מאמר שיטה

כימות פלואוריד בסרום, בעצם ובשיניים במודל עכברים באמצעות דיפוזיה מזורזת על ידי הקסאמתילדיסילוקסן ומדידות באמצעות אלקטרודה סלקטיבית ליונים

20 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71488

⸱

28 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oral Science and Translational Research, College of Dental Medicine, Nova Southeastern University, 2Department of Biological Sciences, Bauru School of Dentistry, University of São Paulo, 3Department of Restorative Dentistry and Endodontology, Osaka University Graduate School of Dentistry, 4Unit of Dentistry, Osaka University Hospital, 5Department of Biomedical Sciences, Adams School of Dentistry, The University of North Carolina at Chapel Hill

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את הכנתן של צלחות דיפוזיה המתווכות על ידי hexamethyldisiloxane (HMDS), ולאחריהן מדידות באמצעות אלקטרודה סלקטיבית ליון כדי לכמת את מסת יוני הפלואוריד בסרום, בעצם ובשיניים של עכברים. שיטה זו מספקת גישה רגישה, מבוססת כיול, להערכת הצטברות פלואוריד בדגימות ביולוגיות.

תקציר

כימות רמות פלוריד ברקמות ביולוגיות חיוני להבנת החשיפה לפלוריד, חילוף החומרים שלו והרעילות שלו. פרוטוקול זה מתאר שיטה רגישה וניתנת לשחזור למדידת מסת יוני פלוריד בסרום, בעצם ובשיניים באמצעות דיפוזיה המתווכת על ידי hexamethyldisiloxane (HMDS), ולאחריה ניתוח באמצעות אלקטרודה סלקטיבית ליון (ISE). דגימות ביולוגיות, כולל סרום, עצם פמורלית ושיני חיתוך של הלסת התחתונה, נאספות מעכברים שנחשפו לטיפולי פלוריד מבוקרים. דגימות עצם ושיניים עוברות שריפה (ashing), טחינה והידרציה, בעוד שסרום מעובד באופן ישיר. כל דגימה מועברת לכלי דיפוזיה המכיל מים אולטרה-טהורים ונחתמת עם מכסה מצופה בוואזלין הנושאת טיפות של נתרן הידרוקסיד המשמשות כמלכודות פלוריד. הזרקה של חומצה גופרית רוויה ב-HMDS מתניעה את שחרור הפלוריד והדיפוזיה שלו, מה שמאפשר ללכוד כמותית את יוני הפלוריד המשוחררים במלכודות. לאחר דיפוזיה של לילה שלם, טיפות מלכודת הפלוריד מאוחדות לדגימה אחת, מחמיצות לטווח ה-pH הנדרש, ומועמדות לנפח מוגדר למדידה ב-ISE. כלי דיפוזיה לכיול, שהוכנו עם מסות פלוריד ידועות, מייצרים עקומת סטנדרט לצורך כימות, ודגימות בקרת איכות מאמתים את יציבות האלקטרודה. תוצאות מייצגות מעכברים מתבגרים ובוגרים שנחשפו ל-0 או 125 ppm פלוריד מדגימות את יכולתה של השיטה לזהות הבדלים תלויי-גיל ותלויי-מינון ברמות הפלוריד בסרום, בעצם ובשיניים. פרוטוקול זה מספק גישה חסונה מבוססת כיול לכימות פלוריד במטריצות ביולוגיות מגוונות ומתאים למחקרים הבוחנים חשיפה לפלוריד, שקיעה ברקמות ותוצאות טוקסיקולוגיות במודלים של עכברים. יתרון מרכזי של שיטה זו הוא יכולתה לכמת במדויק פלוריד בדגימות קטנות ביותר, כולל 3–5 mg של אפר המתקבל משיני חיתוך בודדות של עכבר, מכיוון שתהליך הדיפוזיה מרכז את כל הפלוריד המשוחרר לנפח דגימה מדיד של פחות מ-100 µL.

מבוא

פלואוריד הוא אניון המופיע באופן טבעי, ורמה אופטימלית של פלואוריד יעילה במניעת עששת שיניים1,2,3,4,5. בארצות הברית (U.S.), פלואורידציה של מי הקהילה בריכוז של 0.7 ppm הוטמעה כאסטרטגיה של בריאות הציבור להפחתת שכיחות העששת ולקידום בריאות השן6. עם זאת, בליעה ממושכת של כמות מופרזת של פלואוריד עלולה להשפיע לרעה על רקמות מרובות. חשיפה לרמות גבוהות של פלואוריד משבשת את היווצרות זגוגית השן7,8,9, משנה את היווצרות העצם10, ופוגעת בשלמות השלד11.

ברמה התאית, חשיפה לפלואוריד גורמת למספר הפרעות מטבוליות, כולל עקה חמצונית12, עקה של הרשת האנדופלזמית13, מודיפיקציות אפיגנטיות המשנות את ביטוי הגנים14, ואפופטוזיס באמלובלסטים15,16,17,18. ברמה הגלובלית, ריכוזי פלואוריד גבוהים במי תהום (>1.5 ppm) מהווים בעיה בריאותית משמעותית. מחקר מידול חיזוי שנערך לאחרונה העריך כי כ-180 מיליון בני אדם ברחבי העולם מושפעים פוטנציאלית מחשיפה מוגברת לפלואוריד, כאשר הנטל הגבוה ביותר נמצא באסיה ובאפריקה1. מעבר למי שתייה, חשיפה לפלואוריד מתרחשת גם דרך מזון (למשל, פירות ים; ~1.9 ppm), משקאות (למשל, תה; 0.5–6 ppm19) ומוצרי דנטל כגון משחיית שיניים20 (1,000–1,500 ppm).

לפיכך, הבנה של חשיפה לפלואוריד, חילוף חומרים שלו והשקיעתו ברקמות היא חיונית להערכת הן התועלת הטיפולית והן ההשלכות הטוקסיקולוגיות הפוטנציאליות שלו. כימות מדויק של פלואוריד בדגימות ביולוגיות — כולל שתן, סרום, עצם ושיניים — הוא מרכיב קריטי בעבודה זו. עם זאת, המדידה מהווה אתגר אנליטי בשל ההתנהגות הכימית של הפלואוריד וזיקתו החזקה למטריצות עשירות בסידן. כ-99% מהפלואוריד בגוף נמצא ברקמות מומחשאות כגון עצם ושיניים21. כדי להתמודד עם אתגרים אלו, פותחו מגוון טכניקות אנליטיות, כולל פוטנציומטריה באמצעות אלקטרודה סלקטיבית ליון (ISE), כרומטוגרפיה יונית, בדיקות קולורימטריות, הליכי טיטרציה ושיטות מבוססות גרעין או הפעלה22. מבין אלו, טכניקת הדיפוזיה המהולה ב-hexamethyldisiloxane (HMDS) בשילוב עם מדידה באמצעות אלקטרודה סלקטיבית לפלואוריד התגבשה כאחת הגישות המהימנות והנפוצות ביותר עבור מטריצות ביולוגיות, בשל רגישותה, השחזוריות שלה והתאימות שלה לסוגי דגימות מגוונים23,24,25,26,27,28,29.

למרות זמינותן של שיטות אנליטיות מרובות, לכל גישה יש מגבלות העשויות להגביל את השימוש בה במחקר ניסויי או קליני. כרומטוגרפיית יונים מספקת רגישות וסלקטיביות גבוהות, אך היא דורשת מכשור ייעודי והכנה נרחבת של הדגימות30,31. בדיקות קולורימטריות, כגון שיטת ה-SPADNS (sodium 2‑(parasulfophenylazo)‑1,8-dihydroxynaphthalene-3,6‑disulfonate), הן פשוטות וזולות, אך הן רגישות להפרעות מעכירות ומכרומופורים אנדוגניים, דבר המגביל את מהימנותן בדגימות ביולוגיות מורכבות22,32,33. שיטות טיטרציה הן יעילות מבחינה כלכלית ופשוטות, אך חסרה בהן הרגישות הנדרשת לזיהוי פלואוריד ברמות עקבות ברוב הדגימות הביולוגיות34. טכניקות גרעיניות או מבוססות על הפעלה מציעות רגישות יוצאת דופן, אך הן דורשות גישה לכיטורים או למקורות נייטרונים מבוססי מאיץ, מה שהופך אותן לבלתי מעשיות לשימוש שגרתי במעבדה35. לעומת זאת, דיפוזיה המואצת על ידי HMDS ולאחריה מדידה ב-ISE מספקת איזון מעשי בין רגישות, עלות ונגישות, תוך הבטחת שחרור מלא של הפלואוריד הן מרקמות רכות והן מרקמות ממינרליזציה. דבר זה יתרוני במיוחד למחקרים הכוללים בעלי חיים קטנים, שבהם זמינות הרקמה מוגבלת ומבנים ממינרליזציה, כגון שיניים קדמיות של עכברים, מניבים רק 3–5 mg של אפר לשן.

היכולת של שיטת הדיפוזיה–ISE לרכז את כל הפלואוריד ששוחרר לנפח קטן ומוגדר מאפשרת כימות מדויק אפילו בדגימות קטנות ביותר. עובדה זו הופכת את השיטה למתאימה במיוחד למחקרי טוקסיקינטיקה, ניסויי תגובה למינון ובחינות של חילוף חומרים של פלואוריד בשלבים התפתחותיים שונים. מכרסמים קטנים, ובמיוחד עכברים מסוג C57BL/6J, שימשו באופן נרחב כמודלים של בעלי חיים לחקר השפעות הפלואוריד7,9,12,29,36.

בפרוטוקול זה, המחברים מיישמים את טכניקת הדיפוזיה המואצת על ידי HMDS, ולאחריה מדידה באמצעות אלקטרודה סלקטיבית לפלואוריד, כדי לכמת פלואוריד בסרום, בעצם ובשיניים שנאספו מעכברים שנחשפו למינון גבוה של פלואוריד (125 ppm) בהשוואה לקבוצות ביקורת שלא טופלו. בנוסף, המחברים משווים את הצטברות הפלואוריד בעכברים מתבגרים (6 שבועות בתחילת הטיפול) ועכברים בוגרים (18 שבועות בתחילת הטיפול) כדי להעריך הבדלים תלויי גיל במטבוליזם של פלואוריד ובהשקעתו ברקמות. שיניים חותכות של הלסת התחתונה נבחרו כרקמה דנטלית מייצגת מכיוון ששיניים חותכות של מכרסמים בוקעות באופן רציף ומגיעות לאיזון של מצב יציב בין בקיעה לבלאי סגירה (occlusal wear) סביב גיל 7 שבועות. דפוס צמיחה רציף זה מספק גרדיאנט עקבי ונגיש של התפתחות זגוגית השן, מה שהופך את השיניים החותכות של עכברים למודל נפוץ ומאומת לבדיקת התהוות זגוגית השן ופלואורוזיס שיניים.

פרוטוקול

כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות לשימוש בבעלי חוליות שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת Nova Southeastern (פרוטוקול מס' 2023.02.MSuz1), המוכרת על ידי האיגוד להערכה ולהסמכה של טיפול בבעלי חיים במעבדה במישור הבינלאומי (AAALAC). כל העבודה עם בעלי חיים ת为了ת למדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה ולהנחיות של האיגוד הווטרינרי הרפואי האמריקאי (AVMA) להדרה של בעלי חיים. כל החומרים ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. בעלי חיים ו הכנה ומתן של נתרן פלואוריד במודל עכברי

  1. בעלי חיים: חלק עכברים זכרים מסוג C57BL/6J לשתי קבוצות גיל: מתבגרים, בני 6 שבועות בתחילת הטיפול, ובוגרים, בני 18 שבועות בתחילת הטיפול.
    1. ספק לכל קבוצה מים דה-יוניים נטולי פלואוריד (0 ppm F⁻) או מי שתייה מועשרים בנתרן פלואוריד (125 ppm F⁻) למשך תקופת חשיפה של 6 שבועות.
    2. כלול חמישה בעלי חיים בכל תנאי גיל וטיפול (N = 5/group).
    3. בסוף תקופת החשיפה, גבה סרום, עצמות ירך (femurs) ושיניים חותכות של הלסת התחתונה (mandibular incisors), והכן את כל הדגימות שנאספו לאנליזות המשך.
      ​הערה: דגימה: חומר מעובד כגון עצם לאחר שריפה, שן לאחר שריפה וסרום.
  2. דיור ותזונה של בעלי החיים: שכן את העכברים בתנאי מעבדה סטנדרטיים עם גישה למזון ומים ad libitum.
    1. ספק תזונה נטולת פלואוריד החל משבוע לפני איסוף השיניים, העצמות והסרום כדי למזער את רמות הפלואוריד ברקע.
  3. מי שתייה עם נתרן פלואוריד
    1. להכנת מי שתייה מועשרי פלואוריד, המס נתרן פלואוריד (NaF) במים דה-יוניים כדי להגיע לריכוז הפלואוריד הרצוי (למשל, 125 ppm F⁻).
    2. סנן את התמיסה דרך מסנן ואקום של 0.2 µm אל תוך בקבוק שעבר עיקור באוטוקלאב. הכן תמיסה טרייה מדי יומיים.
      זהירות: NaF רעיל בבליעה ועלול לגרום לגירוי בעור ובעיניים. יש לטפל בחומר במכססת אידורים תוך לבישת חלוק מעבדה, כפפות ניטריל ומשקפי מגן.
  4. עבור מי בקרה נטולי פלואוריד, סנן מים דה-יוניים דרך מסנן ואקום של 0.2 µm אל תוך בקבוק שעבר עיקור באוטוקלאב. הכן מים טריים מדי יומיים.
  5. ספק מי שתייה מועשרי פלואוריד או נטולי פלואוריד ad libitum למשך משך הזמן הרצוי לטיפול בפלואוריד. עקוב אחר מפלס המים מדי יום והחלף את הבקבוקים מדי יומיים.
  6. בסוף תקופת החשיפה, בצע המתה לבעלי החיים באמצעות שאיפת פחמן דו-חמצני (CO₂) ולאחריה עריפת ראש. הליכי ההמתה בוצעו בהתאם להנחיות AVMA להמתת בעלי חיים ואושרו כחלק מפרוטוקול ה-IACUC המוסדי.
    זהירות: CO2 הוא חומר חנק. בצע את הפעולות באזור מאוורר היטב וודא שהתא פועל כראוי. הימנע מחשיפה ישירה לשאיפה.

2. הכנת דגימה למדידת פלואוריד

  1. איסוף דם
    1. בצעו קריוסטזיה לעכברים באמצעות שאיפת CO₂ ואספו מיד דם באמצעות ניקור לב סופי באמצעות מזרק טוברקולין של 1 mL. העבירו את הדם למבחנות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL. השליכו את כל המחטים והמזרקים המשומשים למיכל פסולת חדה מאושר על ידי המוסד.
      זהירות: מחטי המזרקים חדות ועשויות לגרום לפציעות דקירה; טיפלו בהן בזהירות.
    2. אחסנו את הדם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן סובבו בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-2,000 × g.
    3. העבירו את הנוזל העליון (סרום) למבחנת מיקרוצנטריפוגה ואחסנו בטמפרטורה של −80 °C.
      זהירות: מקפיאים לטמפרטורות נמוכות במיוחד מהווים סיכון לנשף קור. לבשו כפפות מבודדות בעת טיפול במבחנות ומנעו מגע ממושך של העור עם משטחים קרים.
  2. עצמות
    1. הוצאת עצמות הירך: לאחר הקריוסטזיה, בצעו דיסקציה של הרגליים האחוריות במפרקי הירך.
    2. הסירו בזהירות את כל הרקמות הרכות מעצמות הירך. שטפו את הרקמות שלוש פעמים במים דה-יוניים. אחסנו את העצמות בטמפרטורה של -80 °C עד לעיבוד המשך. השליכו רקמות רכות שהוסרו וחומרים מזוהמים כלשהם למסלול פסולת ביולוגית מוסדית.
      הערה: ניתן לקבע את הרקמות ב-4% פאראפורמאלדהיד עם 2% סוכרוז למשך 12–16 שעות לצורך אחסון ארוך טווח ב-70% אתנול. הליך קיבוע זה אינו משנה את דיוקו של כימות הפלואוריד העוקב.
    3. שטפו את העצמות ביסודיות במים דה-יוניים. ספגו לחות עודפת באמצעות נייר סופג ללא סיבים.
    4. העבירו את העצמות למבחנות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL עם מכסים פתוחים כדי לאפשר התאיידות והניחו אותן בתנור ייבוש בטמפרטורה של 60 °C למשך 12–16 שעות.
      זהירות: תנור הייבוש עלול לגרום לכוויות. השתמשו בכפפות עמידות לחום בעת טיפול בדגימות.
    5. הפיכת העצמות לאפר: העבירו את העצמות המיובשות לכרוצי אלומינה. הניחו את הכרוצים בתנור מופל וחממו ל-600 °C בקצב של 150 °C/h, ולאחר מכן השאירו למשך 6 שעות. המתינו שחום התנור יירד מתחת ל-200 °C לפני הוצאת הכרוצים. השליכו שאריות של חלקי עצם או חומרים מתכלים מזוהמים למסלול פסולת ביולוגית מוסדית.
      זהירות: תנור המופל והכרוצים מגיעים לטמפרטורות קיצוניות, מה שמהווה סיכון חמור לכוויות. תמיד המתינו שהתנור יתקרר לפני הטיפול בכרוצים. בעת הוצאת הכרוצים, לבשו חלוק מעבדה, משקפי מגן וכפפות עמידות לחום, והשתמשו בפינצטה ארוכה כדי למנוע מגע ישיר עם משטחים חמים.
      שלב קריטי: הפיכה לאפר שאינה מלאה תפגע בניתוחים הבאים. ודאו שחומר העצם הגיע למצב חמצון מלא לפני ההמשך; כל שארית פחמן תפריע למדידות העוקבות.
      ​הערה: עצם שהפכה לאפר כהלכה צריכה להיראות באפור בהיר עד לבן באופן אחיד. חלקיקים כהים יותר — במיוחד שאריות שחורות או דמויות פחם — מעידים על בעירה חלקית. אם קיימת שינוי בצבע, האריכו את משך ההפיכה לאפר כדי לאפשר הסרה מלאה של החומר האורגני.
    6. אחסון עצמות שהפכו לאפר: מיד לאחר ההפיכה לאפר, העבירו את העצמות למבחנות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL. אטמו את המבחנות עם Parafilm ואחסנו אותן בדסיקטור ואקום עד לשימוש.
  3. שיניים
    1. הוצאת שיריים חותכות של הלסת התחתונה: בצעו חתך אופקי בגובה המפרק הלסת-רקה (TMJ) כדי להפריד את הלסת התחתונה מהלסת העליונה.
    2. בצעו חתכים סגיטליים מרכזיים כדי לחלק הן את הלסת העליונה והן את הלסת התחתונה לחצאים שמאלי וימני.
    3. שטפו את הרקמות שלוש פעמים במים דה-יוניים והוציאו בזהירות את השיריים החותכות של הלסת התחתונה. אחסנו את השיריים שהוצאו בטמפרטורה של -80 °C עד לשימוש נוסף. השליכו רקמות רכות שהוצאו וחומרים מתכלים מזוהמים למסלול פסולת ביולוגית מוסדית.
      זהירות: השתמשו בכלי דיסקציה חדים בזהירות בעת ביצוע חתכים במפרק הלסת-רקה ובמישור הסגיטלי המרכזי כדי למנוע פגיעה אישית. לבשו ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות, חלוק מעבדה ומשקפי מגן.
      הערה: ניתן לקבע את הרקמות ב-4% פאראפורמאלדהיד עם 2% סוכרוז למשך 12–16 שעות לצורך אחסון ארוך טווח ב-70% אתנול. הליך קיבוע זה אינו משנה את דיוקו של כימות הפלואוריד העוקב.
    4. הכנת שיניים להפיכה לאפר: שטפו את השיניים ביסודיות במים דה-יוניים והניחו אותן במי חמצן (H₂O₂) בריכוז 1% למשך 12–16 שעות. השליכו תמיסות מי חמצן משומשות כפסולת כימית מסוכנת.
    5. שטפו שוב במים דה-יוניים, ייבשו קצרה באמצעות נייר סופג ללא סיבים, והעבירו למבחנות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL עם מכסים פתוחים. הניחו את המבחנות בתנור ייבוש בטמפרטורה של 60 °C למשך 12–16 שעות.
      זהירות: מי חמצן הם מחמצנים ועשויים לגרום לגירוי בעור ובעיניים. טיפלו בהם במנדף תוך לבישת חלוק מעבדה, כפפות ניטריל ומשקפי מגן. הימנעו ממגע עם חומרים דליקים.
    6. הפיכת שיניים לאפר: העבירו שיניים מיובשות לכרוצי אלומינה והפכו אותן לאפר בתנור מופל בטמפרטורת שהייה של 600 °C למשך 20 שעות, תוך שימוש בקצב עלייה של 150 °C/h.
    7. הוציאו את הכרוצים רק לאחר שהתנור התקרר למשך מתחת ל-200 °C.
      זהירות: תנור המופל והכרוצים מגיעים לטמפרטורות קיצוניות, מה שמהווה סיכון חמור לכוויות. המתינו שהתנור יתקרר למשך מתחת ל-200 °C לפני הטיפול בכרוצים. בעת הוצאת הכרוצים, לבשו חלוק מעבדה, משקפי מגן וכפפות עמידות לחום, והשתמשו בפינצטה ארוכה כדי למנוע מגע ישיר עם משטחים חמים.
      שלב קריטי: הבטיחו חמצון מלא; פחמן שירי יפריע לניתוחים העוקבים.
      הערה: חומר שיניים שהפך לאפר צריך להיראות באפור בהיר עד לבן באופן אחיד. בצעו הפיכה לאפר חוזרת אם נותרו שאריות שחורות.
    8. אחסון דגימות שיניים שהפכו לאפר: מיד לאחר ההפיכה לאפר, העבירו את השיניים למבחנות מיקרוצנטריפוגה בעלות תחתית עגולה של 2 mL.
    9. אטמו את המבחנות עם Parafilm ואחסנו אותן בדסיקטור ואקום עד לשימוש.

3. הכנת צלחים לדיפוזיה המואצת על ידי HMDS

  1. ריאגנטים וחומרים
    1. חומצה גופרית 6 N: לפחות יומיים לפני הכנת צלחות הדיפוזיה, הכינו תמיסת אם של 6 חומצה גופרית בריכוז N.
      הערה: צלחת דיפוזיה: כלי אטום שנועד ליצור סביבה סגורה ומבוקרת, שבה רכיבים המשוחררים מחומר ביולוגי מעובד יכולים להילכד על ידי מלכודת כימית המחוברת למכסה. התכנון האטום מונע חילוף עם אוויר חיצוני ומבטיח שהאנליטים המשוחררים יופנו לעבר המלכודת לצורך מדידה מאוחרת.
    2. הניחו 1 כוס פלסטיק עם מוט ערבוב מגנטי על מערבל מגנטי והוספת 416 מ"ל של מים מזוקקים במיוחד (ultrapure water).
    3. באמצעות 50 הוסף באיטיות 84 מ"ל באמצעות פיפטה סרולוגית של מ"ל מיליליטר של 36 N H₂SO₄ אל המים תוך כדי ערבוב רציף. התמיסה תתחמם; יש להמתין עד שתתקרר לטמפרטורת החדר. יש להשליך תמיסות חומצה גופרתית שלא נעשה בהן שימוש או תמיסות משומשות כפסולת כימית מסוכנת, במסלול פינוי הפסולת הכימית המוסדי.
      אזהרה: חומצה גופרית היא חומר מאכל מאוד. יש לטפל בה במכונה לשאיבת גזים (מ पॉपुलर) תוך חבישה של כפפות עמידות לחומצה, חלוק מעבדה ומשקפי מגן. במקרה של מגע, יש לשטוף מיד בכמות רבה של מים.
    4. חומצה גופרית 6 N רוויה ב-HMDS: העבר את ה-6 חומצה גופרית בריכוז N ל-2 משפך הפרדה והוספה של 15 מ"ל של hexamethyldisiloxane (HMDS).
    5. וודאו שהפקק והברז סגורים היטב, החזיקו את משפך ההפרדה הצידה, ונערה בעוצמה עד להופעת טיפות זעירות של HMDS.
    6. יש להסיר את הפקק כדי לשחרר את הגז המתפתח ולחזור על התהליך פעמיים נוספות.
    7. השאירו את הפקק פתוח למחצה למשך מספר שעות. אחסנו את משפך ההפרדה המכיל את ה-6 חומצה גופרתית רוויה ב-HMDS במעמד בתוך מנדף כימיים. יש להשליך חומצה גופרתית המכילה HMDS וחומרים מזוהמים כפסולת כימית מסוכנת.
      אזהרה: HMDS דליק ורעיל בשאיפה. יש לטפל בחומר במכסה עשן תוך לבישת חלוק מעבדה, כפפות ומשקפי מגן. יש להרחיקו ממקורות הצתה.
    8. 0.05 N נתרן הידרוקסיד: המיס 1 גרגרי NaOH ב-25 מיליליטר מים טהורים במיוחד להכנת 1 תמיססת מלאי בריכוז N.
    9. תערובת 2 מ"ל של ה-1 תמיסת מאגר NaOH בריכוז N עם 38 מ"ל מים אולטרה-טהורים (ultrapure water) כדי לקבל ריכוז של 0.05 תמיסת NaOH בריכוז N.
    10. חלקו למנות של 0.05 N NaOH לתוך 1.5 מבחנות מיקרוצנטריפוגה בנפח של mL לשימוש חד-פעמי, הידקו את המכסים באמצעות Parafilm, ואחסנו את המבחנות בדסיקטורor בוואקום כדי למזער את ה-CO₂ ספיגה. יש להשליך תמיסות נתרן הידרוקסיד שאינן בשימוש או שנוצלו כפסולת כימית מסוכנת.
      אזהרה: נתרן הידרוקסיד הוא חומר קורוזיבי ביותר ועלול לגרום לכוויות חמורות. יש ללבוש חלוק מעבדה, כפפות ומשקפי מגן. טיפלו בתמיסות בזהירות כדי למנוע נתזים.
    11. חומצה אצטית 0.2 N: הוסף 575 µL חומצה אצטית קרחלית למים אולטרה-טהורים והשלמה לנפח סופי של 50 מ"ל להכנת 0.2 חומצה אצטית N. יש להשליך תמיסות של חומצה אצטית כפסולת כימית מסוכנת.
      אזהרה: חומצה אצטית היא חומר מאכל ועלולה לגרום לגירוי של העור, העיניים ודרכי הנשימה. יש לטפל בחומר במכסות שאיבה כימיות תוךneath לבישת חלוק מעבדה, כפפות ומשקפי מגן.
    12. פטרולטום: המסו כ-100 גרם וזלין בטמפרטורה של 60 מעלות °C בתנור. שאבו את הפטרולטום הנוזלי לתוך 10 מזרקים של mL, והניחו להם להקרות ולהתגבש. ניתן לשמור מזרקים מלאים בפטרולטום (Petrolatum) בטמפרטורת החדר למשך מספר שבועות.
    13. צלחת פטרי: השתמש ב-60 × 15 צלחות פטרי ללא טיפול בגודל mm להכנת צלחות דיפוזיה.
    14. יצרו חור קטן במכסה של צלחת פטרי באמצעות מחט מזריק בגודל 18-G שחוממה.
    15. את השוליים הפנימיים של המכסה יש לצפות באטימה רציפה של פטרולטום באמצעות 10 מזרק בנפח mL המצויד במחט קהה בכי মাপ 14 מחט G. יש להשליך את כל המחטים המשומשות לתוך מכל פסולת חדה מאושר על ידי המוסד.
      אזהרה: מחטי מזריקות הן חדות ועלולות לגרום לפציעות דקירה. יש לטפל בהן בזהירות ולהשליכן במיכלים מאושרים לפסולת חדה. בעת חימום מחטים, יש להשתמש בכפפות עמידות לחום ובמיגון עיניים כדי למנוע כוויות.
    16. תמיסות סטוק של NaF לכיול צלחות דיפוזיה. המיס 4.19 ג' NaF ב-1 מים אולטרה-טהורים להכנת 100 תמיסת סטוק בריכוז mM. הכן 10 mM, 100 µM, ו-10 µM תמיסות מלאי על ידי דילולים עוקבים של 1:10 מה-100 תמיסת mM.
      הערה: מול אחד של NaF מספק 19 g F⁻; לכן, 1 µL מתוך 10 µM NaF מכיל 0.19 נג' F⁻ ו-1 µL מתוך 10 190 mM NaF מכיל ng F⁻.
      ​הערה: צלחות דיפוזיה לכיול: צלחות דיפוזיה המשמשות ספציפית לכיול עם מסה ידועה של יוני פלואוריד (F⁻)¯).
  2. הכנות של צלחות דיפוזיה ספציפיות לדגימה
    1. צלוחית לדיפוזיית סרום: העבירו בפיפטה 3 מ"ל מים אולטרה-טהורים לתחתית צלוחית הפטרי והוסיפו 75 µL סרום. יש להשליך כל חומר שזוהם בסרום למסלול פסולת ביולוגית מוסדי. המשיכו לשלב 3.4.
    2. צלחת דיפוזיה לעצם
      1. דחיסה של אפר עצם: השתמשו במיקרו-שפכד כדי לטחון את העצמות לאחר השריפה בתוך מבחנות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל לאבקה דקה. המשיכו בעיבוד אפר העצם הדחוס באופן מיידי. השליכו חומרים מתכלים שזוהמו באפר עצם למסלול פסולת הכימיקה של המוסד.
      2. שקילה והידרציה של אפר עצם
        1. הניחו את תחתיתו הריקה של פטריית המעבדה על כף השקילה של מאזנאי אנליטי בעל רזולוציה של לפחות 0.1 מג.
        2. העבירו את אפר העצם הטחון מה-2 מבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח של mL לצלוחית פורצלן קטנה, כדי לצמצם מטען סטטי ולמנוע פיזור של האבקה.
        3. באמצעות שפכטל מיקרו, הוסיפו כ-5 מג של אפר עצם לצלח וכסה מיד את האבקה ב-3 מ"ל מים טהורים במיוחד לפני הסרת הכלי מהמאזנה האנליטית, כדי למנוע פיזור של האפר.
        4. רשמו את המשקל המדויק של כל דגימת אפר עצם. המשיכו לשלב 3.4.
    3. צלחת דיפוזיה לשיניים
      1. כרסום של שיניים שעברו שריפה (ashing)
        1. העבירו את השיניים החותכות שעברו שריפה ל-2 מבחנות מיקרו-צנטריפוגה בעלות תחתית עגולה בנפח של mL והוסף 5 חרוז פלדת אל-חלד בקוטר mm לכל מבנה. סגרו את המבחנות ואטמו את המכסים באמצעות Parafilm.
        2. השחקו את השיניים הקדמיות (incisors) לאחר השריפה במכשיר Bead beater במהירות של 2,500 סל"ד למשך 10 המשיכו בעיבוד השיניים הטחונות באופן מיידי.
      2. שקילה והידרציה של שיניים שעברו שריפה (ashing)
        1. שפכו את כל תכולת המבחנה, כולל כדור הפלדה אל-חלודה, לתחתית צלחת הדיפוזיה הממוקמת על כף השקילה של מאזניים אנליטיים. השליכו חומרים מתכלים מזוהמים המכילים אפר שיניים למסלול פינוי הפסולת הכימית של המוסד.
        2. הוציאו את כדור הפלדה שאינה מחלידה מהצלחת ורשמו את המשקל המדויק של אפר השן (בדרך כלל 3–4 מ"ג לכל שיני חיתוך תחתונה).
        3. הוסף מיד 3 מ"ל מים ultrapure כדי לכסות את אפר השן לפני הוצאת הכלי מהמאזנה, כדי למנוע פיזור של האפר כתוצאה מפריקה סטטית. המשיכו לשלב 3.4.
  3. כיול ובקרת איכות של צלחות דיפוזיה
    1. במקביל לצלחות הדיפוזיה של הדגימות, הכין שתי סדרות של צלחות דיפוזיה לכיול עבור כיול של 5–6 נקודות, וסדרה אחת זהה של צלחות דיפוזיה לבקרת איכות, כולל ביקורת ריקה (blank).
      הערה: צלחות דיפוזיה לבקרת איכות: מוכנות באופן זהה לצלחות דיפוזיה לכיול, אך נעשה בהן שימוש מדי פעם כדי לאמת את יציבות האלקטרודה ולהבטיח ביצועי מדידה עקביים.
    2. פיפטה 3 מיליליטר (mL) של מים מזוקקים מאוד (ultrapure water) לכל אחת מ-11 או 13 צלחות פטרי, ולהוסיף תמיסת מקור של NaF כדי לכסות את טווח ה-F הצפוי¯ טווח המסה בדגימות specimen. המשיכו לשלב 3.4. להשלמת הרכבת צלחת הדיפוזיה37.
  4. השלמת הרכבת צלחת הדיפוזיה
    1. כדי לבנות משקע של מלכודת פלואוריד, 50 µl מוסיפים שלוש טיפות של NaOH בריכוז 0.05 N על פני השטח הפנימי של מכסה פטרי, הרחק משולי המכסה.
      הערה: מלכודת פלואוריד (F¯ מלכודת (Trap): רכיב של צלחות דיפוזיה המלכד את F¯, ובמיוחד נתרן הידרוקסיד (NaOH).
    2. הפוך את המכסה מבלי להפריע לטיפות ה-NaOH, ואטום אותו היטב לתחתית הצלחת בעזרת הוואזלין (petrolatum).
    3. להכנת תמיסת חומצה גופרתית 3 N רוויה ב-HMDS, ערבבו נפחים שווים של חומצה גופרתית 6 N רוויה ב-HMDS ומים אולטרה-טהורים. יש להכין את התמיסה באופן טרי רגע לפני השימוש, כיוון שלא ניתן לאחסן אותה.
    4. הזריקו 3 מ"ל של חומצה גופרית רוויה ב-HMDS בריכוז 3 N שהוכנה, דרך החור במכסה, אל תוך המים שבתחתית צלוחית הדיפוזיה, באמצעות מזרק של 10 מ"ל המצויד במחט G 20. יש להקפיד שלא להתיז חומצה על פני השטח הפנימיים של המכסה בעת הכנסת או הוצאת מחט המזרק.
    5. דיפוזיה של פלואוריד בסיוע HMDS: אטמו מיד את חור ההזרקה עם טיפת וזלין (petrolatum) המכסה את הפתח לחלוטין, והניחו את צלחות הדיפוזיה על רוקר (rocker) משתנה המכוון למהירות איטית. דגרו למשך הלילה בטמפרטורת החדר (איור 1).

figure-protocol-1
איור 1: סכימה של צלחת דיפוזיה של עצם לחילוץ וללכידה של פלואוריד. איור 1 מדגים את התכנון של צלחת דיפוזיה של עצם שהורכבה בתוך צלחת פטרי לא מטופלת בגודל 60 × 15 mm. המכסה מכיל חור הזרקה קטן שנאטם באמצעות כדור פטרולטום. על פני השטח הפנימי של המכסה, שלוש טיפות של NaOH ממוקמות כמלכודות ליון פלואוריד (F⁻), התלויות מהמכסה במהלך הדיפוזיה. המכסה נאטם באופן הרמטי לבסיס הצלחת באמצעות פטרולטום. תחתית צלחת הפטרי מכילה מים אולטרה-טהורים, חומצה גופרתית רוויה בהקסמתילדיסילוקסאן (HMDS), ואפר עצם, אשר יחד מהווים את סביבת התגובה לשחרור פלואוריד וללכידתו לאחר מכן. איור זה נוצר על ידי המחברים באמצעות Biorender, והאיור מוגבל תחת רישיון CC BY. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

4. מדידת פלואוריד באמצעות ISE

  1. הגדרת ה-ISE
    1. מלאו את האלקטרודה הסלקטיבית לפלואוריד בעלת הערוץ הכפול בתמיסת המילוי המתאימה, חברו אותה לפוטנציומטר ואבטחו את האלקטרודה במחזיק אלקטרודות.
    2. מקמו צלחת פטרי לא מטופלת על גבי ג'ק מספריים מתחת למשטח החשיפה של האלקטרודה, תוך הבטחה שמשטח החשיפה מקביל לתחתית צלחת הפטרי, והגביהו את שולחן הג'ק המספריים כך שצלחת הפטרי כמעט תיגע באלקטרודה (איור 2).
  2. הכנת דגימות למדידה
    הערה: דגימות: רק התוצרים הסופיים הנמדדים עם אלקטרודה סלקטיבית ליון (ISE), המורכבים ממלכודת F¯ לאחר דיפוזיה, אשר לאחר מכן שולבה עם חומצה אצטית ומים, מכונה "דגימות" בפרוטוקול זה. 
    1. כדי לכוון את ה-pH של הדגימה ל-5, הסירו את צלחת הדיפוזיה מהרוקר והרימו בזהירות את המכסה על ידי שבירת אטום הפטרולטום לאחר תקופת הדגירה. הפכו את המכסה על משטח שטוח, תוך הבטחה ששלוש טיפות מלכודת ה-F¯ לא יזוזו.
    2. הוסיפו 15–20 µL של חומצה אצטית 0.2 N לטיפה אחת באמצעות פיפט P20, ולאחר מכן מזגו את כל שלוש הטיפות לטיפה אחת מבלי להחליף את טיפ הפיפט.
      הערה: דגימות עם ריכוזי F¯ גבוהים נוטים להיות בעלות pH התחלתי נמוך יותר ולכן דורשות פחות חומצה אצטית 0.2 N כדי לכוון את ה-pH ל-5 בהשוואה לדגימות המכילות פחות F¯. מכיוון שנפח הדגימה שנותר לאחר רישום פוטנציאל האלקטרודה (שלב 5.3) הוא מינימלי, השתמשו בכל שארית דגימה זמינה כדי לאמת את ה-pH באמצעות נייר אינדיקטור.
    3. כדי לכוון את נפח הדגימה, כווןו פיפט P100 ל-75 µL, שאבו את כל נפח מלכודת ה-F¯ ללא הכנסת אוויר, וכוונו את הדגימה ל-75 µL בדיוק באמצעות מים אולטרה-טהורים.
    4. בצעו שלב זה בזהירות כדי להבטיח נפח מדויק לצורך חישובי ריכוז פלואוריד. השאירו את הדגימה בטיפ הפיפט ועברו מיד לשלב 4.3.
  3. מדידת דגימות specimen, כיול ודגימות בקרת איכות
    1. כדי למדוד את פוטנציאל האלקטרודה של הדגימה, פלטו אותה בין משטח החשיפה של האלקטרודה הסלקטיבית לפלואוריד לבין צלחת הפטרי. ודאו שכל משטח החשיפה של האלקטרודה טבול לחלוטין בנוזל, ללא מגע ישיר עם צלחת הפטרי. המתינו להתייצבות הפוטנציומטר ורשמו את הפוטנציאל (mV) המוצג על ידי ה-ISE.
    2. קבעו את עקומת כיול הסטנדרטית על ידי מדידה רצופה של סדרת סטנדרטים ראשונה לכיול, החל מריכוז F¯ הנמוך ביותר ועד הגבוה ביותר.
      1. שרטטו את פוטנציאל האלקטרודה (mV) מול הלוגריתם של F¯ (ng) כדי לבנות את עקומת הכיול (איור 3). השתמשו ברגרסיה מעריכית כדי לקבל את משוואת עקומת הסטנדרט ואת מקדם הדטרמינציה (R2). קבלו עקומות כיול רק כאשר R2 הוא ≥ 0.99.
    3. מדדו כל דגימה של specimen ורשמו את פוטנציאל האלקטרודה (mV).
    4. כדי לנטר את יציבות האלקטרודה ולזהות סחיפה (drift) פוטנציאלית של הבדיקה, מדדו דגימות בקרת איכות במרווחי זמן לאורך כל הרצה אנליטית.
      1. השוו את ערכי דגימת בקרת האיכות ישירות לדגימות הכיול המתאימות ואשרו התאמה בטווח של כ-5% כדי לוודא ביצועים יציבים של האלקטרודה לאורך זמן.
      2. מדדו מדי פעם צלחת דיפוזיה ריקה (blank) כדי לאשר את היעדר זיהום פלואוריד במהלך טיפול בדגימות ודיפוזיה.
  4. כדי לחשב את מסת ה-F¯ (ng) בכל דגימת specimen, השתמשו במשוואת עקומת הסטנדרט. לאחר מכן חלקו מסה זו בנפח (µL) של הסרום, או במסה (mg) של אפר העצם או השן שנוספו לצלחת הדיפוזיה.
    1. דוגמה לחישוב ריכוז F¯ באפר עצם (ng/mg)
      1. מסת אפר עצם שהוספה לצלחת הדיפוזיה: 5.1 mg; פוטנציאל אלקטרודה של דגימת specimen בנפח 75 µL: –31.6 mV
      2. שלב 1: חישוב מסת פלואוריד באמצעות משוואת הכיול
        1. F⁻ mass (ng) = 3505.4 x e(-0.043x-31.6)
        2. F⁻ mass (ng) = 13,641 ng
      3. שלב 2: חישוב ריכוז פלואוריד באפר עצם
        1. F⁻ concentration =  13,641 ng  /  5.1  mg
        2. F⁻ concentration =  2,675 ng / mg (ppm)

figure-protocol-2
איור 2: סכימה של מערך המדידה ב-ISE.איור 2 ממחיש את התצורה ששימשה למדידות יוני פלואוריד באמצעות אלקטרודה סלקטיבית ליון (ISE) בעלת שני ערוצים. צלחת פטרי ממוקמת על גבי ג'ק מספריים כדי לאפשר כיוון מדויק של גובהה ביחס לאלקטרודה. ה-ISE מחוברת לפוטנציומטר ומכוון כך שפני החיישן שלה יהיו מקבילים למישור צלחת הפטרי, תוך שמירה על מרחק של כ-1–2 mm. לאחר קביעת המרווח, נפח קטן של דגימה (75 µL) מועבר באמצעות פיפט אל הרווח שבין פני החיישן לצלחת הפטרי, כדי להבטיח שהדגימה תכסה באופן מלא את אזור החישה של האלקטרודה במהלך המדידה. איור זה נוצר על ידי המחברים באמצעות Biorender, והאיור מוגן תחת רישיון CC BY. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה מוגדלת של איור זה.

figure-protocol-3
איור 3: עקומת כיול וטבלת כיול תואמת לכימות מסת יוני פלואוריד בדגימות של דגימות שן. פאנל עליון: דוגמה לעקומת כיול ששימשה לקביעת מסת יוני פלואוריד בדגימות של דגימות שן. ציר ה-x מציג את פוטנציאל האלקטרודה (mV, סולם ליניארי), וציר ה-y מציג את מסת יוני הפלואוריד התואמת (ng F⁻, סולם לוגריתמי). נקודות כיול נמדדות מסומנות כקו רצוף, והרגרסיה האקספוננציאלית המותאמת מוצגת כקו מקווקו. תיבה מוטמעת מציגה את משוואת עקומת הסטנדרט ואת מקדם הדטרמינציה (R2 = 0.99). פאנל תחתון: טבלה המכילה את הערכים המספריים ששימשו ליצירת עקומת הכיול. השורה הראשונה מפרטת את חמשת פוטנציאלי האלקטרודה (mV) שנרשמו עבור דגימות הכיול. השורה השנייה מספקת את מסות יוני הפלואוריד התואמות (ng F⁻) עבור כל דגימת כיול. השורה השלישית מפרטת את הנפחים (µL) של תמיסת סטוק NaF בריכוז 10 mM שהוספו לכלי הדיפוזיה של הכיול; מסת יוני הפלואוריד שהוספה זו שקולה למסה שנלכדה בכל דגימת כיול לאחר הדיפוזיה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

תוצאות

כדי להדגים את יישום פרוטוקול זה למדידת ריכוזי פלואוריד (F-) בחומרים ביולוגיים, הוכנו דגימות מרקמות של סרום, עצם ושיני חיתוך של לסת תחתית, שנאספו מעכברים שנחשפו לטיפולי פלואוריד מבוקרים. עכברים זכרים מסוג C57BL/6J חולקו לשתי קטגוריות גיל, מתבגרים (6 שבועות) ובוגרים (18 שבועות), וסופקו להם או מים דה-יוניים נטולי פלואוריד (0 ppm F⁻) או מי שתייה מועשירים בנתרן פלואוריד (125 ppm F⁻) למשך תקופת חשיפה של 6 שבועות. כל קבוצת גיל ותנאי טיפול כללה חמישה בעלי חיים. בתום תקופת החשיפה, נאספו סרום, עצמות ירך ושיני חיתוך של לסת תחתית, ודגימות הרקמות הוכנו ונולאו בהתאם לפרוטוקול. ריכוזי הפלואוריד המייצגים שנמדדו בסרום, בעצם ובשיניים מסוכמים להלן.

figure-results-1
איור 4ריכוזי פלואוריד שנמדדו בסרום, בעצם הירך ובשיריים של הלסת התחתונה. עכברי C57BL/6J זכרים חולקו לשתי קטגוריות גיל, מתבגרים (6 שבועות, עמודה ריקה) ובגירים (18 שבועות, עמודה מלאה), וסופקו להם או מים דה-יוניים נטולי פלואוריד (0 ppm F⁻) או מי שתייה מועשריים בנתרן פלואוריד (125 ppm F⁻) לתקופת חשיפה של 6 שבועות. בתום תקופת החשיפה, נמדדו רמות הפלואוריד ב-(A) סרום, (B) עצם הירך ו-(C) שיניים חותכות של הלסת התחתונה מאותן קבוצות טיפול. ערכי סרום שמתחת לסף הגילוי (<(0.02 ppm) שורטטו לצורכי ויזואליזציה אך הוסירו מהניתוח הסטטיסטי. הנתונים מוצגים כממוצעים ± סטיית תקן (SD). השוואות בין קבוצות בני נוער לקבוצות בוגרים בוצעו באמצעות מבחן Mann–Whitney U עם תיקון Bonferroni–Dunn להשוואות מרובות. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5 לקבוצה). אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ריכוזי פלואוריד בסרום
בשתי הקבוצות (מתבגרים ובוגרים) שטופלו ב-0 ppm פלואוריד, ריכוזי הפלואוריד בסרום היו נמוכים מגבול הגילוי של האלקטרודה הסלקטיבית ליון (<0.02 ppm). בקבוצות הטיפול ב-125 ppm, ריכוז הפלואוריד בסרום עלה ל-0.3 ± 0.2 ppm בקבוצת המתבגרים ול-0.7 ± 0.2 ppm בקבוצת הבוגרים (p = 0.06).השוואה בין קבוצת המתבגרים לקבוצת הבוגרים בטיפול ב-125 ppm בוצעה באמצעות מבחן Mann–Whitney U עם תיקון Bonferroni–Dunn להשוואות מרובות. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/group). קבוצות הטיפול ב-0 ppm הוצאו מהניתוח הסטטיסטי. (איור 4A, טבלה 1).

ריכוזי פלואוריד בעצם הירך
בקבוצות הטיפול של 0-ppm, ריכוזי הפלוריד בעצם הירך היו נמוכים באופן מובהק אצל בני נוער (292 ± 39 ppm) בהשוואה לבעלי חיים בוגרים (896 ± 55 ppm) (p < 0.01). לעומת זאת, בקבוצות של 125 ppm, ריכוזי הפלואוריד בקרב בני נוער (4,108 ± (482 ppm) היו גבוהים באופן מובהק מאשר בבעלי חיים בוגרים (2,966 ± 612 ppm) (p = 0.04). השוואות בין קבוצת בני ההתבגרים לקבוצת הבוגרים בוצעו באמצעות מבחן Mann–Whitney U עם תיקון Bonferroni–Dunn להשוואות מרובות. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5 לקבוצה). (איור 4B, טבלה 1). איור 5A מציג את שינוי הפי (fold-change) ברמות הפלוריד בעצם הירך בין הטיפול ב-0 ppm לטיפול ב-125 ppm עבור כל קבוצת גיל. אצל מתבגרים נצפתה עלייה של פי 14 ברמות הפלוריד בריכוז של 125 ppm, בעוד שעכברים בוגרים הראו עלייה של פי 3.

ריכוזי פלואוריד בשיניים חותכות תחתונות
בקבצות ה-0 ppm, ריכוזי הפלואוריד בשיניים חותכות תחתונות היו נמוכים משמעותית אצל מתבגרים (35 ± 4 ppm) בהשוואה לבעלי חיים בוגרים (123 ± 23 ppm) (p = 0.03). בקבוצות הטיפול ב-125 ppm, ריכוזי הפלואוריד בחותכות עלו ל-5641 ± 955 ppm במתבגרים ול-4392 ± 1694 ppm בבעלי חיים בוגרים. השוואות בין קבוצות המתבגרים והבוגרים בוצעו באמצעות מבחן Mann–Whitney U עם תיקון Bonferroni–Dunn להשוואות מרובות. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/קבוצה). (איור 4C, טבלה 1). למרות שריכוזי הפלואוריד המוחלטים ב-125 ppm לא נבדלו באופן משמעותי בין קבוצות הגיל, שינוי המכפלה (fold-change) מ-0 ppm ל-125 ppm היה גדול משמעותית בעכברי מתבגרים (עלייה של פי 161) מאשר בעכברים בוגרים (עלייה של פי 36) (איור 5B).

figure-results-2
איור 5: מתבגרים מראים עלייה גבוהה יותר (במונחי fold-increase) בהצטברות פלואוריד בעצם ובשיניים החותתות מאשר עכברים בוגרים. שינוי יחסי (Fold-change) בריכוזי הפלואוריד מטיפול של 0 ppm ל-125 ppm פלואוריד בעכברים מתבגרים (עמודה פתוחה) ובוגרים (עמודה מלאה). (A) עצם הירך ו-(B) שן חותתת בלסת התחתונה מאותן קבוצות טיפול. הנתונים מוצגים כממוצעים ± SD. השוואות בין הקבוצות של המתבגרים והבוגרים בוצעו באמצעות t-test לא מזווג. * p < 0.05, (N = 5/קבוצה). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דגימהסרוםפמור (ירך)חותש לסתי תחתון
קבוצת גילמתבגרבוגרמתבגרבוגרמתבגרבוגר
קבוצת טיפול0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm
< 0.020.2< 0.020.8324457693330813748241613229
< 0.020.1< 0.020.8229377892433263954511272654
< 0.020.7< 0.021.0300468387737133155441126997
< 0.020.4< 0.020.5323383280725193551141034169
< 0.020.3< 0.020.528336699372192N/A72711114909
ממוצע< 0.020.3< 0.020.7292410889629663556411234392
SD (סטיית תקן)NA0.2NA0.239482556123955231694

טבלה 1: מדידות פלואוריד פרטניות בסרום, בעצם הירך ובשיניים חותכות של הלסת התחתונה. טבלה 1 מפרטת את ריכוזי הפלואוריד הפרטניים (ppm F⁻) שנמדדו בדגימות סרום, עצם ירך ושיניים חותכות של הלסת התחתונה מעכברים מתבגרים ובוגרים שנחשפו ל-0 ppm או 125 ppm פלואוריד. עבור כל סוג רקמה, הנתונים מוצגים בעמודות התואמות לארבע קבוצות הטיפול: מתבגרים 0 ppm, מתבגרים 125 ppm, בוגרים 0 ppm, ובוגרים 125 ppm. כל עמודה כוללת את חמשת הערכים הפרטניים שנרשמו (N = 5), ולאחריהם הממוצע והסטייה התקנית (SD) שחושבו. בקבוצת הסרום של המתבגרים 0 ppm, כל הערכים שנרשמו היו נמוכים מגבול הגילוי של האלקטרודה הסלקטיבית ליון (<0.02 ppm). הטבלה מספקת את הנתונים המספריים הגולמיים שעליהם מבוססים ערכי הסיכום וההשוואות הסטטיסטיות המוצגים ב-איור 4.

דיון

מדידות פלואוריד בוצעו באמצעות אלקטרודה סלקטיבית ליונים (ISE) הסלקטיבית לפלואוריד, המשלבת ממבנה קריסטלי של לנתניום פלואוריד (LaF₃)38,39. ממבנה זה יוצר קשרים יציבים מאוד של La–F, מה שמוביל להעדפה חזקה של יוני פלואוריד על פני הלידים אחרים. על פי ספרות אלקטרוכימית מבוססת ומפרטי היצרן, ממבנה ה-LaF₃ מראה מקדמי סלקטיביות נמוכים מאוד עבור כלוריד, מה שמעיד על כך שיוני כלוריד אינם יוצרים הפרעה מדידה בתנאים המשמשים בפרוטוקול זה. למרות שכלוריד נמצא באופן טבעי בשיניים ובעצם, פעילותו אינה משפיעה על פוטנציאל האלקטרודה, והאות הרשום משקף באופן ספציפי את פעילות הפלואוריד. גבול הגילוי התחתון של 0.02 ppm תואם לריכוז המינימלי שניתן לכימות אשר תוקף על ידי היצרן עבור אלקטרודת הפלואוריד הסלקטיבית של Orion. גבול זה משקף את ריכוז הפלואוריד הנמוך ביותר שבו האלקטרודה שומרת על תגובה נרנסטית (Nernstian) יציבה ועל קשר ליניארי עם עקומת הכיול. מכיוון שגבול הגילוי מוגדר על ידי מאפייני הממבנה של האלקטרודה ותוקף על ידי היצרן, לא נדרשה קביעה ניסיונית נוספת עבור פרוטוקול זה; עם זאת, בנוגע לטווח הגילוי העליון, המחברים הבחינו כי מסות פלואוריד העולות על כ-38,000 ng במלכודת NaOH של 50 µL הובילו לתגובת אלקטרודה לא-ליניארית, מה שמעיד על כך שעקומת הכיול אינה אמינה יותר בעומסי פלואוריד גבוהים מאוד. אי-ליניאריות זו נובעת ככל הנראה מחריגה מהחוזק היוני וטווח הפעילות האופטימליים עבור האלקטרודה בתנאי הניסוי הנתונים, ולא משקפת גבול עליון מובנה של ה-ISE עצמה. עבור דגימות שצפויות להכיל מסות פלואוריד מעל סף זה, מומלץ להגדיל את נפח מלכודת ה-NaOH כדי לשמור על המדידות בתוך הטווח הדינמי הליניארי של האלקטרודה.

יש לקחת שיקול זה בחשבון בעת החלת הפרוטוקול על דגימות עם תכולת פלואוריד גבוהה באופן חריג. מכיוון ששלב הדיפוזיה צורך את כל נפח הדגימה, לא ניתן היה לבצע מדידות כפולות וניסויי הוספה ושחזור (spike‑and‑recovery) על הדגימות הביולוגיות. כדי להבטיח דיוק ורגישות אנליטית, נכללו סטנדרטים לבקרת איכות (QC) המכילים ריכוזי פלואוריד ידועים בכל סדרת מדידה. סטנדרטים אלו עברו עיבוד ומדידה באופן זהה לדגימות הניסוייות. בכל ההרצות, ריכוזי הפלואוריד שנמדדו בסטנדרטים של ה-QC היו עקביים בטווח של 5% מערכיהם הצפויים. עבור כל סדרה של 10–20 דגימות ביולוגיות, הוכנו במקביל שתי קבוצות עצמאיות של 5–6 דגימות כיול, ועקומת כיול נרשמה לפני כל סשן מדידה. טווח הכיול הותאם עבור כל הרצה כדי להתקרב למסות הפלואוריד הצפויות בדגימות הביולוגיות, אשר תלויות בסוג הדגימה, במסת החומר שהתווספה לכלי הדיפוזיה, ובקבוצת הטיפול ובגיל החיה. עבור מדידות בסרום, סטנדרטי הכיול תאמו לריכוזי פלואוריד של כ-0.06–1.20 ppm בדגימה. עבור מדידות בעצם ובשן, סטנדרטי הכיול תאמו לריכוזי פלואוריד של כ-19–7,600 ppm בדגימה.

פרוטוקול זה מספק גישה רגישה וניתנת לשחזור לכימות מסת יוני פלואוריד בסרום, בעצם ובשיניים, באמצעות דיפוזיה המקולטלת על ידי hexamethyldisiloxane, ולאחריה אנליזה באמצעות ISE. השיטה לוכדת באופן מהימן פלואוריד השתחרר ממטריצות ביולוגיות מגוונות ומאפשרת הערכה כמותית של הצטברות פלואוריד בעקבות חשיפה מבוקרת. תוצאות מייצגות מעכברים מתבגרים ובוגרים מדגימות הבדלים ברורים התלויים בגיל ובמינון בהשקעת הפלואוריד ברחבי הרקמות, מה שמדגיש את התועלת של גישה זו לחקר מטבוליזם וטוקסיקינטיקה של פלואוריד in vivo.

יתרון מרכזי של פרוטוקול זה הוא השימוש בצלחות דיפוזיה המפרידות פיזית בין התגובה המשחררת פלואוריד לבין הסביבה הלוכדת פלואוריד. התכנון האיטום באמצעות פטרולטום (petrolatum) ממזער את חילופי הגזים עם האטמוספירה ומבטיח לכידה יעילה של יוני פלואוריד משוחררים על ידי טיפות נתרבית (sodium hydroxide) על המכסה. חומצה גופרית רוויה ב-HMDS מספקת כוח מניע חזק ועקבי לשחרור פלואוריד מרקמות ממינרליות, כולל מבנים בעלי הסתייך גבוה כגון עצם ושיניים. מדידת ISE עוקבת, המכוילת עם סטנדרטים תואמי-דיפוזיה, מאפשרת כימות מדויק לאורך טווח דינמי רחב. יתרון נוסף של גישה זו הוא היכולת לכמת פלואוריד בדגימות ביולוגיות קטנות ביותר. רקמות ממינרליות מעכברים, ובמיוחד שיניים חותכות של הלסת התחתונה, מניבות רק 3–5 mg של אפר לכל שן. שיטות אנליטיות קונבנציונליות דורשות לעיתים קרובות מסות דגימה גדולות יותר או תכולת פלואוריד גבוהה יותר כדי להשיג זיהוי מהימן. בניגוד לכך, התכנון מבוסס-הדיפוזיה מרכז את כל הפלואוריד ששוחרר מהדגימה כולה לנפח קטן ומוגדר, מה שמאפשר כימות מדויק גם בדגימות זעירות עם מסת פלואוריד מוחלטת נמוכה. מאפיין זה בעל ערך רב במיוחד למחקרים הכוללים בעלי חיים קטנים, זמינות מוגבלת של רקמות או מבנים ממינרליים שעברו מיקרו-דיסקציה.

מגבלה עיקרית של שיטה זו היא גבול הגילוי של ה-ISE שנעשה בו שימוש במחקר זה (0.02 ppm). דגימות סרום מבעלי חיים בקבוצת ביקורת ללא פלואוריד היו לעיתים קרובות מתחת לסף זה, דבר שמנע כימות של ריכוזי פלואוריד נמוכים ביותר. ייתכן שיהיה צורך להוסיף מסה או נפח מוגדל של דגימה לכלי הדיפוזיה, במידה והדבר אפשרי, או להשתמש בטכניקות אנליטיות חלופיות כאשר מודדים ריכוזי קורט הקרובים לגבול הגילוי או נמוכים ממנו. בנוסף, השיטה דורשת דיפוזיה לילה שלם וטיפול זהיר בריאגנטים קורוזיביים, מה שעשוי להגביל את תפוקת העבודה במחקרים בהיקף גדול. למרות ש-ISE מספק כימות רגיש של פלואוריד כולל, הוא אינו יכול להעריך את ההתפלגות המרחבית בתוך רקמות. ניתן לשלב גישות משלימות, כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת בשילוב עם ספקטרוסקופיית רנטגן עם פיזור אנרגיה (SEM-EDX) או פליטת קרני גמא בהשראת חלקיקים (PIGE), כדי להדמיות ולמיפוי של התפלגות הפלואוריד בקנה מידה מיקרוסקופי עד מאקרוסקופי. מודאליות מבוססות דימוי אלו מאפשרות הערכה של הצטברות פלואוריד מקומית ברקמות ממינרליות או רכות, ובכך הן משלימות את מדידות ה-ISE ומספקות הערכה מקיפה יותר של תכולת הפלואוריד ברקמה.

מספר גורמים טכניים חוזרים עשויים להשפיע על הדיוק והמהימנות של דיפוזיית הפלוריד ומדידתו בפרוטוקול זה, ותצפיותינו מדגישות כיצד הכנת הכיול, איטום צלח הדיפוזיה, בקרת pH, ביצועי האלקטרודה וטיפול בדגימות מעצבים יחד את איכות הנתונים. סיבות אפשריות לעקומת כיול לא ליניארית (R2 < 0.99) או לקריאות של דגימות רקמה מחוץ לטווח הצפוי כוללות חישובים שגויים של נפח תמיסת המקור של NaF שהוספה לצלח הדיפוזיה או שגיאות פיפטינג במהלך הכנת סטנדרטי הכיול. פעולה מומלצת: הכינו לפחות שתי סדרות עצמאיות של דגימות כיול עבור כל הרצה, כך שסט גיבוי יהיה זמין אם עקומת כיול אחת חורגת מהטווח הצפוי. איטום לא מלא של צלח הדיפוזיה עלול לגרום לאובדן פלוריד במהלך הדיפוזיה, מה שיוביל לקריאות נמוכות באופן מלאכותי. דבר זה קורה בדרך כלל כאשר מיושם פטרולטום בכמות לא מספיקה על שולי מכסה צלח הדיפוזיה. פעולה מומלצת: מרחו כמות נדיבה של ג'ל פטרולטום סביב שולי מכסה צלח הדיפוזיה ולחצו בחוזקה כדי להבטיח איטום מלא. שגיאות פיפטינג בעת הוספת תמיסת חומצה אצטית למלכודת ה-NaOH עלולות להסיט את pH הדגימה מחוץ לטווח האופטימלי של pH 5.0, מה שיוביל לשחזור פלוריד לא מדויק. פעולה מומלצת: בדקו את ה-pH של כל דגימה באמצעות נייר pH והשליכו כל דגימה שחורגת מ-pH 5. דגימות כיול עשויות לחוץ גם הן מחוץ לגבולות ההקלטה התקינים של האלקטרודה הסלקטיבית לפלוריד. ריכוזים נמוכים מ-0.02 ppm נמצאים מתחת לסף הגילוי של האלקטרודה. פעולה מומלצת: אין להשתמש בדגימות כיול המכילות פחות מ-0.02 ppm פלוריד. לעומת זאת, דגימות כיול עם ריכוזי פלוריד גבוהים מדי עלולות לשנות את העוצמה היונית של התמיסה ולהוביל לתגובות אלקטרודה לא ליניאריות. פעולה מומלצת: בתחילת הפרויקט, הכינו תמיסות כיול המכסות טווח רחב של ריכוזי פלוריד כדי לקבוע את טווח העבודה הליניארי של האלקטרודה הספציפית שבה נעשה שימוש. אם דגימות הרקמה חורגות מטווח ליניארי זה, הפחיתו את מסת הרקמה או הגדילו את נפח מלכודת ה-NaOH והתאימו את נפח החומצה האצטית בהתאם כדי לשמור על pH 5. קושי בהשגת עקומות כיול ליניאריות בטווח של 0.02–1 ppm: סיבה נפוצה היא התיישנות האלקטרודה. אלקטרודות סלקטיביות לפלוריד ישנות מאבדות רגישות בריכוזי פלוריד נמוכים מאוד. פעולה מומלצת: החליפו את האלקטרודה הסלקטיבית לפלוריד. קריאות פוטנציומטר לא יציבות (סחיפת אות או קפיצות) מתרחשות בדרך כלל כאשר פני החישה של האלקטרודה אינם טבולים במלואם בתמיסת הדגימה. פעולה מומלצת: הורידו את האלקטרודה כך שפני החישה יהיו מכוסים לחלוטין על ידי דגימת הנוזל.

באופן כללי, פרוטוקול זה מספק גישה חסונה המבוססת על כיול לכמימות של פלואוריד במטריצות ביולוגיות מגוונות, והוא מתאים למחקרים הבודקים חשיפה לפלואוריד, שיקונו ברקמות ותוצאות טוקסיקולוגיות במודלים של עכברים.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

תודות

המחקר המדווח בפרסום זה נתמך על ידי Japan Society for the Promotion of Science; מלגות מחקר בחוץ לארץ של JSPS מספר 202560528 (S.Y.), Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP); מספר 2024/07452-9 (J.S.T.), והמכון הלאומי למחקר דנטלי ופנים-גולגולתי של ה-National Institutes of Health; מספר R01DE027648 (M.S.) ומספר K02DE029531 (M.S.).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצה אצטית, גלציאליתSigma-AldrichSupelco, GR ACSAX0073-6
כורסי אלומינהAdvalue Technologyקוטר חיצוני 12 מ"מ × 25 מ"מ גובה, AL-6212AL-6212
מאזניים אנליטייםVWRVWR 124B2, d = 0.1 mg—
מערבל חרוצים (Bead Beater)מדד השוואהBeadBug 6—
מחט מזריקה בעלת קצה קההאמזוןמחט תעשייתית בעלת קצה קהה, 14 G × 0.5 אינץ׳X001TT8KX1
פחמן דו-חמצניAirGas——
Chemical Fume HoodMott Manufacturingמודל 7421040—
D(+)-סוכרוזThermo Scientific99.7% עבור ביוכימיה177142500
תמיסת מילוי לאלקטרודהThermo Scientificתמיססת מילוי Orion IonPlus900061
תמיסת אתנולKoptec140 Proof2401
מקפיא, −80 °CThermo Scientificסדרת Revco RDE—
כפפות עמידות לחוםFisher Scientificכפפות אוטוקלב לסכנה ביולוגית של Bel-Art ClaviesH13201
הקסאמתילדיסילוקסאן (HMDS)Fisher ScientificTCI H0091, >98%H0091
מימן פרא-חמצןVWRJ.T. Baker, 30%2204-01
אלקטרודה סלקטיבית ליוןThermo ScientificOrion Fluoride ISE, ערוץ כפול9609BNWP
מערבל מגנטיVWRמערבל 360—
שפתולה מיקרוסקופיתאמזוןשפכטול לגילוף שעווה מס' 7A, פלדת אל-חלד—
מיקרוצנטריפוגהEppendorf5427R5404000131
תנור מופל (Muffle Furnace)Thermo Scientificתנור מופל קטן לשולחן מעבדה של Thermolyne, נפח 1.3 ליטר, דגם FB1315MFB1315M
תנורBoekel ScientificBoekel RapidFISH240200
תמיסת פאראפורמלהיד ב-PBSThermo Scientific4% פאראפורמלהיד ב-PBSJ19943-K2
צלחת פטריVWR60 × 15 מ"מ, ללא טיפול25384-092
וזליןThermo Scientificוזלין, לבן, טהור417090010
נייר אינדיקטור pHFisher ScientificpH-Fix 4.5–10.092120.3
כלי פורצלןFisher Scientificכלי שריפה Fisherbrand, 5 מ"ל, גובה 20 מ"מ, צורה גבוההFB-965-B
פוטנציומטרThermo Scientificמד-pH/ISE מדגם Orion Dual Star2115102
מעמד טבעת עם תסמיךVWRמחזיק טבעת, 15 ס"מ470104-526
תזונת מכרסמיםBio-ServF1515, AIN-76A, ½ משקעיםF1515
ג'ק מספרייםאמזוןג'ק מספרי למעבדה—
משפך הפרדהFisher ScientificEisco, זכוכית בורוסיליקט, 2 ליטרS89285
נתרן כלורידFisher Scientificמאושר ACS, גבישיS271-1
נתריום פלורידFisher Scientificמאושר ACS, אבקהS299-100
נתרן הידרוקסידFisher Scientificכדוריות לבנותBP359-500
פיתורי פלדת אל-חלדFisher ScientificScientific Industries, 5 מ"מ, 100 יחידותSI-CS05
חומצה גופריתFisher Scientificבדרגת ACSA300-500
TISAB IIThermo Scientificתמיסת יישום Orion IonPlus940909
דסיקטור ואקוםFisher Scientificמייבש ואקום חסכוני במקום מבית Bel-Art, 10 אינץ'F42010-0000
מסנן ואקוםFisher Scientificמסנן Flow Bottle-Top, PES, 90 מ"מ, 0.2 µm597-4520
מנער משתנה (Variable Rocker)MidSciLabDoctor / Benchmark Scientific—

מקורות

  1. Podgorski J, Berg M. Global analysis and prediction of fluoride in groundwater. Nat Commun. 2022;13(1):4232. doi:10.1038/s41467-022-31940-x
  2. Iheozor-Ejiofor Z, Worthington HV, Walsh T, O'Malley L, Clarkson JE, Macey R, et al. Water fluoridation for the prevention of dental caries. Cochrane Database Syst Rev. 2015;2015(6):Cd010856. doi:10.1002/14651858.CD010856.pub2
  3. Manchanda S, Sardana D, Liu P, Lee GH, Li KY, Lo EC, et al. Topical fluoride to prevent early childhood caries: Systematic review with network meta-analysis. J Dent. 2022;116:103885. doi:10.1016/j.jdent.2021.103885
  4. Chan AKY, Tamrakar M, Jiang CM, Tsang YC, Leung KCM, Chu CH. Clinical evidence for professionally applied fluoride therapy to prevent and arrest dental caries in older adults: A systematic review. J Dent. 2022;125:104273. doi:10.1016/j.jdent.2022.104273
  5. Zamperini CA, Bedran-Russo AK. Immediate and Sustained Root Caries Prevention of Fluoride Varnish Combined with Toothpastes. Caries Res. 2023;57(5-6):592-601. doi:10.1159/000533279
  6. Melough MM, Sathyanarayana S, Zohoori FV, Gustafsson HC, Sullivan EL, Chi DL, et al. Impact of Fluoride on Associations between Free Sugars Intake and Dental Caries in US Children. JDR Clin Trans Res. 2023;8(3):215-23. doi:10.1177/23800844221093038
  7. Suzuki M, Everett ET, Whitford GM, Bartlett JD. 4-phenylbutyrate Mitigates Fluoride-Induced Cytotoxicity in ALC Cells. Front Physiol. 2017;8:302. doi:10.3389/fphys.2017.00302
  8. Suzuki M, Shin M, Simmer JP, Bartlett JD. Fluoride affects enamel protein content via TGF-beta1-mediated KLK4 inhibition. J Dent Res. 2014;93(10):1022-7. doi:10.1177/0022034514545629
  9. Everett ET, McHenry MA, Reynolds N, Eggertsson H, Sullivan J, Kantmann C, et al. Dental fluorosis: variability among different inbred mouse strains. J Dent Res. 2002;81(11):794-8.
  10. Kong H, He Z, Li H, Xing D, Lin J. The association between fluoride and bone mineral density in US children and adolescents: a pilot study. Nutrients. 2024. doi:10.3390/nu16172948
  11. Mazzoli R, Filippini T, Iamandii I, De Pasquale L, Veneri F, Birnbaum LS, et al. The association of fluoride exposure with bone density and fracture risk: a dose-response meta-analysis. Environ Health. 2025;24(1):73.
  12. Suzuki M, Bandoski C, Bartlett JD. Fluoride induces oxidative damage and SIRT1/autophagy through ROS-mediated JNK signaling. Free Radic Biol Med. 2015;89:369-78.
  13. Kubota K, Lee DH, Tsuchiya M, Young CS, Everett ET, Martinez-Mier EA, et al. Fluoride induces endoplasmic reticulum stress in ameloblasts responsible for dental enamel formation. J Biol Chem. 2005;280(24):23194-202. doi:10.1074/jbc.M503288200
  14. Yamashita S, Okamoto M, Mendonca M. Fluoride alters gene expression via histone H3K27 acetylation in ameloblast-like LS8 cells. Int J Mol Sci. 2024. doi:10.3390/ijms25179600
  15. Deng H, Fujiwara N, Cui H, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Histone acetyltransferase promotes fluoride toxicity in LS8 cells. Chemosphere. 2020;247:125825.
  16. Deng H, Ikeda A, Cui H, Bartlett JD, Suzuki M. MDM2-Mediated p21 Proteasomal Degradation Promotes Fluoride Toxicity in Ameloblasts. Cells. 2019;8(5). doi:10.3390/cells8050436
  17. Fujiwara N, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Curcumin suppresses cell growth and attenuates fluoride-mediated Caspase-3 activation in ameloblast-like LS8 cells. Environ Pollut. 2021;273:116495. doi:10.1016/j.envpol.2021.116495
  18. Suzuki M, Ikeda A, Bartlett JD. Sirt1 overexpression suppresses fluoride-induced p53 acetylation to alleviate fluoride toxicity in ameloblasts responsible for enamel formation. Arch Toxicol. 2018;92(3):1283-93. doi:10.1007/s00204-017-2135-2
  19. Regelson S, Dehghan M, Tantbirojn D, Almoazen H. Evaluation of fluoride levels in commercially available tea in the United States. 2020/12/23 ed2021 Jan-Feb. 17-20 p.
  20. Cantoral A, Luna-Villa LC, Mantilla-Rodriguez AA, Mercado A, Lippert F, Liu Y, et al. Fluoride Content in Foods and Beverages From Mexico City Markets and Supermarkets. Food Nutr Bull. 2019;40(4):514-31. doi:10.1177/0379572119858486
  21. Institute of Medicine SCotSEoDRI. Dietary Reference Intakes for Calcium, Phosphorus, Magnesium, Vitamin D, and Fluoride. Washington, DC: National Academy Press; 1997.
  22. Otal E.H. KML, Kimura M. Fluoride Detection and Quantification, an Overview from Traditional to Innovative Material-Based Methods. In: Wambu E.W. LGJ, Kiplagat A., editor. Fluoride. London: IntechOpen; 2022.
  23. Whitford GM. Absorption and Plasma Concentrations of Fluoride, 1996.
  24. Taves DR. Determination of submicromolar concentrations of fluoride in biological samples. Talanta. 1968;15(10):1015-23. doi:10.1016/0039-9140(68)80109-2
  25. Buzalaf MA, Caroselli EE, de Carvalho JG, de Oliveira RC, da Silva Cardoso VE, Whitford GM. Bone surface and whole bone as biomarkers for acute fluoride exposure. J Anal Toxicol. 2005;29(8):810-3.
  26. Zohoori FV, Maguire A, Martinez-Mier EA, Buzalaf MAR, Sanderson R, Eckert GJ. A Comparison of Simple Analytical Methods for Determination of Fluoride in Microlitre-Volume Plasma Samples. Caries Res. 2019;53(3):275-83. doi:10.1159/000492339
  27. Martínez-Mier EA, Cury JA, Heilman JR, Katz BP, Levy SM, Li Y, et al. Development of gold standard ion-selective electrode-based methods for fluoride analysis. Caries Res. 2011;45(1):3-12. doi:10.1159/000321657
  28. Boivin G, Chapuy MC, Baud CA, Meunier PJ. Fluoride content in human iliac bone: results in controls, patients with fluorosis, and osteoporotic patients treated with fluoride. J Bone Miner Res. 1988;3(5):497-502.
  29. Yamashita S, Okamoto M, Fujiwara N, Achong-Bowe R, Brueckner S, Mendonca M, et al. Developmental vulnerability to fluoride toxicity: enamel and clearance differences in adolescent versus mature mice. Arch Toxicol. 2025.
  30. Chiba K, Hisamatsu, S., Takizawa, Y, Katsura, K. Determination of fluoride in biological materials by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1982;245:8.
  31. Ikenishi K, Chiba, K., Hisamatsu, S, Takizawa, Y. Determination of fluoride in biological samples by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1988;437:8.
  32. Venkateswarlu P, Reddy, D.S., Reddy, T.S. Spectrophotometric determination of fluoride using the SPADNS method. Analyst 1971;96:5.
  33. Kakabadse G. KN, Davies C.W. The Spectrophotometric Determination of Fluoride with SPDNS-Zirkonium Lake. Analyst. 1971;96:8.
  34. Mendham J, Denney RC, Barnes JD, Thomas MJK. Vogel's Textbook of Quantitative Chemical Analysis. 6th ed. Harlow, England: Prentice Hall; 2000.
  35. Kučera J, Štefánik, M. & Veselka, P. Fluorine determination in biological and environmental samples with INAA using fast neutrons from a p(19 MeV)+Be neutron generator. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry 2019;322:7.
  36. Okamoto M, Yamashita S, Memida T, Mendonca M, Brueckner S, Nakamura S, et al. Microhardness Measurements on Tooth and Alveolar Bone in Rodent Oral Disease Models. J Vis Exp. 2024(206). doi:10.3791/66583
  37. Okamoto M, Yamashita S, Mendonca M, Brueckner S, Achong-Bowe R, Thompson J, et al. Ultrastructural evaluation of adverse effects on dentine formation from systemic fluoride application in an experimental mouse model. Int Endod J. 2025;58(1):128-40.
  38. Frant MS, Ross JW, Jr. Electrode for sensing fluoride ion activity in solution. Science. 1966;154(3756):1553-5.
  39. Umezawa Y, Umezawa, K and Sato, H. Selectivity coefficients for ion-selective electrodes: recommended methods for reporting KRB values, 1995.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

BiologyFluorideHexamethyldisiloxane HMDS facilitated diffusionion selective electrodeserumboneteeth
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים