ניתוח סמן ביולוגי של פירופטוזיס ספציפי לגיל והתערבות לא פרמקולוגית בתסמונת מצוקה נשימתית חריפה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר תהליך משולב של ביואינפורמטיקה ולמידת מכונה לזיהוי סמנים ביולוגיים של פירופטוזיס בשכבות גיל בתסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS), בשילוב עם מתודולוגיה in vivo המשתמשת במודל עכברוש המושרה על ידי LPS, לאימות ניסיוני של היעילות הראשונית של אנרגיית ספקטרום מים וקרינה אינפרא-אדומה רחוקה.

תקציר

תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) היא הפרעת דלקת ריאתית מסכנת חיים עם תחלואה ותמותה גבוהים, שבה פירופטוזיס הפכה למנגנון פתוגני מרכזי. בהתחשב בכך שהבדלים חיסוניים ומולקולריים הקשורים לגיל עשויים להשפיע על הפירופטוזיס והתגובה הטיפולית, מחקר זה נועד לזהות סמנים ביולוגיים הקשורים לפירופטוזיס ספציפיים לגיל ולהעריך את הפוטנציאל הטיפולי של מים באנרגיית ספקטרום (SEW) בשילוב עם קרינת אינפרא-אדום רחוקה (FIR). תהליך העבודה המקיף של הפרוטוקול כולל עיבוד מערכי נתונים טרנסקריפטומיים, סטרטיפיקציה לגיל, למידת מכונה וניתוח חדירת מערכת חיסון לזיהוי גנים מרכזיים ספציפיים לגיל. שלב חישובי זה מלווה באימות ניסויי in vivo באמצעות מודל חולדה ARDS מושרה על ידי LPS, תוך שימוש בהערכה היסטולוגית, ELISA ו-Western blotting להערכת התערבות SEW+FIR באופן קפדני ואימות ביטוי גנים במרכז. זוהו שישה עשר גנים הקשורים לפירופטוזיס, ביניהם AXL ו-GSDME היו קשורים בעיקר לחומרת ARDS אצל מטופלים מבוגרים, בעוד ש-SPP1 היה רלוונטי יותר בקרב צעירים. נצפו חתימות חיסוניות ברורות, עם העשרת מקרופאגים M2 ודיכוי חיסון אצל מטופלים מבוגרים, בניגוד להפעלה פרו-דלקתית אצל צעירים יותר. ניתוחים פונקציונליים הצביעו על גנים אלו במסלולים מטבוליים, דלקתיים ומסלולים רגולטוריים חיסוניים. בחיים החיים, טיפול SEW+FIR הקל על פגיעות ריאות, דיכא את ייצור הציטוקינים הדלקתיים (IL-1β, IL-18, IL-6, TNF-α), ווויתן את הביטוי של AXL, GSDME ו-SPP1. ביחד, ממצאים אלו מדגישים הבדלים תלויים בגיל במנגנונים הקשורים לפירופטוזיס ב-ARDS ומזהים את AXL, GSDME ו-SPP1 כמועמדים ראשוניים לסמן ביולוגי שדורשים אימות קליני נוסף. במודל הניסויי הנוכחי של עכברים, SEW+FIR הדגים השפעות מגן על ידי הפחתת דלקת מערכתית ומווסת איתות הקשור לפירופטוזיס, ומספק תמיכה בסיסית ב-in vivo לפוטנציאל שלו כאסטרטגיה נלווית לא-פרמקולוגית.

מבוא

פגיעת ריאה חריפה (ALI)/תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) היא מחלת נשימה חמורה המאופיינת בהופעה חריפה של היפוקסמיה חמורה ובבצקת ריאתית לא-קרדיוגנית, הנגרמת בעיקר מנזק אלוואולרי מפוזר¹. היא יכולה להיגרם על ידי מגוון פגיעות ריאתיות וחוץ-ריאתיות. גורמים ריאתיים כוללים דלקת ריאות זיהומית, שאיבת תכולת קיבה וטראומה חזה חמורה, בעוד שטריגרים חוץ-ריאתיים נובעים מתגובות דלקתיות מערכתיות משניות לפגיעות שאינן ריאתיות, כגון ספסיס, דלקת לבלב, טראומה לא חזה, כוויות קשות, עירוי מסיבי ופגיעות רפרפוזיון לאחר השתלת ריאות^או טרומבקטומיה ^1,2. למרות התקדמות בטיפול התומך, ARDS נותר אתגר קליני משמעותי ברפואה לטיפול נמרץ, עם שיעורי תחלואה ותמותה^{גבוהים ברחבי} העולם. לכן, הבנת הפתוגנזה של ALI/ARDS היא קריטית לפיתוח טיפולים יעילים.

פירופטוזיס, צורה דלקתית של מוות תאי מתוכנת שאופיינה בהרחבה בהקשר של דיכוי גידולים וטיפולים אונקולוגיים⁴, מוכרת כיום כשחקן מרכזי בפתופיזיולוגיה של ARDS⁵. בניגוד לאפופטוזיס, פירופטוזיס מתווך על ידי הפעלת אינפלמזום ופיצול נוסף של גזדרמין D (GSDMD), מה שמוביל להיווצרות נקבוביות ממברנה, לליזיס תאים ולשחרור ציטוקינים פרו-דלקתיים כגון אינטרלוקין-1β (IL-1β) ואינטרלוקין-18 (IL-18^). ב-ARDS, הפעלה מופרזת של פירופטוזיס במאקרופאגים אלוואולריים, תאי אפיתל ותאי אנדותל תורמת לתגובה דלקתית מוגזמת, הפרעה במחסום אלוואולרי-קפילרי, בצקת ריאתית והתקדמות היפוקסמיה⁷. עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שמיקוד ברגולטורים מרכזיים במסלול הפירופטוזיס עשוי לייצג אסטרטגיה חדשה להפחתת דלקת ולשיפור התוצאות הקליניות ב-ARDS ^8,9. עם זאת, נותר פער ידע קריטי בנוגע להשפעת ההזדקנות — גורם מרכזי לרגישות ולפרוגנוזה של ARDS — על הנוף הפירופטוטי. מחקרים עדכניים מתייחסים לעיתים קרובות ל-ARDS כמצב מונוליתי, ומתעלמים מהפוטנציאל לגורמים מולקולריים ספציפיים לגיל שיכולים להכתיב תגובות טיפוליות מותאמות אישית.

בשנים האחרונות, יישום התערבויות ביופיזיקליות חדשניות וחומרים פונקציונליים מתקדמים — כגון מפיצי SEW וקרינת אינפרא-אדום רחוקה (FIR) — זכה לפופולריות כאסטרטגיות לא-פרמקולוגיות לוויסות תגובות חיסוניות ולדיכוי דלקת^10,11. טיפולים אלו דווחו כמגבירים את התרבות הלויקוציטים והפעילות הפגוצית, מפחיתים בצקת רקמה ומפחיתים הפרעות מיקרו-זרימת דם הנגרמות על ידי אנדוטוקסינים — כולל הידבקות לויקוציטים, הצטברות אריתרוציטים, הפעלת טסיות ופגיעה באנדותל 12,13,14. בעכברי ARDS שנגרמו על ידי ליפופוליסכריד (LPS), טיפול משולב ב-SEW ו-FIR הפחיתו משמעותית את רמות IL-1β ו-IL-18—האפקטורים הבולטים במורד הזרם של מפל הפירופטוטי—הן בסרום והן בנוזל השטיפה הברונכואלוארי (BALF). ראיות אלו מצביעות בחוזקה על כך שההשפעות המגנות של SEW+FIR עשויות להיות מתווכות באמצעות דיכוי מוות תאי מונע על ידי אינפלמזומים. יתרה מזאת, SEW, כאשר מיושם באופן עצמאי או כמדיום ממס, נמצא כמוריד את רמות הביטוי של אינטרלוקין-8 (IL-8) ופקטור נמק-α גידולי (TNF-α), תוך העלאת רמות הביטוי של אינטרלוקין-4 (IL-4) ואינטרלוקין-10 (IL-10) בסרום הדם ומקל על נזק היסטופתולוגי לריאות 15,16,17,18.

בהתבסס על תצפיות אלו, השענו כי היעילות הטיפולית של SEW ו-FIR משולב (SEW+FIR) ב-ARDS מבוססת על יכולתו לווסת מסלולים פירופטוטיים ספציפיים לגיל, ובכך לשחזר הומאוסטזיס חיסוני ריאתי באופן ממוקד. נכון להיום, עמוד התווך של ניהול ה-ARDS מתבסס על הנשמה מכנית ועל חומרים פרמקולוגיים מוגבלים כגון קורטיקוסטרואידים, אשר לעיתים קרובות נושאים סיכון לפגיעה ריאתית הנגרמת על ידי מכונת הנשמה או לדיכוי מערכת חיסונית¹⁹. בהשוואה לטיפולים קונבנציונליים אלו, SEW+FIR מציע חלופה לא פולשנית ולא פרמקולוגית, שיכולה להפחית בבטחה מפלי דלקת בשלבים מוקדמים ללא רעילות משנית לאיברים. מעשית, פרוטוקול זה מתאים ביותר כהתערבות נלווית מוקדמת ל-ARDS קלה עד בינונית. המגבלה העיקרית שלו היא שיעילותו ב-ARDS פיברוטי חמור ומאוחר בשלב מאוחר נותרה בלתי מוכחת, והוא אינו יכול להחליף אמצעי תמיכה חיוניים בחיים במסגרת טיפול נמרץ. כדי לבדוק את ההשערה שלנו, פיתחנו צינור משולב שמגשר בין פרופיל טרנסקריפטומי מדורג גיל ולמידת מכונה לבין אימות vivo. גישה זו לא רק מזהה את AXL, GSDME ו-SPP1 כמטרות טיפוליות חדשות וספציפיות לגיל, אלא גם מספקת את הראיות המכאניות הראשונות לפוטנציאל הקליני של SEW+FIR כהתערבות מדויקת לא-פרמקולוגית ל-ARDS.

פרוטוקול

כל ההליכים הניסיוניים בבעלי חיים בוצעו בקפדנות בהתאם להנחיות שאושרו על ידי ועדת רווחת ואתיקה ניסיונית של בית החולים דונגג'ימן, אוניברסיטת הרפואה הסינית בבייג'ינג (אישור מס' 19-54), לפני תחילת המחקר.

מקור נתונים ועיבוד נתונים
שני מערכי ביטוי גנים (GSE89953 ו-GSE116560) נאספו ממאגר Gene Expression Omnibus (GEO)²⁰. מערך הנתונים GSE89953, הכולל נתוני טרנסקריפטומיה של מקרופאגים אלוואולריים שלמים מחולי ARDS בקבוצות גיל שונות, שימש לביטוי מבדלי וניתוח רשת. מאגר הנתונים GSE116560, הכולל מידע קליני כגון מצב אוורור מכני, שימש ללמידת מכונה ולמידול פרוגנוסטי. בנוסף, 608 גנים הקשורים לפירופטוזיס הופקו ממאגר נתונים מקיף של אנוטציות גנים אנושיות, תוך שימוש בציון קורלציה גבוה מ-1 כקריטריון הסקר. נתוני ביטוי גנים ננורמו באמצעות חבילת הלימה ב-R. מספר ניסוי קליני: אינו רלוונטי.

זיהוי DEGs
המטופלים במאגר הנתונים GSE89953 חולקו לשתי קבוצות גיל: גיל נמוך (<45 שנים) וגיל גבוה (≥45 שנים). סף זה נבחר בהתבסס על ראיות אפידמיולוגיות המצביעות על כך שהגיל החציוני להופעת ARDS הוא כ-45 שנים^ו-21. כדי להבטיח את עמידות סף זה, בוצעו ניתוחי רגישות באמצעות סף גיל חלופי (50 ו-55 שנים). ניתוחים אלו הראו דפוסים עקביים בזיהוי גנים של המרכז ובאשכולות מודולים, ובכך אישרו סטטיסטית את סף ה-45 שנה לניתוחים מאוחרים יותר. מערך הנתונים נורמל באמצעות חבילת לימה ב-R. גנים מבוטאים באופן דיפרנציאלי (DEGs) בין קבוצות גיל זוהו באמצעות מידול ליניארי עם מתון אמפירי של בייס. גנים עם ערך P מותאם < 0.05 ו-|log₂ שינוי קיפול| ≥ 0.5 נחשבו ל-DEGs מובהקים סטטיסטית. נוצרו גרפים של הרי געש ומפות חום כדי להמחיש DEGs באמצעות חבילת ggplot2 ב-R.

זיהוי וניתוח העשרה של גנים הקשורים לפירופטוזיס
גנים הקשורים לפירופטוזיס נשלפו ממסד הנתונים של האנומנטציה באמצעות מילת המפתח "פירופטוזיס". המפגש בין DEGs לגנים הקשורים לפירופטוזיס הוגדר כגנים הקשורים לפירופטוזיס (DEPGs) המבוטאים באופן שונה. אונטולוגיית גנים (GO) וניתוחי העשרת מסלולים של DEPGs אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) נערכו באמצעות חבילת clusterProfiler ב-R²². הקטגוריות של תהליך ביולוגי (BP), רכיב תאי (CC) ותפקוד מולקולרי (MF) הוסמכו, וציון Z ≥ 1 וערכי P מותאמים < 0.05 נחשבו למשמעותיים.

ניתוח רשת ביטוי משותף של גנים משוקללים (WGCNA)
כדי לזהות מודולי גנים הקשורים לפירופטוזיס, בוצע WGCNA באמצעות חבילת WGCNA R. רשת חתומה נבנתה באמצעות הספק רך (β) של 26 כדי להבטיח טופולוגיה חופשית^{בקנה מידה 23}. מודולים זוהו באמצעות אלגוריתם חיתוך עץ דינמי עם גודל מודול מינימלי של 30, פיצול עמוק של 2, וסף מיזוג (גובה חיתוך) של 0.25. חושב המתאם בין העצמיים של המודול לתכונות פירופטוזיס. ניתוח שונות של קבוצות גנים (GSVA) בוצע על מודולים נבחרים באמצעות סטים של גנים סימנים שהורדו מ-MsigDB^24,25.

למידת מכונה
מאגר הנתונים GSE116560 חולק לקבוצות גיל גבוה ונמוך, תוך שימוש בגיל 45 כנקודת סף, ושתי הקבוצות נותחו באמצעות אלגוריתמים של למידת מכונה. ניתוח רגרסיה של התכווצות מוחלטת מינימלית (LASSO) יושם באמצעות חבילת glmnet (גרסה 4.1-2) ב-R, כאשר פרמטר העונש האופטימלי (λ) נקבע על ידי אימות צולב של 10 פעמים (קריטריונים 1-SE). עבור אלגוריתם היער האקראי (RF), נבנו 500 עצים (ntree = 500), ומספר התכונות שנדגמו בכל פיצול (mtry) נקבע לשורש הריבועי של סך כל החיזויים כדי להבטיח יציבות המודל. גנים חופפים משתי השיטות הוגדרו כגנים חתימה ספציפיים לגיל.

בנייה והערכה של מודלים אבחנתיים
נבנה מודל חיזוי אבחוני המבוסס על הגנים החתימה שזוהו. הוגשה רגרסיה לוגיסטית לפיתוח המודל, ונוצרה נומוגרמה כדי להמחיש את כוח החיזוי שלו. ביצועי המודל הוערכו באמצעות עקומת מאפיין פעולה של מקלט (ROC), והשטח מתחת לעקומה (AUC) חושב כדי להעריך את דיוק האבחון שלו. אימות פנימי בוצע באמצעות דגימת בוטסטרפ. בוצעה הערכה נוספת של יציבות המודל והתועלת הקלינית באמצעות גרפים של כיול וניתוח עקומות החלטה (DCA).

ניתוח חדירה חיסונית
הרכב תאי החיסון בקבוצות גיל גבוה וצעיר הוערך באמצעות אלגוריתם CIBERSORT המבוסס על מטריצת החתימה LM22. היחסים היחסיים של 22 סוגי תאי החיסון הושוו בין קבוצות. ביטוי שונה של גני המרכז בין תת-קבוצות תאי החיסון נותח באמצעות נתוני דגימה בודדת והוצג במפות חום והיסטוגרמות.

ניתוח העשרת קבוצות גנים (GSEA)
GSEA בוצע בנפרד על גני המרכז מקבוצות הגיל הגבוה והנמוך. ניתוח העשרת קבוצות גנים (GSEA) בוצע באמצעות אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG). הגנים דורגו על פי יחס אות לרעש (או שינוי קפל) בין קבוצות ביטוי גבוה ונמוך. לאחר מכן חושבו ציוני העשרה והעשרה מנורמלת (NES) באמצעות 1,000 פרמוטציות לזיהוי מסלולים מועשרים באופן משמעותי. מסלולים עם שיעור גילוי שגוי (FDR) של פחות מ-0.25 וערך P נומינלי של פחות מ-0.05 הועשרו באופן משמעותי. ניתוח זה שימש להסקת המסלולים הביולוגיים שעשויים להיות מווסתים על ידי כל גן מרכזי.

בעלי חיים ניסיוניים
במחקר זה נעשה שימוש ב-18 חולדות ספרג דאולי זכרים מסוג SPF (בגילאי 6 עד 7 שבועות, 180 גרם ± 10 גרם). מידע מפורט על הספק מופיע בטבלת החומרים.

ריאגנטים וכלים
מכשירי הכנת מים שטופלו בשדה אלקטרומגנטי ומכשירי פליטה אינפרא-אדום רחוקים שימשו להתערבויות ניסיוניות לספק מים באנרגיית ספקטרום (SEW) וקרינת אינפרא-אדום רחוקה (FIR), בהתאמה. ליפופוליסכריד (LPS) שימש למידול ARDS. רמות הציטוקינים (IL-1β, IL-18, IL-6, TNF-α) נמדדו באמצעות ערכות ELISA ספציפיות. רמות ביטוי החלבון (AXL, SPP1, Caspase-3, GSDME, GAPDH) הוערכו באמצעות נוגדנים ראשוניים ספציפיים ונוגדנים משניים צמודים ל-HRP. עיבוד וניתוח דגימות בוצעו באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי, כולל ביומיקרוסקופ, מיקרוטום, צנטריפוגה מהירה, מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחד וקורא מיקרופלט. פרטים מלאים של כל המגבים, הנוגדנים והמכשירים, יחד עם יצרניהם, מסופקים בטבלת החומרים.

קיבוץ ומודל בעלי חיים
שמונה-עשר חולדות ספרג-דולי הוקצו באקראי לקבוצות ביקורת, מודל ו-SEW+FIR, עם שישה חולדות בכל קבוצה. כל קבוצה נשקלה ותועדה מדי יום. קבוצת SEW+FIR קיבלה טיפול ב-FIR (אורך גל 4 מיקרון–14 מיקרון, מרחק הקרנה של 20 ס"מ מפני השטח הגב) למשך 20 דקות ביום בסביבה מבוקרת טמפרטורה (22 מעלות צלזיוס ± 2 מעלות צלזיוס), ובמקביל קיבלה SEW במינון של 1 מיליטר/100 גרם ליום על ידי גאווג'^{אורלי 7}. מים מזוקקים ניתנו דרך הפה לקבוצות הביקורת והמודל במינון שווה ערך של 1 מ"ל ל-100 גרם ליום. מים מזוקקים ומזוקקים ניתנו פעם ביום במשך 7 ימים לאחר חימום באמבט חם בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס. ביום השביעי, 6 שעות לאחר האכלה, קבוצות המודל ו-SEW+FIR הוזרקו בתמיסת LPS במינון של 2 מ"ג/ק"ג לפי משקל דרך וריד הזנב, בעוד שקבוצת הביקורת טופלה במינון של 0.9% תמיסת מלח פיזיולוגית במינון של 2 מ"ג/ק"ג לפי משקל. טכניקת המידול נחשבה לשיטה בוגרת ויציבה להשראת תגובה דלקתית מערכתית באמצעות הזרקת LPS אחת דרך וריד הזנב. רקמת הריאה מהפתולוגיה הריאתית בקבוצות המדומות הייתה תואמת את מאפייני ARDS²⁵. נקודת ביקורת: השראה מוצלחת של ARDS מתבטאת בעייפות נראית לעין, טכיפנאה, וירידה ~10% במשקל הגוף בתוך 16 שעות לאחר ההזרקה²⁶.

איסוף מדדים הקשורים לעכברים
שש עשרה שעות לאחר מכן, כל שלוש הקבוצות הוזרקו תוך-פריטונית ב-3% פנטוברביטל נתרן במינון של 30 מ"ג/ק"ג משקל גוף כדי לגרום להרדמה. קריטי: עומק ההרדמה חייב להיות מאושר במדויק על ידי אובדן רפלקס הגמילה לפני כל התערבות פרוצדורלית. בנוסף, נשמרו פרוטוקולי בטיחות ביולוגית מחמירים; כל החומרים המזוהמים ב-LPS, הנוזלים הביולוגיים וגופות בעלי החיים הושלכו במיכלים ייעודיים לפסולת ביולוגית לצורך שריפה תקינה. חמישה מיליליטר דם נאספו מהאאורטה הבטנית לצינורות סטריליים, והסרום בודד בצנטריפוגציה בעוצמה של 1,000 x גרם למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסרום נשמר אז בטמפרטורה של −80°C לניתוח נוסף. לאחר כריתת תורקוטומיה וקשירת הילום הריאתי הימני, נוזל השטיפה הברונכואלוואולרי (BALF) הושג על ידי שטיפת הריאה השמאלית שלוש פעמים עם מי מלח מקוררים מראש (PBS) באמצעות קנולה אנדוטרכיאלית. לאחר מכן ה-BALF צנטריפוגה ב-1,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והסופרנטנט אוחסן בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס. האונה העליונה של הריאה הימנית הוסרה ונוקתה במלח פיזיולוגי קר להסרת הדם. נוספו תשעה נפחים של מי מלח פיזיולוגיים ביחס למשקל הרקמה, והדגימה נחתכה באמבט קרח באמצעות מספריים עיניים. הומוגנט רקמת ריאה של 10% הוכן באמצעות הומוגנייזר, ואחריו צנטריפוגה בעוצמה של 700 x גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסופרנטנט נאסף ואוחסן בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס לניתוח ביוכימי נוסף. בנוסף, חלק מרקמת הריאה הימנית של כל חולדה הוקבע ב-4% פאראפורמלדהיד לבדיקה היסטולוגית.

מדדי תצפית ושיטות גילוי
האונה התחתונה של הריאה הימנית עובדה באמצעות הטמעה סטנדרטית, חיתוך רקמות, הסרת שעווה, צביעת HE, הפרדת צבע, ייבוש ואיטום סרט לאחר קיבוע ב-4% פאראפורמלדהיד. רקמות הריאות של כל קבוצה הראו שינויים פתולוגיים שנצפו תחת מיקרוסקופ אור.

זוהו חריגות פתולוגיות בארכיטקטורה האלוואולרית ובמחיצה, דרגת חדירת תאי דלקת, היפרמיה ובצקת נימי ריאה תחת מיקרוסקופ אור. המחלקה לפתולוגיה באוניברסיטת הרפואה הסינית בבייג'ינג סייעה בתצפית. ציון פציעות הריאות היסטולוגיות חושב כדי להעריך פגיעות ריאות כך: אין פציעה = 0, פציעה בפחות מ-25% מהשדה = 1, פציעה ב-25–50% מהשדה = 2, פציעה ב-50–75% מהשדה = 3, ופציעה ביותר מ-75% מהשדה = 4. עשרה שדות נבחרו באקראי והוערכו על ידי חוקרים שהיו עיוורים לקבוצה.

ELISA בוצע על דגימות סופרנאנט של BALF, הומוגננט רקמת הריאה ודגימות סרום דם שנאספו קודם לכן, בהתאם להוראות היצרן. בקצרה, דגימות נדגרו בבארות מצופות מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. לאחר שטיפה חמש פעמים עם בופר שטיפה, הוחלו נוגדנים לזיהוי ביוטינילציה (דילול של 1:100) למשך 60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר שלב שטיפה נוסף, נוסף HRP-conjugate ודגרה בחושך למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הספיגה נמדדה ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט לחישוב ריכוזי הדגימה.

ניתוח ווסטרן בלוט בוצע כדי להעריך את רמות הביטוי של AXL, SPP1, קספאז-1, GSDMD, קספאז-3, GSDME ו-GAPDH ברקמת ריאה ודגימות BALF המאוחסנות בטמפרטורה של −80°C. החלבונים נקטפו והועברו ליסיזציה לפי ההוראות בערכת חילוץ החלבון. כמויות שוות של תמציות חלבון (40 מיקרוגרם) נטענו בכל נתיב ופתרנו על ידי SDS-PAGE. הפוליפפטידים הופרדו לאחר מכן והועברו לממברנות PVDF. הממברנות נחסמו עם 5% חלב יבש דל שומן ב-TBST למשך שעה בטמפרטורת החדר ולאחר מכן דגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם הנוגדנים הראשוניים הספציפיים (מדולל ב-1:1000). לאחר שטיפה עם TBST שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחת, הממברנות הוגברו עם נוגדנים משניים מצומדים ל-HRP (מדוללים ב-1:5000) בתמיסת חסימה בטמפרטורת החדר למשך שעה. GAPDH שימש כחלבון ייחוס פנימי. רצועות החלבון הוצגו באמצעות ערכת כימילומינסצנציה משופרת (ECL) עם זמן חשיפה של 1–5 דקות, והתוצאות נותחו באמצעות תוכנת עיבוד תמונה. רמות הביטוי היחסיות של חלבוני המטרה חושבו כיחס בין חלבון המטרה ל-GAPDH.

ניתוח סטטיסטי
אינדקסים כמותיים הוצגו כסטיית תקן ממוצעת ±, והניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות תוכנה סטטיסטית. מבחן קרוסקל–ווליס או ANOVA חד-כיווני שימש להשוואת הבדלים בין מספר קבוצות, בהתאם לחלוקת הנתונים כרגיל. כל הסטטיסטיקות הוערכו באמצעות מבחן השערה דו-צדדי. לניתוחים שכללו השוואות מרובות, כגון ביטוי גנים שונה ופרופיל חדירת תאי חיסון, ערכי P הותאמו באמצעות שיטת Benjamini-Hochberg false discovery rate (FDR). ערך P מותאם של 0.05 או פחות נחשב למובהק סטטיסטית. תוכנת גרפים שימשה לרישום גרפים.

תוצאות

זיהוי DEGs בקבוצות גיל GSE89953 שונות וניתוח העשרה פונקציונלית תואם
נתוני ביטוי גולמיים ממאגר הנתונים GSE89953 נורמל באמצעות פונקציית normalizeBetweenArrays בחבילת לימה (איור 1A), וגרפי הקופסאות לפני ואחרי הנירמול אישרו עקביות משופרת בין הדגימות. ניתוח ביטוי דיפרנציאלי המבוסס על מטריצת הנורמליזציה זיהה 228 DEGs (מותאם p < 0.05 באמצעות תיקון Benjamini-Hochberg, |log₂FC| ≥ 0.5), כולל 16 גנים מופרזים משמעותית ו-43 גנים מופחתת משמעות...

דיון

הצטברות פגיעות דלקתיות וחוסר ויסות חיסוני הן סימן היכר של תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS), המובילה לנזק ריאתי חמור ותמותה גבוהה. עקב הפתוגנזה המורכבת והיעדר טיפולים יעילים, זיהוי מטרות טיפוליות מדויקות הוא קריטי לשיפור התוצאות. ראיות מתפתחות מצביעות על כך שפירופטוזיס, צורה של מוות תאי מתוכנת, ממלאת תפקיד מרכזי בהתקדמות ה-ARDS. בהינתן שהגיל הוא גורם חשוב המשפיע על הופעת וחומרת ה-ARDS, סיווגנו את מערך הנתונים לפי גיל, תוך שימוש ב-45 שנים כנקודת סף, כדי לזהות מטרות מרכזיות הקשורות לפירופט...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נוגדן אנטי-AXL	אבקאם	AB215205
נוגדן אנטי-קספס-3	אבקאם	ab184787
נוגדן אנטי-GAPDH	אבקאם	ab8245
נוגדן אנטי-GSDME	אבקאם	AB215191
נוגדן אנטי-SPP1	אבקאם	AB307994
ביומיקרוסקופ	אולימפוס, יפן	BH2
כלי FIR	קבוצת גואנגדונג JFC	JF-802
עז אנטי-ארנב IgG H& L (HRP)	אבקאם	ab6721
GraphPad Prism 10.1.2	תוכנת GraphPad	-
צנטריפוגה מהירה	תרמו, ארה"ב	סורוול ST16R
ערכת IL-18 ELISA	חברת הביוטכנולוגיה של ג'יאנגסו מייביאו בע"מ.	MB-1735B
IL-1 ובטא; ערכת ELISA	חברת הביוטכנולוגיה של ג'יאנגסו מייביאו בע"מ.	MB-1588B
ערכת IL-6 ELISA	חברת הביוטכנולוגיה של ג'יאנגסו מייביאו בע"מ.	MB-50054A
ImageJ	NIH	-
ליפופוליסכריד (LPS)	סיגמא, ארה"ב	L6511
זכרים עם SPF Sprague Dawley (6-7 שבועות)	בייג'ינג HFK Bioscience Co., Ltd., סין	SCXK(בייג'ינג)2019-008 (רישיון)
קורא מיקרופלט (Varioskan Flash)	תרמו-סיינטיפיק	פלאש ואריוסקן
מיקרוטום	LEICA	RM2235
תוכנת R (limma, clusterProfiler, WGCNA, glmnet, randomForest)	קרן R למחשוב סטטיסטי	-
כלי הכנת תפירה	קבוצת גואנגדונג JFC	JF-139
SPSS 26.0	IBM	-
איזון השולחן	Shanghai Cany Precision Instruments בע"מ	HC· TP11 ו-middot; 10
TNF-α ערכת ELISA	חברת הביוטכנולוגיה של ג'יאנגסו מייביאו בע"מ.	MB-50051A
מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחד	תרמו, ארה"ב	סדרת פורמה 900