כימות ציטומטרי זרימת דם מלאה של טסיות חיוביות בגורם רקמה: תהליך עבודה הרמוני רב-מרכזי

סיכום

כאן, אנו מציגים תהליך עבודה מתואם לכימות ציטומטריית זרימה של טסיות חיוביות בגורמים רקמתיים במחקרים רב-מרכזיים. הפרוטוקול מתאר נהלים סטנדרטיים לאיסוף דם, קיבוע דם מלא, צביעה והרמוניזציה של מכשירים, ומאפשר לבצע ניתוח מקומי או מרכזי, בהתאם ליכולות המעבדה.

תקציר

טסיות ה-Factor Tissue (TF) ^{מייצגות} תת-קבוצה של אוכלוסיית הטסיות. לאחרונה, הוכח כי תת-קבוצה זו חוזה תמותה קרדיודיווסקולרית אצל חולים עם מחלת עורקים כליליים, ובכך היא מבססת ביומרקר שימושי לשכבת סיכון טרומבוטי. כימות מדויק של טסיות^{TF pos} באמצעות ציטומטריית זרימה דורש סטנדרטיזציה קפדנית של טיפול קדם-אנליטי, הליכי צביעה והגדרות מכשירים, במיוחד במחקרים רב-מרכזיים שבהם שונות טכנית עשויה להשפיע על מדידתם. פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה מתואמת להערכת ציטומטריית זרימת דם מלא של טסיות^{TF pos} במחזור הדם, שנועד להבטיח שחזוריות בין מעבדות עם תשתיות טכניות שונות. ההליך כולל איסוף דם סטנדרטי וקיבוע דם מלא לשימור פנוטיפ הטסיות בתוך החיים. שתי שיטות שונות להכנת דגימות מסופקות בהתאם ליכולות המעבדה המקומיות: משלוח דגימות קבועות למעבדת הליבה לצורך צביעה, רכישה וניתוח מרכזיים למרכזים ללא מתקני ציטומטריית זרימה, או צביעה ורכישה מקומית למרכזים המצוידים במכשירי ציטומטריית זרימה ואנשי צוות מיומנים. הערכת אחוז הטסיות^ה-pos-tf מתבצעת על ידי סימון ישיר עם נוגדנים אנטי-TF Star Fluor 488 ו-anti-CD41 PerCP-Cy5.5, כדי לזהות את החלבון היעד ואת סמן אוכלוסיית הטסיות, בהתאמה. הרמוניזציה של ציטומטר זרימה מושגת או באמצעות תבנית רכישה משותפת למודלים זהים של ציטומטר או באמצעות יישור מבוסס חרוזים לפלטפורמות שונות. זרימת העבודה משלבת בנוסף גישת שער סטנדרטית וניתוח נתונים מרכזי כדי לאפשר השוואה אמינה של מדידות^{טו-פלטות מצב} בין אתרים. תוצאות מייצגות הראו שתהליך עבודה זה תומך בכימות שחזורי של טסיות^מצב TF בהגדרות רכישת רב-מרכזיות מאומתות. פרוטוקול זה עשוי להקל על יישום רחב יותר של הערכת^{טסיות TF pos-טסיות} בסטרטיפיקציה בסיכון טרומבוטי ולתמוך בסטנדרטיזציה רחבה יותר של ציטומטריית זרימת טסיות במחקר תרגומי וקליני.

מבוא

פקטור הרקמה (TF) הוא היוזם העיקרי של מפל קרישת הדם וגורם מרכזי ליצירת תרומבין. מעבר לביטוי הקלאסי שלו על ידי תאי תת-אנדותל ולויקוציטים, TF קשור גם לטסיות בסירקולציה 1,2,3,4,5. במהלך טרומבופואזיס, מגהקריוציטים מעבירים TF לתת-קבוצה של טסיות⁶. בתנאים פיזיולוגיים, כ-20–30% מהטסיות המסתובבות מכילות TF המאוחסן בתוך מערכת התעלה הפתוחה, המופרדת מרחבית מפקטור הפלזמה VII⁷. במצב מחולק זה, TF מוגן פונקציונלית מגורמי קרישה במחזור ונשאר לא פעיל. בהתאם לכך, רק חלק קטן מהטסיות מציג TF שטחי שניתן לזהות כאשר דם מלא של אנשים בריאים מנותח באמצעות ציטומטריית זרימה, המשקפת הומאוסטזיס פיזיולוגי ^2,8. מצבים פתולוגיים המאופיין בהפעלת טסיות וחוסר איזון טרומבו-דלקתי עלולים לשבש את שיווי המשקל הזה, ולהוביל לחשיפה מוגברת על פני השטח של TF. דווח על אחוזים גבוהים של טסיות TF חיוביות (TF^pos) במספר הפרעות טרומבוטיות 9,10,11,12,13,14,15. ראוי לציין שבמחלת עורקים כליליים, רמות טסיות^ה-POS של TF העולות על 4% חוזות באופן עצמאי תמותה קרדיווסקולרית במעקב של 5 שנים, ובכך קובעות את אחוז הטסיות^ה-pos-tf כסמן ביולוגי קליני רלוונטי לסיכון לטרומבוטי¹⁶.

לכן, כימות מדויק וניתן לשחזור של טסיות^{TF pos-פלטות} הוא חיוני הן ליישומים תרגומיים והן למחקר קליני. תהליך זרימת זרימה-ציטומטריה של טסיות שפורסמה בעבר להערכת^{טסיות TF po-Systems}, שיפר את המחקר של חלבון זה בסביבות מרכז יחיד¹⁷ , ומספק ייעוץ לאופטימיזציה של שלבים פרה-אנליטיים או אנליטיים נבחרים. עם זאת, גישה זו לא נועדה במיוחד להתמודד עם האתגרים הלוגיסטיים והאנליטיים הנוספים של מחקרים רב-מרכזיים, כולל נהלי משלוח, עיבוד דגימות סטנדרטי, וכן התחשבות בצורך לאחד את רכישת הדגימות בין פלטפורמות ציטומטר זרימה שונות. יתרה מזאת, יש לקחת בחשבון גם את התשתיות השונות ורמות המומחיות הטכנית של המרכזים המשתתפים.

בהקשר זה, הערך המוסף של הפרוטוקול הנוכחי טמון במתן זרימת עבודה מפורטת המשלבת איסוף דם סטנדרטי וקיבוע דם מלא, פרוטוקולי עיבוד דגימות גמישים, הרמוניזציה של רכישת פלטפורמות, וצביעה ישירה ובקרת איכות מרכזית באמצעות ניתוח נתונים.

מטרת העבודה היא לספק מסגרת תפעולית ליישום הרמוני רב-מרכזי של ניתוח^{טסיות TF pos-טסיות} בדם מלא באמצעות ציטומטריית זרימה. עיצוב משולב זה מפחית את השונות הפרה-אנליטית, האנליטית ובין המכשירים, ובכך יוצר תנאי להערכה עקבית של טסיות^{TF pos-platelets} בסביבות רב-מרכזיות.

פרוטוקול

כל תורמי הדם סיפקו הסכמה מדעת בכתב שאושרה על ידי ועדת האתיקה של המוסד (מס' 70/24, CE 18.06.24).

תהליך העבודה הרב-מרכזי לכימות ציטומטריית זרימת דם מלאה של טסיות^{TF pos-טסיות} מסוכם באיור 1. הפרוטוקול המפורט להלן ינחה את המשתמש דרך חמישה שלבים עיקריים.

איור 1: זרימת עבודה רב-מרכזית לניתוח^{טסיות TF pos-platelet}. ייצוג סכמטי של הצינור האנליטי להערכה רב-מרכזית של טסיות^זרימה מסוג TF במחזור באמצעות ציטומטריית זרימת דם מלא. לאחר רישום הנבדקים ומשיכת דם, הדגימות נקבעות ומעובדות בהתאם למשאבים הטכניים הזמינים בכל יחידה קלינית. מרכזים ללא מתקני ציטומטריית זרימה שולחים דגימות קבועות למעבדת הליבה לצביעה, רכישה וניתוח. מרכזים המצוידים בזרימת ציטומטרים עשויים לבצע צביעה ורכישה באתר באמצעות תבניות רכישה סטנדרטיות. הרמוניזציה של מכשירים מושגת או באמצעות תבניות משותפות (אותו מודל מכשיר), תבניות שנוצרות במעבדת הליבה (מודל שונה זמין ליישור), או כיול עם חרוזי פלואורסצנטיות כאשר הרמוניזציה ישירה של תבנית אינה אפשרית. ניתוח נתונים מתבצע באופן מרכזי באמצעות זרימת עבודה סטנדרטית של גייטינג. הדיאגרמה נוצרה באמצעות ChatGPT (OpenAI). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

1. איסוף דם

הערה: הערכת^{טסיות TF דורשת} מקסימום של 50 מיקרוליטר דם מלא.

1. איסוף דם ורידי היקפי מהווריד האנטקוביטלי באמצעות מחט פרפר בקוטר 19. מרחים את החוסם רק לצורך הוניפונקטור ושחררו אותו מיד לאחר הנחת המחט כדי למזער הפעלת טסיות מחוץ לחי (ex vivo).
2. זרוק את שפופרת ה-EDTA הראשונה. לאחר מכן אוספים דם לשואב אבק נתרן ציטראט בנפח 0.129 מיליון, וממלאים את הצינור לפי סימן היצרן כדי לשמור על היחס הנכון בין דם לנוגדי קרישה.
3. הפוך בעדינות 5 פעמים כדי לערבב היטב דם ונוגד קרישה.
4. שמור על הצינור זקוף בטמפרטורת החדר, תוך הימנעות מתערבבות, קירור או הובלה פנאומטית.
5. עבדו את הדגימה תוך 3 שעות לאחר האיסוף.

2. הכנת דוגמאות

הערה: כל הנוגדנים חייבים להיות נרכשים על ידי מעבדת הליבה וחייבים להגיע מאותה אצווה. אם יש צורך בשינוי אצווה במהלך המחקר המתמשך, יש לחבר את אצווה המגיב החדשה ישירות לאצווה בשימוש באמצעות בדיקות מקבילות באותם תנאי בדיקה ולאומץ רק אם מאושרים ביצועים דומים. כל מרכז משתתף ניתן לרכוש תגובות נפוצות (למשל, PBS – תמיסת מלח עם מאגר פוספט – ו-PFA – פאראפורמלדהיד) על ידי כל מרכז משתתף; עם זאת, קודי המוצר חייבים להתאים לאלו של מעבדת הליבה, ויש לשמור על עקביות אצווה לאורך כל המחקר.

1. תקן את הדגימה.
   הערה: לפני תחילת עיבוד הדם, יש להכין 1% PFA על ידי דילול 4% PFA עם PBS בטמפרטורת החדר.
   אזהרה: PFA הוא רעיל ויש לטפל בו עם מכסה כימי תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים (חלוק מעבדה, כפפות והגנה על עיניים). הימנעו משאיפה ומגע עם העור או העיניים. סילוק פסולת: לאסוף את כל התמיסות המכילות PFA, דגימות קבועות וחומרים מזוהמים למכלי פסולת מסוכנת מסומנים וסגורים בהתאם לתקנות מוסדיות ומקומיות.
   1. הפוך בעדינות את השואב 5 פעמים כדי לערבב דם ונוגד קרישה.
   2. העבר 50 מיקרוליטר דם לצינור בנפח 2 מ"ל המכיל 950 מיקרוליטר של 1% PFA.
   3. ערבבו בעדינות את הדגימה ודוגרו במשך שעה ו-30 דקות בטמפרטורת החדר.
   4. הוסף 500 מיקרוליטר של PBS.
   5. צנטריפוגה ב-1500 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   6. הסר את הסופרנטנט ותשהה את הכדור ב-1 מ"ל של PBS.
      הערה: נקודת בדיקה טכנית: לאחר הצנטריפוגה, ודאו שהכדור נראה לפני הסרת הסופרנטנט. הסר בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. לאחר ההשעיה מחדש, יש לוודא שהדגימה הומוגנית וללא גושים או אגרגטים נראים לעין.
   7. שלחו את הדגימה הקבועה למעבדת הליבה באריזה מבוקרת טמפרטורה הנשמרת על 2-8 מעלות צלזיוס בתוך 24 שעות לאחר הקיבוע. אל תקפא. זמן איסוף מסמכים, זמן קיבוע וזמן משלוח.
2. תיוג דגימות לניתוח ציטומטריית זרימה.
   הערה: אנטי-TF סטאר פלואר 488 (שיבוט HTF1; אנטי-CD142) מכוון נגד גורם רקמה, בעוד שאנטי-CD41 PerCP-Cy5.5 מזהה אינטגרין טסיות alphaIIb. לפני תחילת הליך הצביעה, יש להשתמש בנוגדנים בצנטריפוגה בעוצמה של 17000 x g למשך 5 דקות בטמפרטורה של +4 מעלות צלזיוס כדי להסיר כל מצטבר¹⁸. מדלל נוגדן נגד TF Star Fluor 488 (1:100) עם PBS. Anti-CD41 PerCP-Cy5.5 אינו דורש דילול ביניים ויש להשתמש בו בנפח המומלץ על ידי היצרן.
   1. הכינו ארבעה צינורות פוליפרופילן בנפח 2 מ"ל.
   2. יש לחלק 80 מיקרוליטר דגימה קבועה בכל צינור.
   3. הוסף לכל צינור את הנפח הנכון של PBS ונוגדן אנטי-TF Star Fluor 488 כפי שמוצג בטבלה 1  (יום 1).
   4. מערבבים בעדינות את הדגימות.
   5. דגרו O/N בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך.
   6. ביום הבא (יום 2), הוסף אנטי-CD41 PerCP-Cy5.5 לצינורות 3 ו-4 כפי שמצוין בטבלה 1.
   7. מערבבים בעדינות את הדגימות.
   8. דגרו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
   9. מדלל כל צינור ב-300 מיקרוליטר של PBS.
   10. אחסן דגימות מוכתמות בחושך עד לקבלת ציטומטריית זרימה.
       הערה: ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של 4°C עד שלושה ימים^ו-17. אחסון ארוך יותר גורם לדעיכה הדרגתית של האות ויש להימנע מכך.

		יום 1		יום 2
לא.	מזהה צינור	1X PBS (μL)	אנטי-TF סטאר פלואר 488 (מיקרוליטר)	אנטי-CD41 PerCP-Cy5.5 (μL)
1	נקי	20	0	0
2	TF	12.5	7.5	0
3	CD41	15	0	5
4	TF/CD41	7.5	7.5	5

טבלה 1: פרוטוקול צביעה להערכת^{טסיות זדומות (TF}).

3. תקנון רכישת ציטומטר זרימה

1. הגדרת תבנית רכישה (על ידי מעבדת הליבה).
   1. תבנית מוגדרת ל-Flow Cytometer A.
      1. פתח את התוכנה A גרסה 2.6.
      2. צור תרשים נקודות FSC-A/SSC-A [כל האירועים] בקנה מידה לוגריתמי כדי להמחיש אוכלוסיות תאים (איור 2A).
      3. צור גרף נקודות CD41 PerCP-Cy5.5-A/SSC-A [All Events] בקנה מידה לוגריתמי כדי לזהות טסיות בתוך שער [טסיות] (איור 2B).
      4. צור תרשים פסאודו-צבע PerCP-Cy5.5-A/Star Fluor 488-A [כל האירועים] כדי לבדוק שפיזור/פיצוי (איור 2C).
      5. צור גרף נקודות FSC-A/FSC-H בשער [Platelets] והגדר אזור לזיהוי סינגלטים ([Singlets]; איור 2D).
      6. צור תרשים נקודה של CD41 PerCP-Cy5.5-A/TF Star Fluor 488-A בשער [Singlets] כדי לזהות טסיות^{TF pos-platelets} (איור 2E).
      7. הגדר סף ל-1000 ב-SSC-H.
      8. הגדר את קצב הזרימה ל"איטי".
      9. הגדר את רווח B525 ל-315 כדי להבטיח הבחנה מיטבית בין אירועים חיוביים לשליליים; כוונן במידת הצורך לפי הכלי שבו משתמשים.
      10. הגדר את הרווח של B690 לפי בקרת איכות יומית. רכישה מקובלת רק אם אוכלוסיית^{הטסיות המוצלחות} של CD41 נפתרה לחלוטין מהרקע השלילי ונשארת בתוך שער ההתייחסות המוגדר מראש שנקבע בתבנית במהלך הרכישה.
      11. ייצא את התבנית באמצעות "תבנית ייצוא ניסוי".
      12. הורדה: תבנית הרכישה לניתוח^{טסיות TF pos-טסיות} על מד הזרימה A זמינה להורדה כקובץ משלים 1 ואיור משלים 1.
          הערה: מצורף תרשים לבדיקת פליטה/פיצוי (איור 2C), אף שאינו נדרש לניתוח רב-פרמטרי זה. עם זאת, יש לשקול האם ישתמשו בשילוב פלואורוכרומים השונה מהמוצע בפרוטוקול זה.
   2. צור תבנית ל-Flow Cytometer B.
      1. צור קובץ פרוטוקול שכולל את כל הגדרת הרכישה כפי שמתואר ב-3.1.1.
      2. ייצא את התבנית באמצעות פונקציית "ייצוא פרוטוקול" בתוכנה B v1.6, ויוצר קובץ פרוטוקול.
      3. בכלי המקבל, ייבא את קובץ הפרוטוקול באמצעות פונקציית "ייבוא פרוטוקול" בתוך התוכנה.
   3. יצירת תבנית עבור ציטומטר זרימה C.
      1. צור קובץ Workspace שכולל את כל הגדרת הרכישה כפי שמתואר ב-3.1.1. ולייצא אותו.
      2. בכלי המקבל, ייבא את קובץ ה-workspace באמצעות פונקציית "העתק" של התוכנה C v3.1.
2. הרמוניזציה של ציטומטרי זרימה באמצעות חרוזי כיול.
   הערה: השתמש בחרוזי כיול Rainbow עם 6 שיקים.
   1. הגדרת ערך יעד.
      הערה: השתמש בנוסחה הבאה כדי להגדיר את עוצמת הפלואורסצנציה החציונית (MdFI) של השיא הראשון בערוץ הפלואורסצנציה B525:
      MdFI_CU =
      כאשר CU: מכשירי יחידה קלינית ו-RI: כלי ייחוס.
   2. הכנת דוגמה.
      1. מערבולת, בקבוקון החרוזים.
      2. הוסף 5 טיפות חרוזים לצינור דגימה.
      3. הוסיפו 1 מ״ל של PBS.
      4. Vortex ל-5-10 שניות.
   3. רכישת חרוזים.
      1. צור תרשים נקודות FSC-A/SSC-A בקנה מידה לוגריתמי המציג את [All Events], והגדר אזור בשם [Beads] (איור 3A).
      2. צור גרף נקודות FSC-A/FSC-H בשער [Beads] והגדר אזור לזיהוי סינגלטים [Singlet] (איור 3B).
      3. צור תרשים היסטוגרמה עבור ערוץ הפלואורסצנציה Star Fluor 488 (B525).
      4. הצג רק [Singlet] על ההיסטוגרמה.
      5. צייר שער על רוחב כל הפסגה הראשונה (אזור B באיור 3C).
      6. בסרט הסטטיסטיקה, הצג ערכי X חציוני (X-Med).
      7. הסר כל פיצוי קיים.
      8. הגדר את קצב הזרימה ל"איטי".
      9. התחל לרכוש במצב "ריצה".
      10. מתוך "הגדרת רכישה", שנו את מתח/רווח B525 כדי להגיע ליעד X-Med המחושב לפי ערך היעד.
      11. רשם קובץ נתונים של 10,000 אירועים בשער [Singlet] רק לאחר שהקריטריון הזה הושג. אל תרכוש דגימות מחקר עד שטווח היעד יושג.

קובץ משלים 1: תבנית רכישה לניתוח^{טסיות TF pos-platelet} ב-Flow Cytometer A זמינה להורדה. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 1: צילום מסך של תבנית הרכישה לניתוח^{טסיות TF pos-plate} ב-Flow Cytometer A. (A) גרף הנקודה FSC-A מול SSC-A מספק ייצוג חזותי של התפלגות האירועים הכוללת. (B) טסיות מזוהות בגרף CD41 מול SSC-A ומוגדרות כ-[טסיות]. (C) כלול תרשים PerCP-Cy5.5 מול Star Fluor 488 להערכת פוטנציאל דליפה. (D) דאבלטים אינם נכללים בתוך שער [Platelets] באמצעות תרשים FSC-A מול FSC-H, המגדיר את אוכלוסיית [Singlets]. (ה) טסיות^{-טסיות של TF pos} מזוהות בתוך שער [סינגלטים] בהתבסס על פלואורסצנציה PerCP-Cy5.5 ו-Star Fluor 488. (F-H) הגדרות הרכישה, כולל קצב זרימת דגימה (איטי), סף ראשי (SSC) ורווחי גלאי (B525 ו-B690), כפי שמיושמו בתבנית, מוצגות. פרטים מלאים על הגדרת הרכישה וזרימת העבודה מסופקים בסעיף 3.1. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור 2: תבנית רכישה ואסטרטגיית שער לזיהוי טסיות^{TF pos}. (A) גרף נקודות FSC-A/SSC-A (סולם לוגריתם) המציג את כל האירועים שזוהו. (B) תרשים נקודות CD41-A/SSC-A המשמש לזיהוי אוכלוסיית הטסיות. (C) תרשים פסאודוקולור PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 המשמש להערכת דרישות הפיצוי והפליטה הספקטרלית. (D) גרף FSC-A/FSC-H בשער [Platelets] המשמש להוצאת דאבלטים ולהגדרת סינגלטים. (ה) גרף נקודה PerCP-Cy5.5/פלואור כוכבים 488 ב-[סינגלטים] המשמשים לזיהוי טסיות^מצב של TF. שדות הסטטיסטיקה המוצגים בסוגריים מתמלאים אוטומטית בערכים ספציפיים לדגימה כאשר התבנית מוחלת במהלך רכישת הדגימה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: הליך כיול מכשירים מבוססי חרוזים. (A) גרף FSC-A/SSC-A המשמש לזיהוי אירועי חרוזים. (B) גרף FSC-A/FSC-H בתוך אירועי חרוזים המשמש להוצאת אגרגטים ולהגדרת סינגלטים. (C) היסטוגרמה של פלואורסצנציה פלואור 488 המציגה שיאי חרוזים עם שער שהוחל על פסגת החרוז הראשונה לקביעת עוצמת פלואורסצנציה חציונית. הסטטיסטיקות המוצגות ייחשבו כמייצגות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

4. רכישת דגימות ציטומטריית זרימה לניתוח^{טסיות TF pos-platelet}

1. רכוש באמצעות תבנית FCM.
   1. ייבא את תבנית הרכישה באמצעות פונקציית "ייבוא תבנית" בתוך תוכנה A.
   2. רכוש את הדגימות שהוכנו בשלב 2.
   3. ודאו ששערי טסיות וסינגלטים תואמים לגאומטריית הגרף הייחוס לפני רישום הנתונים. כוון את השערים במידת הצורך.
   4. התחל להקליט אחרי 5–10 שניות של זרימה יציבה. רשם קובץ נתונים של 20,000 אירועים בתוך שער  [סינגלטים] (ראו איור 2D). שמור קבצי .fcs שלא קיבלו פיצוי והעבר אותם למעבדת הליבה.
2. רכישה ללא תבנית FCM.
   1. שחזר גיליון רכישה כפי שדווח בסעיף 3.1, כולל חמשת הגרפים המתוארים והיררכיית השער: כל האירועים > טסיות > סינגלטים > רבעי TF/CD41.
   2. הגדר סף ל-1000 ב-SSC-H.
   3. הגדר את קצב הזרימה ל"איטי".
   4. הגדר את המתח/הגבר B525 כפי שמוגדר ב-3.2.3.
   5. רכש את הדוגמה מוכנה בשלב 2. להתחיל להקליט אחרי 5–10 שניות של זרימה יציבה; לרכוש 20,000 אירועים בתוך שער [סינגלטים]. שמור קבצי .fcs שלא קיבלו פיצוי, והעבר אותם למעבדת הליבה.
      הערה: רכישה מתקבלת רק אם מכשיר בקרת איכות יומי מועבר. אם לא ניתן להגיע ליעד של 20,000^{טסיות CD41 pos}– טסיות, יש להשיג מינימום של 10,000 אירועי^{טסיות CD41}.

5. ניתוח נתונים

הערה: תהליך הניתוח המתואר להלן מיועד לתמוך בפעילויות המעבדה המרכזית האחראית על עיבוד נתונים מרכזי ובקרת איכות.

1. פתח דף ניתוח חדש וטעין את קבצי ה-.fcs.
2. עבור כל דגימה, צור תבנית ניתוח כפי שמוצג באיור 2. לפלטפורמות לא זהות, יש להשתמש בתבנית ספציפית לפלטפורמה עם אותו מבנה שער ופלטים סטטיסטיים.
3. ודאו שגייטינג מזהה נכון את אוכלוסיית הטסיות בהתאם למאפייני הפיזור המוגדרים מראש ולאסטרטגיית ההבחנה הסינגלטית (איור 4A,B,D).
4. בדוק אם יש השפעה/פיצוי באמצעות תרשים פסאודו-צבעוני [כל האירועים] (איור 4C).
   הערה: פלואר 488 הפלואורוכרום בעל פליטה ספקטרלית ב-520 ננומטר, לעומת PerCP-Cy5.5, שיש לו פליטה ספקטרלית ב-676 ננומטר, מה שמסביר את חוסר החפיפה ואת הצורך בפיצוי.
5. החלו את רצף השער הבא בגרף הנקודות Star Fluor 488 (איור 5):
   1. לא מוצבע: הגדר רבעים באמצעות הבקרה הלא מוצבעת כך שאירועי^המצב של TF ברקע יישארו ב-0.01% או מתחת לאירועי הטסיות, ללא אוטופלואורסצנציה של טסיות (איור 5A).
   2. TF: החלו את קואורדינטות הרבע שהוגדרו בדגימה הלא מוצבעת כדי לזהות אות^{TF pos-signal} בדגימות צבועות בודדות (איור 5B).
   3. CD41: הגדר רבעים באמצעות דגימת CD41 מוצבעת יחיד כדי להוציא את הפלואורסצנציה ברקע של טסיות (איור 5C).
   4. TF/CD41: החלו את אותם קואורדינטות רבעים לזיהוי אות^ה-pos של TF בדגימות מוצבעות ב-TF/CD41 (איור 5D).
      הערה: אחוז^{הפוסט-טסיות} הסופי של TF מתקבל מהסטטיסטיקות שנוצרות על ידי תוכנת הניתוח ומדווח כאחוז של אירועי^סיבה של CD41 הנופלים ברבע^{ה-TF של} אוכלוסיית הטסיות הסגורות.
6. בצע בקרת איכות מרכזית על זיהוי שמות הקבצים, אצוות, מרווח קיבוע עד רכישה, טמפרטורת משלוח, ספירת אירועים והתפלגויות פלואורסצנציה חריגות. קבצים המראים סטיות מתועדות בטיפול מקומי, משלוח, תזמון קיבוע או הגדרות רכישה צריכים להיות מסומנים, נבדקים באופן מרכזי, ולהוציא או יוחזרו על עצמם, בהתאם לתוכנית ניהול הסטיות הספציפית למחקר.

איור 4: אסטרטגיית שער סדרתית לניתוח טסיות^{TF pos-platelet}. תהליך הניתוח המייצג ממחיש את זיהוי אוכלוסיות הטסיות לאחר טעינת קבצי .fcs. (א-ב) גרפים נקודתיים המאשרים את השערים הנכונים של אוכלוסיות טסיות. (C) תרשים פסאודוקולור PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 המשמש להערכת דליפה ספקטרלית. (D) תרשים FSC-A/FSC-H בתוך שער הטסיות המשמש להוצאת דאבלטים ולהגדרת סינגלטים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 5: תבנית לניתוח נתונים. גרפים נקודתיים מייצגים של (A) בקרה לא צבועה שימשו להגדרת אוטופלואורסצנציה בסיסית ומיקום רבעים. (B) דגימת TF עם צביעה יחיד; (C) דגימת CD41 צבועה בודדת המשמשת להגדרת מיקום הרבעים. (D) דגימת TF/CD41 עם צביעה כפולה המשמשת לניתוח טסיות^{TF pos-platelet}. המספרים מציינים את אחוז הטסיות^{החיוביות} של TF בדגימה מייצגת. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

תוצאות

תהליך עבודה זה תוכנן במיוחד כדי לאפשר למרכזים עם תשתיות טכניות הטרוגניות להשתתף במחקרים רב-מרכזיים שדורשים כימות של טסיות^מצב של TF. איור 1 ממחיש את דיאגרמת זרימת העבודה הארגונית שנועדה לתמוך במחקרים רב-מרכזיים שמטרתם למדוד טסיות^זרימת דם במחזור באמצעות ציטומטריית זרימת דם מלא. נהלי הכנת דגימות שונים מיושמים בהתאם למשאבים הטכניים הזמינים במרכזים המשתתפים. בפרט, (i) כאשר ליחידה קלינית אין מתקן ציטומטריה זרימה או צוות מיומן, דגימות דם מלא עוברות קיבוע מיד לאחר האיסוף ואז נשלחות למעבדת הליבה לצביעה, רכישה וניתוח מרכזיים. (ii) לחלופין, מרכזים המצוידים במתקני ציטומטריית זרימה עשויים לבצע צביעה ורכישה מקומית. במקרים אלו, רכישת הנתונים מתבצעת לפי תהליך עבודה מתואם שהוגדר על ידי המעבדה המרכזית. אם מודל המכשיר תואם לזה ששימש במעבדת הליבה, הרכישה מתבצעת באמצעות תבנית סטנדרטית שמספקת המעבדה המרכזית. כאשר משתמשים במודלים שונים של מכשירים, ניתן להשיג הרמוניזציה באמצעות העברת תבנית - כאשר מכשירים זמינים ליישור במעבדת הליבה - או באמצעות הליכי כיול מבוססי חרוזים לפני איסוף הדגימה. ניתן לאחר מכן לאסוף ולנתח דגימות בהתאם לזרימת העבודה הסטנדרטית.

התוצאות המייצגות הבאות נועדו להמחיש את היתכנות זרימת העבודה ואת שלבי ההתאמה המרכזיים, ולא לספק אימות פורמלי של בדיקות רב-מרכזיות. כדי להבטיח זיהוי TF אמין, אסטרטגיית הצביעה הוערכה תחילה מבחינת תאימות ספקטרלית ויציבות אות. טסיות זוהו באמצעות Anti-CD41 PerCP-Cy5.5, בעוד שזיהוי TF התבסס על נוגדן מונוקלונלי אנטי-TF המקושר ל-Star Fluor 488. בקרים עם צביעה בודדת שימשו לאימות היעדר פליטת פלואורסצנציה בין תעלות הגילוי. כפי שמוצג באיור 6A, דגימות חד-צבועות ב-CD41 PerCP-Cy5.5 לא הפיקו אות שניתן לזהות בערוץ Star Fluor 488. באופן עקבי, אחוז הטסיות^{הפוזיקליות} TF שנמדדו בדגימות עם צביעה כפולה היה דומה לזה שהתקבל בדגימות TF עם צביעה בודדת (איור 6B).

איור 6: אימות ספציפיות הצביעה. (א) דגימת אנטי-CD41 PerCP-Cy5.5 מוצבעת בודדת שנבדקה בגרף נקודה 488 של PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 לאימות ספציפיות האות. (B) אחוזי טסיות^ה-pos-tf שנמדדו בדגימות TF צבועות בודדות לעומת TF/CD41 עם צביעה כפולה מוצגים כמדידות זוגיות בודדות (נקודות) וממוצע SD ± (n = 18 נבדקים עצמאיים). הנתונים נותחו במבחן וילקוקסון-זוגות-חתום-דרגה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.הרגישות האנליטית של הבדיקה המוצעת הוערכה על דגימות מ-n=200 נבדקים בריאים. באמצעות דגימות ביולוגיות ריקות, הגבול המחושב של ריק (LoB) היה 0.39%, גבול הגילוי (LoD) היה 0.77%, וגבול הכימות (LoQ) היה 1.12%, שהוגדר כרמה הנמוכה ביותר הקשורה ל-CV ≤ 20%. השחזוריות בין מפעילים של אסטרטגיית השער הוערכה על 40 מדגמים עצמאיים שנותחו על ידי 6 אופרטורים באמצעות תבנית ניתוח מוגדרת מראש, והניבו ICC של 0.985 (רווח בר-סמך 95%: 0.978-0.990).

היציבות של זיהוי TF לאחר קיבוע דם מלא הוערכה על ידי צביעת דגימות קבועות לאורך זמן. בהשוואה לדגימות בסיסיות שנצבעו ביום הקיבוע (D0), רמות טסיות^ה-pos-f נשארו יציבות עד ארבעה ימים לאחר הקיבוע (D3-D4), והראו ירידה לא מובהקת בלבד של כ-22% ב-D3-D4 (77.8 ± 7.2% - אחוז יחסי בטסיית^הגוף של TF) בהשוואה לרמת D0. כאשר הצביעה בוצעה ב-D5-D6, גילוי טסיות^TF pos-פלטות ירד משמעותית ל-53.8% ±-20.7% (אחוז יחסי בטסיית^{TF pos-platelet}; עמ' < 0.0001; איור 7). תוצאות אלו מצביעות על כך שניתן לנתח דגימות קבועות באופן אמין בתוך ארבעה ימים לאחר הקיבוע עם אובדן אות מתון בלבד.

איור 7: ניתוח זמן-מסלול לאחר קיבוע דגימה. כימות של טסיות^מצב TF שנמדדו בנקודות זמן שונות לאחר הקיבוע מצוין בציר ה-x כך: D0 = יום איסוף הדם; D1 = יום 1; D2 = יום 2; D3-4 = יום 3 או 4; D5-6 = יום 5 או 6. הנתונים מבוטאים כממוצע ± אחוז יחסי של SD לעומת D0 (n = 7-10 נבדקים בריאים, מוערכים בנקודות זמן שלאחר הקיבעון המצוינים). הנתונים נותחו באמצעות אנובה ואחריהם מבחן השוואה מרובה של דאנט. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

ביצועי תהליך הרכישה המאוחד הוערכו לאחר מכן בפלטפורמות ציטומטריית זרימה שונות. הרמוניזציה מבוססת תבנית הוערכה לראשונה באמצעות מכשירי FACSLyric ו-MACSQuant כציטומטרים ייחוסיים. כלים נוספים מאותם דגמים שנמצאו במתקנים חיצוניים שימשו כפלטפורמות ניסוי. דגימות דם מלא המכילות טסיות במנוחה נאספו הן במכשירי ייחוס והן בכלי בדיקה באמצעות תבנית רכישה סטנדרטית. כפי שמוצג באיור 8A,B, הושגו אחוזים דומים של טסיות^{פוז-טבליות} TF על פני ציטומטרים ייחוס וניסוי, מה שמאשר את השחזוריות של גישת התבנית המשותפת.

איור 8: שכפול בין מכשירים באמצעות תבניות רכישה משותפות. אחוזי טסיות^TF pos-נמדדו בדם מלא מתוך n=6 נבדקים בריאים שנאספו במכשירי FACSLyric (A) או MACSQuant (B) באמצעות תבנית רכישה משותפת שהוחלה על פני מכשירים. הנתונים מבוטאים כקביעות אישיות (נקודות) וממוצע ± SD. הנתונים נותחו באמצעות מבחן t זוגי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

לבסוף, הוערכה הרמוניזציה מבוססת חרוזים כדי ליישר כלים בתצורות שונות. ציטומטר A שימש ככלי ייחוס, ו-FACSymphony שימש כמכשיר הבדיקה. היישור בוצע באמצעות חרוזי כיול Rainbow בעלי 6 שיאים על ידי התאמת מתח הגלאי של FACSymphony 488 ננומטר עד שעוצמת הפלואורסצנציה של החרוזים ירדה לטווח היעד שהוגדר מראש. פרופילי היסטוגרמה הממחישים התפלגות שיא החרוזים לפני ואחרי היישור מוצגים באיור 9A. לאחר מכן נאספו דגימות דם מלא במכשיר הבדיקה לפני ואחרי הכיול. לפני ההרמוניזציה, אחוזי^{ה-pos-platelet} של TF היו שונים בין שתי הפלטפורמות. לאחר יישור מבוסס חרוזים, הערכים התאימו במידה רבה לאלו שהתקבלו בציטומטר הייחוס, מה שהדגים הרמוניזציה מוצלחת בין פלטפורמות וכימות TF ששכפול.

איור 9: הרמוניזציה של כלים מבוססת חרוזים. (א) היסטוגרמה מייצגת של חרוזי כיול קשת בענן בעלי 6 פסגות שנרכשו לפני (שיאים אדומים) ואחרי (שיאים ירוקים) ליישור המכשיר. (B) אחוזי טסיות^{TF pos-טסיות} שנמדדו בדגימות מנוחה שהוכנו מ-n=6 נבדקים בריאים שנאספו על כלי הבדיקה לפני (לפני) ואחרי (לאחר ההרמוניזציה). מדידות שהושגו על מכשיר הייחוס מוצגות להשוואה. הנתונים נותחו באמצעות מבחן t זוגי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

דיון

פרוטוקול זה מספק תהליך עבודה שלב אחר שלב לכימות ציטומטריית זרימת דם מלאה של טסיות^{TF pos}, המיועד במיוחד ליישום רב-מרכזי. היתרון המתודולוגי העיקרי שלה על פני תהליכי עבודה קונבנציונליים המבוססים על ניתוח ציטומטריה של זרימת טסיות הוא שהיא מסטנדרטית את כל תהליך האנליזה, מאיסוף דם וקיבוע דם מלא ועד לתיוג דגימות, התאמת מכשירים לפני איסוף הדגימה, וניתוח מרכזי ובקרת איכות נתונים. דבר זה מאפשר למרכזים ללא יכולת עיבוד דגימות להשתתף במחקרים רב-מרכזיים, אם הם יכולים לספק דגימות דם. תהליך העבודה הנוכחי עוסק במקורות המעשיים של שונות בין מרכזים הרלוונטיים ביותר, בהתחשב בכך שרק חלק קטן מהטסיות מציגים TF המזוהה על פני שטח בתנאים פיזיולוגיים ^7,8. מקורות אלו כוללים הבדלים בטיפול בדגימות מקומיות, גישה למתקני ציטומטריית זרימה, תצורת מכשירים וניתוח נתונים תלויי מפעיל.

כדי להתגבר על בעיות אלו, הדם המלא מתקן זמן קצר לאחר האיסוף, מה שמייצב את פנוטיפ הטסיות בתוך הגוף ומונע את הצורך בתיוג מיידי ואיסוף דגימות. תוצאות מייצגות מצביעות על כך שגישה זו של דגימה קבועה מאפשרת עיכוב בעיבוד מרכזי בתוך מרווח הקיבוע המאומת. דבר זה מרחיב את הפוטנציאל להשתתפות במחקר למרכזים ללא מתקני ציטומטריית זרימה באתר, תוך שמירה על זרימת עבודה טרום-אנליטית עקבית. יתרון נוסף של הפרוטוקול הוא השימוש באסטרטגיית צביעה ישירה פשוטה עם פאנל דו-צבעי פשוט, שמפחית את המורכבות של התהליך.

בפאנל השתמשנו בשיבוט הנוגדן המונוקלונלי HTF1, שמזהה את האתר הקטליטי של TF ומתחרה בקשירת פקטור VII, מה שהופך אותו לאחד החומרים האמינים ביותר לזיהוי TF, גם כן בטסיות 14,16,17. הנוגדן הוצמד ל-Star Fluor 488, פלואורוכרום בהיר ועמיד לפוטבול דומה ספקטרלית ל-FITC אך עם יציבות אות משופרת. חשוב לציין כי עירור ב-488 ננומטר מאפשר זיהוי דגימות באמצעות תצורת לייזר כחול הזמינה כמעט בכל ציטומטר זרימה קונבנציונלי, כולל מכשירים ברמת כניסה. שילוב זה של ספציפיות אפיטופה לזיהוי פלואורוכרום פשוט משפר את הרגישות האנליטית והיכולת להרחבה באתרים שונים. במבחן זה, הוגדרו ספי חיוביות באמצעות בקרות לא מוכתמות ו-FMO כאופציה טובה יותר בהשוואה לבקרה איזוטיפית למיקום סף באוכלוסיות בתדירות נמוכה¹⁸.

השימוש בציטומטרי זרימה שונים עשוי לייצג מקור לשונות במחקרי ציטומטריית זרימה רב-מרכזית 19,20,21. בעבר סיפקנו ייעוץ בנוגע לטיפול טרום-אנליטי, התקנת צביעות ואופטימיזציה מקומית של מכשירים¹⁷. אך אמצעים אלו אינם מבטיחים אותות פלואורסצנציה עקביים בין פלטפורמות שונות. זרימת העבודה הנוכחית מתמודדת עם בעיה זו על ידי שילוב ניתוח מרכזי עם הרמוניזציה של רכישות פוטנציאליות. ניתן להשתמש בתבניות רכישה משותפות כאשר קיימים ציטומטרים זהים, בעוד שיישור מבוסס חרוזים יכול להיות מיושם כאשר יש צורך בפלטפורמות שונות. אסטרטגיה כפולה זו מציעה יתרון מעשי על פני מודלים אנליטיים רב-מרכזיים שמסתמכים אך ורק על ניתוח מרכזי לאחר רכישה מקומית הטרוגנית, על ידי הפחתת השונות של ניתוח הנתונים מהתחלה ותמיכה ביישום שערים שכפול יותר בין אתרים.

אין להפריז בכלליות של תהליך העבודה. הפרוטוקול אומת באמצעות תנאי קיבוע דם מלא מוגדרים, שילוב ה-anti-TF-Star Fluor 488 ו-anti-CD41 PerCP-Cy5.5, הליכי הרמוניזציה, ומערך מוגבל של תצורות ציטומטר זרימה. אם משתמשים בשיבוטים אנטי-TF אחרים, שילובי פלואורוכרום, זמני קיבוע או ריכוזי קיבוע, או ציטומטרים בזרימה עם אופטיקה שונה באופן מהותי, יש לבדוק את ביצועי האנליטיקה של זרימת העבודה. בסך הכל, כל כשל בפרוטוקול צריך להיות מנוהל באמצעות כללי סטייה מוגדרים מראש. בהתאם לחומרת הסטייה, הנתונים עשויים להיות מסומנים, חוזרים על עצמם או הוצאו מנתונים בהתאם לתוכנית הסטייה הספציפית למחקר. בתוך גבולות אלו, יש לשקול את הפרוטוקול הנוכחי כמסגרת תפעולית ליישום רב-מרכזי של ניתוח^{טסיות TF pos-platelet}. אימות אנליטי פורמלי, כולל הערכת ביצועים בין-מעבדתית רחבה יותר, אימות משלוחים וחזרתיות הבדיקה, מטופל כעת במחקר תקינה בינלאומי ייעודי של החברה הבינלאומית לטרומבוזיס וההמוסטזיס. הרלוונטיות הקלינית של כימות^מדויק של טסיות פוז-דם מודגשת על ידי ראיות המראות את ערכה הפרוגנוסטי במחלת עורקים כליליים, שבה רמות טסיות^TF pos-platelets העולות על 4% חוזות באופן עצמאי תמותה קרדיווסקולרית ארוכת טווח במעקב חמש שנים¹⁶. מדידה אמינה רב-מרכזית חיונית לאימות טסיות^{פוטנציאל} של TF כסמן ביולוגי ולהרחבת יישומה לניסויים קליניים פרוספקטיביים ורישומים אמיתיים. יישום עתידי של אלגוריתמים אוטומטיים של נורמליזציה ואסטרטגיות אוטוגייטינג עשוי להפחית עוד יותר הטיית מפעילים ולתמוך בניתוח מבוזר תוך שמירה על השוואה בין אתרים^22,23.

לסיכום, זרימת העבודה ההרמונית הזו מספקת גישה מעשית וניתנת לשחזור לכימות של טסיות^{TF pos} באמצעות ציטומטריית זרימת דם מלאה בסביבות רב-מרכזיות. על ידי שילוב נהלים טרום-אנליטיים סטנדרטיים, עיבוד דגימות מפושט ואסטרטגיות הרמוניזציה של מכשירים, הפרוטוקול מאפשר השוואה אמינה בין אתרים בין מדידות ל-TF po-platelets. מעבר לתמיכה בהערכת טסיות^{TF pos-frame} כסמן ביולוגי לסיכון טרומבוטי, העקרונות המתוארים כאן עשויים לתרום למאמצים רחבים יותר לסטנדרטיזציה של ציטומטריית זרימת טסיות ליישומים מחקריים תרגומיים וקליניים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1X PBS w/o Calcium and Magnesium	Gibco	10010-015	לדלילת נוגדנים ודגימות
Anti-CD41 PerCP-Cy5.5  (clone HIP8)	BD	333148	נוגדן מונוקלונלי אנושי אנטי CD41a המשמש כסמן אוכלוסיית טסיות; צריך להיות מסופק על ידי המעבדה המרכזית
Anti-TF Star Fluor 488  (clone HTF1)	Cyanagen	CR304	נוגדן מונוקלונלי אנושי לגורם רקמות (CD142); צריך להיות מסופק על ידי המעבדה המרכזית
BD FACSLyric Flow Cytometer	BD	non catalog item	בטקסט, ציטומטר זרימה B
BD FACSuite software v1.6	BD	non catalog item	בטקסט, תוכנה B
Butterfly Needle G19	PIKDARE	02044019030010	למשיכת דם
CytExpert Software	Beckman Coulter	non catalog item	בטקסט, תוכנה A
CytoFLEX S flow cytometer	Beckman Coulter	non catalog item	בטקסט, ציטומטר זרימה A
MACSQuant Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	non catalog item	בטקסט, ציטומטר זרימה C
MACSQuantify software v3.1	Miltenyi Biotec	non catalog item	בטקסט, תוכנה C
Eppendorf tubes 2 mL	Eppendorf	120094	לקיבוע דם מלא
Paraformaldehyde	Antibioticos – Divisione Carlo Erba Reagenti	387507	לקיבוע דגימות
Pipet tips 10 µL	Gilson	F161630	להעברת דגימות דם
Pipet tips 1000 µL	Gilson	F161670	להעברת דגימות דם
Pipet tips 200 µL	Gilson	F161930	להעברת דגימות דם
Polystyrene Round-Bottom Tube 5 mL	Corning	352052	נדרש לרכישת ציטומטר זרימה
Rainbow calibration beads (6 peaks)	Spherotech (BD)	556286	להרמוניזציה של ציטומטר זרימה
Vacutainer EDTA	BD	368857	לאסוף את 3 מ"ל הראשונים של הדם
Vacutainer multiple sample luer adapter	BD	367300	למשיכת דם
Vacutainer one use holder	BD	364815	למשיכת דם
Vacutainer with 0,129 M sodium citrate	BD	363079	לאסוף דם