנטנט.
   6. החזירו את תאי המטרה לריכוז סופי של 2.5 × 10⁵ תאים/מ"ל (2.5 × 10⁴ תאים/100 מיקרוליטר) במדיה כתומה 2× SYTOX.
      הערה: ניתן לשמור על תאי מטרה תלויים בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂ בצינור למשך עד 30 דקות בזמן הכנת דילול תאי אפקטור.
      הערה: עבור לוח מלא אחד, 60 בארות × 2.5 × 10⁴ תאים/באר = 1.5 × 10⁶ תאי יעד בסך הכל. הכינו 2.0 × 10⁶ תאים כדי להתחשב באובדן. התאימו את מספר התאים לפי גודל הבדיקה וצפיפות הזריעה הרצויה.
3. הכינו תאי אפקטור
   1. הערכו את הריכוז והחיוניות של תאי NK-92 באמצעות שיטת ספירת תאים מבוססת הדרת צבע (למשל, Trypan Blue) או שיטה מאומתת מקבילה. יש להמשיך רק אם הכדאיות היא ≥80%, שכן כדאיות נמוכה יותר עלולה להשפיע על ביצועי הבדיקה.
      הערה: תאי NK-92 שהונדסו לבטא באופן יציב את החלבון הפלואורסצנטי ZsGreen, לבד (בביקורת) או עם מבני CAR ממוקדים ב-BCMA, שימשו כתאי אפקטור.
   2. ספרו והעבירו את מספר התאים הנדרש לצינורות צנטריפוגה חרוטיים באורך 15 מ"ל בודדים.
      הערה: חשב את מספר תאי האפקטור הכולל הנדרש על ידי סכימת מספר התאים הנדרש בכל יחסי E:T לשכפול אחד, הכפלה במספר השכפולים, והוספת עודף של 50% כדי להתחשב באובדן התאים. מספרים עגולים לפי הצורך כדי להקל על ההכנה. לדוגמה, עבור יחס E:T הנעים בין 2:1 ל-0.25:1, השתמש ב-1.5 ×-10⁵ תאי NK לכל שכפול. לשלושה כפילים, יש להכין 4.5 ×-10⁵ תאים לכל מצב בהתבסס על פריסת הלוחות המתוארת באיור המשלים 1A.
   3. תאי צנטריפוגה (5 דקות, 300 × גרם, RT, תאוצה = מקסימום; האטה [בלם] = מקסימום).
   4. זרוק את הסופרנטנט.
   5. החזירו את התאים לריכוז סופי של 5.0 × 10⁵ תאים/מ"ל (5.0 × 10⁴ תאים/100 מיקרוליטר).
4. הכינו דילול תאי אפקטור
   1. הכינו דילול תאי אפקטור, כולל בקרה מטרה בלבד, בפלטת תחתית עגולה עם 96 בארות (ראו איור משלים 1A לפריסת לוחות ייצוגיים עם ארבעה תנאים בשלושה עותקים). כל תנאי מוכן בשלושה עותקים.
   2. הוסף 240 מיקרוליטר לבאר של תאי אפקטור (5.0 × 10⁵ תאים/מ"ל) לבארות התואמים ליחס E:T של 2:1.
   3. הוסף 120 מיקרולטר/באר של מדיה לכל הבארות שנותרו.
   4. בצע דילול סדרתי דו-כיפי מבארות E:T = 2:1 דרך בארות E:T = 0.25:1. ערבב היטב על ידי פיפטינג ≥5 פעמים והחלף את הקצוות בין ההעברות.
      הערה: אם בדיקות הדמיה לא נקבעו במערכת ההדמיה, קבעו אותן לפני הקמת הקו-קולטורה. ניתן לשמור על דילול תאי אפקטור מוכנים בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂ בפלטת תחתית עגולה עם 96 בארות למשך עד 30 דקות בעת הקמת מערכת ההדמיה של התאים החיים.
5. הקמת קו-קולטורה
   1. קבל את לוח ה-96 בארות מצופה פולי-די-ליזין עם תחתית שטוחה.
   2. הוסף 100 מיקרולטר/באר של תליית תאי מטרה לכל הבארות. השעתי היטב את תאי המטרה מיד לפני ההזנחה, על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ≥5 פעמים באמצעות פיפטה מתאימה (למשל, 200 מיקרוליטר) והימנעות מהיווצרות בועות במהלך ההעברה.
   3. הוסיפו 100 מיקרוליטר/באר של תליית תאי אפקטור לבארות המתאימות. השקעו היטב את תאי האפקטור מיד לפני ההעברה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ≥5 פעמים באמצעות פיפטה מתאימה (למשל, 200 מיקרוליטר) והימנעו מהיווצרות בועות במהלך ההעברה.
   4. הוסיפו 200 מיקרוליטר/באר PBS לבארות הלא מנוצלות שמסביב.
   5. צנטריפוגה של הלוח (2 דקות, 100 × גרם, RT, תאוצה = נמוכה [למשל, 2]; האטה [בלם] = נמוך [למשל, 2]).
      הערה: הסחרור הרך הזה קריטי להתייצבות מהירה ואחידה של תאים בתחתית הבאר להדמיה מדויקת על ה-IncuCyte SX5. אנחנו משתמשים במנוע Eppendorf Centrifuge 5810R עם רוטור דלי מתנדנד תואם לשולחן עם הגדרות האצה והאטה מוגדרות ל-2 (מתוך 9).
   6. הניחו את הלוחית במערכת ההדמיה של התאים החיים וצלמו תמונות כל שעה למשך 24 שעות (ניתן להרחבה עד 72 שעות במידת הצורך). ודאו שההדמיה מתבצעת בתנאי דגירה סטנדרטיים (37°C/5% CO₂).
      הערה: כדי להבטיח שהדמיה ב-t = 0 שעות משקפת במדויק את ספירת תאי המטרה הבסיסיים, התחל ברכישת תמונה בתוך 10–15 דקות לאחר הקמת הקו-קולטורציה והצנטריפוגה. לפלטה מלאה עם שלושה ערוצי הדמיה (כלומר, ירוק, כתום ו-NIR), זמן הסריקה הוא כ-10 דקות לשעה עבור 3 תמונות/באר בהגדלה של 20×.
   7. בדוק את איכות התמונה אחרי הסריקה הראשונה והתאם הגדרות במידת הצורך.
6. הגדרות כלי נגינה
   1. הגדר את פירוק הערבוב הספקטרלי לתקן פליטת פלואורסצנציה של SYTOX Orange אל התעלה הירוקה. כוון את ערך ההסרה בתוכנה על ידי השוואת הערוצים הירוק והכתום ואישור שתאי Orange⁺ מתים לא מזוהים בטעות כ-Green⁺. לניסוי המייצג (איור 1), תרומת הערוץ הכתום לערוץ הירוק הוגדרה ל-8.5%. ערכים אלו הם ספציפיים למאגר נתונים וצריכים להיות מותאמים לכל ניסוי.
   2. הגדר ניתוח תא-אחר-תא שאינו דבק כדי להבטיח סגמנטציה והסתרה מדויקת של כל התאים בכל שדה ראייה (ראו איור 1B משלים להגדרת מייצג). הפרמטרים הבאים מומלצים עבור מערכת ההדמיה של תאים חיים המשתמשת במודלים של אפקטור תלייה ומודלים של קו תא מטרה:
      1. הגדר את קוטר האובייקט הצפוי ל-15 מיקרון (קוטר תא משוער).
      2. הגדר רגישות סף ורגישות למרקם ל-5.
      3. הגדר את רגישות הקצה ל-10 כדי להקל על הפרדת אשכולות תאים.
      4. הגדר את טווח מסנן שטח האובייקטים המקובל ל-50–2000 מיקרון² כדי להוציא פסולת וחפצים גדולים.
      5. הגדר אקסצנטריות מקסימלית ל-0.95 כדי להוציא עצמים לא-תאיים.
   3. הגדר את ספי הסיווג (ראו איור 1C המשלים לשער ייצוגי). השתמש בבארות בקרה הממוקדות רק במטרה כדי להגדיר את אוכלוסיית תאי המטרה החיים NIR⁺/Orange⁻ הבסיסיים. לאחר מכן משתמשים בבארות קו-קולטורה בנקודות זמן מאוחרות יותר (למשל, t = 4 h) כדי לאשר הפרדה ברורה עם חפיפה מינימלית בין אוכלוסיות NIR⁺/⁻ ואוכלוסיות כתום⁺/⁻ . דוגמאות לספי סיווג ופרמטרי ניתוח מוצגים באיור המשלים 1C.
      1. הגדר את סף עוצמת הכתום לכ-15.
      2. הגדר את סף עוצמת ה-NIR לכ-0.1.
         הערה: ערכי הפרמטרים והסף עשויים להשתנות בהתאם למכשיר, לתוכנה, למודל קו התאים ולעוצמת אות הפלואורסצנציה.
         הערה: פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לבדיקות ציטוטוקסיות ראשוניות של תאי NK אנושיים או ADCC אם תאי המטרה מבטאים באופן יציב פלואורסצנציה של NIR (למשל, emiRFP670). ניתן גם להתאים אותו לבדיקות הרג מבוססות ציטומטריית זרימה על ידי הימנעות מציפוי פולי-די-ליזין ושימוש בלוחות שטוחים או עגולים עם 96 בארות.

איור 1. כימות הקינטיקה והעוצמה של ציטוטוטוקסיות המתווכת על ידי תאי NK-92 של קולטני אנטיגן כימרי (CAR) באמצעות דימות תאים חיים בזמן אמת. (א) סקירה סכמטית של מבחן ההדמיה של תאים חיים IncuCyte למעקב אחר ציטוטוקסיות המתווכת על ידי תאי NK. תאי מטרה של ^BCMA+ Ramos המבטאים emiRFP670 (ערוץ אינפרא-אדום קרוב [NIR]) מעובדים יחד עם תאי אפקטור NK-92 המבטאים את ZsGreen (ערוץ ירוק), ומוות התאים מזוהה באמצעות SYTOX Orange (תעלת כתום). (B) תמונת פלואורסצנציה מייצגת של באר קו-קולטור ביחס אפקטור למטרה (E:T) של 1:1 ב-12 שעות. תאי מטרה חיים (emiRFP670⁺) מוצגים בכחול, תאי אפקטור NK-92 (ZsGreen⁺) בירוק, ותאים מתים (SYTOX Orange⁺) באדום. התמונות צולמו באמצעות מודול ניתוח Cell-by-Cell שאינו דבק בהגדלה של 20×. פס סולם = 100 מיקרון. (ג) כימות של גדילה והישרדות תאי המטרה לאורך זמן ביחס E:T משתנה עבור תאי NK-92 המבקרים והמבטאים CAR. (D) כימות הישרדות תא המטרה כפונקציה של יחס E:T במספר נקודות זמן (4, 8, 16 ו-24 שעות). ספירות תאי המטרה נורמל לבארות המטרה בלבד (E:T = 0:1) בכל נקודת זמן. (ה) ייצוג סכמטי של מדדים כמותיים המשמשים להערכת ציטוטוקסיות: KR₅₀, יחס הרוצח למטרה הנדרש להשגת 50% הריגה ב-12 שעות; KT₅₀, זמן נדרש להשגת 50% הריגה ביחס E:T של 1:1; ו-IKI₅₀, מדד הרג משולב המוגדר כשטח מפת החום מתחת לאיזוקלין  הישרדות של 50%.(F) מפות חום המציגות צמיחה והישרדות של תאי המטרה כפונקציה של יחס E:T וזמן לכל מצב אפקטור. ערכים כמותיים עבור KR₅₀,_{KT 50} ו-IKI₅₀ מצוינים לכל תנאי. ספירות גולמיות של תאי מטרה חיים התקבלו ^{מאוכלוסיית} NIR⁺/SYTOX Orange המוגבלת באמצעות ניתוח סיווג תא-אחר-תא בתוכנת IncuCyte 2021C. כל התנאים בוצעו בשלושה עותקים (n = 3). הנתונים מוצגים כסטיית תקן ממוצעת ±. ניתוח רגרסיה לא ליניארית שימש למידול מגמות ציטוטוקסיות בפאנלים D ו-F. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה רחבה יותר של איור זה.

2. כימות של ציטוטוקסיות תאית תלויה בנוגדנים באמצעות ציטומטריית זרימה

1. הכנת תאי NK ראשוניים אנושיים
   הערה: תאי NK אנושיים ראשוניים בודדו מדם היקפי מועשר בלויקוציטים שהושג מתורמים בוגרים בריאים באמצעות שיטת העשרת תאי NK ואחריה צנטריפוגציה בגרדיאנט צפיפות, כפי שתואר^{קודם 3}. תאי NK מטוהרים הוקפאו ב-5 × 10⁶ תאים/מ"ל בתמיסת הקפאה (90% FBS ו-10% דימתיל סולפוקסיד [DMSO]) כאליקוטים של 0.5 מ"ל בקריוביאלים ואוחסן בטמפרטורה של פחות מ-−150°C עד לשימוש³.
   1. הפשרו בקבוקון אחד המכיל 5 ×-10⁶ תאי NK ראשוניים אנושיים על ידי ערבוב עדין של הקריוביאל באמבט מים של 37°C למשך כ-1 דקה, עד שנשאר רק גביש קרח קטן.
      זהירות: יש לטפל בכל הדגימות שמקורן בבני אדם באמצעות נהלי בטיחות ביולוגית מתאימים וציוד מגן אישי בהתאם להנחיות המוסדיות.
      זהירות: DMSO מסייע בספיגת כימיקלים בעור. לבש ציוד מגן מתאים ולהימנע ממגע ישיר.
   2. העבר את התאים המופשרים לצינור צנטריפוגה קוני באורך 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל מדיום תרבית תאי NK מחומם מראש (37°C) וערבב בסיבוב עדין.
      הערה: מדיום תרבית תאי NK מורכב מ-Advanced RPMI-1640 בתוספת 10% FBS, 10% סרום AB אנושי, 2 מ"מ L-אלניל-L-גלוטמין, 100 מיקרוגרם/מ"ל פרימוצין, ו-50 U/mL IL-2 אנושי.
   3. תאי צנטריפוגה (5 דקות, 300 × גרם, RT, תאוצה = מקסימום; האטה [בלם] = מקסימום).
   4. זרוק את הסופרנטנט.
   5. החזירו את הכדור ל-5 מ"ל של מדיום תרבית תאי NK מחומם מראש (37°C).
   6. תאי צנטריפוגה (5 דקות, 300 × גרם, RT, תאוצה = מקסימום; האטה [בלם] = מקסימום).
   7. זרוק את הסופרנטנט.
   8. החזירו את הכדור למרחק של 1 מ"ל של מדיום תרבית תאי NK מחומם מראש.
   9. העבר את המתלה לבאר אחת של לוח תרבית רקמה עם 24 בארים.
   10. הוסיפו 1 מ"ל PBS סטרילי לבארות הסובבות כדי למזער אידוי.
   11. דגרו את פלטת 24 הבארים בזווית של 45° (באמצעות מדף או תמיכה לשמירת הזווית) בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂ למשך 16–24 שעות כדי לאפשר התאוששות בתאי NK.
       הערה: תאי NK אנושיים ראשוניים זקוקים למגע קרוב בין תאים לצורך הישרדות והתאוששות מקסימליים, שניתן להשיג על ידי הטיית הלוח של 24 הבארות ואפשרות להצטברות בקצה הבארות. שמור על זמן דגירה עקבי לאורך כל הניסויים.
       הערה: לאחר תקופת ההתאוששות, יש לעבור ישירות להכנת תאי המטרה והגדרת קו-קולטורציה.
2. צבע תאי מטרה עם אסטר קרבוקסי פלואורסאין סוקסינימידיל (CFSE).
   1. השגת 5 ×-^10-5 תאי מטרה והעברה לצינור צנטריפוגה קונית-תחתית בקוטר 15 מ"ל.
      הערה: קו תאי לימפומה שמקורו במטופל CD38⁺ שימש כתאי מטרה¹⁶.
   2. שטוף תאים פעם אחת עם 10 מ"ל PBS.
   3. תאי צנטריפוגה (5 דקות, 300 × גרם, RT, האצה = מקסימום; האטה [בלם] = מקסימום).
   4. הכינו תמיסת עבודה של 0.5 מיקרומום של CFSE ב-PBS באמצעות תמיסת 5 מילימטר על ידי דילול 1 מיקרוליטר של 5 מילימטר CFSE ל-10 מ"ל PBS בצינור צנטריפוגה קוני באורך 15 מ"ל.
      זהירות: CFSE הוא צבע פלואורסצנטי תגובתי הקשור לאמין ועלול להוות סיכון לחשיפה לעור או לעיניים. לטפל בציוד מגן אישי מתאים ולהיפטר מחומרים לא בשימוש בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית המקומיות.
   5. זרוק את הסופרנטנט.
   6. החזירו את הכדור למרחק של כ-1 ×^{10 6} תאים/מ"ל בתמיסת CFSE.
   7. דגרו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C כאשר הצינור עטוף בנייר אלומיניום או מונח בתוך מיכל אטום להגנה מפני אור.
   8. כיבוי התגובה על ידי הוספת 5–10 כרכים של מדיום תרבית.
   9. דגירה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37°C.
   10. תאי צנטריפוגה (5 דקות, 300 × גרם, RT, תאוצה = מקסימום; האטה [בלם] = מקסימום).
   11. זרוק את הסופרנטנט.
   12. החזירו תאים בקצב של 2.5 × 10⁵ תאים/מ"ל, כך ש-100 מיקרוליטר יכילו 2.5 × 10⁴ תאים.
       הערה: המשיכו ישירות לציפוי כדי לשמור על עוצמת אות CFSE עקבית ועמידות תא מטרה.
3. תאי מטרה בלוחות
   1. קבל פלטת תחתית עגולה עם 96 בארות.
   2. הוסף 100 מיקרוליטר לבאר של תאי מטרה (2.5 × 10⁵ תאים/מ"ל) לבארות המיועדות באמצעות פיפטה רב-ערוצית (ראו איור משלים 2). כל תנאי מצופה בשלוש עותקים.
      הערה: ודא שהמתלה של התא הומוגני לפני הציפוי.
4. הכינו והוסיפו נוגדנים
   1. הכינו 200 מיקרוליטר של 4× תמיסת נוגדנים (100 מיקרוגרם/מ"ל) במדיום תרבית תאי NK לכל נוגדן בדיקה ובקרת איזוטיפ תואם.
      הערה: שלב זה מודולרי וניתן להתאים לכל נוגדן המתווך ADCC נגד קו התאים הנבחר. ריכוזי מלאי הנוגדנים והנוסחאות עשויים להשתנות; התאימו את הדילול בהתאם. חומרים משמרים כמו אזיד עשויים להשפיע על הישרדות תאי המטרה ועל תפקוד תאי NK. בעוד שניתן לבדוק מגוון ריכוזי נוגדנים, כאן משתמשים בריכוז סופי של 25 מיקרוגרם/מ"ל.
   2. העבר תמיסות נוגדנים לפלטת באר עמוקה.
   3. הוסף 50 מיקרוליטר לבאר של תמיסת נוגדנים לתאים המטרה וערבב היטב על ידי פיפטינג ≥5 פעמים.
   4. הוסיפו 50 מיקרוליטר/באר של מדיום תרבית תאי NK לבארות בקרה ללא נוגדנים וערבבו היטב על ידי פיפטציה ≥5 פעמים.
   5. דגרו במשך 25–30 דקות בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂.
5. הכנה והוספה של תאי NK
   1. לספור ולקבל 2 × 10⁵ תאי NK באמצעות שיטת ספירת תאים מבוססת הדרת צבע (למשל, כחול טרייפאן) או שיטה מאומתת מקבילה. המספר מספיק לשלוש מצבים המכילים תאי NK מצופים בשלושה עותקים, עם עודף כדי להסביר את אובדן הפיפפטינג (ראו איור משלים 2). המשיכו אם הכדאיות היא ≥75%, שכן כדאיות נמוכה יותר עשויה להשפיע על ביצועי הבדיקה.
   2. החזירו את התאים ל-2.5 × 10⁵ תאים/מ"ל ב-800 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאי NK ראשוני בבני אדם (ריכוז סופי = 1.25 ×^{10 4} תאים/50 מיקרוליטר).
   3. הוסף 50 מיקרוליטר/באר של תאי NK לבארות המתאימות וערבב היטב על ידי פיפטינג ≥5 פעמים.
      הערה: ודא שהמתלה של התא הומוגני לפני הציפוי.
   4. הוסיפו 50 מיקרולטר/באר של מדיום תרבית לשליטה בבארות וערבבו היטב על ידי פיפטינג ≥5 פעמים.
6. הקמת קו-קולטורה סופית
   1. בדקו בקפידה את לוח התחתית העגול עם 96 בארות כדי לוודא שכל הבארות מכילות 200 מיקרו ליטר עם רמות מניסקוס אחידות וללא בועות.
   2. צנטריפוגה את הלוח (2 דקות, 100 × גרם, תאוצה = נמוכה [למשל, 2]; האטה [בלם] = נמוך [למשל, 2]).
      הערה: ספין רך זה חשוב ליישוב מהיר של תאים ולהגברת המגע בין תאים. אנחנו משתמשים במנוע Eppendorf Centrifuge 5810R עם רוטור דלי מתנדנד תואם לשולחן עם הגדרות האצה והאטה מוגדרות ל-2 (מתוך 9).
   3. דגרו במשך 16–18 שעות (לילה) בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂.
      הערה: משך הדגירה הזה מותאם לקריאת ציטוטוקסיות ולא לדגרנולציה, אשר מוערכת בצורה הטובה ביותר על ידי מדידת ביטוי CD107a בנקודות זמן מוקדמות יותר (2–6 שעות). לכן, תגובות הדגרנולציה השיא עשויות להיות מוערכות בחסר.
      הערה: אין להאריך את הדגירה מעבר ל-18 שעות, שכן קו-קולטורציה ממושכת עלולה לגרום למוות מופרז של תאי המטרה בבארות הבקרה ולהפחתת טווח דינמי בין תנאי הניסוי.
7. ביצוע ציטומטריית זרימה
   1. צנטריפוגה (5 דקות, 300 × גרם, תאוצה = מקסימום; האטה [בלם] = מקסימום).
   2. זרוק את הסופרנטנט.
   3. שטוף את כל הבארות עם 200 מיקרוליטר/באר של בופר FACS (2% FBS, 2 מ"מ EDTA ב-PBS).
   4. הכינו תערובת נוגדנים ראשית שטחית בזיכרון FACS על ידי הוספת CD56-BV421 בדילול 1:50, CD16-BV785 בדילול 1:50, ו-CD107a-PE-Cy7 בדילול 1:25.
      הערה: חשב את נפח התערובת הראשית הכולל בהתבסס על עיצוב הפלטת הניסיונית (מספר הבארות × 50 מיקרוליטר/באר + עודף 20%). שיבוטי נוגדנים עשויים להשתנות בעוצמת הצביעה ובנגישות האפיטופים. השיבוטים המשמשים בנתונים המייצגים מופיעים בטבלת החומרים, ושיבוטים חלופיים עשויים לדרוש טיטרציה. נוגדנים נוספים עשויים להיכלל לפנוטיפינג תת-קבוצה של תאי NK (למשל, KIRs, NKG2A/C/D, ו-CD57) ולסמני הפעלה (למשל, CD69 ו-HLA-DR).
   5. החזירו את התאים לתערובת 50 מיקרוליטר/באר של נוגדנים מאסטר וערבבו היטב על ידי פיפטינג ≥5 פעמים.
   6. דגרו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C כאשר הפלטה עטופה בנייר אלומיניום או מונחות בתוך מיכל אטום להגנה מפני אור.
   7. הוסף 150 מיקרוליטר לבאר של בופר FACS.
   8. צנטריפוגה (5 דקות, 300 × גרם, תאוצה = מקסימום; האטה [בלם] = מקסימום).
   9. זרוק את הסופרנטנט.
   10. החזירו תאים ב-100 מיקרוליטר/באר של 5 מיקרומום 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) בבופר FACS וממשיכים מיד לרכישת ציטומטריה בזרימה. אין צורך בדגירה טרום-רכישה.
   11. רכישת נתונים באמצעות ציטומטריית זרימה ותיעוד ערוצי פלואורסצנציה עבור CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI וכל פלואורופור נוסף.
       הערה: הגדרות רכישה (למשל, מתחי גלאי, פיצוי ושחרור) עשויות לדרוש אופטימיזציה. השתמשו בבקרות ללא צבע ויחיד לפיצוי והתקנת שערים, עם חרוזי פיצוי או תאים מייצגים לפי הצורך. יש לשקול בקרות פלואורסצנציה מינוס אחת עבור סמנים עם ביטוי רציף או עמום (למשל, CD107a). שמירה על הגדרות עקביות ואסטרטגיית גייטינג, כולל גייטינג חי/מת וזיהוי אוכלוסיות מטרה ומאפקטורים, לאורך הניסויים.
       הערה: גם שלב 1 וגם שלב 2 ניתנים להתאמה לתאי מטרה דבקים. תאי המטרה של הזרעים (עם מדיום התרבית שלהם) בלוח שטוח עם 96 בארות יום לפני החקלאות המשותפת בצפיפות שמגיעה לכ-70% מפגש ביום הבדיקה. לאחר אישור ההיצמדות, השליכו את מדיום תאי היעד והחליפו ב-100 מיקרוליטר של מדיה טרייה של תאי NK, ואז מוסיפים תאי אפקטור להתחלת קו-קולטורציה. עקב הבדלים בגודל התא ובמורפולוגיה, יש לאופטם את פרמטרי ניתוח IncuCyte Cell-by-Cell עבור כל קו תאים דבק.
       הערה: בבדיקות מבוססות ציטומטריית זרימה עם תאים דביקים, לאחר קו-קולטורה, צנטריפוגה את הלוח (300 × גרם, 5 דקות) והשליכו את הסופרנאנט. הוסף 100 מיקרוליטר לבאר של TrypLE ודגר בטמפרטורה של 37°C עם 5%_CO2 למשך כ-5–15 דקות (תלוי בקו התא) כדי לנתק תאים. הוסיפו 100 מיקרוליטר לבאר של בופר FACS, ערבבו על ידי פיפטינג למעלה ולמטה בתנועה מעגלית, והעבירו את כל התאים לפלטת תחתית עגולה עם 96 בארות. בדקו את הבארות במיקרוסקופ כדי לוודא ניתוק מוחלט לפני שממשיכים בצביעה (שלב 2, תת-שלב 7). אופטימיזציה של זמן הדגירה של TrypLE לפי הצורך להשגת תלייה חד-תאית.

תוצאות

כדי לכמת את הציטוטוקסיות של תאי NK בזמן אמת, תאי אפקטור NK-92 שתוכננו לביטוי CARs אנטי-BCMA גודלו יחד עם תאי מטרה של ^BCMA+ Ramos בלוח שחור, שקוף עם תחתית שטוחה של 96 בארות ונעקבו באמצעות הדמיית תאים חיים (איור 1A ואיור 1A משלים). תאי אפקטור נוספו ביחס E:T של 0:1 (יעד בלבד), 0.25:1, 0.5:1, 1:1 ו-2:1, כאשר כל מצב בוצע בשלושה עותקים. הוערכו שלושה מבנים שונים של CAR NK-92: CAR1 ללא דומיין קו-גירוי, CAR2 עם דומיין קו-גירוי 4-1BB (CD137), ו-CAR3 עם דומיין קו-גירוי DAP10, יחד עם תאי NK-92 בקרה המבטאים וקטור ZsGreen בלבד. כל תאי האפקטור נוצרו באמצעות טרנסדוקציה לנטיויראלית, כפי שתואר^{קודם 4} באמצעות קלטות טרנסגני ZsGreen-P2A-CAR. תאי המטרה של רמוס הועברו באופן דומה עם וקטור לנטיוויראלי המקודד ב-emiRFP670. גדילה והישרדות תאי המטרה נבדקו כל שעה במשך 24 שעות באמצעות מכשיר הדמיה של תאים חיים, שמדד פלואורסצנציה ירוקה לתאי ZsGreen⁺ NK-92, פלואורסצנציה כתומה לתאי SYTOX Orange⁺ מתים, ופלואורסצנציה NIR לתאי יעד emiRFP670⁺ (איור 1A ואיור 1B ו-1C משלים).

תמונות מיקרוסקופיות צולמו במרווחי זמן מוגדרים כדי לדמיין תאי אפקטור, תאי מטרה חיים ותאי מטרה מתים במהלך קו-קולטורציה (איור 1B). כימות של גדילת תאי המטרה וההישרדות הראה שתאי CAR2 ו-CAR3 NK-92 הראו קינטיקה מהירה יותר בהריגה מאשר תאי CAR1 NK-92, במיוחד בנקודות זמן מוקדמות יותר ביחס E:T של 1:1. הריגת תאי המטרה עלתה עם יחס E:T גבוה יותר, כולל בתאי NK-92 בביקורת, שהראו ציטוטוקסיות טבעית (איור 1C). מדידות אלו מדגישות את היכולת של הדמיית תאים חיים ללכוד שינויים דינמיים בפעילות הציטוטוקסית. הישרדות תאי המטרה נותחה גם כפונקציה של יחס E:T בנקודות זמן מוגדרות כדי להשוואת עוצמת CAR NK-92. תאי CAR2 ו-CAR3 NK-92 הראו עוצמה גבוהה יותר ביחס E:T נמוך יותר בנקודות זמן מאוחרות יותר (למשל, E:T = 0.25:1 ב-24 שעות) וביחסי E:T ביניים בנקודות זמן מוקדמות יותר (למשל, E:T = 1:1 ב-4 שעות) (איור 1D). לא נצפו הבדלים משמעותיים בהריגה בין תאי אפקטור CAR2 ו-CAR3 NK-92 לאורך הניתוחים.

מפת חום המשלבת יחס E:T, זמן דגירה משותף והישרדות תאי המטרה מספקת המחשה מקיפה של ציטוטוקסיות טבעית ומתווכת CAR בכל אוכלוסיות האפקטורים ומאפשרת הערכה כמותית. הוגדרו שלושה פרמטרים לכימות עוצמה וקינטיקה: KR₅₀, יחס הרוצח למטרה שמביא ל-50% הריגה (ב-12 שעות); KT₅₀, זמן הדגירה המשותפת הנדרש להשגת 50% הריגה (ביחס E:T של 1:1); ו-IKI₅₀, מדד ההרג המשולב המייצג את שטח מפת החום מתחת ל-50% הישרדות, המוגדר על ידי איזוקלין הישרדות של 50% (איור 1E). מדדים אלו מאפשרים השוואה בין עוצמת תאי CAR NK-92 (KR₅₀), קינטיקה להרגה (KT₅₀) וביצועי ציטוטוקס משולבים (IKI₅₀) (איור 1F). ניתוח זה מדגים כיצד המבחן יכול להשוות כמותית פלטפורמות תאי NK מהונדסות בין פרמטרים מרובים בתוך ניסוי אחד.

ציטומטריית זרימה עם ספירת תאים שימשה למדידת ADCC על ידי שילוב תאי מטרה מסומנים פלואורסצנטית עם תאי NK אנושיים ראשוניים בנוכחות או היעדר נוגדנים טיפוליים, וכימות אוכלוסיית תאי המטרה החיים שנותרו לאחר 16–18 שעות של דגירה (איור 2A). ניתן להשתמש בציטומטרי זרימה כמו Cytek Aurora, BD Symphony או BD Fortessa עם דוגמית בעל תפוקה גבוהה. בהגדרה המייצגת (איור משלים 2), תאי לימפומה שמקורם ב-CD38⁺ הוצפו בצלחת עגולה של 96 בארות, והווסף דראטומומאב (או נוגדן איזוטיפ) לבארות המתאימות. תאי NK עברו תרביות משותפת ביחס E:T של 0.5:1, יחס מותאם לתאים אלו כדי למזער הרג טבעי ולאפשר זיהוי ADCC. לאחר הדגירה, בוצעה ציטומטריית זרימה לזיהוי אוכלוסיות תאים באמצעות פיזור קדמי וצדדי, הוצאת אירועים לא ברי קיימא באמצעות DAPI, והפרדת תאי יעד ^CFSE+ מתאי NK CD56⁺CD16⁺ לניתוח מקביל (איור 2B). עיצוב זה מאפשר מדידה סימולטנית של ציטוטוקסיות ואפיון פנוטיפי.

איור 2. בדיקת ציטוטוקסיות תאית-תלויה בנוגדנים (ADCC) מבוססת זרימה-ציטומטריה מאפשרת כימות סימולטני של הישרדות תאי המטרה והפעלת תאי NK. (א) סקירה סכמטית של מבחן ADCC. תאי המטרה של לימפומה CD38⁺ המסומנים ב-CFSE צופו ב-2.5 ×-10-4 תאים בכל באר וגודלו תחת חמישה מצבים: תאי מטרה בלבד; תאים מטרה עם דראטומומאב (25 מיקרוגרם/מ"ל); תאי מטרה עם תאי NK (E:T = 0.5:1); תאי מטרה עם תאי NK ודראטומומאב; ותאים עם תאי NK ונוגדן בקרה איזוטיפ (25 מיקרוגרם/מ"ל). (B) אסטרטגיית שער זרימה ציטומטרית מייצגת. האירועים הוגברו תחילה על ידי פיזור קדמי ופיזור צדדי, ולאחר מכן הוצאה של תאים לא חיוניים באמצעות DAPI. תאי מטרה זוהו כאירועי ^CFSE+, ותאי NK זוהו כאירועי CD56⁺ ו-CD16⁺. הדגרנולציה של תאי NK הוערכה באמצעות ביטוי CD107a. (ג) כימות הישרדות תאי היעד, המובע כאחוז יחסית למצב הביקורת המטרה בלבד (מוגדר ל-100%). (D) כימות של דה-גרנולציה של תאי NK, כפי שמוצג כאחוז תאי CD107a⁺ בתוך אוכלוסיית תאי NK. פסים מייצגים סטיית תקן ממוצעת ±, ונקודות מונחות מייצגות בארות שכפול בודדות (n = 3). הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות ניתוח חד-כיווני של שונות עם מבחן ההשוואה הפוסט-הוק של טוקי. המובהקות הסטטיסטית מוצגת כך: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

נקודת הסיום העיקרית היא הישרדות תאי המטרה, המחושבת בתוך שער ^CFSE+ החי ומנורמלת למצב המטרה בלבד, שמוגדר ל-100% הישרדות. נרמול זה שולט באובדן תאי מטרה ספונטני ומאפשר השוואה ישירה בין מצבים. בנתונים מייצגים (איור 2C), הוספת דראטומומאב לבדה לא הפחיתה את הישרדות תאי המטרה, מה שמאשר כי לנוגדן אין השפעה ישירה על חיוניות תאי המטרה בהיעדר תאי אפקטור. תרכלה משותפת עם תאי NK בלבד הפחיתה את הישרדות תאי המטרה לכ-70%, המצביעה על ציטוטוקסיות טבעית בסיסית. הוספת דראטומומאב הפחיתה עוד יותר את ההישרדות לכ-37%, תואמת את ההריגה המוגברת בתיווך נוגדנים, בעוד שמצב הביקורת באיזוטיפ הראה הישרדות של כ-62%, בהשוואה למצב של NK בלבד. ניסויים מוצלחים מראים הפרדה ברורה בין מצב מטופל בנוגדנים למצב ביקורת, עם שכפול גבוה בין השכפולים.

פנוטיפינג משני של תאי NK מספק אישור משלים לקשר בין הריגת תאי המטרה לבין הפעלת האפקטורים. דה-גרנולציה של תאי NK, שנמדדה כאחוז תאי CD107a⁺ NK, הייתה הנמוכה ביותר בתרבות משותפת של תא NK ותאי מטרה ללא נוגדן והגבוהה ביותר במצב שטופל בדראטומומאב (כ-31%), כאשר בקרת האיזוטיפ הראתה דגרנולציה ביניים (כ-19%), שתמכה בהפעלה מתווכת נוגדנים (איור 2D). תוצאות אלו מראות שהבדיקה יכולה להבחין בין הריגת תאי מטרה לבין הפעלת אפקטור. למרות שמגמות הדגרנולציה וההישרדות בדרך כלל מתואמות, הן אינן חופפות לחלוטין, מה שמעיד כי הן מייצגות תהליכים ביולוגיים קשורים אך מובחנים.

ניסויים לא אופטימליים מראים בדרך כלל הפרדה מופחתת בין מצבים, שונות בספירת התאים בין בארות, מוות גבוה של תאי מטרה בבארות ביקורת, צביעת CFSE חלשה או דגרנולציה גבוהה ברקע. תוצאות אלו עשויות לנבוע מחיוניות לקויה של תאי היעד, התאוששות לא עקבית של תאי NK, ערבוב לא מספק או שונות בצביעה ורכישה. מכיוון שהבדיקה מזהה באופן עצמאי את תחומי המטרה והאפקטורים, ניתן להרחיב אותה לכלול פנוטיפינג נוסף של תאי המטרה (למשל, צפיפות אנטיגן או ביטוי ליגנד) ואפיון רחב יותר של תאי NK. הכללת תנאי "NK בלבד" יכולה לכמת עוד יותר את דה-גרנולציה בסיסית ואת הקיימות בתאי NK. עיצוב רב-פרמטרי זה הוא יתרון מרכזי, המאפשר לפרש ציטוטוקסיות פונקציונלית לצד פנוטיפים חיסוניים מכניים.

איור משלים 1. פריסת הלוחות הייצוגיים ותהליך הניתוח לבדיקת ציטוטוקסיות בהדמיית תאים חיים. (א) פריסת לוחות 96 בארות מייצגת עבור בדיקת ההרג של תאי צפון קוריאליה הצפון-קרופוליסטית. ארבעה תנאי תאי אפקטור מסודרים ברבעים, שכל אחד מהם נבחן ביחס E:T של 0:1 (ביקורת מטרה בלבד), 0.25:1, 0.5:1, 1:1 ו-2:1, כאשר כל מצב מבוצע בשלוש כפילויות (סה"כ 60 בארות בדיקה). (B) תצורה מייצגת של ניתוח תא-אחר-תא לא דבק בתוכנת IncuCyte 2021C, המדגימה פרמטרים של פירוק, סגמנטציה והסתרה ספקטרלית המשמשים לזיהוי תאי אפקטור ומטרה בודדים תוך הרחקת פסולת ואגרגטים. (ג) אסטרטגיית סיווג ייצוגית תא-תא באמצעות פלואורסצנציה כתומה של NIR לעומת SYTOX להגדרת אוכלוסיית תאי המטרה החיה. בארות יעד בלבד ובארות קו-קולטורה בנקודת זמן לדוגמה (t = 4 שעות) משמשות לאישור הפרדה בין אוכלוסיות תאים חיים ומתים. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 2. פריסת לוחות ייצוגיים לבדיקת ADCC מבוססת ציטומטריית זרימה. פריסת לוחות 96 בארות מייצגת הממחישה חמישה מצבים ניסיוניים עם ציפוי משולש לאורך שורות B–D ועמודות 2–6 (בארות בדיקה כוללות = 15): (1) ביקורת מטרה בלבד, (2) תאי מטרה עם דראטומומאב, (3) תאי מטרה עם תאי NK, (4) תאי מטרה עם תאי NK ודראטומומאב, ו-(5) תאים עם תאי NK ונוגדן בקרה איזוטיפי. תאי היעד צופו ב-2.5 ×-10^תאים בבאר, ותאי NK נוספו ב-1.25 ×-10⁴ תאים לבאר כדי להשיג יחס E:T של 0.5:1. נוגדנים שימשו בריכוז סופי של 25 מיקרוגרם/מ"ל. הבארות הסובבות מולאו ב-PBS כדי למזער את האידוי. תנאי המטרה בלבד שימש לנרמול הישרדות תאי המטרה, ובקרת האיזוטיפ לקחה בחשבון את השפעות נוסחת הנוגדנים ללא תלות בספציפיות האנטיגן. אופטימיזציה של יחס E:T עשויה להידרש בהתאם לרגישות קו התאים היעד. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

פרוטוקולים אלו מספקים שתי גישות משלימות לכימות ציטוטוקסיות של תאי NK בפורמט סטנדרטי של לוח 96 בארות. שלב 1 עושה שימוש בהדמיה בזמן אמת של תאים חיים כדי לנטר באופן רציף אובדן תאי מטרה, והוא מתאים להערכת הקינטיקה של הריגות טבעיות ומתווכות CAR ביחס E:T מרובה. שלב 2 משתמש בציטומטריית זרימה לכימות ADCC לאחר תקופת קו-אינקובציה מוגדרת, תוך הפרדת מדורי המטרה והאפקטור לניתוח פנוטיפי¹⁷. שיטות אלו, המוצגות כפלטפורמות בדיקה משלימות שיכולות לשמש למידול תהליכים ביולוגיים שונים, הן גם ניתנות להחלפה בקלות. תאי NK אנושיים ראשוניים יכולים לשמש לבדיקות ADCC מבוססות הדמיה של תאים חיים, וניתן גם להנדסה להריגה בתיווך CAR בבדיקות ציטומטריית זרימה. יתרה מזאת, למרות שתאי NK-92 מסוג פראי חסרים את הביטוי^{CD16 18}, הכנסת CD16 (למשל, באמצעות טרנסדוקציה לנטיויראלית) מאפשרת לתאי NK-92 לתווך ADCC עוצמתי. לכן, ניתן להתאים את שני המבחנים לצרכים מדעיים ותרגומיים אישיים.

ישנם מספר שלבים החשובים במיוחד לשחזוריות בשני המבחנים. שינויים קטנים במספר תאי האפקטור ובפנוטיפ יכולים לשנות באופן דרסטי את הישרדות תאי היעד. ספירת תאים מדויקת והשעיה מחדש יסודית במהלך הציפוי חיוניים למזעור סטיות בספירת התאים וערבוב לא מלא. באופן דומה, יש לשמור על הכנת התאים עקבית בין ניסויים, כולל כדאיות, זמן התאוששות וחשיפה קודמת לציטוקין, כדי להבטיח תפקוד אפקטור אחיד. גאומטריית הלוחות היא גורם מרכזי נוסף לביצועי הבדיקה. בתהליך הדמיה של תאים חיים, פלטות מצופות תחתית שטוחות תומכות ברכישת תמונה יציבה ובניתוח שדה עקבי, בעוד שבזרימת העבודה של ציטומטריית זרימה, לוחות תחתית עגולים מעודדים מגע בין תא לתא ומסייעים בהתאוששות של קו-תרביות לא דבקות בנקודת הקצה. בנוסף, יש לאמת את איכות הסימון הפלואורסצנטי לפני הבדיקה, שכן הבחנה לקויה בין תאי מטרה באמצעות הדמיה או הפרדה חלשה של CFSE באמצעות ציטומטריית זרימה יפגעו בכימות ובפרשנות.

שני זרימות העבודה הללו מציגות שיקולים טכניים נפרדים. במבחן הדמיה של תאים חיים, גורמים נפוצים לאיכות נתונים ירודה כוללים ציפוי תאים לא אחיד, התקבצות תאים צפופות או גושים, וספי ניתוח תמונה לא אופטימליים, שכולם ניתנים לתיקון בקלות. בעיות אלו עלולות לעוות את ספירת התאים ולגרום למעקב לא עקבי לאורך זמן. בבדיקה מבוססת ציטומטריית זרימה, תוצאות לא אופטימליות נגרמות לרוב על ידי מוות גבוה של תאי המטרה ברקע, הפרדה חלשה בין אוכלוסיית המטרה לאפקטור, צביעת נוגדנים לקויה, או פיפטינג לא עקבי בין בארות השכפול. מכיוון שבדיקות אלו מיועדות לניתוח השוואתי, הכללת בקרות פנימיות מתאימות חיונית לפרשנות, כולל בקרות מטרה בלבד לנרמול וביקורות שליליות תואמות למצבים ספציפיים לנוגדנים או CAR.

יש לקחת בחשבון מספר מגבלות משותפות וספציפיות לבדיקה בשיטות אלו. מבחן ההדמיה של תאים חיים מספק רזולוציה זמנית אך תלוי בפרמטרים מדויקים של תיוג פלואורסצנטי וניתוח תמונה, ששניהם עשויים להיות מושפעים מאשכול תאים, חפיפה ספקטרלית או שינויים במורפולוגיה במהלך קו-קולטורה¹⁵. במקרים מסוימים, במיוחד כאשר מבחנים כוללים תאי אפקטור ראשוניים, השגת סימון פלואורסצנטי מתאים מבלי לשנות את דינמיקת ההרג היא קשה או בלתי אפשרית. הבדיקה המבוססת על ציטומטריית זרימה מספקת רזולוציה פנוטיפית גבוהה יותר בנקודת קצה מוגדרת, אך אינה מבחינה עצמאית בין הרג מוקדם למאוחר אלא אם נאספות מספר נקודות זמן תואמות, מה שיכול להיות יקר וגוזל זמן¹⁷. בנוסף, מדידות נקודת קצה עשויות לשקף לא רק מוות תאי מטרה אלא גם הבדלים בהתרבות תאי המטרה, שחיקת האפקטורים או התאוששות במהלך טיפול בדגימה. קריאות מכניות כמו CD107a מפורשות בצורה הטובה ביותר כאינדיקטורים משלימים להפעלת תאי אפקטור, ולא כתחליף ישיר להסרת תא המטרה¹⁹. באופן רחב יותר, אף אחת מהפלטפורמות אינה משחזרת במלואה את הארכיטקטורה המרחבית, אינטראקציות סטרומליות, גרדיאנטים של ציטוקינים או מגבלות תנועה שמעצבות את תפקוד תאי ה-NK ב-vivo.

יש לקחת בחשבון גם מספר גורמים ביולוגיים בעת פירוש מבחני הרג תאי NK. שונות בין תורם היא חלק מהותי בניסויים בתאי NK ראשוניים בבני אדם, אשר שונים בפוטנציאל הציטוטוקסי ובהרכב תת-הקבוצה בשל גיל התורם, מין, היסטוריה של מחלות זיהומיות ופולימורפיזמים של קולטנים²⁰. השימוש בתאי NK-92 מפחית מאוד את השיוון, אך תאים אלו עדיין יכולים להראות שינויים הקשורים למקור ולמעבר¹⁸. הפרוטוקול שלנו מפחית הבדלים טכניים או ניסיוניים באמצעות פרמטרים סטנדרטיים והשוואות לאותו פלטה, כדי להעריך בצורה מדויקת יותר את הגורמים הביולוגיים הללו. כאשר אפשר, אנו ממליצים להשתמש בטווחי מעבר מוגדרים של NK-92 עם ספי כדאיות קבועים. לתאי NK ראשוניים, בדיקות צריכות להשתמש בתאי NK ממספר תורמים לכל מצב, כאשר ניתוחים סטטיסטיים מתחשבים בשונות בין תורם (למשל, מודלים של השפעות זוגיות או מעורבות), בהתחשב בכך שהבדלים יחסיים בין מצבים נשמרים בדרך כלל בין תורמים. יתרה מזאת, ניתן לשלב סמנים נוספים לתאי NK (למשל, KIRs, NKG2A/C/D ו-CD57) בפאנלים של נוגדנים המשמשים לציטומטריית זרימה, כדי להשוואת תדירויות תת-קבוצות בין תורמים ולהערכת הפעלה של תאי NK ספציפיים לתת-קבוצה (כלומר, ביטוי CD107a ו-CD69), מה שמקל עוד יותר על פרשנות התוצאות. לבסוף, עבור כל מבחני הריגת תאי NK, יש לקחת בחשבון תרחישים נוספים מסוימים. ביטוי אנטיגנים ממוקדים על תאי NK, בין אם בביטוי אנדוגני או ברכישת אנטיגנים מתאי המטרה באמצעות טרוגוציטוזה, עלול לגרום לרצח אחים של תאי NK ולתוצאות מבלבלות. לדוגמה, דראטומומאב יכול לכוון ל-CD38 המובע על תאי NK ולגרום ל-Fratricide²¹, מה שמגביל את גודל ה-ADCC מול היעדים המיועדים. למרבה המזל, בדיקות דימות תאים חיים וציטומטריית זרימה מאפשרות כימות של תאי NK להערכת רצח אחים.

למרות מגבלות אלו, השימוש המשולב בהדמיית תאים חיים וציטומטריית זרימה מספק מסגרת מעשית לבדיקות תפקודיות ניתנות לשחזור של תאי NK במגוון יישומים בסיסיים ופרה-קליניים. תהליך הדמיה מועיל כאשר התנהגות זמנית חשובה, כמו הבחנה בין תגובות מהירות לתגובות ציטוטוקסיות מאוחרות או השוואת קינטיקה של הרג בין עיצובים של CAR²². זרימת העבודה המבוססת על ציטומטריית זרימה היא יתרון כאשר יש לפרש קריאות פונקציונליות לצד פנוטיפים של תאי אפקטור ותאי מטרה באותו מדגם. יחד, גישות אלו מאפשרות הערכה כמותית של הרג טבעי, ציטוטוקסיות בתיווך CAR, ו-ADCC באמצעות פלטפורמות ניסוי נגישות באופן נרחב. על ידי הקמת מסגרת סטנדרטית וניתנת להרחבה, מערכת זו מאפשרת בשוואות ביצועים קפדניות וחקירה מכנית בין מודאליות מבוססות תאי NK, ומאיצה את פיתוח ותרגום קליני של אימונותרפיות מהדור הבא.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Advanced RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	12633020	Basal medium for NK-92 and primary human NK-cell culture media (see protocol for complete formulation)
Anti-human CD107a antibody, PE-Cy7 conjugated (clone H4A3)	BioLegend	328618	Degranulation marker for flow cytometry
Anti-human CD16 antibody, BV785 conjugated (clone 3G8)	BioLegend	302046	Flow cytometry
Anti-human CD56 antibody, BV421 conjugated (clone HCD56)	BioLegend	318328	Flow cytometry
Benchtop centrifuge with swinging bucket rotor compatible with 15-mL tubes and 96-well plates (Eppendorf Centrifuge 5810R)	Eppendorf	5811000015	Used for cell pelleting and plate centrifugation (100–300 × g)
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	Thermo Fisher Scientific	C34554	Cell proliferation dye for target-cell labeling
Cytek Aurora spectral flow cytometer (or equivalent)	Cytek Biosciences	N7-00003	Used for flow cytometry acquisition and analysis
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	BioLegend	422801	Nuclear stain for live/dead discrimination
Deep-well 96-well plate	USA Scientific	1896-2110	Used for antibody preparation
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100	Cryopreservation reagent
Fetal bovine serum (FBS)	Avantor	76419-584	Basal media supplementation; used in FACS buffer (2% FBS)
General Purpose Water Bath, 10 L (37 °C)	PolyScience	WBE10	For cell thawing
GlutaMAX (L-alanyl-L-glutamine supplement)	Thermo Fisher Scientific	35050061	Stable glutamine source
Human AB serum	Sigma-Aldrich	H4522-100ML	Supplement for primary human NK-cell culture media
IncuCyte SX5 live-cell imaging system	Sartorius	4816	Real-time live-cell imaging and Cell-by-Cell analysis
LUNA-FL dual fluorescence cell counter (or equivalent)	Logos Biosystems	L20001	Automated cell counting
Parafilm M (4 in × 250 ft roll)	Genesee	16-101	Plate sealing and storage
Phosphate-buffered saline (PBS), sterile (pH 7.2–7.4)	Corning	21-020-CV	Used for washes and FACS buffer preparation
Poly-D-lysine (0.1 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	A3890401	Plate coating reagent
Primocin	InvivoGen	ant-pm-2	Antibiotic
Recombinant human interleukin-2 (IL-2)	R&D Systems	202-IL-500	Cytokine
RosetteSep Human NK-cell enrichment kit	STEMCELL Technologies	15065	Human NK-cell enrichment cocktail
SYTOX Orange dead cell stain	Thermo Fisher Scientific	S34861	Viability dye for live-cell imaging
Trypan Blue 0.4%	Gibco	15250-061	Viability dye for cell counting
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604039	For adherent cell detachment
UltraPure EDTA (0.5 M, pH 8.0)	Thermo Fisher Scientific	15575020	Used for FACS buffer preparation
15-mL conical-bottom centrifuge tubes	Corning	352097	Sterile
24-well tissue culture plate (tissue culture–treated)	Corning	3524	Used for NK-cell recovery
96-well clear round-bottom plate (tissue culture–treated)	Corning	3799	Used for co-culture and flow cytometry assays
96-well flat clear-bottom black polystyrene plate (tissue culture–treated)	Corning	3603	Compatible with live-cell imaging systems