מאמר שיטה

כימות פלואוריד בסרום, בעצם ובשיניים במודל עכברים באמצעות דיפוזיה מזורזת על ידי הקסאמתילדיסילוקסן ומדידות באמצעות אלקטרודה סלקטיבית ליונים

238 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71488

⸱

28 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oral Science and Translational Research, College of Dental Medicine, Nova Southeastern University, 2Department of Biological Sciences, Bauru School of Dentistry, University of São Paulo, 3Department of Restorative Dentistry and Endodontology, Osaka University Graduate School of Dentistry, 4Unit of Dentistry, Osaka University Hospital, 5Department of Biomedical Sciences, Adams School of Dentistry, The University of North Carolina at Chapel Hill

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את הכנתן של צלחות דיפוזיה המתווכות על ידי hexamethyldisiloxane (HMDS), ולאחריהן מדידות באמצעות אלקטרודה סלקטיבית ליון כדי לכמת את מסת יוני הפלואוריד בסרום, בעצם ובשיניים של עכברים. שיטה זו מספקת גישה רגישה, מבוססת כיול, להערכת הצטברות פלואוריד בדגימות ביולוגיות.

תקציר

כימות רמות פלוריד ברקמות ביולוגיות חיוני להבנת החשיפה לפלוריד, חילוף החומרים שלו והרעילות שלו. פרוטוקול זה מתאר שיטה רגישה וניתנת לשחזור למדידת מסת יוני פלוריד בסרום, בעצם ובשיניים באמצעות דיפוזיה המתווכת על ידי hexamethyldisiloxane (HMDS), ולאחריה ניתוח באמצעות אלקטרודה סלקטיבית ליון (ISE). דגימות ביולוגיות, כולל סרום, עצם פמורלית ושיני חיתוך של הלסת התחתונה, נאספות מעכברים שנחשפו לטיפולי פלוריד מבוקרים. דגימות עצם ושיניים עוברות שריפה (ashing), טחינה והידרציה, בעוד שסרום מעובד באופן ישיר. כל דגימה מועברת לכלי דיפוזיה המכיל מים אולטרה-טהורים ונחתמת עם מכסה מצופה בוואזלין הנושאת טיפות של נתרן הידרוקסיד המשמשות כמלכודות פלוריד. הזרקה של חומצה גופרית רוויה ב-HMDS מתניעה את שחרור הפלוריד והדיפוזיה שלו, מה שמאפשר ללכוד כמותית את יוני הפלוריד המשוחררים במלכודות. לאחר דיפוזיה של לילה שלם, טיפות מלכודת הפלוריד מאוחדות לדגימה אחת, מחמיצות לטווח ה-pH הנדרש, ומועמדות לנפח מוגדר למדידה ב-ISE. כלי דיפוזיה לכיול, שהוכנו עם מסות פלוריד ידועות, מייצרים עקומת סטנדרט לצורך כימות, ודגימות בקרת איכות מאמתים את יציבות האלקטרודה. תוצאות מייצגות מעכברים מתבגרים ובוגרים שנחשפו ל-0 או 125 ppm פלוריד מדגימות את יכולתה של השיטה לזהות הבדלים תלויי-גיל ותלויי-מינון ברמות הפלוריד בסרום, בעצם ובשיניים. פרוטוקול זה מספק גישה חסונה מבוססת כיול לכימות פלוריד במטריצות ביולוגיות מגוונות ומתאים למחקרים הבוחנים חשיפה לפלוריד, שקיעה ברקמות ותוצאות טוקסיקולוגיות במודלים של עכברים. יתרון מרכזי של שיטה זו הוא יכולתה לכמת במדויק פלוריד בדגימות קטנות ביותר, כולל 3–5 mg של אפר המתקבל משיני חיתוך בודדות של עכבר, מכיוון שתהליך הדיפוזיה מרכז את כל הפלוריד המשוחרר לנפח דגימה מדיד של פחות מ-100 µL.

מבוא

פלואוריד הוא אניון המופיע באופן טבעי, ורמה אופטימלית של פלואוריד יעילה במניעת עששת שיניים1,2,3,4,5. בארצות הברית (U.S.), פלואורידציה של מי הקהילה בריכוז של 0.7 ppm הוטמעה כאסטרטגיה של בריאות הציבור להפחתת שכיחות העששת ולקידום בריאות השן6. עם זאת, בליעה ממושכת של כמות מופרזת של פלואוריד עלולה להשפיע לרעה על רקמות מרובות. חשיפה לרמות גבוהות של פלואוריד משבשת את היווצרות זגוגית השן7,8,9, משנה את היווצרות העצם10, ופוגעת בשלמות השלד11.

ברמה התאית, חשיפה לפלואוריד גורמת למספר הפרעות מטבוליות, כולל עקה חמצונית12, עקה של הרשת האנדופלזמית13, מודיפיקציות אפיגנטיות המשנות את ביטוי הגנים14, ואפופטוזיס באמלובלסטים15,16,17,18. ברמה הגלובלית, ריכוזי פלואוריד גבוהים במי תהום (>1.5 ppm) מהווים בעיה בריאותית משמעותית. מחקר מידול חיזוי שנערך לאחרונה העריך כי כ-180 מיליון בני אדם ברחבי העולם מושפעים פוטנציאלית מחשיפה מוגברת לפלואוריד, כאשר הנטל הגבוה ביותר נמצא באסיה ובאפריקה1. מעבר למי שתייה, חשיפה לפלואוריד מתרחשת גם דרך מזון (למשל, פירות ים; ~1.9 ppm), משקאות (למשל, תה; 0.5–6 ppm19) ומוצרי דנטל כגון משחיית שיניים20 (1,000–1,500 ppm).

לפיכך, הבנה של חשיפה לפלואוריד, חילוף חומרים שלו והשקיעתו ברקמות היא חיונית להערכת הן התועלת הטיפולית והן ההשלכות הטוקסיקולוגיות הפוטנציאליות שלו. כימות מדויק של פלואוריד בדגימות ביולוגיות — כולל שתן, סרום, עצם ושיניים — הוא מרכיב קריטי בעבודה זו. עם זאת, המדידה מהווה אתגר אנליטי בשל ההתנהגות הכימית של הפלואוריד וזיקתו החזקה למטריצות עשירות בסידן. כ-99% מהפלואוריד בגוף נמצא ברקמות מומחשאות כגון עצם ושיניים21. כדי להתמודד עם אתגרים אלו, פותחו מגוון טכניקות אנליטיות, כולל פוטנציומטריה באמצעות אלקטרודה סלקטיבית ליון (ISE), כרומטוגרפיה יונית, בדיקות קולורימטריות, הליכי טיטרציה ושיטות מבוססות גרעין או הפעלה22. מבין אלו, טכניקת הדיפוזיה המהולה ב-hexamethyldisiloxane (HMDS) בשילוב עם מדידה באמצעות אלקטרודה סלקטיבית לפלואוריד התגבשה כאחת הגישות המהימנות והנפוצות ביותר עבור מטריצות ביולוגיות, בשל רגישותה, השחזוריות שלה והתאימות שלה לסוגי דגימות מגוונים23,24,25,26,27,28,29.

למרות זמינותן של שיטות אנליטיות מרובות, לכל גישה יש מגבלות העשויות להגביל את השימוש בה במחקר ניסויי או קליני. כרומטוגרפיית יונים מספקת רגישות וסלקטיביות גבוהות, אך היא דורשת מכשור ייעודי והכנה נרחבת של הדגימות30,31. בדיקות קולורימטריות, כגון שיטת ה-SPADNS (sodium 2‑(parasulfophenylazo)‑1,8-dihydroxynaphthalene-3,6‑disulfonate), הן פשוטות וזולות, אך הן רגישות להפרעות מעכירות ומכרומופורים אנדוגניים, דבר המגביל את מהימנותן בדגימות ביולוגיות מורכבות22,32,33. שיטות טיטרציה הן יעילות מבחינה כלכלית ופשוטות, אך חסרה בהן הרגישות הנדרשת לזיהוי פלואוריד ברמות עקבות ברוב הדגימות הביולוגיות34. טכניקות גרעיניות או מבוססות על הפעלה מציעות רגישות יוצאת דופן, אך הן דורשות גישה לכיטורים או למקורות נייטרונים מבוססי מאיץ, מה שהופך אותן לבלתי מעשיות לשימוש שגרתי במעבדה35. לעומת זאת, דיפוזיה המואצת על ידי HMDS ולאחריה מדידה ב-ISE מספקת איזון מעשי בין רגישות, עלות ונגישות, תוך הבטחת שחרור מלא של הפלואוריד הן מרקמות רכות והן מרקמות ממינרליזציה. דבר זה יתרוני במיוחד למחקרים הכוללים בעלי חיים קטנים, שבהם זמינות הרקמה מוגבלת ומבנים ממינרליזציה, כגון שיניים קדמיות של עכברים, מניבים רק 3–5 mg של אפר לשן.

היכולת של שיטת הדיפוזיה–ISE לרכז את כל הפלואוריד ששוחרר לנפח קטן ומוגדר מאפשרת כימות מדויק אפילו בדגימות קטנות ביותר. עובדה זו הופכת את השיטה למתאימה במיוחד למחקרי טוקסיקינטיקה, ניסויי תגובה למינון ובחינות של חילוף חומרים של פלואוריד בשלבים התפתחותיים שונים. מכרסמים קטנים, ובמיוחד עכברים מסוג C57BL/6J, שימשו באופן נרחב כמודלים של בעלי חיים לחקר השפעות הפלואוריד7,9,12,29,36.

בפרוטוקול זה, המחברים מיישמים את טכניקת הדיפוזיה המואצת על ידי HMDS, ולאחריה מדידה באמצעות אלקטרודה סלקטיבית לפלואוריד, כדי לכמת פלואוריד בסרום, בעצם ובשיניים שנאספו מעכברים שנחשפו למינון גבוה של פלואוריד (125 ppm) בהשוואה לקבוצות ביקורת שלא טופלו. בנוסף, המחברים משווים את הצטברות הפלואוריד בעכברים מתבגרים (6 שבועות בתחילת הטיפול) ועכברים בוגרים (18 שבועות בתחילת הטיפול) כדי להעריך הבדלים תלויי גיל במטבוליזם של פלואוריד ובהשקעתו ברקמות. שיניים חותכות של הלסת התחתונה נבחרו כרקמה דנטלית מייצגת מכיוון ששיניים חותכות של מכרסמים בוקעות באופן רציף ומגיעות לאיזון של מצב יציב בין בקיעה לבלאי סגירה (occlusal wear) סביב גיל 7 שבועות. דפוס צמיחה רציף זה מספק גרדיאנט עקבי ונגיש של התפתחות זגוגית השן, מה שהופך את השיניים החותכות של עכברים למודל נפוץ ומאומת לבדיקת התהוות זגוגית השן ופלואורוזיס שיניים.

פרוטוקול

כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות לשימוש בבעלי חוליות שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בהם (IACUC) באוניברסיטת Nova Southeastern (פרוטוקול מס' 2023.02.MSuz1), המוכרת על ידי האיגוד להערכה ולהסמכה של טיפול בבעלי חיים במעבדה ברמה בינלאומית (AAALAC). כל העבודה עם בעלי חיים תאמה את המדריך לטיפול בבעלי חיים במעבדה ולהנחיות של האיגוד הרפואי הווטרינרי האמריקאי (AVMA) להדמיסית של בעלי חיים. כל החומרים שנעשה בהם שימוש במחקר זה מופיעים בטבלת החומרים.

1. בעלי חיים ו הכנה והגשה של נתרבן פלוריד במודל עכברי

  1. בעלי חיים: חלק את עכברי C57BL/6J זכרים לשתי קטגוריות גיל: מתבגרים, 6 שבועות בתחילת הטיפול, ובוגרים, 18 שבועות בתחילת הטיפול.
    1. ספק לכל קבוצה מים דה-יוניים נטולי פלואוריד (0 ppm F⁻) או מי שתייה מועשירים בנתרן פלואוריד (125 ppm F⁻) למשך תקופת חשיפה של 6 שבועות.
    2. כלול חמישה בעלי חיים בכל תנאי גיל וטיפול (N = 5/group).
    3. בסוף תקופת החשיפה, אסוף סרום, עצמות ירך (femurs) ושיניים חותכות תחתונות (mandibular incisors), והכן את כל הדגימות שנאספו לאנליזות המשך.
      הערה: דגימה (Specimen): חומר שעבר עיבוד כגון עצם שעברה שריפה (ashed bone), שן שעברה שריפה (ashed tooth) וסרום.
  2. דיור ותזונה של בעלי החיים: השכן את העכברים בתנאי מעבדה סטנדרטיים עם גישה למזון ומים ad libitum.
    1. ספק תזונה נטולת פלואוריד החל משבוע לפני איסוף השיניים, העצמות והסרום כדי למזער את רמות הפלואוריד ברקע.
  3. מי שתייה עם נתרן פלואוריד
    1. להכנת מי שתייה מועשירים בפלואוריד, המס נתרן פלואוריד (NaF) במים דה-יוניים כדי להגיע לריכוז הפלואוריד הרצוי (למשל, 125 ppm F⁻).
    2. סנן את התמיסה דרך מסנן ואקום של 0.2 µm לתוך בקבוק שעבר עיקור באוטוקלאב. הכן תמיסה טרייה מדי יומיים.
      זהירות: NaF הוא רעיל בבליעה ועשוי לגרום לגירוי בעור ובעיניים. יש לטפל בחומר במנדף תוך לבישת חלוק מעבדה, כפפות ניטריל ומשקפי מגן.
  4. עבור מי בקרה נטולי פלואוריד, סנן מים דה-יוניים דרך מסנן ואקום של 0.2 µm לתוך בקבוק שעבר עיקור באוטוקלאב. הכן מים טריים מדי יומיים.
  5. ספק מי שתייה מועשירים בפלואוריד או נטולי פלואוריד ad libitum למשך הזמן הרצוי לטיפול בפלואוריד. עקוב אחר מפלס המים מדי יום והחלף בקבוקים מדי יומיים.
  6. בסוף תקופת החשיפה, בצע המתה לבעלי החיים באמצעות שאיפת פחמן דו-חמצני (CO₂) ולאחריה עריפת ראש. נהלי ההמתה בוצעו בהתאם להנחיות AVMA להמתת בעלי חיים ואושרו כחלק מפרוטוקול ה-IACUC המוסדי.
    זהירות: CO2 הוא חומר חנק. בצע את הפעולות באזור מאוורר היטב וודא שהתא פועל כראוי. הימנע מחשיפה לשאיפה ישירה.

2. הכנת דגימות למדידת פלואוריד

  1. איסוף דם
    1. בצעו הרדמה של העכברים באמצעות שאיפת CO₂ ואספו מיד דם באמצעות דקירה לבבית סופית באמצעות מזרק טוברקולין של 1 mL. העבירו את הדם למבחנות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL. השליכו את כל המחטים והמזרקים המשומשים למיכל פסולת חדים מאושר של המוסד.
      אזהרה: מחטי המזרקים חדות ועשויות לגרום לפציעות דקירה; טפלו בהן בזהירות.
    2. אחסנו את הדם למשך 30 min בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן סובבו בצנטריפוגה למשך 10 min ב-2,000 × g.
    3. העבירו את העלוי (סרום) למבחנת מיקרוצנטריפוגה ואחסנו ב-−80 °C.
      אזהרה: מקפיאים בטמפרטורה נמוכה במיוחד מהווים סיכון לכוויות קור. לבשו כפפות מבודדות בעת טיפול במבחנות והימנעו ממגע ממושך של העור עם משטחים קרים.
  2. עצמות
    1. הוצאת עצמות הירך (femora): לאחר ההרדמה, בצעו דיסקציה של הרגליים האחוריות במפרקי הירך.
    2. הסירו בזהירות את כל הרקמות הרכות מעצמות הירך. שטפו את הרקמות שלוש פעמים במים דה-יוניזציה. אחסנו את העצמות ב- -80 °C עד לעיבוד נוסף. השליכו את הרקמות הרכות שהוסרו ואת כל החומרים המזוהמים למסלול פסולת ביולוגית של המוסד.
      הערה: ניתן לקבע את הרקמות ב-4% פאראפורמאלדהיד עם 2% סוכרוז למשך 12–16 h לצורך אחסון לטווח ארוך ב-70% אתנול. הליך קיבוע זה אינו פוגע בדיוק של כימות הפלוריד שלאחר מכן.
    3. שטפו את העצמות ביסודיות במים דה-יוניזציה. ספגו לחות עודפת בעזרת נייר סופג ללא סיבים.
    4. העבירו את העצמות למבחנות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL עם מכסים פתוחים כדי לאפשר התאיידות, והניחו אותן בתנור ייבוש ב-60 °C למשך 12–16 h.
      אזהרה: תנור הייבוש עלול לגרום לכוויות. השתמשו בכפפות עמידות לחום בעת טיפול בדגימות.
    5. הפיכת העצמות לאפר (Ashing): העבירו את העצמות המיובשות לכ crucibles של אלומינה. הניחו את ה-crucibles בתנור מופל (muffle furnace) וחממו ל-600 °C בקצב של 150 °C/h, ולאחר מכן השאירו למשך 6 h. המתינו שהתנור יתקרר לטמפרטורה שמתחת ל-200 °C לפני הוצאת ה-crucibles. השליכו שרידי עצם או חומרים מתכלים מזוהמים למסלול פסולת ביולוגית של המוסד.
      אזהרה: תנור המופל וה-crucibles מגיעים לטמפרטורות קיצוניות, המהוות סיכון חמור לכוויות. תמיד המתינו שהתנור יתקרר לפני הטיפול ב-crucibles. בעת הוצאת ה-crucibles, לבשו חלוק מעבדה, משקפי מגן וכפפות עמידות לחום, והשתמשו בפינצטה ארוכה כדי למנוע מגע ישיר עם משטחים חמים.
      שלב קריטי: הפיכה לאפר שאינה מלאה תפגע בניתוחים הבאים. ודאו שחומר העצם הגיע למצב מחומצן מלא לפני ההמשך; כל שארית פחמן תפריע למדידות הבאות.
      הערה: עצם שהופכה לאפר כראוי צריכה להיראות באפור בהיר עד לבן באופן אחיד. חלקיקים כהים יותר — ובמיוחד שאריות שחורות או דמויות פחם — מעידים על בעירה לא מלאה. אם קיימת שינוי בצבע, האריכו את משך ההפיכה לאפר כדי לאפשר הסרה מלאה של החומר האורגני.
    6. אחסון עצמות שהופכו לאפר: מיד לאחר ההפיכה לאפר, העבירו את העצמות למבחנות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL. אטמו את המבחנות ב-Parafilm ואחסנו אותן בדסיקטור ואקום עד לשימוש.
  3. שיניים
    1. הוצאת שיניים חותכות תחתונות (mandibular incisors): בצעו חיתוך אופקי בגובה המפרק הלסת-רקה כדי להפריד את הלסת התחתונה מהלסת העליונה.
    2. בצעו חיתוכים סגיטליים מרכזיים כדי לחלק את הלסת העליונה והתחתונה למחצית שמאל וימין.
    3. שטפו את הרקמות שלוש פעמים במים דה-יוניזציה והוציאו בזהירות את השיניים החותכות התחתונות. אחסנו את השיניים שהוצאו ב- -80 °C עד לשימוש נוסף. השליכו רקמות רכות שהוצאו וחומרים מתכלים מזוהמים למסלול פסולת ביולוגית של המוסד.
      אזהרה: השתמשו בכלי דיסקציה חדים בזהירות בעת ביצוע חיתוכים במפרק הלסת-רקה ובמישור הסגיטלי המרכזי כדי למנוע פציעות אישיות. לבשו ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות, חלוק מעבדה ומשקפי מגן.
      הערה: ניתן לקבע את הרקמות ב-4% פאראפורמאלדהיד עם 2% סוכרוז למשך 12–16 h לצורך אחסון לטווח ארוך ב-70% אתנול. הליך קיבוע זה אינו פוגע בדיוק של כימות הפלוריד שלאחר מכן.
    4. הכנת שיניים להפיכה לאפר: שטפו את השיניים ביסודיות במים דה-יוניזציה והניחו אותן במי Solution של 1% מימן-פרוקסיד (H₂O₂) למשך 12–16 h. השליכו תמיסות מימן-פרוקסיד משומשות כפסולת כימית מסוכנת.
    5. שטפו שוב במים דה-יוניזציה, ייבשו קצרות בעזרת טישיו ללא סיבים, והעבירו למבחנות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL עם מכסים פתוחים. הניחו את המבחנות בתנור ייבוש ב-60 °C למשך 12–16 h.
      אזהרה: מימן-פרוקסיד הוא מחמצן ועשוי לגרום לגירוי בעור ובעיניים. טפלו בו במנדף תוך לבישת חלוק מעבדה, כפפות ניטריל ומשקפי מגן. הימנעו ממגע עם חומרים דליקים.
    6. הפיכת שיניים לאפר: העבירו שיניים מיובשות ל-crucibles של אלומינה והפכו לאפר בתנור מופל בטמפרטורת שהייה של 600 °C למשך 20 h, תוך שימוש בקצב עלייה של 150 °C/h.
    7. הוציאו את ה-crucibles רק לאחר שהתנור התקרר מתחת ל-200 °C.
      אזהרה: תנור המופל וה-crucibles מגיעים לטמפרטורות קיצוניות, המהוות סיכון חמור לכוויות. המתינו שהתנור יתקרר מתחת ל-200 °C לפני הטיפול ב-crucibles. בעת הוצאת ה-crucibles, לבשו חלוק מעבדה, משקפי מגן וכפפות עמידות לחום, והשתמשו בפינצטה ארוכה כדי למנוע מגע ישיר עם משטחים חמים.
      שלב קריטי: ודאו חמצון מלא; פחמן שירי יפריע לניתוחים הבאים.
      הערה: חומר שיניים שהופך לאפר צריך להיראות באפור בהיר עד לבן באופן אחיד. בצעו הפיכה לאפר שוב אם נותרו שאריות שחורות.
    8. אחסון דגימות שיניים שהופכו לאפר: מיד לאחר ההפיכה לאפר, העבירו את השיניים למבחנות מיקרוצנטריפוגה של 2 mL בעלות תחתית עגולה.
    9. אטמו את המבחנות ב-Parafilm ואחסנו אותן בדסיקטור ואקום עד לשימוש.

3. הכנת צלחות דיפוזיה מסייעות HMDS

  1. ריאגנטים וחומרים
    1. חומצה גופרתית 6N: לפחות יומיים לפני הכנת צלחות הדיפוזיה, הכינו תמיסת אם של חומצה גופרתית 6N.
      הערה: צלחת דיפוזיה: כלי אטום שנועד ליצור סביבה סגורה ומבוקרת שבה רכיבים המשתחררים מחומר ביולוגי שעבר עיבוד יכולים להילכד על ידי מלכודת כימית המחוברת למכסה. התכנון האטום מונע חילוף עם אוויר חיצוני ומבטיח כי אנליטים המשתחררים יופנו לעבר המלכודת לצורך מדידה עוקבת.
    2. הניחו כוס כימית מפלסטיק בנפח 1 ליטר עם מקלט מגנטי על גבי מערבל מגנטי והוסיפו 416 מ"ל של מים ultrapure.
    3. באמצעות פיפטה סרולוגית של 50 מיליליטר, הוסיפו לאט 84 מיליליטר של $\text{H}_2\text{SO}_4$ בריכוז $36\text{N}$ למים תוך כדי ערבוב רציף. התמיסה תתחמם; המתינו לקירורה עד לטמפרטורת החדר.. יש להשליך תמיסות חומצה גופרתית שאינן בשימוש או שכבר נוצלו כפסולת כימית מסוכנת, במסלול פינוי הפסולת הכימית של המוסד.
      זהירות: חומצה גופריתית היא חומר מאכל מאוד. יש לטפל בה במנדף תוך לבישת כפפות עמידות לחומצות, חלוק מעבדה ומשקפי מגן. במקרה של מגע, יש לשטוף מיד בכמות גדולה של מים.
    4. חומצה גופריתית 6 N רוויה ב-HMDS: העבירו את החומצה הגופריתית 6 N למשפך הפרדה בנפח 2 ליטר והוסיפו 15 מיליליטר hexamethyldisiloxane (HMDS).
    5. וודאו שהפקק והברז סגורים היטב, החזיקו את משפך ההפרדה לרוחב, ונערה בעוצמה עד להופעת טיפות זעירות של HMDS.
    6. פתחו את הפקק כדי לשחרר את הגז המתפתח וחזרו על התהליך פעמיים נוספות.
    7. השאירו את הפקק פתוח מעט למשך מספר שעות. אחסנו את משפך ההפרדה המכיל חומצה גופרית 6 N רוויה ב-HMDS על מעמד בתוך מנדף כימי. השליכו חומצה גופרית המכילה HMDS וחומרים מזוהמים כפסולת כימית מסוכנת.
      זהירות: HMDS דליק ורעיל בשאיפה. יש לטפל בחומר בתוך מ tendência (מכסה מסיננת), תוך לבישת חלוק מעבדה, כפפות ומשקפי מגן. יש להרחיקו ממקורות הצתה.
    8. נתרן הידרוקסיד 0.05 N: המס 1 גרם גרגרי NaOH ב-25 מ"ל מים אולטרה-טהורים כדי להכין תמיסת מלאי 1 N.
    9. ערבבו 2 מ"ל של תמיסת המקור של NaOH בריכוז 1 N עם 38 מ"ל מים אולטרה-טהורים כדי לקבל תמיסת NaOH בריכוז 0.05 N.
    10. חלקו את ה-NaOH בריכוז 0.05 N לאנבוני (aliquots) בתוך מבחנות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל לשימוש חד-פעמי, אטמו את המכסים באמצעות Parafilm, ואחסנו את המבחנות בתוך דסיקטור ואקום כדי לצמצם את ספיגת ה-CO₂. השליכו תמיסות נתרן הידרוקסיד שאינן בשימוש או שסיימו את תפקידן כפסולת כימית מסוכנת.
      זהירות: נתרן הידרוקסיד הוא חומר קורוזיבי ביותר ועלול לגרום לכוויות חמורות. יש ללבוש חלוק מעבדה, כפפות ומשקפי מגן. יש לטפל בתמיסות בזהירות כדי למנוע נתזים.
    11. חומצה אצטית 0.2 N: הוסף 575 µL הוסיפו חומצה אצטית קרחית למים אולטרה-טהורים והשלימו לנפח סופי של 50 מ"ל להכנת חומצה אצטית בריכוז 0.2 N. השליכו תמיסות חומצה אצטית כפסולת כימית מסוכנת.
      אזהרה: חומצה אצטית היא חומר מאכל ועלולה לגרום לגירוי בעור, בעיניים ובדרכי הנשימה. יש לטפל בחומר בתוך מ chụp כימיים תוך לבישת חלוק מעבדה, כפפות ומשקפי מגן.
    12. וזלין: המס כ-100 גרם וזלין ב- 60 °C בתנור. שאבו את הפטרולטום הנוזלי למזרקים של 10 מ"ל והניחו לו להתקרר ולהתמצק. ניתן לאחסן מזרקים מלאים בפטרולטום בטמפרטורת החדר למשך מספר שבועות.
    13. צנחית פטרי: השתמש בצנחית פטרי ללא טיפול בגודל 60 × 15 מ"מ להכנת צנחיות דיפוזיה.
    14. צרו חור קטן במכסה של צלחת פטרי באמצעות מחט מזריק בגודל 18-G שחוממה.
    15. יש למרוח שכבת איטום רציפה של וזלין (petrolatum) על השפה הפנימית של המכסה, באמצעות מזרק של 10 מ"ל המצויד במחט קהה בכיול 14G. יש להשליך את כל המחטים המשומשות לתוך מכל מאושר להשלכת חפצים חדים של המוסד.
      זהירות: מחטי מזרקים הן חדות ועלולות לגרום לפציעות דקירה. יש לטפל בהן בזהירות ולהשליכן למכלי פסולת חדה מאושרים. בעת חימום מחטים, יש להשתמש בכפפות עמידות לחום ובמיגון עיניים למניעת כוויות.
    16. תמיסות סטוק של NaF לכיול צלחות דיפוזיה. המס 4.19 גרם NaF ב-1 ליטר מים אולטרה-טהורים כדי להכין תמיסת סטוק בריכוז 100 מילימולר (mM). הכן תמיסה בריכוז 10 מילימולר, 100 µMו- 10 µM תמיסות סטוק באמצעות דילולים סדרתיים של 1:10 של תמיסת ה-100 mM.
      הערה: מול אחד של NaF מספק 19 גרם F⁻; לפיכך, 1 µL של 10 µM NaF מכיל 0.19 ננוגרם F⁻ ו- 1 µL של 10 mM NaF מכיל 190 ng F⁻.
      הערה: צלחות דיפוזיה לכיול: צלחות דיפוזיה המשמשות ספציפית לכיול עם מסה ידועה של יוני פלואוריד (F¯).
  2. הכנות של צלחות דיפוזיה ספציפיות לדגימה
    1. צלחת דיפוזיה של סרום: העבירו בפיפטה 3 מ"ל מים אולטרה-טהורים לתחתית צלחת הפטרי והוסיפו 75 µL סרום. השליכו את כל החומרים שזוהמו בסרום לנתיב הפסולת הביולוגית המוסדי. המשיכו לשלב 3.4.
    2. צלוחית דיפוזיה לעצם
      1. דחיסה של אפר עצם לאבקה: השתמשו במרקורספטולה (micro spatula) כדי לטחון את העצמות לאחר השריפה בתוך מבחנות מיקרוצנטריפוז' של 1.5 מ"ל לאבקה דקה. המשיכו בעיבוד של אפר העצם הדחוס מיד. השליכו חומרים מתכלים שזוהמו באפר עצם לנשף הפסולת הכימית המוסדי.
      2. שקילה והידרציה של אפר עצם
        1. הניחו את חלקו התחתון הריק של צלחת הפטרי על כף השקילה של מאזנאי אנליטי עם רזולוציה של לפחות 0.1 מ"ג.
        2. העבירו את אפר העצם הטחון משפופרת המיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל לכלי פורצלן קטן כדי למזער את המטען הסטטי ולמנוע פיזור של האבקה.
        3. באמצעות מיקרו-שפכטל, הוסיפו כ-5 מ"ג של אפר עצם לצלוחית וכסו מיד את האבקה ב-3 מ"ל מים אולטרה-טהורים לפני הסרת הצלוחית מהמאזניים האנליטיים, כדי למנוע פיזור של האפר.
        4. יש לרשום את המשקל המדויק של כל דגימת אפר עצם. המשך לשלב 3.4.
    3. צלחת דיפוזיה לשן
      1. טחינת שיניים שעברו שריפה (ashed teeth)
        1. העבירו את החותכים שעברו שריפה לשפופרות מיקרוצנטריפוגה בעלות תחתית עגולה בנפח 2 מ"ל, והוסיפו לכל שפופרת חרוץ פלדת אל-חלד בקוטר 5 מ"מ. סגרו את השפופרות ואטמו את המכסים באמצעות Parafilm.
        2. יש לטחון את שיני החותש לאחר השריפה במכשיר bead beater במהירות של 2,500 סבב לדקה (rpm) למשך 10 שניות. יש להמשיך בעיבוד השיניים הטחונות באופן מיידי.
      2. שקילה והידרציה של שיניים שעברו שריפה (ashed teeth)
        1. שפכו את כל תכולת המבחנה, כולל חרוץ הפלדה אל-חלודה, לתחתית צלחת הדיפוזיה הממוקמת על כף השקילה של מאזניים אנליטיים. השליכו מוצרי צריכה מזוהמים המכילים אפר שיניים למסלול פסולת הכימיים של המוסד.
        2. הוצא את חרוץ הפלדה שאינה מחלידה מהצלחת ורשום את המשקל המדויק של אפר השן (בדרך כלל 3–4 מ"ג לכל שיני חיתוך תחתונה).
        3. הוסיפו מיד 3 מ"ל מים אולטרה-טהורים כדי לכסות את אפר השן, לפני끔 הוצאת הצלחת מהמאזנה, כדי למנוע פיזור של האפר כתוצאה מפריקה סטטית. המשיכו לשלב 3.4.
  3. כיול ובקרת איכות של צלחות דיפוזיה
    1. במקביל לצלחות הדיפוזיה של הדגימות, הכינו שתי סדרות של צלחות דיפוזיה לכיול עבור כיול של 5–6 נקודות וסדרה אחת זהה של צלחות דיפוזיה לבקרת איכות, כולל דגימה ריקה (blank).
      הערה: צלחות דיפוזיה לבקרת איכות: מוכנות באופן זהה לצלחות הדיפוזיה לכיול, אך משמשות מדי פעם כדי לאמת את יציבות האלקטרודה ולהבטיח ביצועי מדידה עקביים.
    2. העבירו בפיפטה 3 מ"ל מים ultrapure לכל אחת מ-11 או 13 צלחות פטרי, והוסיפו תמיסת NaF מלאי כדי לכסות את טווח מסות ה-F¯ הצפוי בדגימות הנסייניות. המשיכו לשלב 3.4 כדי להשלים את הרכבת צלחות הדיפוזיה.37.
  4. השלמת הרכבת צלחת הדיפוזיה
    1. לבניית משקע מלכודת פלוריד, 50 µl של 0.05 N NaOH מתווסף בשלוש טיפות אל פני השטח הפנימיים של מכסה פטרי, הרחק משולי המכסה.
      הערה: מלכודת פלוריד (Fluoride trap / F¯ Trap): רכיב של צלחות דיפוזיה הלוכד F¯, ובאופן ספציפי נתרן הידרוקסיד (NaOH).
    2. הפוך את המכסה מבלי להפריע לטיפות ה-NaOH ואטום אותו היטב לתחתית הצלחת באמצעות הוואזלין (petrolatum).
    3. להכנת תמיסת חומצה גופרית 3 N רוויה ב-HMDS, ערבבו נפחים שווים של חומצה גופרית 6 N רוויה ב-HMDS ומים אולטרה-טהורים. יש להכין תמיסה טרייה רגע לפני השימוש, שכן לא ניתן לאחסנה.
    4. הזריקו 3 מ"ל של חומצה גופרתית 3 N רוויה ב-HMDS שהוכנה, דרך החור במכסה, אל תוך המים בתחתית כלי הדיפוזיה, באמצעות מזרק של 10 מ"ל מצויד במחט 20 G. יש להקפיד שלא להתיז חומצה על פני השטח הפנימיים של המכסה בעת הכנסת מחט המזרק או הוצאתה.
    5. דיפוזיה של פלואוריד בסיוע HMDS: יש לאטום מיד את חור ההזרקה באמצעות טיפת וזלין המכסה את הפתח באופן מלא, ולהניח את צלחות הדיפוזיה על רוקר (rocker) משתנה המכוון למהירות נמוכה. יש להדגיר למשך לילה בטמפרטורת החדר (איור 1).

שיווי משקל סטטי; תרשים של צלחת פטרי; ניסוי עם אפר עצם, מים וחומצה גופריתית רוויה ב-HDMS.
איור 1: תרשים של צלחת דיפוזיה של עצם להפקה וללכידה של פלואוריד. איור 1 ממחיש את תכנונה של צלחת דיפוזיה של עצם שהורכבה בתוך צלחת פטרי לא מטופלת בגודל 60 × 15 mm. המכסה מכיל חור הזרקה קטן שנאטם באמצעות חרוז וזלין. על פני השטח הפנימיים של המכסה ממוקמות שלוש טיפות של NaOH המשמשות כמלכודות ליון פלואוריד (F⁻), התלויות מהמכסה במהלך הדיפוזיה. המכסה נאטם הרמטית לבסיס הצלחת באמצעות וזלין. בתחתית צלחת הפטרי נמצאים מים אולטרה-טהורים, חומצה גופריתית רוויה ב-hexamethyldisiloxane (HMDS) ואפר עצם, אשר יחד יוצרים את סביבת התגובה לשחרור הפלואוריד וללכידתו לאחר מכן. איור זה נוצר על ידי המחברים באמצעות Biorender, והאיור מורשה תחת רישיון CC BY. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

4. מדידת פלואוריד באמצעות ISE

  1. הגדרת ה-ISE
    1. מלאו את האלקטרודה בעלת הערוץ הכפול הסלקטיבית לפלואוריד עם תמיסת המילוי המתאימה, חברו אותה לפוטנציומטר ואבטחו את האלקטרודה במחזיק אלקטרודות.
    2. מקמו צלחת פטרי שלא טופלה על גבי ג'ק מספריים מתחת למשטח החיישן של האלקטרודה, תוך וידוא שמשטח החיישן מקביל לתחתית צלחת הפטרי, והרימו את שולחן הג'ק המספריים כך שצלחת הפטרי תהיה כמעט נוגעת באלקטרודה (איור 2).
  2. הכנת דגימות למדידה
    הערה: דגימות: רק התוצרים הסופיים שנמדדו באמצעות אלקטרודה סלקטיבית ליונים (ISE), המורכבים ממלכוד ה-F¯ לאחר דיפוזיה, אשר שולבו לאחר מכן עם חומצה אצטית ומים, יכונו "דגימות" בפרוטוקול זה. 
    1. כדי לכוון את ה-pH של הדגימה ל-5, הסירו את צלחת הדיפוזיה מהרוקר והרימו בזהירות את המכסה על ידי שבירת אטום הפטרולטום לאחר תקופת האינקובציה. הפכו את המכסה על משטח שטוח, תוך וידוא ששלוש טיפות מלכוד ה-F¯ נשארות ללא הפרעה.
    2. הוסיפו 15–20 µL של 0.2 N חומצה אצטית לטיפה אחת באמצעות פיפט P20, ולאחר מכן מרחבו את כל שלוש הטיפות לטיפה אחת מבלי להחליף את טיפ הפיפט.
      הערה: דגימות עם ריכוזי F¯ גבוהים נוטות להיות בעלות pH ראשוני נמוך יותר ולכן דורשות פחות 0.2 N חומצה אצטית כדי לכוון את ה-pH ל-5 בהשוואה לדגימות המכילות פחות F¯. מכיוון שנפח הדגימה שנותר לאחר רישום פוטנציאל האלקטרודה (שלב 5.3) הוא מינימלי, השתמשו בכל שארית דגימה שזמינה כדי לאמת את ה-pH באמצעות נייר אינדיקטור.
    3. כדי לכוון את נפח הדגימה, כווןו פיפט P100 ל-75 µL, שאבו את כל נפח מלכוד ה-F¯ ללא הכנסת אוויר, וכוונו את הדגימה ל-75 µL בדיוק באמצעות מים אולטרה-טהורים.
    4. בצעו שלב זה בזהירות כדי להבטיח נפח מדויק לחישובי ריכוז הפלואוריד. השאירו את הדגימה בטיפ הפיפט ועברו מיד לשלב 4.3.
  3. מדידת דגימות הבדיקה, כיול ודגימות בקרת איכות
    1. כדי למדוד את פוטנציאל האלקטרודה של הדגימה, פלטו אותה בין משטח החיישן של האלקטרודה הסלקטיבית לפלואוריד לבין צלחת הפטרי. ודאו שכל משטח החיישן של האלקטרודה טבול לחלוטין בנוזל, ללא מגע ישיר עם צלחת הפטרי. המתינו להתייצבות הפוטנציומטר ורשמו את הפוטנציאל (mV) המוצג על ידי ה-ISE.
    2. קבעו את עקומת כיול הסטנדרט על ידי מדידת הסט הראשון של סטנדרטים לכיול באופן רצית, החל מריכוז ה-F¯ הנמוך ביותר ועד לגבוה ביותר.
      1. שרטטו את פוטנציאל האלקטרודה (mV) מול הלוגריתם של F¯ (ng) כדי לבנות את עקומת הכיול (איור 3). השתמשו ברגרסיה אקספוננציאלית כדי לקבל את משוואת עקומת הסטנדרט ואת מקדם הדטרמינציה (R2). קבלו עקומות כיול רק כאשר R2 הוא ≥ 0.99.
    3. מדדו כל דגימת בדיקה ורשמו את פוטנציאל האלקטרודה (mV).
    4. כדי לנטר את יציבות האלקטרודה ולזהות סחיפה פוטנציאלית של הבדיקה, מדדו דגימות בקרת איכות לסירוגין לאורך כל ריצה אנליטית.
      1. השוו את ערכי דגימות בקרת האיכות ישירות לדגימות הכיול התואמות ואשרו התאמה בטווח של כ-5% כדי לאמת ביצועים יציבים של האלקטרודה לאורך זמן.
      2. מדדו באופן תקופתי צלחת דיפוזיה ריקה (blank) כדי לאשר היעדר זיהום פלואוריד במהלך טיפול בדגימות ודיפוזיה.
  4. כדי לחשב את מסת ה-F¯(ng) בכל דגימת בדיקה, השתמשו במשוואת עקומת הסטנדרט. לאחר מכן חלקו מסה זו בנפח (µL) של הסרום, או במסה (mg) של אפר העצם או השן שהתווספו לצלחת הדיפוזיה.
    1. דוגמה לחישוב ריכוז F¯ באפר עצם (ng/mg)
      1. מסת אפר עצם שהתווספה לצלחת הדיפוזיה: 5.1 mg; פוטנציאל אלקטרודה של דגימת בדיקה בנפח 75 µL: –31.6 mV
      2. שלב 1: חישוב מסת פלואוריד באמצעות משוואת הכיול
        1. F⁻ mass (ng) = 3505.4 x e(-0.043x-31.6)
        2. F⁻ mass (ng) = 13,641 ng
      3. שלב 2: חישוב ריכוז פלואוריד באפר העצם
        1. F⁻ concentration =  13,641 ng  /  5.1  mg
        2. F⁻ concentration =  2,675 ng / mg (ppm)

הסדר של אלקטרודה סלקטיבית ליונים (ISE) עם פוטנציומטר ודגימה על גבי ג'ק מספריים למדידת יונים.
איור 2: תרשים של הסדר למדידת ISE.איור 2 ממחיש את התצורה המשמשת למדידות של יוני פלוריד באמצעות אלקטרודה סלקטיבית ליונים (ISE) בעלת שני ערוצים. צלחת פטרי ממוקמת על גבי ג'ק מספריים כדי לאפשר כיוון מדויק של גובהה ביחס לאלקטרודה. ה-ISE מחוברת לפוטנציומטר ומכוונת כך שפני החישה שלה מקבילים למישור צלחת הפטרי, תוך שמירה על מרחק של כ-1–2 mm. לאחר קביעת המרווח, נפח קטן של דגימה (75 µL) מועבר באמצעות פיפט למרווח שבין פני החישה לצלחת הפטרי, ובכך מובטח שהדגימה מכסה באופן מלא את אזור החישה של האלקטרודה במהלך המדידה. איור זה נוצר על ידי המחברים באמצעות Biorender, והאיור מורשה תחת רישיון CC BY. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

עקום כיול של יוני פלואוריד; פוטנציאל אלקטרודה מול ריכוז; תוצאת ניתוח רגרסיה לינארית.
איור 3: עקום כיול וטבלת כיול תואמת לכימות מסת יוני פלואוריד בדגימות של דגימות שן. פאנל עליון: דוגמה לעקום כיול המשמש לקביעת מסת יוני פלואוריד בדגימות של דגימות שן. ציר ה-x מראה את פוטנציאל האלקטרודה (mV, סקאלה לינארית), וציר ה-y מראה את מסת יוני הפלואוריד התואמת (ng F⁻, סקאלה לוגריתמית). נקודות כיול נמדדות מוצגות כקו רצוף, והרגרסיה האקספוננציאלית המותאמת מוצגת כקו מקווקו. תיבה פנימית מציגה את משוואת עקום הסטנדרט ואת מקדם הדטרמינציה (R2 = 0.99). פאנל תחתון: טבלה המכילה את הערכים המספריים ששימשו ליצירת עקום הכיול. השורה הראשונה מפרטת את חמשת פוטנציאלי האלקטרודה (mV) שנרשמו עבור דגימות הכיול. השורה השנייה מספקת את מסות יוני הפלואוריד התואמות (ng F⁻) עבור כל דגימת כיול. השורה השלישית מפרטת את הנפחים (µL) של תמיסת סטוק NaF בריכוז 10 mM שהוספו לצלוחיות הדיפוזיה של הכיול; מסת יוני הפלואוריד שהוספה זו שקולה למסה שנלכדה בכל דגימת כיול לאחר הדיפוזיה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות

כדי להדגים את היישום של פרוטוקול זה למדידת ריכוזי פלואוריד (F-) בחומרים ביולוגיים, הוכנו דגימות מתוך סרום, עצם ושיניים חותכות של לסת תחתית שנאספו מעכברים שנחשפו לטיפולי פלואוריד מבוקרים. עכברים זכרים מסוג C57BL/6J חולקו לשתי קטגוריות גיל, מתבגרים (6 שבועות) ובוגרים (18 שבועות), וסופקו להם או מים דה-יוניזיים ללא פלואוריד (0 ppm F⁻) או מי שתייה מועשירים בנתרן-פלואוריד (125 ppm F⁻) למשך תקופת חשיפה של 6 שבועות. כל גיל ותנאי טיפול כללו חמישה בעלי חיים. בסוף תקופת החשיפה, נדגמו סרום, עצמות פמור ושיניים חותכות של לסת תחתית, והדגימות הוכנו ונולתחו בהתאם לפרוטוקול. ריכוזי פלואוריד מייצגים שנמדדו בסרום, בעצם ובשיניים מסוכמים להלן.

השפעת פלוריד על רמות F⁻; סרום, עצם הירך, שן חותכת; נתוני תרשים עמודות; השוואת נוכחות פלוריד.
איור 4ריכוזי פלואוריד שנמדדו בסרום, בעצם הירך ובשיניים חותכות של הלסת התחתונה. עכברי C57BL/6J זכרים חולקו לשתי קטגוריות גיל, מתבגרים (6 שבועות, עמודה ריקה) ובוגרים (18 שבועות, עמודה מלאה), וסופקו להם או מים דה-יוניים נטולי פלוריד (0 ppm F⁻) או מי שתייה מועשירים בנתרן פלוריד (125 ppm F⁻) למשך תקופת חשיפה של 6 שבועות. בתום תקופת החשיפה, נמדדו רמות הפלוריד ב-(A) סרום, (B) עצם הירך, ו-(C) שיניים חותכות של הלסת התחתונה מאותן קבוצות טיפול. ערכי סרום הנמוכים מגבול הגילוי (<(0.02 ppm) שורטטו לצורך ויזואליזציה אך הוצאו מהניתוח הסטטיסטי. הנתונים מוצגים כממוצעים ± SD. השוואות בין קבוצות בני הנוער לקבוצות הבוגרים בוצעו באמצעות מבחן Mann–Whitney U עם תיקון Bonferroni–Dunn להשוואות מרובות. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5 לקבוצה). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ריכוזי פלואוריד בסרום
בשתי הקבוצות, של מתבגרים ושל בוגרים, שטופלו ב-0 ppm פלואוריד, ריכוזי הפלואוריד בסרום היו נמוכים מגבול הגילוי של האלקטרודה הסלקטיבית ליונים (<0.02 ppm). בקבוצות הטיפול ב-125 ppm, ריכוז הפלואוריד בסרום עלה ל-0.3 ± 0.2 ppm בקבוצת המתבגרים ול-0.7 ± 0.2 ppm בקבוצת הבוגרים (p = 0.06).ההשוואה בין קבוצת המתבגרים לקבוצת הבוגרים בטיפול של 125 ppm בוצעה באמצעות מבחן Mann–Whitney U עם תיקון Bonferroni–Dunn להשוואות מרובות. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/group). קבוצות הטיפול ב-0 ppm הוצאו מהניתוח הסטטיסטי. (איור 4A, טבלה 1).

ריכוזי פלואוריד בעצם הירך
בקבוצות הטיפול של 0‑ppm, ריכוזי הפלואוריד בעצם הירך היו נמוכים משמעותית בקרב מתבגרים (292 ± 39 ppm) בהשוואה לבעלי חיים בוגרים (896 ± 55 ppm) (p < 0.01). לעומת זאת, בקבוצות ה-125‑ppm, ריכוזי הפלואוריד במתבגרים (4,108 ± 482 ppm) היו גבוהים משמעותית מאשר בבעלי חיים בוגרים (2,966 ± 612 ppm) (p = 0.04). השוואות בין קבוצות המתבגרים והבוגרים בוצעו באמצעות מבחן Mann–Whitney U עם תיקון Bonferroni–Dunn להשוואות מרובות. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/group). (איור 4B, טבלה 1). איור 5A מציג את שינוי המכפלה (fold‑change) בפלואוריד בעצם הירך בין הטיפולים ב-0‑ppm וב-125‑ppm עבור כל קבוצת גיל. מתבגרים הראו עלייה של פי 14 ברמות הפלואוריד ב-125 ppm, בעוד שעכברים בוגרים הראו עלייה של פי 3.

ריכוזי פלואוריד בשיניים חותכות של הלסת התחתונה
בקבוצות ה-0 ppm, ריכוזי הפלואוריד בשיניים חותכות של הלסת התחתונה היו נמוכים משמעותית בקרב מתבגרים (35 ± 4 ppm) בהשוואה לבעלי חיים בוגרים (123 ± 23 ppm) (p = 0.03). בקבוצות הטיפול ב-125 ppm, ריכוזי הפלואוריד בשיניים חותכות עלו ל-5641 ± 955 ppm במתבגרים ול-4392 ± 1694 ppm בבעלי חיים בוגרים. השוואות בין קבוצות המתבגרים והבוגרים בוצעו באמצעות מבחן Mann–Whitney U עם תיקון Bonferroni–Dunn להשוואות מרובות. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/group). (איור 4C, טבלה 1). למרות שריכוזי הפלואוריד המוחלטים ב-125 ppm לא נבדלו באופן מובהק בין קבוצות הגיל, השינוי המכפיל (fold-change) מ-0 ppm ל-125 ppm היה גבוה משמעותית בעכברים מתבגרים (עלייה של פי 161) מאשר בעכברים בוגרים (עלייה של פי 36) (איור 5B).

השפעת פלוריד על העצם: תרשים עמודות המראה את שינוי הקיפול (fold change) בירך ובשן חותכת בדגימות של עכברים מתבגרים ובוגרים.
איור 5: עכברים מתבגרים מראים עלייה גדולה יותר בשינוי הקיפול של הצטברות פלוריד בעצמות ובשיניים חותכות מאשר עכברים בוגרים. שינוי הקיפול בריכוזי הפלוריד מטיפול של 0 ppm ל-125 ppm פלוריד בעכברים מתבגרים (עמודה פתוחה) ובוגרים (עמודה מלאה). (A) עצם הירך ו-(B) שן חותכת תת-לסתית מאותן קבוצות טיפול. הנתונים מוצגים כממוצעים ± SD. השוואות בין הקבוצות של המתבגרים והבוגרים בוצעו באמצעות unpaired t-test. * p < 0.05, (N = 5/group). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דגימהסרוםפמור (עצם הירך)שיני חיתוך תחתונות
קבוצת גילמתבגרבוגרמתבגרבוגרמתבגרבוגר
קבוצת טיפול0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm
< 0.020.2< 0.020.8324457693330813748241613229
< 0.020.1< 0.020.8229377892433263954511272654
< 0.020.7< 0.021.0300468387737133155441126997
< 0.020.4< 0.020.5323383280725193551141034169
< 0.020.3< 0.020.528336699372192N/A72711114909
ממוצע< 0.020.3< 0.020.7292410889629663556411234392
סטיית תקןNA0.2NA0.239482556123955231694

טבלה 1: מדידות פלואוריד אינדיבידואליות בסרום, בעצם הירך ובשיניים חותכות של הלסת התחתונה. טבלה 1 מפרטת את ריכוזי הפלואוריד האינדיבידואליים (ppm F⁻) שנמדדו בדגימות של סרום, עצם ירך ושיניים חותכות של הלסת התחתונה מעכברים מתבגרים ובוגרים שנחשפו ל-0 ppm או 125 ppm פלואוריד. עבור כל סוג רקמה, הנתונים מוצגים בעמודות המתאימות לארבע קבוצות הטיפול: מתבגרים 0 ppm, מתבגרים 125 ppm, בוגרים 0 ppm, ובוגרים 125 ppm. כל עמודה כוללת את חמשת הערכים האינדיבידואליים שנרשמו (N = 5), ולאחריהם הממוצע והסטיית התקן (SD) המחושבים. בקבוצת הסרום של מתבגרים 0 ppm, כל הערכים שנרשמו היו נמוכים מגבול הגילוי של האלקטרודה הסלקטיבית ליונים (<0.02 ppm). הטבלה מספקת את הנתונים המספריים הגולמיים העומדים בבסיס ערכי הסיכום וההשוואות הסטטיסטיות המוצגים ב-איור 4.

דיון

מדידות פלואוריד בוצעו באמצעות אלקטרודה סלקטיבית ליונים (ISE) הסלקטיבית לפלואוריד, המשלבת ממבנה קריסטלי של לנתניום פלואוריד (LaF₃)38,39. ממבנה זה יוצר קשרים יציבים מאוד של La–F, מה שמוביל להעדפה חזקה של יוני פלואוריד על פני הלידים אחרים. על פי ספרות אלקטרוכימית מבוססת ומפרטי היצרן, ממבנה ה-LaF₃ מראה מקדמי סלקטיביות נמוכים מאוד עבור כלוריד, מה שמעיד על כך שיוני כלוריד אינם יוצרים הפרעה מדידה בתנאים המשמשים בפרוטוקול זה. למרות שכלוריד נמצא באופן טבעי בשיניים ובעצם, פעילותו אינה משפיעה על פוטנציאל האלקטרודה, והאות הרשום משקף באופן ספציפי את פעילות הפלואוריד. גבול הגילוי התחתון של 0.02 ppm תואם לריכוז המינימלי שניתן לכימות אשר תוקף על ידי היצרן עבור אלקטרודת הפלואוריד הסלקטיבית של Orion. גבול זה משקף את ריכוז הפלואוריד הנמוך ביותר שבו האלקטרודה שומרת על תגובה נרנסטית (Nernstian) יציבה ועל קשר ליניארי עם עקומת הכיול. מכיוון שגבול הגילוי מוגדר על ידי מאפייני הממבנה של האלקטרודה ותוקף על ידי היצרן, לא נדרשה קביעה ניסיונית נוספת עבור פרוטוקול זה; עם זאת, בנוגע לטווח הגילוי העליון, המחברים הבחינו כי מסות פלואוריד העולות על כ-38,000 ng במלכודת NaOH של 50 µL הובילו לתגובת אלקטרודה לא-ליניארית, מה שמעיד על כך שעקומת הכיול אינה אמינה יותר בעומסי פלואוריד גבוהים מאוד. אי-ליניאריות זו נובעת ככל הנראה מחריגה מהחוזק היוני וטווח הפעילות האופטימליים עבור האלקטרודה בתנאי הניסוי הנתונים, ולא משקפת גבול עליון מובנה של ה-ISE עצמה. עבור דגימות שצפויות להכיל מסות פלואוריד מעל סף זה, מומלץ להגדיל את נפח מלכודת ה-NaOH כדי לשמור על המדידות בתוך הטווח הדינמי הליניארי של האלקטרודה.

יש לקחת שיקול זה בחשבון בעת החלת הפרוטוקול על דגימות עם תכולת פלואוריד גבוהה באופן חריג. מכיוון ששלב הדיפוזיה צורך את כל נפח הדגימה, לא ניתן היה לבצע מדידות כפולות וניסויי הוספה ושחזור (spike‑and‑recovery) על הדגימות הביולוגיות. כדי להבטיח דיוק ורגישות אנליטית, נכללו סטנדרטים לבקרת איכות (QC) המכילים ריכוזי פלואוריד ידועים בכל סדרת מדידה. סטנדרטים אלו עברו עיבוד ומדידה באופן זהה לדגימות הניסוייות. בכל ההרצות, ריכוזי הפלואוריד שנמדדו בסטנדרטים של ה-QC היו עקביים בטווח של 5% מערכיהם הצפויים. עבור כל סדרה של 10–20 דגימות ביולוגיות, הוכנו במקביל שתי קבוצות עצמאיות של 5–6 דגימות כיול, ועקומת כיול נרשמה לפני כל סשן מדידה. טווח הכיול הותאם עבור כל הרצה כדי להתקרב למסות הפלואוריד הצפויות בדגימות הביולוגיות, אשר תלויות בסוג הדגימה, במסת החומר שהתווספה לכלי הדיפוזיה, ובקבוצת הטיפול ובגיל החיה. עבור מדידות בסרום, סטנדרטי הכיול תאמו לריכוזי פלואוריד של כ-0.06–1.20 ppm בדגימה. עבור מדידות בעצם ובשן, סטנדרטי הכיול תאמו לריכוזי פלואוריד של כ-19–7,600 ppm בדגימה.

פרוטוקול זה מספק גישה רגישה וניתנת לשחזור לכימות מסת יוני פלואוריד בסרום, בעצם ובשיניים, באמצעות דיפוזיה המקולטלת על ידי hexamethyldisiloxane, ולאחריה אנליזה באמצעות ISE. השיטה לוכדת באופן מהימן פלואוריד השתחרר ממטריצות ביולוגיות מגוונות ומאפשרת הערכה כמותית של הצטברות פלואוריד בעקבות חשיפה מבוקרת. תוצאות מייצגות מעכברים מתבגרים ובוגרים מדגימות הבדלים ברורים התלויים בגיל ובמינון בהשקעת הפלואוריד ברחבי הרקמות, מה שמדגיש את התועלת של גישה זו לחקר מטבוליזם וטוקסיקינטיקה של פלואוריד in vivo.

יתרון מרכזי של פרוטוקול זה הוא השימוש בצלחות דיפוזיה המפרידות פיזית בין התגובה המשחררת פלואוריד לבין הסביבה הלוכדת פלואוריד. התכנון האיטום באמצעות פטרולטום (petrolatum) ממזער את חילופי הגזים עם האטמוספירה ומבטיח לכידה יעילה של יוני פלואוריד משוחררים על ידי טיפות נתרבית (sodium hydroxide) על המכסה. חומצה גופרית רוויה ב-HMDS מספקת כוח מניע חזק ועקבי לשחרור פלואוריד מרקמות ממינרליות, כולל מבנים בעלי הסתייך גבוה כגון עצם ושיניים. מדידת ISE עוקבת, המכוילת עם סטנדרטים תואמי-דיפוזיה, מאפשרת כימות מדויק לאורך טווח דינמי רחב. יתרון נוסף של גישה זו הוא היכולת לכמת פלואוריד בדגימות ביולוגיות קטנות ביותר. רקמות ממינרליות מעכברים, ובמיוחד שיניים חותכות של הלסת התחתונה, מניבות רק 3–5 mg של אפר לכל שן. שיטות אנליטיות קונבנציונליות דורשות לעיתים קרובות מסות דגימה גדולות יותר או תכולת פלואוריד גבוהה יותר כדי להשיג זיהוי מהימן. בניגוד לכך, התכנון מבוסס-הדיפוזיה מרכז את כל הפלואוריד ששוחרר מהדגימה כולה לנפח קטן ומוגדר, מה שמאפשר כימות מדויק גם בדגימות זעירות עם מסת פלואוריד מוחלטת נמוכה. מאפיין זה בעל ערך רב במיוחד למחקרים הכוללים בעלי חיים קטנים, זמינות מוגבלת של רקמות או מבנים ממינרליים שעברו מיקרו-דיסקציה.

מגבלה עיקרית של שיטה זו היא גבול הגילוי של ה-ISE שנעשה בו שימוש במחקר זה (0.02 ppm). דגימות סרום מבעלי חיים בקבוצת ביקורת ללא פלואוריד היו לעיתים קרובות מתחת לסף זה, דבר שמנע כימות של ריכוזי פלואוריד נמוכים ביותר. ייתכן שיהיה צורך להוסיף מסה או נפח מוגדל של דגימה לכלי הדיפוזיה, במידה והדבר אפשרי, או להשתמש בטכניקות אנליטיות חלופיות כאשר מודדים ריכוזי קורט הקרובים לגבול הגילוי או נמוכים ממנו. בנוסף, השיטה דורשת דיפוזיה לילה שלם וטיפול זהיר בריאגנטים קורוזיביים, מה שעשוי להגביל את תפוקת העבודה במחקרים בהיקף גדול. למרות ש-ISE מספק כימות רגיש של פלואוריד כולל, הוא אינו יכול להעריך את ההתפלגות המרחבית בתוך רקמות. ניתן לשלב גישות משלימות, כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת בשילוב עם ספקטרוסקופיית רנטגן עם פיזור אנרגיה (SEM-EDX) או פליטת קרני גמא בהשראת חלקיקים (PIGE), כדי להדמיות ולמיפוי של התפלגות הפלואוריד בקנה מידה מיקרוסקופי עד מאקרוסקופי. מודאליות מבוססות דימוי אלו מאפשרות הערכה של הצטברות פלואוריד מקומית ברקמות ממינרליות או רכות, ובכך הן משלימות את מדידות ה-ISE ומספקות הערכה מקיפה יותר של תכולת הפלואוריד ברקמה.

מספר גורמים טכניים חוזרים עשויים להשפיע על הדיוק והמהימנות של דיפוזיית הפלוריד ומדידתו בפרוטוקול זה, ותצפיותינו מדגישות כיצד הכנת הכיול, איטום צלח הדיפוזיה, בקרת pH, ביצועי האלקטרודה וטיפול בדגימות מעצבים יחד את איכות הנתונים. סיבות אפשריות לעקומת כיול לא ליניארית (R2 < 0.99) או לקריאות של דגימות רקמה מחוץ לטווח הצפוי כוללות חישובים שגויים של נפח תמיסת המקור של NaF שהוספה לצלח הדיפוזיה או שגיאות פיפטינג במהלך הכנת סטנדרטי הכיול. פעולה מומלצת: הכינו לפחות שתי סדרות עצמאיות של דגימות כיול עבור כל הרצה, כך שסט גיבוי יהיה זמין אם עקומת כיול אחת חורגת מהטווח הצפוי. איטום לא מלא של צלח הדיפוזיה עלול לגרום לאובדן פלוריד במהלך הדיפוזיה, מה שיוביל לקריאות נמוכות באופן מלאכותי. דבר זה קורה בדרך כלל כאשר מיושם פטרולטום בכמות לא מספיקה על שולי מכסה צלח הדיפוזיה. פעולה מומלצת: מרחו כמות נדיבה של ג'ל פטרולטום סביב שולי מכסה צלח הדיפוזיה ולחצו בחוזקה כדי להבטיח איטום מלא. שגיאות פיפטינג בעת הוספת תמיסת חומצה אצטית למלכודת ה-NaOH עלולות להסיט את pH הדגימה מחוץ לטווח האופטימלי של pH 5.0, מה שיוביל לשחזור פלוריד לא מדויק. פעולה מומלצת: בדקו את ה-pH של כל דגימה באמצעות נייר pH והשליכו כל דגימה שחורגת מ-pH 5. דגימות כיול עשויות לחוץ גם הן מחוץ לגבולות ההקלטה התקינים של האלקטרודה הסלקטיבית לפלוריד. ריכוזים נמוכים מ-0.02 ppm נמצאים מתחת לסף הגילוי של האלקטרודה. פעולה מומלצת: אין להשתמש בדגימות כיול המכילות פחות מ-0.02 ppm פלוריד. לעומת זאת, דגימות כיול עם ריכוזי פלוריד גבוהים מדי עלולות לשנות את העוצמה היונית של התמיסה ולהוביל לתגובות אלקטרודה לא ליניאריות. פעולה מומלצת: בתחילת הפרויקט, הכינו תמיסות כיול המכסות טווח רחב של ריכוזי פלוריד כדי לקבוע את טווח העבודה הליניארי של האלקטרודה הספציפית שבה נעשה שימוש. אם דגימות הרקמה חורגות מטווח ליניארי זה, הפחיתו את מסת הרקמה או הגדילו את נפח מלכודת ה-NaOH והתאימו את נפח החומצה האצטית בהתאם כדי לשמור על pH 5. קושי בהשגת עקומות כיול ליניאריות בטווח של 0.02–1 ppm: סיבה נפוצה היא התיישנות האלקטרודה. אלקטרודות סלקטיביות לפלוריד ישנות מאבדות רגישות בריכוזי פלוריד נמוכים מאוד. פעולה מומלצת: החליפו את האלקטרודה הסלקטיבית לפלוריד. קריאות פוטנציומטר לא יציבות (סחיפת אות או קפיצות) מתרחשות בדרך כלל כאשר פני החישה של האלקטרודה אינם טבולים במלואם בתמיסת הדגימה. פעולה מומלצת: הורידו את האלקטרודה כך שפני החישה יהיו מכוסים לחלוטין על ידי דגימת הנוזל.

באופן כללי, פרוטוקול זה מספק גישה חסונה המבוססת על כיול לכמימות של פלואוריד במטריצות ביולוגיות מגוונות, והוא מתאים למחקרים הבודקים חשיפה לפלואוריד, שיקונו ברקמות ותוצאות טוקסיקולוגיות במודלים של עכברים.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

תודות

המחקר המדווח בפרסום זה נתמך על ידי Japan Society for the Promotion of Science; מלגות מחקר בחוץ לארץ של JSPS מספר 202560528 (S.Y.), Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP); מספר 2024/07452-9 (J.S.T.), והמכון הלאומי למחקר דנטלי ופנים-גולגולתי של ה-National Institutes of Health; מספר R01DE027648 (M.S.) ומספר K02DE029531 (M.S.).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצה אצטית, גלציאליתSigma-AldrichSupelco, GR ACSAX0073-6
כורסי אלומינהAdvalue Technologyקוטר חיצוני 12 מ"מ × 25 מ"מ גובה, AL-6212AL-6212
מאזניים אנליטייםVWRVWR 124B2, d = 0.1 mg—
מערבל חרוצים (Bead Beater)מדד השוואהBeadBug 6—
מחט מזריקה בעלת קצה קההאמזוןמחט תעשייתית בעלת קצה קהה, 14 G × 0.5 אינץ׳X001TT8KX1
פחמן דו-חמצניAirGas——
Chemical Fume HoodMott Manufacturingמודל 7421040—
D(+)-סוכרוזThermo Scientific99.7% עבור ביוכימיה177142500
תמיסת מילוי לאלקטרודהThermo Scientificתמיססת מילוי Orion IonPlus900061
תמיסת אתנולKoptec140 Proof2401
מקפיא, −80 °CThermo Scientificסדרת Revco RDE—
כפפות עמידות לחוםFisher Scientificכפפות אוטוקלב לסכנה ביולוגית של Bel-Art ClaviesH13201
הקסאמתילדיסילוקסאן (HMDS)Fisher ScientificTCI H0091, >98%H0091
מימן פרא-חמצןVWRJ.T. Baker, 30%2204-01
אלקטרודה סלקטיבית ליוןThermo ScientificOrion Fluoride ISE, ערוץ כפול9609BNWP
מערבל מגנטיVWRמערבל 360—
שפתולה מיקרוסקופיתאמזוןשפכטול לגילוף שעווה מס' 7A, פלדת אל-חלד—
מיקרוצנטריפוגהEppendorf5427R5404000131
תנור מופל (Muffle Furnace)Thermo Scientificתנור מופל קטן לשולחן מעבדה של Thermolyne, נפח 1.3 ליטר, דגם FB1315MFB1315M
תנורBoekel ScientificBoekel RapidFISH240200
תמיסת פאראפורמלהיד ב-PBSThermo Scientific4% פאראפורמלהיד ב-PBSJ19943-K2
צלחת פטריVWR60 × 15 מ"מ, ללא טיפול25384-092
וזליןThermo Scientificוזלין, לבן, טהור417090010
נייר אינדיקטור pHFisher ScientificpH-Fix 4.5–10.092120.3
כלי פורצלןFisher Scientificכלי שריפה Fisherbrand, 5 מ"ל, גובה 20 מ"מ, צורה גבוההFB-965-B
פוטנציומטרThermo Scientificמד-pH/ISE מדגם Orion Dual Star2115102
מעמד טבעת עם תסמיךVWRמחזיק טבעת, 15 ס"מ470104-526
תזונת מכרסמיםBio-ServF1515, AIN-76A, ½ משקעיםF1515
ג'ק מספרייםאמזוןג'ק מספרי למעבדה—
משפך הפרדהFisher ScientificEisco, זכוכית בורוסיליקט, 2 ליטרS89285
נתרן כלורידFisher Scientificמאושר ACS, גבישיS271-1
נתריום פלורידFisher Scientificמאושר ACS, אבקהS299-100
נתרן הידרוקסידFisher Scientificכדוריות לבנותBP359-500
פיתורי פלדת אל-חלדFisher ScientificScientific Industries, 5 מ"מ, 100 יחידותSI-CS05
חומצה גופריתFisher Scientificבדרגת ACSA300-500
TISAB IIThermo Scientificתמיסת יישום Orion IonPlus940909
דסיקטור ואקוםFisher Scientificמייבש ואקום חסכוני במקום מבית Bel-Art, 10 אינץ'F42010-0000
מסנן ואקוםFisher Scientificמסנן Flow Bottle-Top, PES, 90 מ"מ, 0.2 µm597-4520
מנער משתנה (Variable Rocker)MidSciLabDoctor / Benchmark Scientific—

מקורות

  1. Podgorski J, Berg M. Global analysis and prediction of fluoride in groundwater. Nat Commun. 2022;13(1):4232. doi:10.1038/s41467-022-31940-x
  2. Iheozor-Ejiofor Z, Worthington HV, Walsh T, O'Malley L, Clarkson JE, Macey R, et al. Water fluoridation for the prevention of dental caries. Cochrane Database Syst Rev. 2015;2015(6):Cd010856. doi:10.1002/14651858.CD010856.pub2
  3. Manchanda S, Sardana D, Liu P, Lee GH, Li KY, Lo EC, et al. Topical fluoride to prevent early childhood caries: Systematic review with network meta-analysis. J Dent. 2022;116:103885. doi:10.1016/j.jdent.2021.103885
  4. Chan AKY, Tamrakar M, Jiang CM, Tsang YC, Leung KCM, Chu CH. Clinical evidence for professionally applied fluoride therapy to prevent and arrest dental caries in older adults: A systematic review. J Dent. 2022;125:104273. doi:10.1016/j.jdent.2022.104273
  5. Zamperini CA, Bedran-Russo AK. Immediate and Sustained Root Caries Prevention of Fluoride Varnish Combined with Toothpastes. Caries Res. 2023;57(5-6):592-601. doi:10.1159/000533279
  6. Melough MM, Sathyanarayana S, Zohoori FV, Gustafsson HC, Sullivan EL, Chi DL, et al. Impact of Fluoride on Associations between Free Sugars Intake and Dental Caries in US Children. JDR Clin Trans Res. 2023;8(3):215-23. doi:10.1177/23800844221093038
  7. Suzuki M, Everett ET, Whitford GM, Bartlett JD. 4-phenylbutyrate Mitigates Fluoride-Induced Cytotoxicity in ALC Cells. Front Physiol. 2017;8:302. doi:10.3389/fphys.2017.00302
  8. Suzuki M, Shin M, Simmer JP, Bartlett JD. Fluoride affects enamel protein content via TGF-beta1-mediated KLK4 inhibition. J Dent Res. 2014;93(10):1022-7. doi:10.1177/0022034514545629
  9. Everett ET, McHenry MA, Reynolds N, Eggertsson H, Sullivan J, Kantmann C, et al. Dental fluorosis: variability among different inbred mouse strains. J Dent Res. 2002;81(11):794-8.
  10. Kong H, He Z, Li H, Xing D, Lin J. The association between fluoride and bone mineral density in US children and adolescents: a pilot study. Nutrients. 2024. doi:10.3390/nu16172948
  11. Mazzoli R, Filippini T, Iamandii I, De Pasquale L, Veneri F, Birnbaum LS, et al. The association of fluoride exposure with bone density and fracture risk: a dose-response meta-analysis. Environ Health. 2025;24(1):73.
  12. Suzuki M, Bandoski C, Bartlett JD. Fluoride induces oxidative damage and SIRT1/autophagy through ROS-mediated JNK signaling. Free Radic Biol Med. 2015;89:369-78.
  13. Kubota K, Lee DH, Tsuchiya M, Young CS, Everett ET, Martinez-Mier EA, et al. Fluoride induces endoplasmic reticulum stress in ameloblasts responsible for dental enamel formation. J Biol Chem. 2005;280(24):23194-202. doi:10.1074/jbc.M503288200
  14. Yamashita S, Okamoto M, Mendonca M. Fluoride alters gene expression via histone H3K27 acetylation in ameloblast-like LS8 cells. Int J Mol Sci. 2024. doi:10.3390/ijms25179600
  15. Deng H, Fujiwara N, Cui H, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Histone acetyltransferase promotes fluoride toxicity in LS8 cells. Chemosphere. 2020;247:125825.
  16. Deng H, Ikeda A, Cui H, Bartlett JD, Suzuki M. MDM2-Mediated p21 Proteasomal Degradation Promotes Fluoride Toxicity in Ameloblasts. Cells. 2019;8(5). doi:10.3390/cells8050436
  17. Fujiwara N, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Curcumin suppresses cell growth and attenuates fluoride-mediated Caspase-3 activation in ameloblast-like LS8 cells. Environ Pollut. 2021;273:116495. doi:10.1016/j.envpol.2021.116495
  18. Suzuki M, Ikeda A, Bartlett JD. Sirt1 overexpression suppresses fluoride-induced p53 acetylation to alleviate fluoride toxicity in ameloblasts responsible for enamel formation. Arch Toxicol. 2018;92(3):1283-93. doi:10.1007/s00204-017-2135-2
  19. Regelson S, Dehghan M, Tantbirojn D, Almoazen H. Evaluation of fluoride levels in commercially available tea in the United States. 2020/12/23 ed2021 Jan-Feb. 17-20 p.
  20. Cantoral A, Luna-Villa LC, Mantilla-Rodriguez AA, Mercado A, Lippert F, Liu Y, et al. Fluoride Content in Foods and Beverages From Mexico City Markets and Supermarkets. Food Nutr Bull. 2019;40(4):514-31. doi:10.1177/0379572119858486
  21. Institute of Medicine SCotSEoDRI. Dietary Reference Intakes for Calcium, Phosphorus, Magnesium, Vitamin D, and Fluoride. Washington, DC: National Academy Press; 1997.
  22. Otal E.H. KML, Kimura M. Fluoride Detection and Quantification, an Overview from Traditional to Innovative Material-Based Methods. In: Wambu E.W. LGJ, Kiplagat A., editor. Fluoride. London: IntechOpen; 2022.
  23. Whitford GM. Absorption and Plasma Concentrations of Fluoride, 1996.
  24. Taves DR. Determination of submicromolar concentrations of fluoride in biological samples. Talanta. 1968;15(10):1015-23. doi:10.1016/0039-9140(68)80109-2
  25. Buzalaf MA, Caroselli EE, de Carvalho JG, de Oliveira RC, da Silva Cardoso VE, Whitford GM. Bone surface and whole bone as biomarkers for acute fluoride exposure. J Anal Toxicol. 2005;29(8):810-3.
  26. Zohoori FV, Maguire A, Martinez-Mier EA, Buzalaf MAR, Sanderson R, Eckert GJ. A Comparison of Simple Analytical Methods for Determination of Fluoride in Microlitre-Volume Plasma Samples. Caries Res. 2019;53(3):275-83. doi:10.1159/000492339
  27. Martínez-Mier EA, Cury JA, Heilman JR, Katz BP, Levy SM, Li Y, et al. Development of gold standard ion-selective electrode-based methods for fluoride analysis. Caries Res. 2011;45(1):3-12. doi:10.1159/000321657
  28. Boivin G, Chapuy MC, Baud CA, Meunier PJ. Fluoride content in human iliac bone: results in controls, patients with fluorosis, and osteoporotic patients treated with fluoride. J Bone Miner Res. 1988;3(5):497-502.
  29. Yamashita S, Okamoto M, Fujiwara N, Achong-Bowe R, Brueckner S, Mendonca M, et al. Developmental vulnerability to fluoride toxicity: enamel and clearance differences in adolescent versus mature mice. Arch Toxicol. 2025.
  30. Chiba K, Hisamatsu, S., Takizawa, Y, Katsura, K. Determination of fluoride in biological materials by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1982;245:8.
  31. Ikenishi K, Chiba, K., Hisamatsu, S, Takizawa, Y. Determination of fluoride in biological samples by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1988;437:8.
  32. Venkateswarlu P, Reddy, D.S., Reddy, T.S. Spectrophotometric determination of fluoride using the SPADNS method. Analyst 1971;96:5.
  33. Kakabadse G. KN, Davies C.W. The Spectrophotometric Determination of Fluoride with SPDNS-Zirkonium Lake. Analyst. 1971;96:8.
  34. Mendham J, Denney RC, Barnes JD, Thomas MJK. Vogel's Textbook of Quantitative Chemical Analysis. 6th ed. Harlow, England: Prentice Hall; 2000.
  35. Kučera J, Štefánik, M. & Veselka, P. Fluorine determination in biological and environmental samples with INAA using fast neutrons from a p(19 MeV)+Be neutron generator. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry 2019;322:7.
  36. Okamoto M, Yamashita S, Memida T, Mendonca M, Brueckner S, Nakamura S, et al. Microhardness Measurements on Tooth and Alveolar Bone in Rodent Oral Disease Models. J Vis Exp. 2024(206). doi:10.3791/66583
  37. Okamoto M, Yamashita S, Mendonca M, Brueckner S, Achong-Bowe R, Thompson J, et al. Ultrastructural evaluation of adverse effects on dentine formation from systemic fluoride application in an experimental mouse model. Int Endod J. 2025;58(1):128-40.
  38. Frant MS, Ross JW, Jr. Electrode for sensing fluoride ion activity in solution. Science. 1966;154(3756):1553-5.
  39. Umezawa Y, Umezawa, K and Sato, H. Selectivity coefficients for ion-selective electrodes: recommended methods for reporting KRB values, 1995.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

כימות פלורידדיפוזיית HMDSפלוריד בסרוםפלוריד בעצםפלוריד בשןדגימות ביולוגיותעקומת סטנדרטשקיעה ברקמות
כימות פלואוריד בסרום, בעצם ובשיניים במודל עכברים באמצעות דיפוזיה מזורזת על ידי הקסאמתילדיסילוקסן ומדידות באמצעות אלקטרודה סלקטיבית ליונים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.