מאמר שיטה

עריכת גנום בתאי יונקים ראשוניים באמצעות אלקטרופורציה של RNA עורך

154 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71449

⸱

31 ביולי 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetic Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Institute for NanoBioTechnology, Johns Hopkins University

במאמר זה

סיכום

העברת עורכי גנום כ-RNA היא אמצעי עוצמתי במיוחד לשינוי הגנומים של תאי יונקים ראשוניים וקווי תאים. מטרת הפרוטוקול היא להעביר עורכי גנום כ-mRNA לתאים ראשוניים ולקווי תאים ביונקים, ולאחר מכן ריצוף וניתוח ממוקדים של Illumina כדי לכמת את תוצאות העריכה.

תקציר

עורכי CRISPR כולל נוקלאזים, עורכי בסיס ועורכי ראש יכולים לתקן ביעילות וריאנטים גנטיים הגורמים למחלות או לשבש גנים יעדיים. תוצאות עריכה מוערכות לעיתים קרובות בתאים ראשוניים מתורבתים, תאים שמקורם במטופל או קווי תאים מהונדסים כדי לחקור את השפעת השונות הגנטית או כצעד ראשון לפני התחלת מחקרים בבעלי חיים או תרגום קליני. העברת עורכים כ-mRNA יחד עם RNA מדריך סינתטי לתאים יונקים יכולה לשפר את יעילות העריכה ביחס לגישות מבוססות פלסמידים ולמנוע בעיות כמו שילוב DNA או עריכה מחוץ למטרה של ביטוי מתמשך. מאמר זה מציג תהליך להכנת mRNA לעורך גנום באמצעות שעתוק חוץ גופי (IVT), הכולל כיסוי קו-טרנספריפסיונלי ונוקלאוטידים שעברו שינוי כימי, mRNA עורך אלקטרופורטים ו-RNA מונחים לפיברובלסטים ראשוניים בבני אדם, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) או קווי תאים לימפובלסטואידיים (LCLs), וכימות תוצאות העריכה באמצעות ריצוף אמפליקונים ממוקד בפלטפורמת Illumina ואחריו ניתוח באמצעות CRISPResso2. תהליך עבודה זה מאפשר בנצ'מרקינג כמותי של RNA מנחים, פרמטרי אלקטרופורציה וגרסאות עורך, ותומך ביישומים בהמשך כולל שיבוט תא יחיד, בדיקות פנוטיפיות, מחקרים פרה-קליניים בבעלי חיים ופיתוח טיפולי.

מבוא

עריכת גנום יעילה בתאי יונקים ראשוניים תומכת ביצירת מודלים גנטיים ובהערכה פרה-קלינית של אסטרטגיות טיפוליות מועמדות. התקדמות אחרונה בטכנולוגיות מבוססות CRISPR, כולל עריכת בסיסים ועריכת פריים, מאפשרת שינויים מדויקים בנוקלאוטידים מבלי להכניס שבירות DNA דו-גדיליות, ובכך משפרת את טוהר תוצאות העריכה 1,2. טכנולוגיות אלו יושמו בהצלחה במודלים של מחלות ועריכת גנום טיפולית, כולל אסטרטגיות לתיקון וריאנטים שמובילים למחלת אנמיה חרמשית3 ולסיסטיק פיברוזיס4.

אסטרטגיה יעילה במיוחד להעברת רכיבי עריכת הגנום לתאי יונקים היא אלקטרופורציה של mRNA מתועתק במבחנה (IVT) המקודדת את אנזים העריכה בשילוב עם RNA מנחה סינתטי (gRNAs). העברת mRNA מאפשרת ביטוי זמני של עורכי הגנום, מה שמפחית פעילות נוקלאז ממושכת ומפחית את הסיכוי לאירועי עריכה לא מדויקים. התקדמות בטכנולוגיית IVT שיפרה את היעילות, התפוקה והאיכות של סינתזת mRNA 4,5,6. תבניות DNA של פלסמיד ותבניות DNA שמקורן ב-PCR משמשות לעיתים קרובות לשעתוק במבחנה, ולכל אחת מהן יתרונות ומגבלות ייחודיות. בפרוטוקול זה, תבניות שנוצרות על ידי PCR מועדפות כדי למנוע בעיות הקשורות להפצת מסלולי פולי(A) ארוכים בפלסמידים, הנוטים לרקומבינציה ולשינויים באורך. עם זאת, שימוש בתבניות PCR כפי שמתואר בפרוטוקול זה דורש פריימר הפוך יקר שמכיל את זנב פוליא(A) של 120 נוקלאוטידים, ו-PCR עשוי להיות רגיש יותר לשגיאות מאשר התפשטות חיידקית של פלסמידים עבור רצפים שאינם מקודדים בפריימרים. כחלופה, ספקים מסחריים כמו Elegen ו-4basebio יכולים לספק תבניות DNA באיכות גבוהה, ולהציע אפשרות אמינה, אם כי יקרה יותר, ליצירת תבניות שעתוק.

תכנון RNA מונחה קפדני הוא מרכיב קריטי נוסף בניסויי עריכת גנום מוצלחים. פותחו מספר כלים חישוביים לסיוע לחוקרים בזיהוי רצפי gRNA אופטימליים בהתבסס על יעילות חזויה במטרה ופעילות מינימלית מחוץ למטרה. פלטפורמות בשימוש נרחב כוללות את CHOPCHOP ו-CRISPOR, המאפשרות זיהוי רצפי מדריך התואמים לדרישות המוטיב הסמוך לפרוטוספייסר (PAM) של אנזימי Cas ומספקות מדדי ניקוד להעדפת מדריכים מועמדים עם פעילות וספציפיות חזויה גבוהה 7,8. העקרונות הבסיסיים והפרקטיקות המומלצות לתכנון RNA המדריך תוארו בהרחבה בספרות CRISPR9,10,11,12,13.

אלקטרופורציה משמשת לעיתים קרובות להעברת מגיבים לעריכת גנום לתאים יונקים, משום שהיא יכולה להשיג יעילות אספקה גבוהה בסוגי תאים שבדרך כלל עמידים לשיטות טרנספקציה מבוססות ליפידים. האלקטרופורציה חודרת זמנית לממברנת התא, ומאפשרת לחומצות גרעין חיצוניות כמו mRNA ו-gRNA להיכנס לציטופלזמה. פרוטוקולי אלקטרופורציה אופטימליים פותחו עבור סוגי תאים יונקים שונים, כולל תאים ראשוניים, פיברובלסטים, קווי תאים לימפובלסטואידיים ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים14. פלטפורמות אלקטרופורציה מסחריות כמו מערכות Lonza 4D ו-Amaxa מספקות תוכניות ומגבים ספציפיים לסוג תאים, שנועדו לשפר את יעילות האספקה תוך שמירה על חיוניות התא. מערכות אלקטרופורציה בעלות תפוקה גבוהה כמו פלטפורמת המעבורת Amaxa עם 96 בארות מאפשרות גם ניסויים ניתנים להרחבה של עריכת גנום בתנאים ניסיוניים שונים. מערכת האלקטרופורציה Neon גם היא נפוצה אך אינה מוקד הפרוטוקול הזה.

לאחר אספקת רכיבי עריכת הגנום, תוצאות העריכה מוערכות בדרך כלל באמצעות ריצוף ממוקד מהדור הבא (NGS) של האזור הגנומי שמקיף את אתר העריכה. ספריות ריצוף נוצרות על ידי הגברת PCR של מיקום היעד, ואחריה אינדוקס וריצוף בתפוקה גבוהה. קריאות הריצוף המתקבלות מנותחות באמצעות צינורות ביואינפורמטיים מיוחדים המיועדים לניסויי עריכת גנום. בפרוטוקול זה, תוצאות העריכה נמדדות באמצעות CRISPResso2, פלטפורמה חישובית נפוצה המאפשרת ניתוח מפורט של תוצאות עריכת הגנום מנתוני ריצוף15. CRISPResso2 מיישרת קריאות רצף לרצף ייחוס ומכמת את תוצאות העריכה, כולל יעילות עריכה כללית, תדרי הכנסה–מחיקה (indel), החלפות מדויקות של נוקלאוטידים והתפלגויות עריכה ברחבי אזור היעד. התוכנה מספקת גם ויזואליזציות גרפיות וסיכומים סטטיסטיים שמסייעים בהשוואה בין תנאי ניסוי ואופטימיזציה של פרמטרי עריכה.

ביחד, שילוב ייצור mRNA איכותי של IVT, העברה אופטימלית באמצעות אלקטרופורציה וניתוח ריצוף ברזולוציה גבוהה מספק תהליך עבודה איתן להערכת אסטרטגיות עריכת גנום בתאים מתורבתים (איור 1). גישה זו מאפשרת אופטימיזציה איטרטיבית של יעילות העריכה, הספציפיות והפרמטרים הניסיוניים לפני קידום אסטרטגיות עריכת הגנום לעבר מחקרים בחיים ויישומים טיפוליים פוטנציאליים.

פרוטוקול

הצהרת אתיקה:
כל ההליכים הכוללים קווי תאים שמקורם בבני אדם בוצעו בהתאם להנחיות מוסדיות ולפרוטוקולים מאושרים.

1. יצירת תבנית DNA ליניארית באמצעות PCR

זהירות: בצע את כל שלבי ה-RNA באמצעות חומרים מתכלים ומשטחי עבודה ללא RNase. יש לשקול את עורכי ה-mRNA הרשומים ואת הווריאנטים השונים שלהם בעת בחירת העורך המתאים לשינוי הגנומי המיועד (טבלה 1).

  1. הרכיבו את תגובת ה-PCR על DNA פלסמיד שהופק מחיידקים באמצעות ערכת מיניפרפ או מידיפרפ. השתמשו ב-20 ng של DNA פלסמיד לכל תגובת PCR של 50 מיקרוליטר עם האנזים NEBNext Ultra II Q5 Master Mix, והרכבו את ה-PCR כפי שמתואר בטבלה 2.
    1. השתמש בפריימר קדמי שמתקן את המקדם הלא פעיל של T7 בפלסמיד, שמונע שעתוק מעגלי.
    2. השתמשו בפריימר הפוך שמציג זנב פולי(A)₁₂₀ של 120-NT כדי לתמוך בתעתוק יעיל וביציבות mRNA.
    3. השתמשו ב-N1-מתיל-פסאודורידין במקום אורציל וכללו את CleanCap AG לשיפור תרגום ה-mRNA ולהפחתת הפעלה חיסונית מולדת 1,2,3,4 (איור 1).
      הערה: קיימים אנלוגים נוספים לנוקלאוטידים וראגנטים מכיסויים נוספים, אך הם הראו בעקביות פעילות גבוהה בעריכת הגנום של mRNA. אספקה מבוססת ננו-חלקיקים היא חלופה מתאימה אך אינה נדונה בפרוטוקול זה.
  2. הגביר את רצף הקידוד של העורך באמצעות PCR למשך 30 מחזורים באמצעות פריימרים שמכניסים פרומוטר T7 פונקציונלי במעלה אזור הקידוד ורצף poly(A) במורד הזרם (טבלה 2 וטבלה 3).
    הערה: רצף הנוקלאוטידים של תבנית IVT מסומן בטבלה 4.
  3. אמת וטהר את מוצר ה-PCR
    1. הרץ 5 מיקרוליטר של מוצר PCR על ג'ל אגרוז 1% בבופר TE במתח 180 וולט למשך 30 דקות. אשר את קיומו של רצועה אחת בכ-4000-6500 bp (תלוי בעורך המתמלל) לפני המשך לטיהור מוצר PCR.
    2. לטהר את מוצר ה-PCR באמצעות ערכת ניקוי PCR (טבלת חומרים).
      הערה: אם נצפים רצועות מרובות או איכות ירודה של מוצרי PCR, יש לייעל את תנאי התרמחזור (טבלה 5 – טבלת פתרון תקלות).
    3. כמת את ה-DNA המטוהר באמצעות בדיקת dsDNA פלואורומטרית. לניתוח קיוביט dsDNA, יש להכין את תערובת המאסטר של צבע בופר על ידי שילוב 796 מיקרוליטר של תמיסת קיוביט רגישה גבוהה עם 4 מיקרוליטר צבע, שניהם מסופקים בערכה.
    4. בצינורות נפרדים, מערבבים 198 מיקרוליטר של תערובת המאסטר של צבע בופר עם 2 מיקרוליטר של תקן S1 בריכוז נמוך, תקן S2 בריכוז גבוה והדגימה. הכנס כל תקן ודגימה כפי שמתבקש במכשיר הפלואורומטר של קיוביט כדי למדוד את ריכוז המלאי.
      הערה: אם הדגימות מעל טווח הניתוח, ייתכן שיהיה צורך להכין דילול.

2. תעתיק את ה-mRNA

  1. הכינו את תגובת IVT על קרח באמצעות T7 RNA פולימראז, NTPs, אנלוג לכיסוי לכיסוי קו-טרנספירציוני, ו-N1-מתיל-פסאודורידין טריפוספט כתחליף לאורידין כדי להפחית את ההפעלה החיסונית המולדת1˒5˒6.
  2. הכינו את תערובת תגובת ה-IVT לפי טבלה 4. השתמשו ברצף התבנית המוערת שמופיע בטבלה 4. הרכיבו כל תגובת שעתוק בנפח סופי של 40 מיקרוליטר.
  3. הכינו 5–10 צינורות תגובה ליצירת מספיק mRNA למספר ניסויים. כל תגובה של 40 מיקרוליטר מייצרת כ-100 מיקרוגרם mRNA. עם 1 מיקרוגרם mRNA המשמש לעריכת אלקטרופורציה ראשונית ו-3 מיקרוגרם mRNA לעריכת אלקטרופורציה בסיסית, זה מספיק ל~33–100 אלקטרופורציות.
  4. תמלל את ה-RNA
    1. ערבב היטב את תגובת ה-IVT על ידי פיפטינג. דגרו את התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
  5. לטהר את ה-RNA
    1. העבר לצינור בנפח 1.5 מ"ל ומוסף תמיסת ליתיום כלוריד (LiCl) בעוצמה של 7.5 מ' לתגובת ה-IVT בנפח השווה למחצית מנפח התגובה הכולל כדי להגיע לריכוז LiCl סופי של 2.5 מ'. לתגובה IVT של 40 מיקרוליטר, הוסף 20 מיקרוליטר של 7.5 מטר LiCl. ערבבו היטב על ידי פיפטינג עדין.
    2. דגרו את התגובה בטמפרטורה של מינוס 20°C למשך 30 דקות. צנטריפוגה את הדגימה ב-16,000 × גרם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    3. הסר את הסופרנטנט עם פיפטה וזרוק אותו. שטפו את הכדור עם 1 מ״ל 70% אתנול בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לא הכרחי להפריע לכדור. צנטריפוגה ב-16,000 × גרם ב-4°C למשך 5 דקות.
    4. הסר את האתנול לחלוטין ותן לכדור להתייבש באוויר למשך 1-2 דקות בארון בטיחות ביולוגית ללא RNase. אל תייבש יותר מדי את הכדור כי יהיה קשה להחזיר אותו.
  6. השעיה מחדש וכימות של ה-RNA
    1. החזירו את ה-RNA למים ללא נוקלאז. בהתחלה החזירו כל תגובה ל-50 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז ומדללים עוד לאחר מדידת ריכוז ה-RNA. כמת את ה-RNA באמצעות מבחן RNA פלואורומטרי כמו ננו-דרופ.
      נקודת הפסקה: לאחר כימות ואליקוטינג של RNA, אחסן את האליקוטים של ה-mRNA בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לאלקטרופורציה. הימנעו ממחזורי הקפאה והפשרה חוזרים; הפשיר כל אליקו רק פעם אחת לפני השימוש.
    2. אשר כי תפוקת ה-mRNA המטוהרת היא כ-100-400 מיקרוגרם לכל תגובה של 40 מיקרו-ליטר IVT. מדלל את ה-mRNA ל-2 מיקרוג·מיקרוליטר-1 עם מים ללא נוקלאז לפני ההפרדה. אחסן את האליקווטים ב-−80°C.
      הערה: הימנעו ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים. הכינו אליקווטים חד-פעמיים והשליכו חומר מפשיר שלא נוצל. הכינו 12.5 מיקרוליטר אליקוטים ברצועות PCR ל-8–20 אלקטרופורציות לכל אליקווט.
  7. הערכת שלמות ה-RNA
    1. הערכת גודל ושלמות ה-RNA באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז או אלקטרופורזה אוטומטית (איור 2)
    2. הכינו ג'ל אגרוז 0.8% המכיל 10,000 פעמים SYBR זהב מדולל. השתמש בסולם RNA חד-גדילי, כמו סמן nesb ssRNA.
    3. דנטור ה-mRNA באמצעות צבע ג'ל טעינה של 2x RNA וחימום דגימות ל-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני טעינת הדגימות על הג'ל.
    4. אשר שה-mRNA מופיע כרצועה דומיננטית בכ-4000-6500 NT, בהתאם לעורך המתמלל, עם טשטוש מינימלי או תוצרים בעלי משקל מולקולרי נמוך. השליכו דגימות RNA שמראות התדרדרות משמעותית, טשטוש או רצועות בלתי צפויות מרובות.

3. תכנון והכנה של RNA מנחים

הערה: זהה רצפי מוטיב סמוך (PAM) של פרוטוספייסר בתוך לוקוס הגנומי היעד ובחר RNA מנחים התואמים לעורך הנבחר ולשינוי הגנומי המיועד לזה. פלטפורמות עיצוב RNA מדריכים כגון CHOPCHOP, CRISPOR, CRISPRware, IDT Cas9 Checker, Benchling ו-VectorBuilder יכולות לשמש לתעדוף RNA מנחה עם פעילות וספציפיות חזויהחיובית 6,7,8,9,10,11,12,13.

  1. זיהוי אתרי PAM בלוקוס הגנומי המטרה התואמים לווריאנט הנוקלאז הנבחר, כולל וריאנטים תואמי NGN, באמצעות כלי תכנון RNA מנחים.
  2. בחירת RNA מדריך עם פעילות חזויה גבוהה במטרה ופעילות נמוכה מחוץ למטרה החזויה. אשר את חלון העריכה עבור ה-RNA המדריך.
  3. עבור יישומי עריכת בסיס או עריכה ראשונית, בחרו RNAים מנחים שממקמים את העריכה המיועדת בתוך חלון הפעילות האופטימלי של העורך הנבחר.
  4. סדר sgRNA או pegRNA המכיל אנלוגים של בסיס 2'-O-מתיל עבור שלושת הנוקלאוטידים הראשונים והאחרונים, וכן קישור של 3' פוספורותיואט בין שלושת הבסיסים הראשונים והאחרונים של המדריכים.
  5. תליית מחדש את ה-RNA המנחה במים ללא נוקלאז או בופר TE (100μM). הכינו 5 מיקרוליטר אליקווטים ואחסנו את האליקוטים בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס. בזמן השימוש, יש להפשיר ולדלל בבופר האלקטרופורציה לפני האלקטרופורציה.

4. הכנת תרבית תאים

הערה: יש להעריך את שלמות התא באמצעות מיקרוסקופיה ובדיקות כדאיות לפני האלקטרופורציה.

  1. תרבית פיברובלסטים ראשוניים או תאי HEK293T ב-DMEM עם תוספת של 10% FBS, 4.5 גרם· L-1 גלוקוז, GlutaMAX, ו-110 מ"ג· L-1 נתרן פירובאט. לוחות את התאים על בקבוקי T75 סטריליים (משטח TC) בנקודת חיבור של 20% לכל בקבוק. שמור על התאים בין המעברים 1-20. פיצלו תאים ב-80% מפגש והשתמשו בתאים ב-70-80% לצורך אלקטרופורציה.
  2. תרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים במדיה mTeSR Plus. לוחות את התאים על בקבוקי T75 סטריליים מצופים בג'לטרקס ב-20% חיבור לכל בקבוק. החלף מדיה מדי יום ותשמור על התאים בין קטעים 1-20. הוסיפו קוקטייל CEPT למדיה במשך 24 השעות אחרי כל קטע. פיצלו תאים ב-80% מפגש והשתמשו בתאים ב-70-80% לצורך אלקטרופורציה.
  3. שמרו על התאים בטמפרטורה של 37°C ב-5% CO₂ עד שהתאים מגיעים לצפיפות המתאימה לאלקטרופורציה, בדרך כלל 70%–80% קונפלונציה.
  4. הסר את המדיה כאשר התאים נמצאים במספר מתאים ובמפגש מתאים לאלקטרופורציה.
  5. מוסיפים את אנזים TrypLE Express לתאים (1 מ"ל לבקבוק T75) ולדגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הפעל בעדינות את התאים כנגד הבקבוק כדי לקבל תלייה חד-תאית. הפסק את הדיסוציאציה על ידי הוספת 3 מ"ל של מדיום תרבית תאים, ואישור היעדר גושי תאים גדולים לפני הספירה.
  6. הכדור של התאים ב-1,000 × גרם למשך 5 דקות, שטוף את התאים פעם אחת עם 15 מ"ל מלח מפופר פוספט (DPBS) של דולבקקו, וצנטריפוגה שוב את התאים.
  7. הערכו את ריכוז התאים והכדאיות באמצעות בדיקת כדאיות אוטומטית כמו Nucleocounter NC-3000 עם תמיסה 13. משלבים 11.4 מיקרוליטר של תאים עם 0.6 מיקרוליטר של תמיסה 13 לפני המדידה על ה-Nuclipocounter. המשך באלקטרופורציה רק כאשר החיוניות של התא היא לפחות 85%, וזרוק או הכן מחדש דגימות מתחת לסף זה.
  8. החזירו את התאים בצפיפות של כ-0.5 × 106–2 × 106 תאים·מ"ל-1 ב-DPBS. ספרו את התאים והערכו את הקיימות באמצעות המוציטומטר או מונה תאים.
  9. המשך רק אם החיוניות של התא ≥ 85%.
  10. החזירו את התאים לבופר אלקטרופורציה. החזירו 2 ×-105 תאים ב-5 מיקרוליטר של בופר אלקטרופורציה קר בכל תגובה.
  11. הכינו את בופר האלקטרופורציה עם תמיסת התוסף לפי הוראות היצרן מיד לפני השימוש ושמרו על הבופר על קרח.
  12. שמרו על התאים קרים והתקדמו במהירות. שמור על התאים על קרח והמשך מיד למערכת האלקטרופורציה.

5. אלקטרופורציה

הערה: הכינו עריכת מטען בצינורות פס PCR כדי להקל על פיפטינג רב-ערוצי. לאחר האלקטרופורציה, החזירו את התאים לתחום המשולב עם קוקטייל CEPT כדי לשפר את הישרדות התאים.

  1. הכינו את מטען ה-RNA.
    1. הכינו את מטען ה-RNA על הקרח על ידי שילוב העורך mRNA ו-RNA(ים) המונחים בבופר האלקטרופורציה.
    2. לעורכי בסיס ונוקליאזים, יש להכין תמיסת אלקטרופורציה סופית המכילה 1.5 מיקרו-ליטר (3 מיקרוגרם) של mRNA, 0.5 מיקרוליטר (50 פיקו-מול) של RNA מונחה, ו-15 מיקרו-ליטר של בופר אלקטרופורציה לכל דגימה.
    3. לעורכים ראשוניים, יש להכין תמיסת אלקטרופורציה סופית המכילה 0.5 מיקרו-ליטר (1 מיקרוגרם) של mRNA, 1.5 מיקרוליטר (150 pmol) של RNA מנחה, ו-15 מיקרו-ליטר של בופר אלקטרופורציה לכל דגימה.
    4. הכינו את פתרונות המטען של ה-RNA כמאסטר 1.2× כדי לפצות על אובדן נפח במהלך ההעברה והטיפול בדגימות. אופטימיזציה של נפחי המגיב והיחסים לכל אתר יעד וגרסה של עורך לפי הצורך.
  2. פזר את התאים, המטען והאלקטרופוראט.
    1. הוסיפו 5 מיקרוליטר מתליית התא לכל באר אלקטרופורציה.
    2. הוסף 17 מיקרוליטר מטען RNA בבופר אלקטרופורציה ל-5 מיקרוליטר תאים. מערבבים את המתלים על ידי פיפטינג פעמיים.
      זהירות: המשך במהירות לאחר שילוב התאים ומטען ה-RNA, כי RNאזות המופרשות על ידי התאים עלולות לפרק במהירות את ה-mRNA של העורך. השלים את האלקטרופורציה תוך 2 דקות לאחר ערבוב התאים ומטען ה-RNA.
    3. הרץ את תוכנית האלקטרופורציה המותאמת לסוג התא הנבחר (טבלה 6; איור 2; איור 3).
      1. לפיברובלסטים ראשוניים בעור אנושי או לתאי HEK293T, השתמשו במערכת האלקטרופורציה Lonza 4D עם בופר SF. הוסף 200,000 תאים בכל תגובה לקובטה אלקטרופורציה של 20 מיקרולטר. הרץ את התוכנית CM-130. מיד הוסיפו 80 מיקרוליטר DMEM מחומם מראש + 10% FBS, 4.5 גרם· L-1 גלוקוז, 4 מ"מ L-גלוטמין, ו-110 מ"ג· L-1 נתרן פירובאט. שחזרו תאים למשך 10 דקות לפני שמדללים לפלטות של 96 או 24 בארות.
      2. לתאי גזע פלוריפוטנטיים, השתמשו במערכת האלקטרופורציה Lonza 4D עם בופר P3. הוסף 200,000 תאים בכל תגובה לקובט אלקטרופורציה של 20 מיקרוליטר. הרץ את התוכנית DN-100. מיד הוסיפו 80 מיקרוליטר של מדיה mTeSR Plus מחוממת מראש. שחזור תאים למשך 10 דקות לפני הדילול לצלחות של 24 בארים.
    4. בדקו את התאים מדי יום לאחר השריון כדי לעקוב אחרי בריאות התאים והתאוששותם.

6. חילוץ DNA גנומי

הערה: ודא ש-DNA גנומי באיכות מספקת וללא מעכבים לפני הגברת PCR, שכן איכות ה-DNA יכולה להשפיע על הכנת ספריית הריצוף וכימות מדויק של תוצאות עריכת הגנום9,10,11.

  1. שטוף וקצור את התאים.
    1. אסוף את התאים 2-3 ימים אחרי האלקטרופורציה. שטוף את התאים פעם אחת עם DPBS וממשיך מיד להפקת DNA גנומי.
    2. הכינו בופר פירוק לא שלם על ידי שילוב של 10 מ"ל של 1 מטר טריס-HCl (pH 8.0), 5 מ"ל של תמיסת סודיום דודציל סולפט (SDS) של 10% (משקל/נפח), ומים נטולי נוקלאז לנפח סופי של 1 ליטר. אחסן את בופר הפירוק הבלתי שלם בטמפרטורת החדר למשך עד 6 חודשים.
    3. הכינו את בופר הליזה המלא טרי על ידי הוספת פרוטאנאז K בדילול של 1:1,000 (נפח/נפח) ל-aliquot של בופר ליזיס לא שלם. הוסף את בופר הליזה המלא לתאים כדי להתחיל את הליזה. הוסף 40 מיקרוליטר של בופר ליזיס מלא לכל באר המכילה כ-80,000 תאים בלוח באר של 96. אל תבצע פיפט למעלה ולמטה כי זה עלול לגרום לאובדן דגימה.
  2. תעכל את הדגימות.
    1. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות להשלמת פירוק התאים ועיכול ה-K.
  3. נטרל פרוטינאז K.
    1. העבר את הליזטים לצינורות PCR או לפלטת PCR עם 96 בארים. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לנטרל את פרוטנאז K.
  4. אחסן את הליזאטים.

נקודת הפסקה: אחסן את הליזאטים בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס עד להגברת PCR.

7. רצף אמפליקונים ממוקד לניתוח עריכה

הערה: מוצרי PCR בכמויות אקווימולריות לפני ריצוף. כ-10,000 קריאות ריצוף לכל דגימה בדרך כלל מספיקות לכימות תוצאות עריכת גנום בכמויות גדולות.

  1. תעצב פריימרים ספציפיים ללוקוס שיפיקו כ-300 bp מגברים במהירות של לפחות 25 bp במעלה הזרם ו-25 bp במורד אתר העריכה (טבלה 7).
  2. הגבירו את מיקום הגנום היעד על ידי ביצוע PCR1 בהתאם לתנאים המפורטים בטבלה 8, טבלה 9.
  3. הוסף מדדי דגימה ייחודיים לפי PCR באמצעות מכפלת PCR1 כתבנית, כמו כאשר פריימרים מוצגים בטבלה 7 "דוגמה ל-PCR אינדוקס פריימר". השתמש בתנאי PCR כפי שמוצג בטאב 2 בטבלה 8 ובטבלה 9.
  4. הרץ את מוצרי PCR1 ו-PCR2 על ג'ל אגרוז 1.5% כדי לאשר את נוכחות רצועות בודדות בגדלים הצפויים.
  5. איחד את מוצרי PCR2 בכמויות אקווימולריות. נקה את ספריית PCR2 המאגדת באמצעות יחס חרוזים לדגימה של AMPure XP של 0.65:1 לפי הוראות היצרן. שחרור את הספרייה המטוהרת ב-30 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז ואשר הסרת דימרים מתאמים באמצעות אלקטרופורזה ג'לית לפני הריצוף.
  6. כמת את הספרייה המאוחדת הסופית באמצעות בדיקת dsDNA פלואורומטרית. הערכת התפלגות גודל הקטעים באמצעות אלקטרופורזה קפילרית.
  7. רצף את הספריות באמצעות קריאות חד-קצוות של 300 מחזורים על כלי MiSeq של Illumina. מדלל את הספרייה המאוחדת הסופית ל-4 ננומטר. משלבים 5 מיקרו-ליטר את ספריית 4 ננומטר המאוחדת עם 5 מיקרו-ליטר של 0.1 M NaOH ופיפט לערבוב. דגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לדמוט, ואז הוסיפו 990 מיקרוליטר של בופר HT מקורר שמספק ערכת MiSeq לנטרול התמיסה ודילול ל-20 pM. ספייק, שליטה של 15% ב-PhiX. טען את הספרייה על מחסנית Illumina MiSeq והריץ רצף חד-קצה של 300 מחזורים באמצעות הגדרות הרצה הסטנדרטיות של היצרן. שאף לייצר כ-30,000 קריאות לכל דגימה, אם כי 10,000 קריאות לכל דגימה מספיקות לעריכת ניתוח12. ריצוף MiSeq ניתן לבצע לפי מדגם בחברות מסוימות כמו Genewiz או Quintara.

8. ניתוח תוצאות עריכת גנום

הערה: ניתוח CRISPResso2 מאפשר כימות של יעילות העריכה הכוללת, תדירויות המרת נוקלאוטידים ותדרי החדרה/מחיקה (indel), וניתן להשתמש בו לאפיון תוצאות עריכה בתנאי ניסוי15.

  1. דה-מולטיפלקס נתוני הריצוף וארגן את קבצי FASTQ לפי לוקוס גנומי ותנאי ניסוי.
  2. התקן את CRISPResso2 לפי ההוראות שמופיעות במאגר Github (https://github.com/pinellolab/crispresso2).
  3. הרץ ניתוח אצווה של CRISPResso2 באמצעות קבצי batch.txt שמגדירים את קבצי FASTQ הקלט ואת פרמטרי הניתוח (דוגמאות מופיעות בטבלה 7). הגדר את ציון איכות הקריאה המינימלי ל-30. הגדר את רוחב חלון ה-"w" ל-20. אם משתמשים בעורכי בסיס ציטוזין, ניתן למרכז חלק מהאינדלים סביב הנוקלאוטידים הערוכים בבסיס בנוסף לאתר הנייק. במקרה כזה, תכוון את מרכז החלון "WC" ל-10- במקום למרכז ברירת המחדל באתר ה-nick כדי לתפוס בצורה הטובה ביותר את האינדלים האלה.
  4. חלץ פלטים כמותיים, כגון תדרי המרת נוקלאוטידים, תדרי הכנסה/מחיקה (אינדל), ואם רלוונטי, תדרי HDR או עריכה ראשוניים מקבצי הפלט הסיכומים המתאימים. אלה נמצאים בדרך כלל בקבצים בשם "CRISPRessoBatch_quantification_of_editing_frequency.txt" ו-"Nucleotide_percentage_summary.txt", שניתן לפתוח במיקרוסופט אקסל או בתוכנות עריכת גיליונות אלקטרוניים אחרים.
  5. ייצא את ערכי העריכה הכמותיים לגרפים ופרשנות נתונים במורד הזרם, כפי שמופיע באיורים 3-4. השתמש בקבצי "alleles_frequency_table_around_sgRNA.pdf" (כפי שמוצג באיור 5) כדי להעריך תוצאות עריכה אלליות.

תוצאות

שימוש בעורך יעיל עם אתר בדיקה נגיש בקלות, כמו עורך הבסיס ABE8e עם אתר הבקרה HEK3, יכול לעיתים לגרום ליעילות עריכה מעל 90% אם מערכת ההפצה מתאימה היטב לתאים בהם השתמשו בניסוי. יעילות עריכה נמוכה יותר עלולה להיווצר אם יש בעיות ב-mRNA של העורך, ב-RNA המנחה, באתר היעד או בתנאי ההפצה שהופכים אותם לפחות מתאימים לעריכה. שימוש בגרסאות Cas9 שמגישות לרצפי PAM גמישים יותר אך קושרים אותם פחות חזק, או מכוונים עורכים לנוקלאוטידים שמחוץ לחלון העריכה האידיאלי שלהם, יכולים להפחית את יעילות העריכה. mRNA עורכים מוצלחים שנוצרו על ידי IVT מופיעים בדרך כלל כרצועה דומיננטית אחת עם טשטוש מינימלי או תוצרי פירוק במשקל מולקולרי נמוך, מה שמעיד על שלמות תמלול גבוהה המתאימה לאלקטרופורציה במורד הזרם (איור 2).

לאחר אלקטרופורציה של mRNA עורך ו-RNA מדריך סינתטי, רוב התאים מתאוששים תוך 24–48 שעות ושומרים על המורפולוגיה הטיפוסית שלהם עם תוכניות אלקטרופורציה מתאימות (איור 3–4). תנאי האלקטרופורציה צריכים להיות מותאמים לסוג התא הספציפי, שכן בופרים שונים יכולים להניב תוצאות שונות באופן ניכר. מרכז הידע המקוון של לונזה מציע המלצות על קודי בופר ואלקטרופורציה לסוגי תאים נפוצים, ולונזה מציע ערכות אופטימיזציה נפרדות לקווי תאים ותאים ראשוניים. השוואה אמפירית של מאגרים יכולה לסייע בזיהוי תנאים מיטביים לאספקה יעילה. תוכניות לא מתאימות עלולות להוביל לאי-אספקה כלל או להיות רעילים מאוד לתאים (לאבד מעל 50% או למנוע המשך מחזור התא). ניסויי אופטימיזציה מייצגים הראו הבדלים משמעותיים בתוצאות העריכה בתנאי אלקטרופורציה, כאשר חלק מהתוכניות הניבו יעילות עריכה גבוהה בעוד אחרות הפיקו עריכה מינימלית, מה שמדגיש את חשיבות האופטימיזציה האמפירית לכל סוג תא (איור 3–4).

ב-iPSCs, פיברובלסטים ו-LCLs, נעשה שימוש בריצוף אמפליקונים ממוקד ואחריו ניתוח CRISPResso2 לכימות יעילות העריכה ותוצרי לוואי (איור 4). עריכת בסיסי אדנין של לוקוס הבדיקה HEK3 מוצגת כאן (איור 4), שהובילה להמרות נוקלאוטידים המיועדות עם תדירויות אינדל נמוכות בדגימות שנבדקו. ניתוח CRISPResso2 מאפשר הדמיה של אללים ערוכים ולא ערוכים בלוקוס היעד ומסייע לכימות המרות נוקלאוטידים מיועדות, תדירויות אינדל ותוצרי עריכה נוספים, ומספק הערכה מקיפה של תוצאות העריכה (איור 5). יעילות העריכה נמדדת על ידי מדידת תדירות ההחלפה המדויקת של נוקלאוטיד יחיד באתר היעד. הלוקוס HEK3 משמש כמוקד מודל בשל פרופיל העריכה המאופיין היטב שלו ויכולת השחזור שלו במערכות ניסיוניות, מה שמאפשר הערכה חזקה של ביצועי עריכת הבסיס בתנאים שונים. אנו ממליצים לבדוק מדריך זה כבקרה חיובית בתאים אנושיים בעת אופטימיזציה של הליכי עריכה חדשים. עריכת בסיס מועשרת בדרך כלל להמרות נוקלאוטידים מיועדות עם תדרי אינדל נמוכים, בעוד שעריכה ראשונית מניבה תערובת של עריכות מדויקות ותוצרי לוואי בתדר נמוך 3,12. יעילות העריכה השתנתה בין תנאים, עם הבדלים ברורים שנצפו בין סוגי תאים לתוכניות אלקטרופורציה (איור 3-4). שינויים אלו ככל הנראה משקפים הבדלים בקליטה תאית, בחיוניות ובפעילות תיקון DNA, וכן את השפעת פרמטרי האלקטרופורציה על יעילות המשלוח. ביחד, ממצאים אלו מדגישים את חשיבות האופטימיזציה הספציפית לסוג התא של הגדרות אלקטרופורציה להשגת תוצאות עריכה עקביות ומקסימליות.

figure-results-1
איור 1. הכנת mRNA עורך באמצעות תמלול במבחנה.
סקירה סכמטית של יצירת mRNA על ידי העורך. (שלב 1) הכנת תבנית פלסמיד המכילה את רצף הקידוד של העורך ומקדם T7. (שלב 2) הגברת PCR ליצירת תבנית DNA ליניארית. (שלב 3) שעתוק במבחנה באמצעות פולימראז Rna מסוג T7 לסינתזת mRNA מכוסה. (שלב 4) טיהור mRNA להסרת DNA תבנית, אנזימים ונוקלאוטידים חופשיים. ה-mRNA המכוסה שנוצר מתאים להעברה במורד הזרם לתאי יונקים באמצעות אלקטרופורציה או ננו-חלקיקים ליפידיים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2. דוגמה לתמונה של אלקטרופורזה בג'ל mRNA 
תמונת אלקטרופורזה של שלושה mRNA של עורך גנום הפועלת על ג'ל אגרוז 1% באמצעות צביעת זהב SYBR. סולם ssRNA מ-NEB מוצג משמאל עם סימני גודל המסומנים לאורך שלהם. היעדר טשטוש משמעותי או פסים קטנים מעיד על כך ש-mRNA אלו באיכות מתאימה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3. אופטימיזציה של תנאי אלקטרופורציה לעריכת גנום בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). 
יעילות עריכה שהושגה בתנאי אלקטרופורציה שונים ב-iPSCs מוצגות. התאים עברו אלקטרופורציה באמצעות מספר מאגרים ושילובי תוכניות, כולל בופר CB-150 P4, בופר CD-118 P3, בופר DN-100 P3, בופר DC-100 P3, כולם במכשיר Nucleofection 4D Lonza. העריכה הוערכה באמצעות מכשיר האלקטרופורציה ניאון עם פרמטרים (1600 וולט, 20 מילישניות, פולס אחד). יעילות העריכה נמדדה על ידי ניתוח ריצוף ממוקד של הלוקוס הערוך. N=1 לכל דגימה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 4. אופטימיזציה של תנאי אלקטרופורציה לעריכת גנום בפיברובלסטים.
יעילות עריכה לאחר אלקטרופורציה באמצעות תוכניות נוקליופקציה שונות. הפיברובלסטים עברו אלקטרופורציה באמצעות מספר תוכניות נוקלאופקטור של לונזה (CA-137, CM-138, DS-150, EH-100, EN-150, EO-114 ו-FF-113), ותוצאות העריכה נמדדו באמצעות ריצוף ממוקד. התוצאות מוצגות עבור שני שכפולים (P2, P3). בקרה שלילית ללא העברת עורך כלולה. השוואת קודי אלקטרופורציה מדגישה הבדלים ביעילות העריכה בין הגדרות אלקטרופורציה, ומאפשרת זיהוי פרמטרים מיטביים לעריכת גנום פיברובלסטים. N=1 לכל דגימה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-5
איור 5. אפיון תוצאות עריכת הגנום בלוקוס היעד. 
פלט טבלת תדירות אללים מ-CRISPResso2, המציגה את השפע היחסי של אללים ערוכים ולא ערוכים סביב אזור היעד של sgRNA, כפי שנקבע על ידי ניתוח רצף בתפוקה גבוהה לאחר העריכה. הערות אדומות מציינות את חלון העריכה הבסיסי ואת הפולימורפיזם ההטרוזיגוטי הקיים בקו התאים שבו השתמשו. רצף המרווח של ה-RNA המדריך מסומן באפור. "מיקום החיתוך החזויה" המוצג בקו מקווקוק מוזז ביחס למיקום הטיפוסי "PAM מינוס 3" עבור SpCas9 עקב שינוי מרכז החלון "wc" בקובץ הניתוח שלנו (דוגמה בטבלה 8). הדבר אינו מזיז בפועל את מיקום החיתוך האמיתי החזויה, אך הפלט מוצג כך כדי להצביע על כך שהאינדלים המקיפים את הקו המקווקוק בתוך חלון של 20 נוקלאוטידים יוערכו, וילכדו גם אינדל שבמרכז אתר הניקט האמיתי וגם את אלו שמרכזם בנוקלאוטידים דה-אמינים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

טבלה 1. עורכים ורצפים ששימשו במחקר זה 
טור 1: עורכי גנום זמינים ב-AddGene לתמלול במבחנה. שמות ומזהי Addgene לפלסמידים הזמינים המתאימים לשעתוק חוץ גופי כפי שמתואר בפרוטוקול זה. עמודה 2: רצפים של מרווחי RNA מנחים ששימשו במחקר זה. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 2. מגיבים PCR להגברה של תבנית הפלסמיד mRNA.
רשימת המגיבים ורכיבי התגובה המשמשים להגברת PCR של תבנית הפלסמיד ליצירת DNA ליניארי ליישומים במורד הזרם, וכן רצף הפריימרים של השעתוק הקדמי וההפוך. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 3. תנאי מחזור PCR להגברה של תבנית ה-mRNA. 
טבלה זו מפרטת את תנאי התרמחזור המשמשים להגברת תבנית ה-mRNA ב-PCR מ-DNA הפלסמיד לפני יישומים במורד הזרם. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 4. חומרים המשמשים לתגובות שעתוק במבחנה (IVT). 
טבלה זו מפרטת את התגובות ורכיבי התגובה המשמשים לשעתוק חוץ גופי לסינתזת mRNA של עורך מתוך תבנית ה-DNA הליניארית. רצף תבנית לדוגמה (ABE8e) מוצג עם אלמנטים מקודדים בצבעים. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 5. מדריך לפתרון תקלות לשלבים מרכזיים בתהליך עריכת הגנום. 
טבלה זו מסכמת בעיות טכניות נפוצות שעשויות להתעורר במהלך הכנת mRNA על ידי עורך באמצעות תעתוק במבחנה (IVT) וניתוח ריצוף MiSeq. לכל שלב בתהליך העבודה ניתנים בעיות פוטנציאליות, סיבות אפשריות ופתרונות מומלצים כדי לסייע באופטימיזציה של יעילות העריכה ולהבטיח זיהוי מדויק של תוצאות העריכה. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 6. תוכניות אלקטרופורציה אופטימליות לסוגי תאים יונקים שונים. 
טבלה זו מפרטת את קודי תוכנית האלקטרופורציה ותנאי הבופר המשמשים להעברה יעילה של mRNA עורך ולהנחות RNA לסוגי תאים יונקים שונים. פרמטרי האלקטרופורציה הרשומים נבדקו כדי לזהות תנאים שממקסמים את יעילות עריכת הגנום תוך שמירה על חיוניות התא. אותה תוכנית עשויה שלא לעבוד עבור כל קו תאים או מקור של תאים ראשוניים, ולכן מומלץ לבדוק חלופות מהרשימה הזו אם העריכה לא מצליחה בהתחלה. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 7. פרמטרי ניתוח CRISPResso2 לכימות תוצאות עריכת הגנום. 
הלשונית הראשונה מציגה דוגמה לעיצוב הפריימר HTS1 המשמש להגברה של לוקוס המטרה. הלשונית השנייה מספקת דוגמה לפריימרי האינדקס ששימשו במהלך הכנת הספרייה. הלשונית השלישית ממחישה דוגמה לסידור האינדקסים המשמש להקצאת אינדקסים ייחודיים לכל מדגם במהלך הריצוף. הלשונית הרביעית מכילה דוגמה לקובץ אצווה לניתוח CRISPResso2, והלשונית החמישית מספקת דוגמה נוספת לקובץ אצווה לניתוח CRISPResso2. יש לשים לב שמרכז החלון "wc" מותאם לעורכי בסיסים כדי להקל על זיהוי אינדל שממוקם במרכז הבסיסים המנוטרים בנוסף לאלו שמרכזים על חתך נוקלאז או אתר החתך. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 8. מגיבים PCR1 (טאב 1) ו-PCR2 (טאב 2) להכנת ספריית MiSeq.
טבלה זו מפרטת את התגובות ורכיבי התגובה ששימשו ב-Tab 1 (PCR1) להגברת לוקוסי הגנום היעד, וב-Tab 2 (PCR2) לשילוב רצפי אינדקס ספציפיים לדגימה ומתאמי ריצוף Illumina, המייצרים ספריות מוכנות לריצוף לניתוח MiSeq. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 9. תנאי מחזור PCR1 (טאב 1) ו-PCR2 (טאב 2) להכנת ספריית MiSeq.

טבלה זו מפרטת את תנאי התרמחזור המשמשים ב-Tab 1 (PCR1) להגברת אזורי הגנום היעד, וב-Tab 2 (PCR2) לשילוב רצפי אינדקס ספציפיים לדגימה ומתאמי ריצוף Illumina, היוצרים ספריות מוכנות לריצוף לניתוח MiSeq. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

דיון

פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה לעריכת גנום בתאי יונקים ראשוניים באמצעות אלקטרופורציה של mRNA עורך ו-RNA מדריך סינתטי. המשלוח כ-mRNA נוטה להניב עריכה יעילה יותר ביחס להעברת הפלסמידים, ו-mRNA נוטה להיות פשוט ועקבי יותר בין האצווה ביחס לחלבון עורך או ריבונוקלאוספרוטאין. כאשר השוו mRNA וצורות ריבונוקלאופרוטאינים של עורכי בסיס בעבודה קודמת, mRNA הניב יעילות עריכה טובה יותר3. בהשוואה לשיטות העברת פלסמיד או ויראליות, הפצה מבוססת mRNA מאפשרת ביטוי חולף והפחתת הסיכון לאינטגרציה גנומית, אם כי ייתכן שתידרש אופטימיזציה עבור סוגי תאים שונים. בנוסף ליעילות עריכה נמוכה יותר, השימוש ב-DNA פלסמיד לעריכת גנום טומן בחובו סיכון להשתלבות אקראית בגנום של תאי המטרה ועלול להגדיל את הסיכון לעריכה מחוץ למטרה עקב ביטוי ממושך של העורך. השילוב של ריצוף אמפליקונים ממוקד ו-CRISPResso2 מאפשר כימות סטנדרטי של יעילות העריכה ואפיון של כל תוצאה אללית3.

מספר גורמים חיוניים להצלחה. שלבים קריטיים בפרוטוקול זה כוללים שמירה על שלמות ה-RNA באמצעות טיפול קפדני ללא RNase, בחירת RNA מנחים אופטימליים, ואופטימיזציה מדויקת של תנאי האלקטרופורציה לכל סוג תא. שלמות ה-RNA ושליטה קפדנית ב-RNase משפיעים מאוד על התוצאות, ובחירת RNA מנחה נותרת גורם עיקרי ליעילות ולפרופילי תוצרי לוואי. הגדרות אלקטרופורציה דורשות אופטימיזציה אמפירית לפי סוג התא, וחלק מהתוכניות שמניבות עריכה גבוהה עלולות לגרום גם לרעילות. אם נצפתה יעילות עריכה נמוכה, יש לשקול אופטימיזציה של פרמטרי האלקטרופורציה, איכות ה-RNA או עיצוב RNA מנחה. אם מתרחשת רעילות מופרזת, הפחתת עוצמת האלקטרופורציה או קלט RNA עשויה לשפר את חיוניות התא. אסטרטגיות אופטימיזציה נוספות כוללות בדיקת בופרי אלקטרופורציה חלופיים ותוכנות המותאמות לסוג התא היעד, או שינוי ריכוזי עורך או מדריך RNA. תהליך עבודה זה מספק פלטפורמה מעשית לבניית עורכים ולייצור תאים מותאמים לפני שיבוט תא יחיד בהמשך, פנוטיפינג, מחקרים בחיים או פיתוח תרגומי. תהליך עבודה זה רלוונטי באופן רחב להערכת אסטרטגיות עריכת גנום בתאים ראשוניים, ומאפשר השוואה שיטתית של מודאליות עריכה בין הקשרים גנומיים וסוגי תאים. היא תומכת במידול מחלות באמצעות הכנסת או תיקון של וריאנטים קליניים רלוונטיים, וכן חקירה פונקציונלית של אלמנטים רגולטוריים מקודדים ולא-מקודדים. בנוסף, הוא מספק פלטפורמה לאופטימיזציה של גישות עריכה טיפוליות, כולל הערכת יעילות מדויקת, פעילות מחוץ למטרה ועמידות עריכה. זרימת העבודה יכולה לשמש גם לסינון ותעדוף RNA מנחים ומערכות עריכה, להערכת אסטרטגיות מסירה, ולבדוק וריאנטים ספציפיים למטופלים במסגרת רפואה מדויקת. ביחד, הוא משמש גשר רב-שימושי בין ביולוגיה גנומית בסיסית, מחקר תרגומי ופיתוח פרה-קליני. מגבלה של שיטה זו היא שיעילות האלקטרופורציה וחיוניות התאים יכולים להשתנות משמעותית בין סוגי תאים, מה שדורש אופטימיזציה אמפירית. בנוסף, תוצאות העריכה עשויות להיות תלויות בעיצוב ה-RNA המדריך ובטוהר, ובנגישות של מוקד היעד, מה שעשוי להגביל את השחזוריות בין מערכות ניסוי שונות. למרות מגבלות אלו, אופטימיזציה זהירה של פרמטרים ניסיוניים ועיצוב מדריך יכולה להפחית שונות, ולאפשר יישום אמין וניתן לשחזור של גישה זו במערכות תאיות מגוונות.

גילויים

N.W. ו-E.V.B. הגישו בקשות פטנט על טכנולוגיות עריכת גנום דרך אוניברסיטת ג'ונס הופקינס. G.A.N. הגישה בקשות פטנט הקשורות לטכנולוגיות עריכת גנום דרך מכון ברוד ואוניברסיטת ג'ונס הופקינס.

תרומת המחברים:
M.V., J.N.W., E.V.B, D.M.E., J.D. ו-G.A.N. ניסחו כל אחד קטעים נפרדים מהטקסט. מ.ו. אסף וערך את הטקסט הסופי ואחריו עריכות מכל המחברים.

תודות

אנו מודים לביאטריס אולאלה סאסטרה על דיונים מועילים בנוגע לפרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי פרס Big Beat Challenge של קרן הלב הבריטית ל-CureHeart (מספר הפניה לפרס). BBC/F/21/220106), קרן סיסטיק פיברוזיס (פרס NEWBY23XX0), והמכונים הלאומיים לבריאות של ארה"ב (R00HL163805 DP2OD038783 ל-G.A.N.). J.N.W. מכירה בתמיכה במענק NIH מס' T32 GM148383.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1M Tris-HCl, pH 8.0Thermo Fisher Scientific15568025
Agarose Thermo Fisher Scientific R0491 Agarose UltraPure 16500500 ThermoFisher 500g
AMPure XP SPRI Beads Beckman Coulter B23317 A63880, AMPure XP Beads for DNA Cleanup, 5 mL, Beckman Coulter
ATP (100 mM) New England Biolabs N0450 
CEPT Cocktail Bio-Techne / Tocris 7200 
CleanCap AG Reagent TriLink Biotechnologies N-7113 CleanCap AG 3′ OMe CleanScript IVT Kit, 125 x 20 µL rxns, 
CTP (100 mM) New England Biolabs N0450 
Custom DNA Primers Integrated DNA Technologies Custom 
DNA Loading Dye New England Biolabs B7024 
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific 14190-144 D8537-100ML
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 11965-092 DMEM High Glucose [4,500 mg/L] with [4.0 mM] L-Glutamine and [110 mg/L] Sodium Pyruvate, 500 mL
Gel Extraction Kit Qiagen 28704 
GTP (100 mM) New England Biolabs N0450 
Illumina Indexing Primers Illumina FC-131-2001 10uM stocks
Illumina MiSeq Sequencer Illumina SY-410-1003 
Lithium Chloride RNA Precipitation Solution Thermo Fisher Scientific AM9480 
Lonza 4D Nucleofector System Lonza AAF-1002X 
ssRNA Ladder NEBNEBN0362S5ul/ reaction
MiSeq Reagent Kit v3 (300 cycles) Illumina MS-102-3002 
N1-Methyl-Pseudouridine-5′-Triphosphate TriLink Biotechnologies N-1081 
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix New England Biolabs M0544 
Nuclease-Free Water Thermo Fisher Scientific AM9937 
NucleoCounter NC Slide A8 ChemoMetec 941-0008 
NucleoCounter NC-3000 ChemoMetec NC-3000 10ul of cell solution and 0.4167 μL of DAPI solution 
Solution 15, Hoechst 33342, 1 mL 910-3015 ChemometecChemometec910-3013 500 μg/ml ~ 0.9 mM ~ 0.05%
Nucleocuvette Strips Lonza V4XP-3032 
P3 Primary Cell Nucleofector Solution Lonza V4XP-3032 1 x 0.675 mL P3 Primary Cell Nucleofector® Solution
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F530L 
Proteinase K Thermo Fisher Scientific EO0491 כמות: 1mL, >600 U/mL (~20 mg/mL)
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0491 2,000 units/ml 100 units 
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q33230 
Qubit RNA Broad Range Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q10211 
Qubit™ Assay TubesThermo Fisher ScientificQ32856
RNA Gel Loading Dye (2x)Thermo Fisher ScientificR06415ul/ reaction
RNA Purification Kit Zymo Research R1017 
RNase Away Thermo Fisher Scientific 1236B62 
SDS, 10% solutionThermo Fisher Scientific 15553027
SYBR Gold Nucleic Acid Gel StainThermo Fisher ScientificS11494
SYBR Safe DNA Gel Stain Thermo Fisher Scientific S33102 
Synthetic sgRNA / pegRNA Synthego / IDT Custom 2ug 
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit, 250 reactionsNew England Biolabs E2040L
TrypLE Express Enzyme Thermo Fisher Scientific 12604013 100 mL
TE buffer (Tris-EDTA)Thermo Fisher Scientific AM9849TE, pH 8.0, RNase-free Thermo
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific 25200056 1X 
Fetal Bovine Serum (FBS), Premium, 500 mLThermo Fisher ScientificA5670701
mTSER PLUS STEM cell Technologies# 100-0276
Penicillin/Streptomycin Mixture 10,000 ug/mL, 100 mL, 4-packQuality Biological120-095-721 

מקורות

  1. Gao H, Gao S, Kan G, Valentovich LN, An Y. Research progress of base editing and prime editing tools based on the CRISPR/Cas system. Mol Ther Nucleic Acids. 2025;36.
  2. Chen PJ, Hussmann JA, Yan J, et al. Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes. Cell. 2021;184(22):5635–5652. doi:10.1016/j.cell.2021.09.018.
  3. Newby GA, Yen JS, Woodard KJ, et al. Base editing of haematopoietic stem cells rescues sickle cell disease in mice. Nature. 2022;595(7866):295-302. doi:10.1038/s41586-021-03609-w.
  4. Sousa AA, Hemez C, Lei L, et al. Systematic optimization of prime editing for the efficient functional correction of CFTR F508del in human airway epithelial cells. Nat Biomed Eng. 2024;9(1):7. doi:10.1038/s41551-024-01233-3.
  5. Mayuranathan T, Newby GA, Feng R, et al. Potent and uniform fetal hemoglobin induction via base editing. Nat Genet. 2023;55(7):1210-1217.
  6. He W, Zhang X, Zou Y, et al. Effective synthesis of high-integrity mRNA using in vitro transcription. Molecules. 2024;29(11).
  7. Popova PG, Lagace MA, Tang G, Blakney AK. Effect of in vitro transcription conditions on yield of high-quality messenger and self-amplifying RNA. Eur J Pharm Biopharm. 2024;198.
  8. Zhang F, Wang Y, Wang X, et al. RT-IVT method allows multiplex real-time quantification of in vitro transcriptional mRNA production. Commun Biol. 2023;6(1).
  9. Montague TG, Cruz JM, Gagnon JA, Church GM, Valen E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 2014;42(W1)-W407.
  10. Concordet JP, Haeussler M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Res. 2018;46(W1)-W245.
  11. Mohr SE, Hu Y, Ewen-Campen B, Housden BE, Viswanatha R, Perrimon N. CRISPR guide RNA design for research applications. FEBS J. 2016;283(17):3232-3245.
  12. Huang TP, Newby GA, Liu DR. Precision genome editing using cytosine and adenine base editors in mammalian cells. Nat Protoc. 2021;16(2):1089-1106. doi:10.1038/s41596-020-00450-9.
  13. Doman JL, Sousa AA, Randolph PB, Chen PJ, Liu DR. Designing and executing prime editing experiments in mammalian cells. Nat Protoc. 2023;18(6):1780-1818. doi:10.1038/s41596-022-00724-4.
  14. Chicaybam L, Barcelos C, Peixoto B, et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Front Bioeng Biotechnol. 2017;4:99.
  15. Clement K, Rees H, Canver MC, et al. CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis. Nat Biotechnol. 2019;37(3):224-230.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

233233mRNAIVTiPSCs
עריכת גנום בתאי יונקים ראשוניים באמצעות אלקטרופורציה של RNA עורך
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.