מאמר שיטה

ייצור הידרוג'לים פוליאקרילאמידיים ניתנים לכיוונון לחקר השפעות קשיחות מטריצה על תאי גזע ליידיג

DOI:

10.3791/71387

⸱

5 ביוני 2026

 ,  ,  ,  , 
1Scientific Research Center, The Seventh Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 2School of Medicine, Shenzhen Campus of Sun Yat-sen University, 3Department of Urology, The Sixth Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, 4Center for Stem Cell Biology and Tissue Engineering, Key Laboratory for Stem Cells and Tissue Engineering, Sun Yat-sen University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את ייצור הידרוג'לים פוליאקרילאמידיים עם קשיחות ניתנת לכיוון כדי לחקור את השפעות מכניקת המטריצות על התנהגות תאי ליידיג גזע במערכת תרבית דו-ממדית מבוקרת.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוקשות במטריקס חוץ-תאית (ECM) מווסתת באופן קריטי את התנהגות תאי הגזע. בעבר הראינו כי עלייה פתולוגית בנוקשות המטריקס במהלך ההזדקנות משביעה על ההומאוסטזיס של תאי הגזע Leydig (SLC), מה שמוביל לירידה בטסטוסטרון. בהתבסס על תגלית זו, אנו מציגים כאן פרוטוקול מפורט—שפותח במקור במעבדתנו—לייצור הידרוג'לים פוליאקרילאמידיים (PA) עם קשיחות ניתנת לכוונון כדי למודל את מיקרו-סביבת האשכים במבחנה. שיטה זו מאפשרת יציקה חוזרת של ג'לים בטווח קשיחות של 1–100 קילופסקל, המכסה תנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. השלבים המרכזיים כוללים ערבוב מדויק של אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד, איזון נפיחות ג'ל, הפעלת פני השטח עם סולפו-SANPAH, וציפוי קולגן לתמיכה בהידבקות ובתרבית של SLC. אנו מספקים נוסחאות אופטימליות לקשיחות מטרה והנחיות לפתרון תקלות לבעיות נפוצות כמו פולימריזציה לא שלמה וחיבור תאים לקויה. מערכת זו מאפשרת חקירה שיטתית של האופן שבו קשיחות הסובסטרט מווסת התפשטות, התמיינות ותפקוד סטרואידוגני של SLC בתנאים דו-ממדיים מוגדרים. מעבר לביולוגיה רבייתית, היא משמשת גם פלטפורמה חשובה למחקרים מכנוביולוגיים בסוגי תאים אחרים ולסקר טיפולים המתמקדים בתפקוד לקוי הקשור לנוקשות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התכונות המכאניות של המטריצה החוץ-תאית (ECM) ממלאות תפקיד מרכזי בוויסות גורל תאי הגזע, כולל התפשטות, התמיינות ותחזוקה פונקציונלית 1,2,3,4. באשך, הידוק ECM הקשור לגיל נחשב לירידה בייצור הטסטוסטרון. עם זאת, המנגנונים המכנוביולוגיים הבסיסיים עדיין אינם מובנים היטב, בין היתר בשל היעדר מודלים סטנדרטיים במבחנה שמסכמים בנאמנות את טווח הנוקשות הפיזיולוגית של נישת האשכים. הנוקשות הפיזיולוגית של רקמת אשכים צעירה בעכבר היא כ-1–15 קילופסקל, בעוד שרקמה מיושנת או פיברוטית יכולה להגיע ל-20–30 קילופסקל ומעלה.

הידרוגלים פוליאקרילאמיד (PA) הפכו לפלטפורמה רב-שימושית לחקר אינטראקציות בין תאים-מטריצות, משום שניתן לכוון בדיוק את קשיחותם על ידי שינוי היחס בין אקרילמיד לביס-אקרילמיד 5,6. בהשוואה למצעות אחרות כמו זכוכית מצופה קולגן או הידרוג'לים מסחריים, ג'לי PA מציעים שליטה עצמאית על הקשיחות וצפיפות הליגנדים הביוכימית, ומאפשרים ניתוח שיטתי של רמזים מכניים. למרות שקיימים מספר פרוטוקולים לייצור ג'ל PA 7,8,9, לעיתים קרובות חסרים להם אופטימיזציה מפורטת לסוגי תאים מסוימים, במיוחד לתאים ראשוניים נדירים כמו SLCs.

כאן אנו מציגים פרוטוקול עמיד וניתן לשחזור להכנת הידרוג'לים PA עם קשיחות מוגדרת (1–100 קילופסקל) המותאם לגידול SLCs של עכברים. השיטה כוללת הוראות שלב אחר שלב ליציקת ג'ל, איזון נפיחות, פונקציונליזציה של פני השטח באמצעות סולפו-SANPAH, וציפוי קולגן לקידום היצמדות התא. על ידי ביצוע פרוטוקול זה, חוקרים יכולים ליצור מצעים בעלי קשיחות ניתנת לכיוון (הנעה בין 1 ל-100 קילופסקל) המדמים את הסביבה המכאנית של אשכים צעירים (רכים) ומבוגרים (נוקשים), ומאפשרים חקירה כמותית של תגובות SLC התלויות בקשיחות. המערכת גם מותאמת לסוגי תאים רגישים למכאניים אחרים ומספקת פלטפורמה לסקר סמים המתמקד בפתולוגיות הקשורות לנוקשות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים לבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית של אוניברסיטת סון יאט-סן (אישור מס' SYSU-IACUC-2026-B1278) ובוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות.

1. בידוד ותרבות של SLCs ראשוניים בעכברים

  1. נתח אשכים מעכברי C57BL/6 והסר בזהירות את הטוניקה אלבוגינאה.
  2. חתוך את האשכים לחתיכות קטנות.
  3. הפרדת תאים אינטרסטיציאליים מצינורות זרעיים על ידי דגירה ב-1 מ"ג/מ"ל קולגנאז מסוג IV ב-DMEM/F12 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  4. הוסף DMEM/F12 המכיל 10% סרום בקר עוברי כדי לעצור פעילות קולגנאז.
  5. צנטריפוגה ב-1500 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. החזירו את הכדור ל-PBS וסיננו דרך פילטר של 70 מיקרון.
  7. העשרת תאי CD51⁺ באמצעות מיון תאים מופעל-פלואורסצנציה (FACS) באמצעות מיין תאי הזרם.
  8. זרעו את התאים המועשרים במדיום תרבית SLC המורכב מ-DMEM/F12 בהשלמה: 1 ננומטר דקסמתזון, 1 ng/mL LIF, 5 מיקרוגרם/ליטר אינסולין-טרנספרין-סודיום סלניט, 5% תמצית עובר עוף, 0.1 מ"מ β-מרקפטואנול, 1% חומצות אמינו לא חיוניות, 1% N2, 2% B27, פקטור גדילה בסיסי של 20 ng/mL, גורם גדילה אפידרמלי, גורם גדילה שמקורו בטסיות, ואונקוסטטין M.
  9. גידול ה-SLCs בתנאים סטנדרטיים (37°C, 5% CO₂) עד שיגיעו לצפיפות הרצויה לזריעה על הידרוגלים.

2. הרכבת מיכל הזכוכית ליציקת ג'ל

  1. בדקו ונקו בקפידה את לוחות הזכוכית והמרווחים המיוחדים המשמשים ליציקת ג'לים אלקטרופורזה פוליאקרילאמידית (PAGE), ווודאו שהם נקיים מאבק, נזק ושאריות.
  2. הרכיבו נכון את לוחות הזכוכית, המרווחים והמהדקים לפי הוראות היצרן, תוך הבטחת אטום היטב למניעת דליפה במהלך יציקת הג'ל.
  3. הנח את המיכל הזכוכית המורכב היטב על מעמד מעבדה, מוכן ליציקה.
    הערה: מערכת היציקה משתמשת בלוחות זכוכית Western Blot סטנדרטיים (sodium dodecyl sulfate [SDS]-PAGE) עם מרווחים קבועים בעובי של 1.0 מ"מ, מה שמבטיח עובי ג'ל שניתן לשחזר ומשטח שטוח לתרבית תאים.

3. הכנת תמיסת תערובת ג'ל PAGE

  1. מדדו במדויק את התגובות הבאות לפי העיצוב הניסויי (ראו טבלה 1) לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי בנפח 15 מ"ל או 50 מ"ל: תמיסת מלאי אקרילאמיד 40%, תמיסת ביס-אקרילאמיד 2%, בופר HEPES 1M (pH 8.5), סטרילי ddH₂O.
    אזהרה: אקרילאמיד וביס-אקרילאמיד הם נוירוטוקסינים. תמיד יש ללבוש כפפות ומסכת אבק בעת שקילת אבקה יבשה כדי למנוע מגע עור ושאיפת חלקיקים באוויר. יש לבצע את ההליכים בתוך מכסה אדים.

4. הוספת יוזם וזרז, ויציקת הג'ל

  1. הוסיפו את החומר הבא לתמיסה המעורבת ברצף: 10% אמוניום פרסולפט (APS): משמש כיוזם להתחלת תגובת הפולימריזציה. N,N,N',N'-טטרמתילתילנדיאמין (TEMED): משמש כזרז להאצת תגובת הפולימריזציה. לנפח ג'ל כולל של 6 מ"ל, יש להוסיף 60 מיקרוליטר של 10% APS ו-6 מיקרוליטר של TEMED (ראו טבלה 1 לסקיילינג).
    הערה: תגובת הפולימריזציה מתחילה מיד לאחר הוספת TEMED; לכן, יש לבצע את השלבים הבאים במהירות.

5. שפיכת התמיסה המעורבת

  1. מיד שפכו פיפטה או שפכו את התמיסה המעורבת בעקביות לאורך קצה אחד של המיכל הזכוכית כדי למנוע יצירת בועות.

6. לאפשר לג'ל לפולימר

  1. תן למיכל הג'ל היצוק לעמוד ללא הפרעה בטמפרטורת החדר.
    הערה: הפולימריזציה בדרך כלל נמשכת 15–30 דקות בטמפרטורת החדר (20–25 מעלות צלזיוס).
  2. המשיכו לשלב הבא לאחר שניתן לראות ממשק ברור בין תערובת הג'ל הלא פולימריזציה לג'ל הפולימריז, והג'ל מוצק לחלוטין (הג'ל אינו זורם כאשר המיכל מוטה).
  3. מיד לאחר היציקה, מניחים בזהירות שכבה דקה של אתנול מוחלט (או אתנול רווי מים) מעל תערובת הג'ל כדי למנוע חמצן אטמוספרי, שמעכב פולימריזציה רדיקלית. האתנול גם מסייע ליצירת משטח עליון שטוח.
  4. לאחר הפולימריזציה, יש להסיר את האתנול לפני פירוק הלוחות.

7. פירוק המיכל וקצירת הג'ל

  1. פירקו בזהירות את המהדקים והשתמשו בטריז או מרית פלסטיק כדי לפרק בעדינות את לוחות הזכוכית, כך שהג'ל הפולימרי PAGE יישאר שלם על צלחת אחת.
  2. הכינו מנה לתרבית המכילה כמות מספקת של PBS סטרילי.
  3. קילפו בזהירות את הג'ל מהצלחת הזכוכית בעזרת מרית או יד עם כפפה, ותנו לו להחליק בצורה חלקה לתוך ה-PBS.
  4. אטום את הצלחת המכילה את הג'ל ב-PBS ודוגר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
    הערה: שלב זה הוא קריטי. הג'ל החדש מיובש וחייב לספוג מים במלואו ולהתנפח למידותיו הסופיות ב-PBS. אם מדלגים על שלב זה והג'ל נחתך ישירות, הוא ימשיך להתרחב במדיה של תרבית התאים הבאה, ככל הנראה יעבור את שטח התרבית ויהפוך אותו לבלתי שמיש. עובי הג'ל אחרי הנפיחות הוא 1 מ"מ. זה קריטי כי כאשר עובי הג'ל יורד מתחת ל-100 מיקרון, התאים עלולים לחוש את הקשיחות של לוח התרבית הקשיח שמתחת, מה שיפריע למדידות המכנוביולוגיות המיועדות.

8. חיתוך והעברת הג'ל לפלטת תרבית

  1. למחרת, קחו את הג'ל מ-4 מעלות צלזיוס. באמצעות חור ביופסיה סטרילי או חותך להב (בקוטר התואם לגודל הבאר של לוח התרבית, לדוגמה, לוח עם 6 בארות), חותך את הג'ל בתנאים סטריליים.
  2. בתוך ארון בטיחות ביולוגית, השתמשו במלקחיים סטריליים כדי להרים בעדינות את דיסק הג'ל החתוך ולהניח אותו במרכז באר תרבית ריקה וסטרילית.

9. שטיפה ראשונית והקרנת UV

  1. הוסיפו מספיק PBS סטרילי לבאר המכילה את הג'ל, כדי להבטיח שהוא יהיה שקוע לחלוטין.
  2. נענע בעדינות את צלחת התרבות כדי לשטוף את פני הג'ל.
  3. שאפו את ה-PBS באמצעות פיפטה.
  4. חזור על תהליך הכביסה הזה שוב, לסך הכל שתי שטיפות שכל אחת נמשכת 3 דקות.
  5. אחרי הכביסה, הוסיפו מספיק PBS סטרילי כדי לכסות את הג'ל שוב. הניחו את כל צלחת התרביות עם המכסה מעט פתוח מתחת למנורת UV (בתוך ארון בטיחות ביולוגית או קרוסלינקר UV ייעודי) והקרינו במשך שעה לעיקור בסיסי.

10. הפעלה של מקשר צולב סולפו-סנפה

  1. בתוך ארון הבטיחות הביולוגית, שואב בזהירות את ה-PBS מהבאר.
  2. לפני השאיפה, הפרדו בעדינות את הג'ל מדפנות ותחתית הבאר באמצעות קצה פיפטה כדי למנוע נזק לג'ל עקב מתיחות פנים נוזלית.
  3. העבר את הג'ל לבאר נקייה אחרת באותו פלטה עם מלקחיים סטריליים.
    הערה: בעת העברת הג'ל, תחילה הוספת כמות קטנה של PBS לבאר הנקייה יכולה לעזור להוציא בועות אוויר הכלואות בין תחתית הבאר לג'ל בעת ההנחה, ומשמשת גם כשטיפה נוספת.
  4. הכנת תמיסת עבודה באמצעות קרוסלינקר: הכינו טרי תמיסת עבודה של 0.2 מ"ג/מ"ל סולפו-SANPAH על ידי דילול תמיסת המלאי (ראו טבלה 1) באמצעות מים סטריליים או בופר מומלץ (למשל, PBS).
    הערה: הגן על התמיסה מפני אור.
  5. הוסיפו מספיק תמיסת עבודה של סולפו-SANPAH לכיסוי הג'ל (למשל, 250 מיקרוליטר לפלטה עם 12 בארות, 500 מיקרוליטר לפלטת 6 בארות), כדי להבטיח שהג'ל מכוסה לחלוטין.
  6. הניחו את הלוח תחתאור UV 2 של 365 ננומטר / 120 mJ/cm וקרינו למשך שעה.
    הערה: שלב זה מפעיל את Sulfo-SANPAH, ומאפשר לו להיקשר לקבוצות פונקציונליות על פני הג'ל.

11. הפעלת Crosslinker ושטיפות סופיות

  1. לאחר ההקרנה, שואב את תמיסת Sulfo-SANPAH מהבאר שבתוך ארון הבטיחות הביולוגית.
  2. הוסיפו מספיק PBS סטרילי לבאר, נענעו בעדינות כדי לשטוף את פני הג'ל, ושאבו את ה-PBS.
  3. חזור על תהליך הכביסה הזה שוב, לסך הכל שתי שטיפות שנמשכות 3 דקות, כדי להסיר לחלוטין כל סולפו-סנפה שלא הגיב.

12. הכנת פתרון קולגן מסוג I לזנב עכברוש

  1. השתמש בתמיסת חומצה אצטית של 0.02 מטר כממס כדי לדלל את תמיסת הקולגן מסוג I של זנב העכברוש.
  2. כוונו את ריכוז התמיסה הסופית ל-60–100 מיקרוגרם/מ"ל. לדוגמה, אם ריכוז מלאי הקולגן הוא 4 מ"ג/מ"ל, מוסיפים 15–25 מיקרוליטר של מלאי ל-985–975 מיקרוליטר של 0.02 מ' חומצה אצטית כדי לקבל 1 מ"ל תמיסה עובדת.

13. ציפוי קולגן ודגירה

  1. הוסף את נפח תמיסת הקולגן המתאימה לכל באר המכילה את הג'ל המופעל בהתאם לסוג הצלחת: הוסף 2 מ"ל לפלטה עם 6 בארות, או 1 מ"ל לפלטה עם 12 בארות.
  2. סובבו בעדינות את צלחת התרבית כדי לוודא שתמיסת הקולגן מכסה באופן שווה את הג'ל ואת תחתית הבאר.
  3. כסו את הפלטה ודגרו במשך הלילה באינקובטור עם טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ כדי לאפשר לקולגן להתייצב על פני הג'ל באמצעות קישור צולב Sulfo-SANPAH.

14. הקרנת UV משנית וקיבוע

  1. למחרת, הסר את הפלטה והקרינה שוב תחת אור UV של כ-120 mJ/cm2 למשך שעה.

15. הסרת קולגן ותאי זרע לא קשורים

  1. בתוך ארון הבטיחות הביולוגית, שאפו בזהירות את תמיסת הקולגן מסוג עכברוש מסוג I מהבארות.
  2. הוסיפו PBS סטרילי לבארות, נענעו בעדינות כדי לשטוף את פני הג'ל, ושאבו את ה-PBS.
  3. חזור על השטיפה שוב, לסך הכל שתי שטיחות, כל אחת נמשכת 3 דקות.
  4. לאחר הכביסה, מטריצת הג'ל מוכנה. החזירו את תאי הגזע Leydig המוכנים לתוך כל תווך תרבית ה-SLC (ההרכב מפורט בשלב 1).
  5. זרע את תליית התא ישירות על פני הג'ל. צפיפות הזריעה המומלצת היא 2 × 104 תאים לס"מ 2 (למשל, כ-2 ×10 5 תאים לכל באר עבור צלחת 6 בארות סטנדרטית).
  6. דגרו את לוחות הגידול בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח של 5% CO₂.
  7. כדי לשמור על חיוניות תאים אופטימליים ותפקוד סטרואידוגני, החליפו את מדיום התרבית כל 48 שעות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביצוע מוצלח של פרוטוקול זה מניב הידרוג'לים פוליאקרילאמידיים עם קשיחות מוגדרת (הנעה בין 1 ל-100 קילופסקל) שנשארים מחוברים היטב ללוח התרבית ותומכים בהיצמדות והתפשטות SLC חזקה. איור 1 מספק סקירה סכמטית של כל תהליך העבודה, מיציקת ג'ל ועד זריעת תאים, ומאפשר למשתמשים להמחיש את השלבים המרכזיים של הפרוטוקול.

אימות מכני של הידרוג'לים פוליאקרילאמידיים (קשיחות מטרה: 1, 5, 15, 30, 50 ו-100 קילופסקל) בוצע באמצעות ריאומטריה אוסצילטורית (גאומטרי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התכונות המכאניות של המטריצה החוץ-תאית ממלאות תפקיד יסודי בוויסות התנהגות תאי הגזע, אך הכלים לחקור השפעות אלו באופן שיטתי בתאי רבייה נותרו מוגבלים. העבודה הקודמת שלנו הראתה כי הידוק מטריצת הגזע במהלך ההזדקנות מפריע להומאוסטזיס של תאי הגזע של Leydig (SLC) דרך ציר Piezo1/ROS/Gli1, מה שמוביל לירידה בטסטוסטרון10. בהתבסס על תגלית זו, פיתחנו את פרוטוקול ההידרוג'ל הפוליאקרילאמידי הזה כדי לספק פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשחזור לחקירת האופן שבו קשיחות הסובסטרט מווסת ישירות את...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המימון לפרויקט זה ניתן על ידי תוכנית המחקר והפיתוח המרכזית הלאומית של תאי גזע ומחקר תרגומי של סין (2021YFA1100601), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82371608), קרן המחקר הבסיסי והיישומי של גואנגדונג (2023B1515020016), ותוכנית המחקר הבסיסי של שנזן (JCYJ20240813150417024, JCYJ20240813150422030).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצה אצטיתסיגמא-אלדריץ'Cat#A6283מדלל לקולגן זנב עכברוש (0.02 מ')
Acryiamide     סאנגון ביוטקCat#A100341-0500מונומר להכנת ג'ל פוליאקרילאמיד
אמוניום פרסולפט (APS) סאנגון ביוטקCat#A100486-0100יוזם לפולימריזציה של ג'ל
תוספת B27Invitrogenחתול#A1486701תוסף מוגדר מועשר בנוגדי חמצון והורמונים; תומך בהישרדות תאי עצב ותאי גזע (2% V/V)
גורם גדילה בסיסי של פיברובלסטים (bFGF)InvitrogenCat#13256029גורם גדילה מיטוגנטי; מקדם התרבות וגזע SLC (20 ng/mL)
ביס-אקרילאמיד שנגחאי יואניה ביוטכנולוגיהCat#S14002קרוסלינקר לג'לים פוליאקרילאמידיים
תמצית עובר עוףUS BiologicalsCat#C3999מקור עשיר לגורמי גדילה וחומרים מזינים; תומכת בצמיחה ובכדאיות SLC (5% v/v)
קולגן, סוג I, מזנב עכברושיסןCat#40125ES50מצפה את משטח ההידרוג'ל הפוליאקרילמידי המופעל על ידי Sulfo-SANPAH לקידום היצמדות ותרבית של SLC.
קולגנאז סוג IVגיבקוקטגור#17104-0191 מ"ג/מ"ל ב-DMEM/F12 לעיכול רקמת אשכים
CYP11A1 נוגדןג'נטקסCat#GTX56293ל-Western Bluting
דקסמתזוןסיגמא-אלדריץ'Cat#D1756אגוניסט קולטני גלוקוקורטיקואידים; תומך בהתפשטות SLC ותחזוקת גבעול (1 ננומטר)
DMEM/F12 בינוניגיבקוחתול#11320033מדיום בסיסי לעיכול, שטיפה ותרבות SLC
גורם גדילה אפידרמלי (EGF)PeproTechCat#AF-100-15מעודד התרבות SLC ושומר על מצב לא מובחן (20 ng/mL)
סרום בקר עוברי (FBS)ויסטקקטגור#SE100-011משתמשים ב-10% כדי לעצור פעילות קולגנאז
פיג'ילא זמיןhttps://imagej.net/Fijiתוכנת ניתוח תמונות
נוגדן GADPHפרויטנטקCat#60004-1-Igל-Western Bluting
אנזימי עיכול ג'ל ביוטכנולוגיה מדויקתCat#GXDLFAתערובת אנזימים לעיכול רקמת אשכים ובידוד SLC
HEPES ציטיבהCat#SH30237.01בופר לשמירה על pH 7.0– 7.4
HSD3 ובטא; נוגדןסנטה קרוזCat#sc-515120ל-Western Bluting
מיין תאי הזרםBDhttps://www.bdbiosciences.com/content/dam/bdb/marketing-documents/BD_Influx_tech_specs.pdf
אינסולין-טרנספרין-סודיום סלניט (ITS)סיגמא-אלדריץ'חתול#11074547001מקדם הישרדות תאים, קליטת גלוקוז והגנה מפני נוגדי חמצון (5 & mu; g/L)
תחליף סרום KnockOut (KSR) גיבקוקטגור#10828-028תחליף סרום למדיום תרבית SLC
LIF (גורם מעכב לוקמיה)מיליפורחתול#LIF1010ציטוקין השומר על פלוריפוטנטיות של תאי גזע והתחדשות עצמית (1 ng/mL)
אשכי עכבריםמאמר זהלא זמיןבודד מעכברים C57BL/6
ערכת ELISA לטסטוסטרון עכברפיין ביוטקCat#40203ES80לכימות טסטוסטרון בסופרנטנטים בתרבות
עכבר: C57BL/6 שנזן טופביוטקלא זמיןזן העכבר המשמש לאיסוף אשכים
עכבר: תאי גזע אשכים (SLCs) מאמר זהלא זמיןתאים ראשוניים מבודדים מאשכי עכבר
תוספת N2InvitrogenCat#17502001תוסף מוגדר ללא סרום התומך בתרביות עצביות ותאי גזע (1% v/v)
חומצות אמינו לא חיוניותהייקלוןCat#SH30050.03מספק מקורות חנקן לסינתזת חלבונים ולמטבוליזם של תאים (1% v/v)
אונקוסטטין M (OSM)PeproTechקטגור#300-10Tציטוקין המעורב בוויסות התמיינות של SLC ובבשלה של תאי Leydig (20 ng/mL)
מלח ממוגן בפוספט (PBS)גיבקוחתול#10010023בופר כביסה ותלייה מחדש
גורם גדילה שמקורו בטסיות (PDGF)PeproTechקטגור#100-14Bתומך בהתרבות תאים, נדידה והישרדות (20 ng/mL)
פריזמה 9.0GraphPadhttps://www.graphpad.com/תוכנה לניתוח סטטיסטי וגרפים
נוגדן StARפרויטנטקCat#67130-1-Igל-Western Bluting
סולפו-סנפה מקליןCat#102568-43-4קרוסלינקר הטרוביפונקציונלי להפעלת פני ג'ל
TEMED פיג'יןCat#PH0341זרז לפולימריזציה
β-מרקפטואנולInvitrogenCat#21985023מפחית לחץ חמצוני ותומך בצמיחת תאים בתרבות (0.1 מ"מ)

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  2. Smith, L. R., Cho, S., Discher, D. E. Stem cell differentiation is regulated by extracellular matrix mechanics. Physiology. 33 (1), 16-25 (2018).
  3. Chaudhuri, O., et al. Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate and activity. Nature Mater. 15 (3), 326-334 (2016).
  4. Nellinger, S., Kluger, P. J. How mechanical and physicochemical material characteristics influence adipose-derived stem cell fate. Int J Mol Sci. 24 (4), 3551(2023).
  5. Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  6. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Curr Protoc Cell Biol. , (2010).
  7. Sanzari, I., et al. Parylene C topographic micropattern as a template for patterning PDMS and polyacrylamide hydrogel. Sci Rep. 7 (1), 5764(2017).
  8. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
  9. Aratyn-Schaus, Y., et al. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. J Vis Exp. 46, e2173(2010).
  10. Huang, J., et al. High matrix stiffness triggers testosterone decline in aging males by disrupting stem Leydig cell pool homeostasis. Cell Rep. 44 (9), 116207(2025).
  11. Syed, S., Karadaghy, A., Zustiak, S. Simple polyacrylamide-based multiwell stiffness assay for the study of stiffness-dependent cell responses. J Vis Exp. 97, e52643(2015).
  12. Zheng, Y. C., et al. Islet transplantation ameliorates diabetes-induced testicular interstitial fibrosis and is associated with inhibition of TGF-β1/Smad2 pathway in a rat model of type 1 diabetes. Mol Med Rep. 23 (5), 376(2021).
  13. Trottmann, M., et al. Shear-wave elastography of the testis in the healthy man - determination of standard values. Clin Hemorheol Microcirc. 62 (3), 273-281 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Extracellular MatrixHydrogel FabricationCollagen CoatingSubstrate StiffnessCell DifferentiationMechanobiologySteroidogenic Function

מאמרים קשורים