מאמר שיטה

כימות פלואוריד בסרום, בעצם ובשיניים במודל עכברים באמצעות דיפוזיה מזורזת על ידי הקסאמתילדיסילוקסן ומדידות באמצעות אלקטרודה סלקטיבית ליונים

81 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71488

⸱

28 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oral Science and Translational Research, College of Dental Medicine, Nova Southeastern University, 2Department of Biological Sciences, Bauru School of Dentistry, University of São Paulo, 3Department of Restorative Dentistry and Endodontology, Osaka University Graduate School of Dentistry, 4Unit of Dentistry, Osaka University Hospital, 5Department of Biomedical Sciences, Adams School of Dentistry, The University of North Carolina at Chapel Hill

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את הכנתן של צלחות דיפוזיה המתווכות על ידי hexamethyldisiloxane (HMDS), ולאחריהן מדידות באמצעות אלקטרודה סלקטיבית ליון כדי לכמת את מסת יוני הפלואוריד בסרום, בעצם ובשיניים של עכברים. שיטה זו מספקת גישה רגישה, מבוססת כיול, להערכת הצטברות פלואוריד בדגימות ביולוגיות.

תקציר

כימות רמות פלוריד ברקמות ביולוגיות חיוני להבנת החשיפה לפלוריד, חילוף החומרים שלו והרעילות שלו. פרוטוקול זה מתאר שיטה רגישה וניתנת לשחזור למדידת מסת יוני פלוריד בסרום, בעצם ובשיניים באמצעות דיפוזיה המתווכת על ידי hexamethyldisiloxane (HMDS), ולאחריה ניתוח באמצעות אלקטרודה סלקטיבית ליון (ISE). דגימות ביולוגיות, כולל סרום, עצם פמורלית ושיני חיתוך של הלסת התחתונה, נאספות מעכברים שנחשפו לטיפולי פלוריד מבוקרים. דגימות עצם ושיניים עוברות שריפה (ashing), טחינה והידרציה, בעוד שסרום מעובד באופן ישיר. כל דגימה מועברת לכלי דיפוזיה המכיל מים אולטרה-טהורים ונחתמת עם מכסה מצופה בוואזלין הנושאת טיפות של נתרן הידרוקסיד המשמשות כמלכודות פלוריד. הזרקה של חומצה גופרית רוויה ב-HMDS מתניעה את שחרור הפלוריד והדיפוזיה שלו, מה שמאפשר ללכוד כמותית את יוני הפלוריד המשוחררים במלכודות. לאחר דיפוזיה של לילה שלם, טיפות מלכודת הפלוריד מאוחדות לדגימה אחת, מחמיצות לטווח ה-pH הנדרש, ומועמדות לנפח מוגדר למדידה ב-ISE. כלי דיפוזיה לכיול, שהוכנו עם מסות פלוריד ידועות, מייצרים עקומת סטנדרט לצורך כימות, ודגימות בקרת איכות מאמתים את יציבות האלקטרודה. תוצאות מייצגות מעכברים מתבגרים ובוגרים שנחשפו ל-0 או 125 ppm פלוריד מדגימות את יכולתה של השיטה לזהות הבדלים תלויי-גיל ותלויי-מינון ברמות הפלוריד בסרום, בעצם ובשיניים. פרוטוקול זה מספק גישה חסונה מבוססת כיול לכימות פלוריד במטריצות ביולוגיות מגוונות ומתאים למחקרים הבוחנים חשיפה לפלוריד, שקיעה ברקמות ותוצאות טוקסיקולוגיות במודלים של עכברים. יתרון מרכזי של שיטה זו הוא יכולתה לכמת במדויק פלוריד בדגימות קטנות ביותר, כולל 3–5 mg של אפר המתקבל משיני חיתוך בודדות של עכבר, מכיוון שתהליך הדיפוזיה מרכז את כל הפלוריד המשוחרר לנפח דגימה מדיד של פחות מ-100 µL.

מבוא

פלואוריד הוא אניון המופיע באופן טבעי, ורמה אופטימלית של פלואוריד יעילה במניעת עששת שיניים1,2,3,4,5. בארצות הברית (U.S.), פלואורידציה של מי הקהילה בריכוז של 0.7 ppm הוטמעה כאסטרטגיה של בריאות הציבור להפחתת שכיחות העששת ולקידום בריאות השן6. עם זאת, בליעה ממושכת של כמות מופרזת של פלואוריד עלולה להשפיע לרעה על רקמות מרובות. חשיפה לרמות גבוהות של פלואוריד משבשת את היווצרות זגוגית השן7,8,9, משנה את היווצרות העצם10, ופוגעת בשלמות השלד11.

ברמה התאית, חשיפה לפלואוריד גורמת למספר הפרעות מטבוליות, כולל עקה חמצונית12, עקה של הרשת האנדופלזמית13, מודיפיקציות אפיגנטיות המשנות את ביטוי הגנים14, ואפופטוזיס באמלובלסטים15,16,17,18. ברמה הגלובלית, ריכוזי פלואוריד גבוהים במי תהום (>1.5 ppm) מהווים בעיה בריאותית משמעותית. מחקר מידול חיזוי שנערך לאחרונה העריך כי כ-180 מיליון בני אדם ברחבי העולם מושפעים פוטנציאלית מחשיפה מוגברת לפלואוריד, כאשר הנטל הגבוה ביותר נמצא באסיה ובאפריקה1. מעבר למי שתייה, חשיפה לפלואוריד מתרחשת גם דרך מזון (למשל, פירות ים; ~1.9 ppm), משקאות (למשל, תה; 0.5–6 ppm19) ומוצרי דנטל כגון משחיית שיניים20 (1,000–1,500 ppm).

לפיכך, הבנה של חשיפה לפלואוריד, חילוף חומרים שלו והשקיעתו ברקמות היא חיונית להערכת הן התועלת הטיפולית והן ההשלכות הטוקסיקולוגיות הפוטנציאליות שלו. כימות מדויק של פלואוריד בדגימות ביולוגיות — כולל שתן, סרום, עצם ושיניים — הוא מרכיב קריטי בעבודה זו. עם זאת, המדידה מהווה אתגר אנליטי בשל ההתנהגות הכימית של הפלואוריד וזיקתו החזקה למטריצות עשירות בסידן. כ-99% מהפלואוריד בגוף נמצא ברקמות מומחשאות כגון עצם ושיניים21. כדי להתמודד עם אתגרים אלו, פותחו מגוון טכניקות אנליטיות, כולל פוטנציומטריה באמצעות אלקטרודה סלקטיבית ליון (ISE), כרומטוגרפיה יונית, בדיקות קולורימטריות, הליכי טיטרציה ושיטות מבוססות גרעין או הפעלה22. מבין אלו, טכניקת הדיפוזיה המהולה ב-hexamethyldisiloxane (HMDS) בשילוב עם מדידה באמצעות אלקטרודה סלקטיבית לפלואוריד התגבשה כאחת הגישות המהימנות והנפוצות ביותר עבור מטריצות ביולוגיות, בשל רגישותה, השחזוריות שלה והתאימות שלה לסוגי דגימות מגוונים23,24,25,26,27,28,29.

למרות זמינותן של שיטות אנליטיות מרובות, לכל גישה יש מגבלות העשויות להגביל את השימוש בה במחקר ניסויי או קליני. כרומטוגרפיית יונים מספקת רגישות וסלקטיביות גבוהות, אך היא דורשת מכשור ייעודי והכנה נרחבת של הדגימות30,31. בדיקות קולורימטריות, כגון שיטת ה-SPADNS (sodium 2‑(parasulfophenylazo)‑1,8-dihydroxynaphthalene-3,6‑disulfonate), הן פשוטות וזולות, אך הן רגישות להפרעות מעכירות ומכרומופורים אנדוגניים, דבר המגביל את מהימנותן בדגימות ביולוגיות מורכבות22,32,33. שיטות טיטרציה הן יעילות מבחינה כלכלית ופשוטות, אך חסרה בהן הרגישות הנדרשת לזיהוי פלואוריד ברמות עקבות ברוב הדגימות הביולוגיות34. טכניקות גרעיניות או מבוססות על הפעלה מציעות רגישות יוצאת דופן, אך הן דורשות גישה לכיטורים או למקורות נייטרונים מבוססי מאיץ, מה שהופך אותן לבלתי מעשיות לשימוש שגרתי במעבדה35. לעומת זאת, דיפוזיה המואצת על ידי HMDS ולאחריה מדידה ב-ISE מספקת איזון מעשי בין רגישות, עלות ונגישות, תוך הבטחת שחרור מלא של הפלואוריד הן מרקמות רכות והן מרקמות ממינרליזציה. דבר זה יתרוני במיוחד למחקרים הכוללים בעלי חיים קטנים, שבהם זמינות הרקמה מוגבלת ומבנים ממינרליזציה, כגון שיניים קדמיות של עכברים, מניבים רק 3–5 mg של אפר לשן.

היכולת של שיטת הדיפוזיה–ISE לרכז את כל הפלואוריד ששוחרר לנפח קטן ומוגדר מאפשרת כימות מדויק אפילו בדגימות קטנות ביותר. עובדה זו הופכת את השיטה למתאימה במיוחד למחקרי טוקסיקינטיקה, ניסויי תגובה למינון ובחינות של חילוף חומרים של פלואוריד בשלבים התפתחותיים שונים. מכרסמים קטנים, ובמיוחד עכברים מסוג C57BL/6J, שימשו באופן נרחב כמודלים של בעלי חיים לחקר השפעות הפלואוריד7,9,12,29,36.

בפרוטוקול זה, המחברים מיישמים את טכניקת הדיפוזיה המואצת על ידי HMDS, ולאחריה מדידה באמצעות אלקטרודה סלקטיבית לפלואוריד, כדי לכמת פלואוריד בסרום, בעצם ובשיניים שנאספו מעכברים שנחשפו למינון גבוה של פלואוריד (125 ppm) בהשוואה לקבוצות ביקורת שלא טופלו. בנוסף, המחברים משווים את הצטברות הפלואוריד בעכברים מתבגרים (6 שבועות בתחילת הטיפול) ועכברים בוגרים (18 שבועות בתחילת הטיפול) כדי להעריך הבדלים תלויי גיל במטבוליזם של פלואוריד ובהשקעתו ברקמות. שיניים חותכות של הלסת התחתונה נבחרו כרקמה דנטלית מייצגת מכיוון ששיניים חותכות של מכרסמים בוקעות באופן רציף ומגיעות לאיזון של מצב יציב בין בקיעה לבלאי סגירה (occlusal wear) סביב גיל 7 שבועות. דפוס צמיחה רציף זה מספק גרדיאנט עקבי ונגיש של התפתחות זגוגית השן, מה שהופך את השיניים החותכות של עכברים למודל נפוץ ומאומת לבדיקת התהוות זגוגית השן ופלואורוזיס שיניים.

פרוטוקול

כל הפרוצדורות המתוארות בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות לשימוש בבעלי חיים בעלי חוליות שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ובחינת בעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת Nova Southeastern (פרוטוקול מס׳ 2023.02.MSuz1), המוכרת על ידי האיגוד להערכה והסמכה של טיפול בבעלי חיים במעבדה ברמה בינלאומית (AAALAC). כל העבודה עם בעלי חיים תואמה למדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה ולהנחיות האיגוד הווטרינרי הרפואי האמריקאי (AVMA) להדרה של בעלי חיים. כל החומרים שנעשה בהם שימוש במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. בעלי חיים ו הכנה ומתן של נתרן פלואוריד במודל עכברי

  1. בעלי חיים: חלקו עכברי C57BL/6J זכרים לשתי קטגוריות גיל: מתבגרים, בני 6 שבועות בתחילת הטיפול, ובוגרים, בני 18 שבועות בתחילת הטיפול.
    1. ספקו לכל קבוצה מים דה-יוניים נטולי פלואוריד (0 ppm F⁻) או מי שתייה מועשירים בנתרן פלואוריד (125 ppm F⁻) למשך תקופת חשיפה של 6 שבועות.
    2. כלולו חמישה בעלי חיים בכל תנאי גיל וטיפול (N = 5/group).
    3. בסוף תקופת החשיפה, אספו סרום, עצמות ירך (femurs) ושיניים חותכות של הלסת התחתונה (mandibular incisors), והכינו את כל הדגימות שנאספו לאנליזות המשך.
      הערה: דגימה (Specimen): חומר שעבר עיבוד כגון עצם לאחר שריפה, שן לאחר שריפה וסרום.
  2. דיור ותזונה של בעלי החיים: שכן את העכברים בתנאי מעבדה סטנדרטיים עם גישה למזון ומים באופן ad libitum.
    1. ספקו תזונה נטולת פלואוריד החל משבוע לפני איסוף השיניים, העצם והסרום כדי למזער את רמות הפלואוריד ברקע.
  3. מי שתייה עם נתרן פלואוריד
    1. להכנת מי שתייה מועשירים בפלואוריד, המסו נתרן פלואוריד (NaF) במים דה-יוניים עד להשגת ריכוז הפלואוריד הרצוי (למשל, 125 ppm F⁻).
    2. סננו את התמיסה דרך מסנן ואקום של 0.2 µm לבקבוק שעבר עיקור באוטוקלאב. הכינו תמיסה טרייה מדי יומיים.
      זהירות: NaF רעיל בבליעה ועשוי לגרום לגירוי בעור ובעיניים. יש לטפל בחומר במכונה למניעת אדים (fume hood) תוך לבישת חלוק מעבדה, כפפות ניטריל ומשקפי מגן.
  4. עבור מי בקרה נטולי פלואוריד, סננו מים דה-יוניים דרך מסנן ואקום של 0.2 µm לבקבוק שעבר עיקור באוטוקלאב. הכינו מים טריים מדי יומיים.
  5. ספקו מי שתייה מועשירים בפלואוריד או נטולי פלואוריד באופן ad libitum למשך משך הזמן הרצוי לטיפול בפלואוריד. עקבו אחר מפלס המים מדי יום והחליפו בקבוקים מדי יומיים.
  6. בסוף תקופת החשיפה, השמידו את בעלי החיים באמצעות שאיפת פחמן דו-חמצאי (CO₂) ולאחריה עריפת ראש. הליכי ההשמדה בוצעו בהתאם להנחיות ה-AVMA להשמדת בעלי חיים ואושרו כחלק מפרוטוקול ה-IACUC המוסדי.
    זהירות: CO2 הוא חומר חונק. בצעו את ההליכים באזור מאוורר היטב והבטיחו שהתא פועל כראוי. הימנעו מחשיפה ישירה לשאיפה.

2. הכנת דגימות למדידת פלואוריד

  1. איסוף דם
    1. בצעו המתנזיה לעכברים באמצעות שאיפת CO₂ ואספו מיד דם באמצעות ניקור לבסופי (terminal cardiac puncture) בעזרת מזרק טוברקולין של 1 mL. העבירו את הדם למבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 mL. השליכו את כל המחטים והמזרקים המשומשים לתוך מכל פסולת חדה מאושר מוסדית.
      אזהרה: מחטי מזרקים הן חדות ועשויות לגרום לפציעות דקירה; טיפלו בהן בזהירות.
    2. אחסנו את הדם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן סובבו בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-2,00 × g.
    3. העבירו את העילגון (סרום) למבחנת מיקרו-צנטריפוגה ואחסנו ב-−80 °C.
      אזהרה: מקפיאים בטמפרטורה נמוכה במיוחד מהווים סכנת כוויות קור. לבשו כפפות מבודדות בעת טיפול במבחנות ומנעו מגע ממושך של העור עם משטחים קרים.
  2. עצמות
    1. הוצאת עצמות הירך: לאחר ההמתנזיה, בצעו נתיחה של הרגליים האחוריות במפרקי הירך.
    2. הסירו בזהירות את כל הרקמות הרכות מעצמות הירך. שטפו את הרקמות שלוש פעמים במים דה-יוניים. אחסנו את העצמות ב-80 °C- עד לעיבוד נוסף. השליכו רקמות רכות שהוסרו וחומרים מזוהמים למסלול פסולת ביולוגית מוסדי.
      הערה: ניתן לקבע רקמות ב-4% פאראפורמדהיד עם 2% סוכרוז למשך 12–16 שעות לצורך אחסון ארוך טווח ב-70% אתנול. הליך קיבוע זה אינו משנה את דיוק הכמות של הפלואוריד במדידות הבאות.
    3. שטפו את העצמות ביסודיות במים דה-יוניים. ספגו לחות עודפת בעזרת נייר סופג ללא סיבים.
    4. העבירו את העצמות למבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 mL עם מכסים פתוחים כדי לאפשר התאיידות, והניחו אותן בתנור ייבוש ב-60 °C למשך 12–16 שעות.
      אזהרה: תנור הייבוש עלול לגרום לכוויות. השתמשו בכפפות עמידות לחום בעת טיפול בדגימות.
    5. שרפית העצמות: העבירו את העצמות המיובשות לכירות אלומינה. הניחו את הכירות בתנור מופל (muffle furnace) וחממו ל-60 °C בקצב של 150 °C/h, ולאחר מכן החזיקו בטמפרטורה זו למשך 6 שעות. המתינו ששמע התנור יתקרר להפחות מ-20 °C לפני הוצאת הכירות. השליכו שרידי עצם או חומרים מתכלים מזוהמים למסלול פסולת ביולוגית מוסדי.
      אזהרה: תנור המופל והכירות מגיעים לטמפרטורות קיצוניות, המהוות סכנת כוויות חמורה. תמיד המתינו לקירור התנור לפני הטיפול בכירות. בעת הוצאת הכירות, לבשו חלוק מעבדה, משקפי מגן וכפפות עמידות לחום, והשתמשו בפינצטה ארוכה כדי למנוע מגע ישיר עם משטחים חמים.
      שלב קריטי: שרפית לא שלמה תפגע בניתוחים הבאים. ודאו שחומר העצם הגיע למצב חמצון מלא לפני ההמשך; כל שארית פחמן תפריע למדידות הבאות.
      הערה: עצם שעברה שרפית תקינה צריכה להיראות באפור בהיר עד לבן אחיד. חלקיקים כהים יותר — במיוחד שאריות שחורות או דמויות פחם — מעידים על בעירה לא שלמה. אם קיימת שינוי בצבע, האריכו את משך השרפית כדי לאפשר הסרה מלאה של החומר האורגני.
    6. אחסון עצמות משורפפות: מיד לאחר השרפית, העבירו את העצמות למבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 mL. אטמו את המבחנות ב-Parafilm ואחסנו אותן בדסיקטור ואקום עד לשימוש.
  3. שיניים
    1. הוצאת שיניים חותכות של הלסת התחתונה: בצעו חתך אופקי בגובה המפרק הלסת-רקה (temporomandibular joint) כדי להפריד את הלסת התחתונה מהלסת העליונה.
    2. בצעו חתכים סגיטליים מרכזיים כדי לחלק את הלסת העליונה והתחתונה למחצית שמאל ומגמין.
    3. שטפו את הרקמות שלוש פעמים במים דה-יוניים והוציאו בזהירות את השיניים החותכות של הלסת התחתונה. אחסנו את השיניים שהוצאו ב-80 °C- עד לשימוש הבא. השליכו רקמות רכות שהוצאו וחומרים מתכלים מזוהמים למסלול פסולת ביולוגית מוסדי.
      אזהרה: השתמשו בכלי נתיחה חדים בזהירות בעת ביצוע חתכים במפרק הלסת-רקה ובמישור הסגיטלי המרכזי כדי למנוע פגיעה אישית. לבשו ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות, חלוק מעבדה ומשקפי מגן.
      הערה: ניתן לקבע רקמות ב-4% פאראפורמדהיד עם 2% סוכרוז למשך 12–16 שעות לצורך אחסון ארוך טווח ב-70% אתנול. הליך קיבוע זה אינו משנה את דיוק הכמות של הפלואוריד במדידות הבאות.
    4. הכנת שיניים לשרפית: שטפו את השיניים ביסודיות במים דה-יוניים והניחו אותן במי חמצן (H₂O₂) בריכוז 1% למשך 12–16 שעות. השליכו תמיסות מי חמצן משומשות כפסולת כימית מסוכנת.
    5. שטפו שוב במים דה-יוניים, ייבשו קצרות בעזרת טישו ללא סיבים, והעבירו למבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 mL עם מכסים פתוחים. הניחו את המבחנות בתנור ייבוש ב-60 °C למשך 12–16 שעות.
      אזהרה: מי חמצן הוא מחמצן ועשוי לגרום לגירוי של העור והעיניים. טיפלו בתמיסה בתוך מ 빠르게 (fume hood) תוך לבישת חלוק מעבדה, כפפות ניטריל ומשקפי מגן. הימנעו ממגע עם חומרים דליקים.
    6. שרפית שיניים: העבירו את השיניים המיובשות לכירות אלומינה ובצעו שרפית בתנור מופל בטמפרטורת שהייה של 60 °C למשך 20 שעות, תוך שימוש בקצב עלייה של 150 °C/h.
    7. הוציאו את הכירות רק לאחר שהתנור התקרר להפחות מ-20 °C.
      אזהרה: תנור המופל והכירות מגיעים לטמפרטורות קיצוניות, המהוות סכנת כוויות חמורה. המתינו ששמע התנור יתקרר להפחות מ-20 °C לפני הטיפול בכירות. בעת הוצאת הכירות, לבשו חלוק מעבדה, משקפי מגן וכפפות עמידות לחום, והשתמשו בפינצטה ארוכה כדי למנוע מגע ישיר עם משטחים חמים.
      שלב קריטי: ודאו חמצון מלא; פחמן שירי יפריע לניתוחים הבאים.
      הערה: חומר שיניים משורפף צריך להיראות באפור בהיר עד לבן אחיד. בצעו שרפית חוזרת אם נשארו שאריות שחורות.
    8. אחסון דגימות שיניים משורפפות: מיד לאחר השרפית, העבירו את השיניים למבחנות מיקרו-צנטריפוגה בעלות תחתית עגולה של 2 mL.
    9. אטמו את המבחנות ב-Parafilm ואחסנו אותן בדסיקטור ואקום עד לשימוש.

3. הכנת צלחות דיפוזיה בסיוע HMDS

  1. ריאגנטים וחומרים
    1. חומצה גופרית 6 N: לפחות יומיים לפני הכנת צלוניות הדיפוזיה, הכינו תמיסת אם של חומצה גופרית 6 N.
      הערה: צלחת דיפוזיה: כלי אטום שנועד ליצור סביבה סגורה ומבוקרת, שבה רכיבים השתחררו מחומר ביולוגי שעבר עיבוד יכולים להילכד על ידי מלכודת כימית המוצמדת למכסה. התכנון האטום מונע חילוף עם האוויר החיצוני ומבטיח כי האנליטים המשוחררים יופנו אל המלכודת לצורך מדידה מאוחרת.
    2. הנח כוס פלסטיק בנפח 1 ליטר עם מגנט ערבוב על גבי מערבל מגנטי והוסף 416 מ"ל של מים טהורים במיוחד (ultrapure water).
    3. באמצעות פיפטה סרולוגית של 50 מ"ל, הוסיפו באיטיות 84 מ"ל של H₂SO₄ בריכוז 36 N למים תוך כדי ערבוב רציף. התמיסה תתחמם; המתינו עד שתתקרר לטמפרטורת החדר.. יש להשליך תמיסות של חומצה גופרית שלא נעשה בהן שימוש או תמיסות משומשות כפסולת כימית מסוכנת במסלול פינוי הפסולת הכימית של המוסד.
      זהירות: חומצה גופרתית היא חומר מאכל מאוד. יש לטפל בחומר בתוך מקרן עשביב תוך לבישת כפפות עמידות לחומצה, חלוק מעבדה ומשקפי מגן. במקרה של מגע, יש לשטוף מיד בכמות גדולה של מים.
    4. חומצה גופרית 6 N רוויה ב-HMDS: העבירו את החומצה הגופרית 6 N למשפך הפרדה בנפח 2 לטר והוסיפו 15 מ"ל hexamethyldisiloxane (HMDS).
    5. וודאו שהפקק והברז סגורים היטב, החזיקו את משפך ההפרדה לרוחב ונערו בעוצמה עד להופעת טיפות זעירות של HMDS.
    6. פתח את הפקק כדי לשחרר את הגז המתפתח וחזור על התהליך פעמיים נוספות.
    7. השאר את הפק פתוח חלקית למשך מספר שעות. אחסן את משפך ההפרדה המכיל חומצה גופרתית 6 N רוויה ב-HMDS במעמד בתוך מ 빠르게ת כימיקלים. השליך חומצה גופרתית המכילה HMDS וחומרים מזוהמים כפספת כימית מסוכנת.
      אזהרה: HMDS דליק ורעיל בשאיפה. יש לטפל בחומר בתוך מ 빠르게-מתג (fume hood) תוך כדי לבישת חלוק מעבדה, כפפות ומשקפי מגן. יש להרחיקו ממקורות הצתה.
    8. נתרן הידרוקסיד 0.05 N: המיסו 1 גרם כיתורי NaOH ב-25 מ"ל מים אולטרה-טהורים להכנת תמיסת מקור בריכוז 1 N.
    9. ערב 2 מ"ל של תמיסת המלאי של NaOH בריכוז 1 N עם 38 מ"ל מים מזוקקים (ultrapure water) כדי להכין תמיסת NaOH בריכוז 0.05 N.
    10. חלקו את ה-NaOH בריכוז 0.05 N למבחנות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל לשימוש חד-פעמי, אטמו את המכסים באמצעות Parafilm ואחסנו את המבחנות בדססיקטור ואקום כדי למזער ספיגת CO₂. השליכו תמיסות סודיום הידרוקסיד שלא נעשה בהן שימוש או תמיסות משומשות כפסולת כימית מסוכנת.
      אזהרה: נתרן הידרוקסיד הוא חומר קורוזיבי ביותר ועלול לגרום לכוויות חמורות. יש ללבוש חלוק מעבדה, כפפות ומשקפי מגן. יש לטפל בתמיסות בזהירות כדי למנוע התזות.
    11. חומצה אצטית 0.2 N: הוסף 575 µL הוסיפו חומצה אצטית קרחית למים אולטרה-טהורים והשלימו לנפח סופי של 50 מ"ל כדי להכין חומצה אצטית בריכוז 0.2 N. השליכו תמיסות חומצה אצטית כפסולת כימית מסוכנת.
      אזהרה: חומצה אצטית היא חומר מאכל ועלולה לגרום לגירוי בעור, בעיניים ובדרכי הנשימה. יש לטפל בחומר בתוך מ আর্জেন্টিনা כימית תוך לבישת חלוק מעבדה, כפפות ומשקפי מגן.
    12. וזלין (Petrolatum): המס כ-10 גרם וזלין ב- 60 °C בתנור. שאבו את הפטרולטום הנוזלי למזרקים של 10 מיליליטר והניחו לו להירגע ולהתמצק. ניתן לשמור מזרקים מלאים בפטרולטום בטמפרטורת החדר למשך מספר שבועות.
    13. צלחית פטרי: השתמשו בצלחיות פטרי לא מטופלות בגודל 60 × 15 מ"מ להכנת צלחיות דיפוזיה.
    14. המיסו חור קטן במכסה של צלח פטרי באמצעות מחט מזריקה בכיליב 18-G שחוממה.
    15. מרחו שכבת איטום רציפה של וזלין (petrolatum) על השפה הפנימית של המכסה, באמצעות מזרק של 10 מ"ל המצויד במחט קהה בכילוי 14G. השליכו את כל המחטים המשומשות למיכל מאושר של המוסד לפסולת חדה.
      זהירות: מחטי מזריקים הן חדות ועשויות לגרום לפציעות דקירה. יש לטיפל בהן בזהירות ולהשליכן למכלים מאושרים עבור חפצים חדים. בעת חימום מחטים, יש להשתמש בכפפות עמידות לחום ובמיגון עיניים כדי למנוע כוויות.
    16. תמיסות סטוק של NaF לכיול צלחות דיפוזיה. המס 4.19 גרם NaF בליטר אחד של מים אולטרה-טהורים כדי להכין תמיסת סטוק בריכוז 10 mM. הכן תמיסות בריכוז 10 mM, 100 µMו- 10 µM תמיסות מלאי באמצעות דילוல்கள் סדרתיים ביחס של 1:10 של תמיסת ה-10 mM.
      הערה: מול אחד של NaF מספק 19 גרם F⁻; לכן, 1 µL של 10 µM NaF מכיל 0.19 ng של F⁻ ו- 1 µL של 10 mM NaF מכילה 190 ng F⁻.
      הערה: צלחות דיפוזיה לכיול: צלחות דיפוזיה המשמשות ספציפית לכיול עם מסה ידועה של יוני פלואוריד (F¯).
  2. הכנות של צלחות דיפוזיה ספציפיות לדגימה
    1. צלחת דיפוזיית סרום: העבירו בפיפטה 3 מ"ל מים אולטרה-טהורים לתחתית פטריית פטרי והוסיפו 75 µL סרום. יש להשליך את כל החומרים המזוהמים בסרום למסלול פסולת ביולוגית מוסדי. המשיכו לשלב 3.4.
    2. צלחת דיפוזיה לעצם
      1. דחיסת אפר עצם לאבקה: השתמשו במיקרו-שפכטל כדי לטחון את העצמות שהפכו לאפר בתוך מבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל לאבקה דקה. המשיכו בעיבוד אפר העצם הדחוס לאבקה באופן מיידי. השליכו חומרים מתכלים המזוהמים באפר עצם לנשף הפסולת הכימית המוסדי.
      2. שקילה והשקיה של אפר עצם
        1. הנח את תחתיתו הריקה של פטרית הפטרי (Petri dish) על כף השקילה של מאזנאי אנליטי בעל רזולוציה של לפחות 0.1 מ"ג.
        2. העבירו את אפר העצם הטחון מפיה של מבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל לכלי פורצלן קטן, כדי למזער מטען סטטי ולמנוע פיזור של האבקה.
        3. בעזרת שפכטל מיקרוסקופי, העבירו כ-5 מ"ג של אפר עצם אל הצלחת, וכסו מיד את האבקה ב-3 מ"ל מים אולטרה-טהורים לפני הסרת הצלחת מהמאזניים האנליטיים, כדי למנוע פיזור של האפר.
        4. רשמו את המשקל המדויק של כל דגימת אפר עצם. המשיכו לשלב 3.4.
    3. צלחת דיפוזיה לשיניים
      1. כרסום של שיניים שעברו שריפה (ashing)
        1. העבירו את שיני החיתוך לאחר השריפה לשפופרות מיקרוצנטריפוגה בעלות תחתית עגולה בנפח של 2 מ"ל, והוסיפו לשפופרה כל אחת חרוז פלדה אל-חלודה בקוטר של 5 מ"מ. סגרו את השפופרות ואטמו את המכסים באמצעות Parafilm.
        2. טחנו את חיתכי השיניים לאחר השריפה במכשיר bead beater במהירות של 2,500 סל"ד למשך 10 שניות. המשיכו בעיבוד השיניים הטחונות באופן מיידי.
      2. שקילה והדרייה של שיניים לאחר שריפה
        1. שפכו את כל תכולת המבחנה, כולל פסולית הפלדה אל חלוד, לתחתית צלחת הדיפוזיה המוצבת על כף המאזניים של מאזני אנליזה. השליכו חומרים מתכלים מזוהמים המכילים אפר שיניים למערכת לפינוי הפסולת הכימית המוסדית.
        2. הוציאו את כדור הפלדה אל-חלודה מהכלי ורשמו את המשקל המדויק של אפר השן (בדרך כלל 3–4 מ"ג לכל שיני חיתוך תחתונות).
        3. הוסיפו מיד 3 מ"ל מים אולטרה-טוהרים כדי לכסות את אפר השן, לפני써 הסרת הכלי מהמאזנה, כדי למנוע פיזור של האפר שנגרם מפריקת חשמל סטטית. המשיכו לשלב 3.4.
  3. כיול ובקרת איכות של צלחות דיפוזיה
    1. במקביל לצלוחי הדיפוזיה של הדגימות, הכין שתי סדרות של צלוחי דיפוזיה לכיול עבור כיול של 5–6 נקודות, וסדרה אחת זהה של צלוחי דיפוזיה לבקרת איכות, כולל בקרת רקע (blank).
      הערה: צלחות דיפוזיה לבקרת איכות: מוכנות באופן זהה לצלחות הדיפוזיה לכיול, אך משמשות באופן תקופתי לאימות יציבות האלקטרודה ולהבטחת ביצועי מדידה עקביים.
    2. העבירו בפיפטה 3 מ"ל מים אולטרה-טהורים לכל אחת מ-1 או 13 צלחוני פטרי, והוסיפו תמיסת אם של NaF כדי לכסות את טווח המסות הצפוי של F¯ בדגימות הבדיקה. המשיכו לשלב 3.4 להשלמת הרכבת צלחוני הדיפוזיה.37.
  4. השלמת הרכבת צלחת הדיפוזיה
    1. כדי להכין משקע למלכודת פלואוריד, 50 µl מוסיפים שלוש טיפות של NaOH בריכוז 0.05 N אל פני השטח הפנימיים של מכסה פטרי, הרחק משפת המכסה.
      הערה: מלכודת פלואוריד (F¯ Trap): רכיב בצלחות דיפוזיה הלוכד F¯, ובאופן ספציפי נתרן הידרוקסיד (NaOH).
    2. הפוך את המכסה מבלי להפר את טיפות ה-NaOH ואטום אותו היטב לתחתית הצלחת באמצעות הוואזלין (petrolatum).
    3. להכנת תמיסת חומצה גופרתית רוויה ב-HMDS בריכוז 3 N, ערבבו נפחים שווים של חומצה גופרתית רוויה ב-HMDS בריכוז 6 N ומים אולטרה-טהורים. יש להכין את התמיסה סמוך למועד השימוש, כיוון שאינה ניתנת לאחסון.
    4. הזריקו 3 מ"ל של חומצה גופרתית רוויה ב-HMDS בריכוז 3 N שהוכנה, דרך החור במכסה, אל תוך המים בתחתית כלי הדיפוזיה, באמצעות מזרק של 10 מ"ל המצויד במחט 20 G. יש להיזהר שלא להתיז חומצה על פני השטח הפנימיים של המכסה בעת הכנסת מחט המזרק או הוצאתה.
    5. דיפוזיית פלואוריד בסיוע HMDS: אטמו באופן מיידי את חור ההזרקה בעזרת טיפת וזלין המכסה לחלוטין את הפתח, והניחו את צלחות הדיפוזיה על רוקר משתנה (variable rocker) המוגדר למהירות נמוכה. דגרו למשך הלילה בטמפרטורת החדר (איור 1).

דיאגרמה של צלחת פטרי; מלכודת F (F-Trap), איטום פטרולטום, אפר עצם, תהליך חומצה גופרית רוויה ב-HDMS.
איור 1סכימה של צלחת דיפוזיה של עצם לחילוץ וללכדת פלואוריד. איור 1 ממחיש את התכנון של כלי דיפוזיה לעצם שהורכב בתוך צלחת פטרי ללא טיפול בגודל 60 × 15 מ"מ. המכסה מכיל חור הזרקה קטן שנאטם באמצעות כדור פטרולטום. על פני השטח הפנימי של המכסה ממוקמות שלוש טיפות של NaOH המשמשות כמלכודות ליון פלואוריד (F⁻), התלויות מהמכסה במהלך הדיפוזיה. המכסה נאטם בצורה הרמטית לבסיס הכלי באמצעות פטרולטום. בתחתית צלחת הפטרי נמצאים מים אולטרה-טהורים, חומצה גופרית רוויה בהקסמתילדיסילוקסאן (HMDS) ואפר עצם, אשר יחד מהווים את סביבת התגובה לשחרור הפלואוריד וללכידה שלאחריה. איור זה נוצר על ידי המחברים באמצעות Biorender, והאיור מוגדר תחת רישיון CC BY. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

4. מדידת פלואוריד באמצעות ISE

  1. הגדרת ה-ISE
    1. מלא את האלקטרודה הסלקטיבית לפלואוריד בעלת הערוץ הכפול בתמיסת מילוי מתאימה, חבר אותה לפוטנציומטר ואבטח את האלקטרודה במחזיק אלקטרודות.
    2. מקם צלחת פטרי לא מטופלת על גבי ג'ק מספריים מתחת למשטח החישון של האלקטרודה, תוך הבטחה שמשטח החישון מקבילי לתחתית צלחת הפטרי, והרם את שולחן הג'ק המספריים כך שצלחת הפטרי כמעט תגע באלקטרודה (איור 2).
  2. הכנת דגימות למדידה
    הערה: דגימות: רק התוצרים הסופיים שנמדדו באמצעות אלקטרודה סלקטיבית ליונים (ISE), המורכבים ממלכוד ה-F¯ לאחר דיפוזיה, אשר שולבו לאחר מכן עם חומצה אצטית ומים, יכונה "דגימות" בפרוטוקול זה. 
    1. כדי לכוון את ה-pH של הדגימה ל-5, הסר את צלחת הדיפוזיה מהרוקר והרם בזהירות את המכסה על ידי שבירת חסם הפטרולטום לאחר תקופת הדגירה. הפוך את המכסה על משטח שטוח, תוך הבטחה ששלוש טיפות מלכוד ה-F¯ יישארו ללא הפרעה.
    2. הוסף 15–20 µL של חומצה אצטית 0.2 N לטיפה אחת באמצעות פיפטת P20, ולאחר מכןמזג את כל שלוש הטיפות לטיפה אחת מבלי להחליף את טיפ הפפיטה.
      הערה: דגימות עם ריכוזי F¯ גבוהים נוטות להיות בעלות pH ראשוני נמוך יותר ולכן דורשות פחות חומצה אצטית 0.2 N כדי לכוון את ה-pH ל-5 בהשוואה לדגימות המכילות פחות F¯. מכיוון שנפח הדגימה שנותר לאחר רישום פוטנציאל האלקטרודה (שלב 5.3) הוא מינימלי, השתמש בכל שארית דגימה זמינה כדי לאמת את ה-pH באמצעות נייר אינדיקטור.
    3. כדי לכוון את נפח הדגימה, כוון פיפטת P100 ל-75 µL, שאוב את כל נפח מלכוד ה-F¯ ללא הכנסת אוויר, וכוון את הדגימה בדיוק ל-75 µL באמצעות מים אולטרה-טהורים.
    4. בצע שלב זה בזהירות כדי להבטיח נפח מדויק לצורך חישובי ריכוז הפלואוריד. שמור את הדגימה בטיפ הפיפטה ועבור מיד לשלב 4.3.
  3. מדידת דגימות הבדיקה, כיול ודגימות בקרת איכות
    1. כדי למדוד את פוטנציאל האלקטרודה של הדגימה, פנה אותה בין משטח החישון של האלקטרודה הסלקטיבית לפלואוריד לבין צלחת הפטרי. ודא שכל משטח החישון של האלקטרודה טבול לחלוטין בנוזל, ללא מגע ישיר עם צלחת הפטרי. המתן לייצוב הפוטנציומטר ורשום את הפוטנציאל (mV) המוצג על ידי ה-ISE.
    2. קבע את עקומת כיול הסטנדרט על ידי מדידה רצפתית של סט הסטנדרטים הראשון לכיול, החל מהריכוז הנמוך ביותר של F¯ ועד לגבוה ביותר.
      1. שרט את פוטנציאל האלקטרודה (mV) מול הלוגריתם של F¯ (ng) כדי לבנות את עקומת הכיול (איור 3). בצע רגרסיה מעריכית כדי לקבל את משוואת עקומת הסטנדרט ואת מקדם הדטרמינציה (R2). קבל עקומות כיול רק כאשר R2 הוא ≥ 0.99.
    3. מדוד כל דגימת בדיקה ורשום את פוטנציאל האלקטרודה (mV).
    4. כדי לנטר את יציבות האלקטרודה ולזהות סחיפה פוטנציאלית של הבדיקה, מדוד דגימות בקרת איכות לסירוגין לאורך כל ריצה אנליטית.
      1. השווה את ערכי דגימות בקרת האיכות ישירות לדגימות הכיול המתאימות ואשר התאמה של כ-5% כדי לאמת ביצועים יציבים של האלקטרודה לאורך זמן.
      2. מדוד מדי פעם צלחת דיפוזיה ריקה (blank) כדי לאשר היעדר זיהום פלואוריד במהלך טיפול בדגימות ודיפוזיה.
  4. כדי לחשב את מסת ה-F¯ (ng) בכל דגימת בדיקה, השתמש במשוואת עקומת הסטנדרט. לאחר מכן חלק מסה זו בנפח (µL) של סרום, או במסה (mg) של אפר עצם או שן שהתוספו לצלחת הדיפוזיה.
    1. דוגמה לחישוב ריכוז F¯ באפר עצם (ng/mg)
      1. מסת אפר עצם שהתוספה לצלחת הדיפוזיה: 5.1 mg ; פוטנציאל אלקטרודה של דגימת בדיקה בנפח 75 µL: –31.6 mV
      2. שלב 1: חישוב מסת פלואוריד באמצעות משוואת הכיול
        1. F⁻ mass (ng) = 3505.4 x e(-0.043x-31.6)
        2. F⁻ mass (ng) = 13,641 ng
      3. שלב 2: חישוב ריכוז פלואוריד באפר עצם
        1. F⁻ concentration =  13,641 ng /  5.1  mg
        2. F⁻ concentration =  2,675 ng / mg (ppm)

תרשים ניתוח פוטנציומטרי: ISE עם פוטנציומטר מודד דגימה על גבי ג'ק מספריים לצורך זיהוי יונים.
איור 2סכימה של מערך המדידה ב-ISE. איור 2 מציג את התצורה המשמשת למדידות של יוני פלואוריד באמצעות אלקטרודה סלקטיבית ליון (ISE) בעלת ערוץ כפול. צלחת פטרי ממוקמת על גבי ג'ק מספרי כדי לאפשר כיוון מדויק של גובהה ביחס לאלקטרודה. ה-ISE מחוברת לפוטנציומטר ומכוונת כך שפני השטח הרגישים שלה יהיו מקבילים למישור צלחת הפטרי, תוך שמירה על מרחק של כ-1–2 מ"מ. לאחר קביעת המרווח, נפח קטן של דגימה (75 µL) מועבר בפיפטה אל הרווח שבין פני השטח של החיישן לבין פטרי dish, תוך הבטחה שהדגימה מכסה באופן מלא את אזור החשיפה של האלקטרודה במהלך המדידה. דמות זו נוצרה על ידי המחברים באמצעות Biorender, והדמות מוגבלת תחת רישיון CC BY. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של איור זה.

גרף כיול של יוני פלואוריד; רגרסיה ליניארית; פוטנציאל אלקטרודה מול ריכוז ב-mV/ננוגרמים.
איור 3עקומת כיול וטבלת כיול תואמת לכימות מסת יוני פלואוריד בדגימות של דגימות שינייםהפאנל העליון: דוגמה לעקומת כיול ששימשה לקביעת מסת יוני הפלואוריד בדגימות של דגימות שיניים. ציר ה-x מציג את פוטנציאל האלקטרודה (mV, סולם ליניארי), וציר ה-y מציג את מסת יוני הפלואוריד המתאימה (ng F⁻, סולם לוגריתמי). נקודות כיול נמדודות מוצגות כקו רציף, והרגרסיה המעריכית המתואמת מוצגת כקו מקווקו. תיבה פנימית מציגה את משוואת עקומת הסטנדרט ואת מקדם הדטרמינציה (R²).2 = 0.9). פאנל תחתון: טבלה המכילה את הערכים המספריים ששימשו ליצירת עקומת הכיול. השורה הראשונה מפרטת את חמשת פוטנציאלי האלקטרודה (mV) שנרשמו עבור דגימות הכיול. השורה השנייה מפרטת את מסות יוני הפלואוריד המתאימות (ng F⁻) עבור כל דגימת כיול. השורה השלישית מפרטת את הנפחים (µL) של תמיסו ריכוז NaF 10 mM שהוסיפו לצלחות הדיפוזיה של הכיול; מסת יוני הפלואוריד שנוספה זו שקולה למסה שנלכדה בכל דגימת כיול לאחר הדיפוזיה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות

כדי להדגים את היישום של פרוטוקול זה למדידת ריכוזי פלואוריד (F-) בחומרים ביולוגיים, הופקו דגימות specimen מתוך סרום, עצם ושיניים חותכות של לסות תחתונות (mandibular incisors) שנאספו מעכברים שנחשפו לטיפולי פלואוריד מבוקרים. עכברים זכרים מסוג C57BL/6J חולקו לשתי קטגוריות גיל, מתבגרים (6 שבועות) ובוגרים (18 שבועות), וקיבלו או מים דאיונזים נטולי פלואוריד (0 ppm F⁻) או מי שתייה מועשירים בנתרן-פלואוריד (125 ppm F⁻) למשך תקופת חשיפה של 6 שבועות. כל תנאי גיל וטיפול כלל חמישה בעלי חיים. בתום תקופת החשיפה, נדגמו סרום, עצמות ירך (femurs) ושיניים חותכות של לסות תחתונות, ודגימות ה-specimen הוכרו ונותחו בהתאם לפרוטוקול. ריכוזי פלואוריד מייצגים שנמדדו בסרום, בעצם ובשיניים מסוכמים להלן.

תרשים עמודי של ריכוז פלואוריד; סרום, עצם הירך, שן חותבת; ניתוח של מתבגרים לעומת בוגרים.
איור 4ריכוזי פלואוריד שנמדדו בסרום, בעצם הירך ובשיניים חותכות של הלסת התחתונה. עכברי C57BL/6J זכרים חולקו לשתי קטגוריות גיל, מתבגרים (6 שבועות, עמודה ריקה) ובוגרים (18 שבועות, עמודה מלאה), וסופקו להם או מים דה-יוניים נטולי פלואוריד (0 ppm F⁻) או מי שתייה מועשירים בנתרן פלואוריד (125 ppm F⁻) למשך תקופת חשיפה של 6 שבועות. בתום תקופת החשיפה, נמדדו רמות הפלואוריד ב-(A) סרום, (B) עצם הפמור (ירך) ו-(C) שיניים חותכות של הלסת התחתונה מאותן קבוצות טיפול. ערכי סרום הנמוכים מגבול הגילוי (<(0.02 ppm) שורטטו לצורך ויזואליזציה אך הוצאו מהניתוח הסטטיסטי. הנתונים מוצגים כממוצעים ± SD. השוואות בין קבוצות בני נוער לקבוצות בוגרים בוצעו באמצעות מבחן Mann–Whitney U עם תיקון Bonferroni–Dunn להשוואות מרובות. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5 לקבוצה). אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

ריכוזי פלואוריד בסרום
בשתי הקבוצות, של בני הנוער ושל המבוגרים שטופלו ב-0 ppm פלוריד, ריכוזי הפלוריד בסרום היו נמוכים מגבול הגילוי של האלקטרודה הסלקטיבית ליונים (<0.02 ppm). בקבוצות הטיפול ב-125 ppm, רמת הפלואוריד בסרום עלתה ל-0.3 ± 0.2 ppm בקבוצת המתבגרים ול-0.7 ± 0.2 ppm בקבוצה הבוגרת (p = 0.06). ההשוואה בין קבוצת הנערים לקבוצת הבוגרים בטיפול של 125 ppm בוצעה באמצעות מבחן Mann–Whitney U עם תיקון Bonferroni–Dunn להשוואות מרובות. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5 לקבוצה). קבוצות הטיפול ב-0 ppm הוצאו מהניתוח הסטטיסטי. (איור 4A, טבלה 1).

ריכוזי פלוריד בעצם הירך
בקבוצות הטיפול שקיבלו 0 ppm, ריכוזי הפלואוריד בעצם הירך היו נמוכים באופן מובהק בקרב מתבגרים (292 ± 39 ppm) בהשוואה לבעלי חיים בוגרים (896 ± 5 ppm) (p < 0.01). לעומת זאת, בקבוצות ה-125 ppm, ריכוזי הפלואוריד בבני הגיל ההתבגרות (4,108 ± 482 ppm) היו גבוהים באופן מובהק מאלו של בעלי חיים בוגרים (2,96 ± 612 ppm) (p = 0.04). השוואות בין קבוצות בני הנוער לקבוצות הבוגרים בוצעו באמצעות מבחן Mann–Whitney U עם תיקון Bonferroni–Dunn להשוואות מרובות. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5 לקבוצה). (איור 4ב, טבלה 1). איור 5A מציג את שינוי המכפלה (fold-change) של רמות הפלואוריד בעצם הפמורס בין הטיפולים של 0 ppm ו-125 ppm עבור כל קבוצת גיל. מתבגרים הראו עלייה פי 14 ברמות הפלואוריד בריכוז של 125 ppm, בעוד שעכברים בוגרים הראו עלייה פי 3.

ריכוזי פלואוריד בשיניים חותכות תחתונות
בקבוצות ה-0 ppm, ריכוזי הפלואוריד בחותכות התחתונות היו נמוכים משמעותית בבני נוער (35 ± 4 ppm) בהשוואה לבעלי חיים בוגרים (123 ± 23 ppm) (p = 0.03). בקבוצות הטיפול ב-125 ppm, ריכוזי הפלואוריד בחותכות עלו ל-5641 ± 95 ppm בבני נוער ול-4392 ± 1694 ppm בבעלי חיים בוגרים. השוואות בין קבוצות בני הנוער לבוגרים בוצעו באמצעות מבחן Mann–Whitney U עם תיקון Bonferroni–Dunn להשוואות מרובות. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/group). (איור 4C, טבלה 1). למרות שריכוזי הפלואוריד המוחלטים ב-125 ppm לא נבדלו משמעותית בין קבוצות הגיל, השינוי היחסי (fold-change) מ-0 ppm ל-125 ppm היה גדול משמעותית בעכברים בני נוער (עלייה של פי 161) מאשר בעכברים בוגרים (עלייה של פי 36) (איור 5B).

תרשים עמודות המראה את השפעת הפלואוריד על שינוי קיפול (fold change) ברקמות הפמור (עצם הירך) והשיניים החותכות, בבני נוער לעומת בוגרים.
איור 5בני עשרה עד תשעה עשרה (מתבגרים) מראים עלייה גבוהה יותר במכפלה של הצטברות פלואוריד בעצמות ובשיני החותת בהשוואה לעכברים בוגרים. שינוי יחסי (Fold-change) בריכוזי הפלואוריד מטיפול של 0 ppm ל-125 ppm של פלואוריד בעכברים מתבגרים (פס ר为空/פתוח) ועכברים בוגרים (פס מלא).A) עצם הירך ו(B) שיני חיתוך מנדיבולריות מאותן קבוצות טיפול. הנתונים מוצגים כממוצעים ± SD. השוואות בין קבוצות בני העמידה וקבוצות הבוגרים בוצעו באמצעות t-test לא מזווג. * p < 0.05, (N = 5 לקבוצה). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של דמות זו.

דגימהסרוםפמור (ירך)שיני חיתוך תחתונות
קבוצת גילמתבגרבוגרמתבגרבוגרמתבגרבוגר
קבוצת טיפול0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm
< 0.020.2< 0.020.83244576933081374824161329
< 0.020.1< 0.020.82293789243263954511272654
< 0.020.7< 0.021.03046838737133154412697
< 0.020.4< 0.020.532338328072519355141034169
< 0.020.3< 0.020.52833699372192N/A727114909
ממוצע< 0.020.3< 0.020.729241088962963556411234392
סטיית תקןNA0.2NA0.2394825612395231694

טבלה 1: מדידות פלואוריד פרטניות בסרום, בעצם הירך ובשיניים חותכות של הלסת התחתונה. טבלה 1 מפרטת את ריכוזי הפלואוריד האינדיבידואליים (ppm F⁻) שנמדדו בדגימות של סרום, עצם הירך ושינאי התחתית של לסת העליונה/תחתונה (mandibular incisor) מעכברים מתבגרים ובגירים שנחשפו ל-0 ppm או ל-125 ppm של פלואוריד. עבור כל סוג רקמה, הנתונים מוצגים בעמודות התואמות לארבע קבוצות הטיפול: מתבגרים 0 ppm, מתבגרים 125 ppm, בגירים 0 ppm ובגירים 125 ppm. כל עמודה כוללת את חמשת הערכים האינדיבידואליים שנרשמו (N = 5), ולאחריהם הממוצע וסטיית התקן (SD) המחושבים. בקבוצת הסרום של מתבגרים 0 ppm, כל הערכים שנרשמו היו מתחת לסף הגילוי של האלקטרודה הסלקטיבית ליון (<0.02 ppm). הטבלה מספקת את הנתונים המספריים הגולמיים העומדים בבסיס ערכי הסיכום וההשוואות הסטטיסטיות המוצגים ב- איור 4.

דיון

מדידות פלואוריד בוצעו באמצעות אלקטרודה סלקטיבית ליונים (ISE) הסלקטיבית לפלואוריד, המשלבת ממבנה קריסטלי של לנתניום פלואוריד (LaF₃)38,39. ממבנה זה יוצר קשרים יציבים מאוד של La–F, מה שמוביל להעדפה חזקה של יוני פלואוריד על פני הלידים אחרים. על פי ספרות אלקטרוכימית מבוססת ומפרטי היצרן, ממבנה ה-LaF₃ מראה מקדמי סלקטיביות נמוכים מאוד עבור כלוריד, מה שמעיד על כך שיוני כלוריד אינם יוצרים הפרעה מדידה בתנאים המשמשים בפרוטוקול זה. למרות שכלוריד נמצא באופן טבעי בשיניים ובעצם, פעילותו אינה משפיעה על פוטנציאל האלקטרודה, והאות הרשום משקף באופן ספציפי את פעילות הפלואוריד. גבול הגילוי התחתון של 0.02 ppm תואם לריכוז המינימלי שניתן לכימות אשר תוקף על ידי היצרן עבור אלקטרודת הפלואוריד הסלקטיבית של Orion. גבול זה משקף את ריכוז הפלואוריד הנמוך ביותר שבו האלקטרודה שומרת על תגובה נרנסטית (Nernstian) יציבה ועל קשר ליניארי עם עקומת הכיול. מכיוון שגבול הגילוי מוגדר על ידי מאפייני הממבנה של האלקטרודה ותוקף על ידי היצרן, לא נדרשה קביעה ניסיונית נוספת עבור פרוטוקול זה; עם זאת, בנוגע לטווח הגילוי העליון, המחברים הבחינו כי מסות פלואוריד העולות על כ-38,000 ng במלכודת NaOH של 50 µL הובילו לתגובת אלקטרודה לא-ליניארית, מה שמעיד על כך שעקומת הכיול אינה אמינה יותר בעומסי פלואוריד גבוהים מאוד. אי-ליניאריות זו נובעת ככל הנראה מחריגה מהחוזק היוני וטווח הפעילות האופטימליים עבור האלקטרודה בתנאי הניסוי הנתונים, ולא משקפת גבול עליון מובנה של ה-ISE עצמה. עבור דגימות שצפויות להכיל מסות פלואוריד מעל סף זה, מומלץ להגדיל את נפח מלכודת ה-NaOH כדי לשמור על המדידות בתוך הטווח הדינמי הליניארי של האלקטרודה.

יש לקחת שיקול זה בחשבון בעת החלת הפרוטוקול על דגימות עם תכולת פלואוריד גבוהה באופן חריג. מכיוון ששלב הדיפוזיה צורך את כל נפח הדגימה, לא ניתן היה לבצע מדידות כפולות וניסויי הוספה ושחזור (spike‑and‑recovery) על הדגימות הביולוגיות. כדי להבטיח דיוק ורגישות אנליטית, נכללו סטנדרטים לבקרת איכות (QC) המכילים ריכוזי פלואוריד ידועים בכל סדרת מדידה. סטנדרטים אלו עברו עיבוד ומדידה באופן זהה לדגימות הניסוייות. בכל ההרצות, ריכוזי הפלואוריד שנמדדו בסטנדרטים של ה-QC היו עקביים בטווח של 5% מערכיהם הצפויים. עבור כל סדרה של 10–20 דגימות ביולוגיות, הוכנו במקביל שתי קבוצות עצמאיות של 5–6 דגימות כיול, ועקומת כיול נרשמה לפני כל סשן מדידה. טווח הכיול הותאם עבור כל הרצה כדי להתקרב למסות הפלואוריד הצפויות בדגימות הביולוגיות, אשר תלויות בסוג הדגימה, במסת החומר שהתווספה לכלי הדיפוזיה, ובקבוצת הטיפול ובגיל החיה. עבור מדידות בסרום, סטנדרטי הכיול תאמו לריכוזי פלואוריד של כ-0.06–1.20 ppm בדגימה. עבור מדידות בעצם ובשן, סטנדרטי הכיול תאמו לריכוזי פלואוריד של כ-19–7,600 ppm בדגימה.

פרוטוקול זה מספק גישה רגישה וניתנת לשחזור לכימות מסת יוני פלואוריד בסרום, בעצם ובשיניים, באמצעות דיפוזיה המקולטלת על ידי hexamethyldisiloxane, ולאחריה אנליזה באמצעות ISE. השיטה לוכדת באופן מהימן פלואוריד השתחרר ממטריצות ביולוגיות מגוונות ומאפשרת הערכה כמותית של הצטברות פלואוריד בעקבות חשיפה מבוקרת. תוצאות מייצגות מעכברים מתבגרים ובוגרים מדגימות הבדלים ברורים התלויים בגיל ובמינון בהשקעת הפלואוריד ברחבי הרקמות, מה שמדגיש את התועלת של גישה זו לחקר מטבוליזם וטוקסיקינטיקה של פלואוריד in vivo.

יתרון מרכזי של פרוטוקול זה הוא השימוש בצלחות דיפוזיה המפרידות פיזית בין התגובה המשחררת פלואוריד לבין הסביבה הלוכדת פלואוריד. התכנון האיטום באמצעות פטרולטום (petrolatum) ממזער את חילופי הגזים עם האטמוספירה ומבטיח לכידה יעילה של יוני פלואוריד משוחררים על ידי טיפות נתרבית (sodium hydroxide) על המכסה. חומצה גופרית רוויה ב-HMDS מספקת כוח מניע חזק ועקבי לשחרור פלואוריד מרקמות ממינרליות, כולל מבנים בעלי הסתייך גבוה כגון עצם ושיניים. מדידת ISE עוקבת, המכוילת עם סטנדרטים תואמי-דיפוזיה, מאפשרת כימות מדויק לאורך טווח דינמי רחב. יתרון נוסף של גישה זו הוא היכולת לכמת פלואוריד בדגימות ביולוגיות קטנות ביותר. רקמות ממינרליות מעכברים, ובמיוחד שיניים חותכות של הלסת התחתונה, מניבות רק 3–5 mg של אפר לכל שן. שיטות אנליטיות קונבנציונליות דורשות לעיתים קרובות מסות דגימה גדולות יותר או תכולת פלואוריד גבוהה יותר כדי להשיג זיהוי מהימן. בניגוד לכך, התכנון מבוסס-הדיפוזיה מרכז את כל הפלואוריד ששוחרר מהדגימה כולה לנפח קטן ומוגדר, מה שמאפשר כימות מדויק גם בדגימות זעירות עם מסת פלואוריד מוחלטת נמוכה. מאפיין זה בעל ערך רב במיוחד למחקרים הכוללים בעלי חיים קטנים, זמינות מוגבלת של רקמות או מבנים ממינרליים שעברו מיקרו-דיסקציה.

מגבלה עיקרית של שיטה זו היא גבול הגילוי של ה-ISE שנעשה בו שימוש במחקר זה (0.02 ppm). דגימות סרום מבעלי חיים בקבוצת ביקורת ללא פלואוריד היו לעיתים קרובות מתחת לסף זה, דבר שמנע כימות של ריכוזי פלואוריד נמוכים ביותר. ייתכן שיהיה צורך להוסיף מסה או נפח מוגדל של דגימה לכלי הדיפוזיה, במידה והדבר אפשרי, או להשתמש בטכניקות אנליטיות חלופיות כאשר מודדים ריכוזי קורט הקרובים לגבול הגילוי או נמוכים ממנו. בנוסף, השיטה דורשת דיפוזיה לילה שלם וטיפול זהיר בריאגנטים קורוזיביים, מה שעשוי להגביל את תפוקת העבודה במחקרים בהיקף גדול. למרות ש-ISE מספק כימות רגיש של פלואוריד כולל, הוא אינו יכול להעריך את ההתפלגות המרחבית בתוך רקמות. ניתן לשלב גישות משלימות, כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת בשילוב עם ספקטרוסקופיית רנטגן עם פיזור אנרגיה (SEM-EDX) או פליטת קרני גמא בהשראת חלקיקים (PIGE), כדי להדמיות ולמיפוי של התפלגות הפלואוריד בקנה מידה מיקרוסקופי עד מאקרוסקופי. מודאליות מבוססות דימוי אלו מאפשרות הערכה של הצטברות פלואוריד מקומית ברקמות ממינרליות או רכות, ובכך הן משלימות את מדידות ה-ISE ומספקות הערכה מקיפה יותר של תכולת הפלואוריד ברקמה.

מספר גורמים טכניים חוזרים עשויים להשפיע על הדיוק והמהימנות של דיפוזיית הפלוריד ומדידתו בפרוטוקול זה, ותצפיותינו מדגישות כיצד הכנת הכיול, איטום צלח הדיפוזיה, בקרת pH, ביצועי האלקטרודה וטיפול בדגימות מעצבים יחד את איכות הנתונים. סיבות אפשריות לעקומת כיול לא ליניארית (R2 < 0.99) או לקריאות של דגימות רקמה מחוץ לטווח הצפוי כוללות חישובים שגויים של נפח תמיסת המקור של NaF שהוספה לצלח הדיפוזיה או שגיאות פיפטינג במהלך הכנת סטנדרטי הכיול. פעולה מומלצת: הכינו לפחות שתי סדרות עצמאיות של דגימות כיול עבור כל הרצה, כך שסט גיבוי יהיה זמין אם עקומת כיול אחת חורגת מהטווח הצפוי. איטום לא מלא של צלח הדיפוזיה עלול לגרום לאובדן פלוריד במהלך הדיפוזיה, מה שיוביל לקריאות נמוכות באופן מלאכותי. דבר זה קורה בדרך כלל כאשר מיושם פטרולטום בכמות לא מספיקה על שולי מכסה צלח הדיפוזיה. פעולה מומלצת: מרחו כמות נדיבה של ג'ל פטרולטום סביב שולי מכסה צלח הדיפוזיה ולחצו בחוזקה כדי להבטיח איטום מלא. שגיאות פיפטינג בעת הוספת תמיסת חומצה אצטית למלכודת ה-NaOH עלולות להסיט את pH הדגימה מחוץ לטווח האופטימלי של pH 5.0, מה שיוביל לשחזור פלוריד לא מדויק. פעולה מומלצת: בדקו את ה-pH של כל דגימה באמצעות נייר pH והשליכו כל דגימה שחורגת מ-pH 5. דגימות כיול עשויות לחוץ גם הן מחוץ לגבולות ההקלטה התקינים של האלקטרודה הסלקטיבית לפלוריד. ריכוזים נמוכים מ-0.02 ppm נמצאים מתחת לסף הגילוי של האלקטרודה. פעולה מומלצת: אין להשתמש בדגימות כיול המכילות פחות מ-0.02 ppm פלוריד. לעומת זאת, דגימות כיול עם ריכוזי פלוריד גבוהים מדי עלולות לשנות את העוצמה היונית של התמיסה ולהוביל לתגובות אלקטרודה לא ליניאריות. פעולה מומלצת: בתחילת הפרויקט, הכינו תמיסות כיול המכסות טווח רחב של ריכוזי פלוריד כדי לקבוע את טווח העבודה הליניארי של האלקטרודה הספציפית שבה נעשה שימוש. אם דגימות הרקמה חורגות מטווח ליניארי זה, הפחיתו את מסת הרקמה או הגדילו את נפח מלכודת ה-NaOH והתאימו את נפח החומצה האצטית בהתאם כדי לשמור על pH 5. קושי בהשגת עקומות כיול ליניאריות בטווח של 0.02–1 ppm: סיבה נפוצה היא התיישנות האלקטרודה. אלקטרודות סלקטיביות לפלוריד ישנות מאבדות רגישות בריכוזי פלוריד נמוכים מאוד. פעולה מומלצת: החליפו את האלקטרודה הסלקטיבית לפלוריד. קריאות פוטנציומטר לא יציבות (סחיפת אות או קפיצות) מתרחשות בדרך כלל כאשר פני החישה של האלקטרודה אינם טבולים במלואם בתמיסת הדגימה. פעולה מומלצת: הורידו את האלקטרודה כך שפני החישה יהיו מכוסים לחלוטין על ידי דגימת הנוזל.

באופן כללי, פרוטוקול זה מספק גישה חסונה המבוססת על כיול לכמימות של פלואוריד במטריצות ביולוגיות מגוונות, והוא מתאים למחקרים הבודקים חשיפה לפלואוריד, שיקונו ברקמות ותוצאות טוקסיקולוגיות במודלים של עכברים.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

תודות

המחקר המדווח בפרסום זה נתמך על ידי Japan Society for the Promotion of Science; מלגות מחקר בחוץ לארץ של JSPS מספר 202560528 (S.Y.), Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP); מספר 2024/07452-9 (J.S.T.), והמכון הלאומי למחקר דנטלי ופנים-גולגולתי של ה-National Institutes of Health; מספר R01DE027648 (M.S.) ומספר K02DE029531 (M.S.).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצה אצטית, גלציאליתSigma-AldrichSupelco, GR ACSAX0073-6
כורסי אלומינהAdvalue Technologyקוטר חיצוני 12 מ"מ × 25 מ"מ גובה, AL-6212AL-6212
מאזניים אנליטייםVWRVWR 124B2, d = 0.1 mg—
מערבל חרוצים (Bead Beater)מדד השוואהBeadBug 6—
מחט מזריקה בעלת קצה קההאמזוןמחט תעשייתית בעלת קצה קהה, 14 G × 0.5 אינץ׳X001TT8KX1
פחמן דו-חמצניAirGas——
Chemical Fume HoodMott Manufacturingמודל 7421040—
D(+)-סוכרוזThermo Scientific99.7% עבור ביוכימיה177142500
תמיסת מילוי לאלקטרודהThermo Scientificתמיססת מילוי Orion IonPlus900061
תמיסת אתנולKoptec140 Proof2401
מקפיא, −80 °CThermo Scientificסדרת Revco RDE—
כפפות עמידות לחוםFisher Scientificכפפות אוטוקלב לסכנה ביולוגית של Bel-Art ClaviesH13201
הקסאמתילדיסילוקסאן (HMDS)Fisher ScientificTCI H0091, >98%H0091
מימן פרא-חמצןVWRJ.T. Baker, 30%2204-01
אלקטרודה סלקטיבית ליוןThermo ScientificOrion Fluoride ISE, ערוץ כפול9609BNWP
מערבל מגנטיVWRמערבל 360—
שפתולה מיקרוסקופיתאמזוןשפכטול לגילוף שעווה מס' 7A, פלדת אל-חלד—
מיקרוצנטריפוגהEppendorf5427R5404000131
תנור מופל (Muffle Furnace)Thermo Scientificתנור מופל קטן לשולחן מעבדה של Thermolyne, נפח 1.3 ליטר, דגם FB1315MFB1315M
תנורBoekel ScientificBoekel RapidFISH240200
תמיסת פאראפורמלהיד ב-PBSThermo Scientific4% פאראפורמלהיד ב-PBSJ19943-K2
צלחת פטריVWR60 × 15 מ"מ, ללא טיפול25384-092
וזליןThermo Scientificוזלין, לבן, טהור417090010
נייר אינדיקטור pHFisher ScientificpH-Fix 4.5–10.092120.3
כלי פורצלןFisher Scientificכלי שריפה Fisherbrand, 5 מ"ל, גובה 20 מ"מ, צורה גבוההFB-965-B
פוטנציומטרThermo Scientificמד-pH/ISE מדגם Orion Dual Star2115102
מעמד טבעת עם תסמיךVWRמחזיק טבעת, 15 ס"מ470104-526
תזונת מכרסמיםBio-ServF1515, AIN-76A, ½ משקעיםF1515
ג'ק מספרייםאמזוןג'ק מספרי למעבדה—
משפך הפרדהFisher ScientificEisco, זכוכית בורוסיליקט, 2 ליטרS89285
נתרן כלורידFisher Scientificמאושר ACS, גבישיS271-1
נתריום פלורידFisher Scientificמאושר ACS, אבקהS299-100
נתרן הידרוקסידFisher Scientificכדוריות לבנותBP359-500
פיתורי פלדת אל-חלדFisher ScientificScientific Industries, 5 מ"מ, 100 יחידותSI-CS05
חומצה גופריתFisher Scientificבדרגת ACSA300-500
TISAB IIThermo Scientificתמיסת יישום Orion IonPlus940909
דסיקטור ואקוםFisher Scientificמייבש ואקום חסכוני במקום מבית Bel-Art, 10 אינץ'F42010-0000
מסנן ואקוםFisher Scientificמסנן Flow Bottle-Top, PES, 90 מ"מ, 0.2 µm597-4520
מנער משתנה (Variable Rocker)MidSciLabDoctor / Benchmark Scientific—

מקורות

  1. Podgorski J, Berg M. Global analysis and prediction of fluoride in groundwater. Nat Commun. 2022;13(1):4232. doi:10.1038/s41467-022-31940-x
  2. Iheozor-Ejiofor Z, Worthington HV, Walsh T, O'Malley L, Clarkson JE, Macey R, et al. Water fluoridation for the prevention of dental caries. Cochrane Database Syst Rev. 2015;2015(6):Cd010856. doi:10.1002/14651858.CD010856.pub2
  3. Manchanda S, Sardana D, Liu P, Lee GH, Li KY, Lo EC, et al. Topical fluoride to prevent early childhood caries: Systematic review with network meta-analysis. J Dent. 2022;116:103885. doi:10.1016/j.jdent.2021.103885
  4. Chan AKY, Tamrakar M, Jiang CM, Tsang YC, Leung KCM, Chu CH. Clinical evidence for professionally applied fluoride therapy to prevent and arrest dental caries in older adults: A systematic review. J Dent. 2022;125:104273. doi:10.1016/j.jdent.2022.104273
  5. Zamperini CA, Bedran-Russo AK. Immediate and Sustained Root Caries Prevention of Fluoride Varnish Combined with Toothpastes. Caries Res. 2023;57(5-6):592-601. doi:10.1159/000533279
  6. Melough MM, Sathyanarayana S, Zohoori FV, Gustafsson HC, Sullivan EL, Chi DL, et al. Impact of Fluoride on Associations between Free Sugars Intake and Dental Caries in US Children. JDR Clin Trans Res. 2023;8(3):215-23. doi:10.1177/23800844221093038
  7. Suzuki M, Everett ET, Whitford GM, Bartlett JD. 4-phenylbutyrate Mitigates Fluoride-Induced Cytotoxicity in ALC Cells. Front Physiol. 2017;8:302. doi:10.3389/fphys.2017.00302
  8. Suzuki M, Shin M, Simmer JP, Bartlett JD. Fluoride affects enamel protein content via TGF-beta1-mediated KLK4 inhibition. J Dent Res. 2014;93(10):1022-7. doi:10.1177/0022034514545629
  9. Everett ET, McHenry MA, Reynolds N, Eggertsson H, Sullivan J, Kantmann C, et al. Dental fluorosis: variability among different inbred mouse strains. J Dent Res. 2002;81(11):794-8.
  10. Kong H, He Z, Li H, Xing D, Lin J. The association between fluoride and bone mineral density in US children and adolescents: a pilot study. Nutrients. 2024. doi:10.3390/nu16172948
  11. Mazzoli R, Filippini T, Iamandii I, De Pasquale L, Veneri F, Birnbaum LS, et al. The association of fluoride exposure with bone density and fracture risk: a dose-response meta-analysis. Environ Health. 2025;24(1):73.
  12. Suzuki M, Bandoski C, Bartlett JD. Fluoride induces oxidative damage and SIRT1/autophagy through ROS-mediated JNK signaling. Free Radic Biol Med. 2015;89:369-78.
  13. Kubota K, Lee DH, Tsuchiya M, Young CS, Everett ET, Martinez-Mier EA, et al. Fluoride induces endoplasmic reticulum stress in ameloblasts responsible for dental enamel formation. J Biol Chem. 2005;280(24):23194-202. doi:10.1074/jbc.M503288200
  14. Yamashita S, Okamoto M, Mendonca M. Fluoride alters gene expression via histone H3K27 acetylation in ameloblast-like LS8 cells. Int J Mol Sci. 2024. doi:10.3390/ijms25179600
  15. Deng H, Fujiwara N, Cui H, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Histone acetyltransferase promotes fluoride toxicity in LS8 cells. Chemosphere. 2020;247:125825.
  16. Deng H, Ikeda A, Cui H, Bartlett JD, Suzuki M. MDM2-Mediated p21 Proteasomal Degradation Promotes Fluoride Toxicity in Ameloblasts. Cells. 2019;8(5). doi:10.3390/cells8050436
  17. Fujiwara N, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Curcumin suppresses cell growth and attenuates fluoride-mediated Caspase-3 activation in ameloblast-like LS8 cells. Environ Pollut. 2021;273:116495. doi:10.1016/j.envpol.2021.116495
  18. Suzuki M, Ikeda A, Bartlett JD. Sirt1 overexpression suppresses fluoride-induced p53 acetylation to alleviate fluoride toxicity in ameloblasts responsible for enamel formation. Arch Toxicol. 2018;92(3):1283-93. doi:10.1007/s00204-017-2135-2
  19. Regelson S, Dehghan M, Tantbirojn D, Almoazen H. Evaluation of fluoride levels in commercially available tea in the United States. 2020/12/23 ed2021 Jan-Feb. 17-20 p.
  20. Cantoral A, Luna-Villa LC, Mantilla-Rodriguez AA, Mercado A, Lippert F, Liu Y, et al. Fluoride Content in Foods and Beverages From Mexico City Markets and Supermarkets. Food Nutr Bull. 2019;40(4):514-31. doi:10.1177/0379572119858486
  21. Institute of Medicine SCotSEoDRI. Dietary Reference Intakes for Calcium, Phosphorus, Magnesium, Vitamin D, and Fluoride. Washington, DC: National Academy Press; 1997.
  22. Otal E.H. KML, Kimura M. Fluoride Detection and Quantification, an Overview from Traditional to Innovative Material-Based Methods. In: Wambu E.W. LGJ, Kiplagat A., editor. Fluoride. London: IntechOpen; 2022.
  23. Whitford GM. Absorption and Plasma Concentrations of Fluoride, 1996.
  24. Taves DR. Determination of submicromolar concentrations of fluoride in biological samples. Talanta. 1968;15(10):1015-23. doi:10.1016/0039-9140(68)80109-2
  25. Buzalaf MA, Caroselli EE, de Carvalho JG, de Oliveira RC, da Silva Cardoso VE, Whitford GM. Bone surface and whole bone as biomarkers for acute fluoride exposure. J Anal Toxicol. 2005;29(8):810-3.
  26. Zohoori FV, Maguire A, Martinez-Mier EA, Buzalaf MAR, Sanderson R, Eckert GJ. A Comparison of Simple Analytical Methods for Determination of Fluoride in Microlitre-Volume Plasma Samples. Caries Res. 2019;53(3):275-83. doi:10.1159/000492339
  27. Martínez-Mier EA, Cury JA, Heilman JR, Katz BP, Levy SM, Li Y, et al. Development of gold standard ion-selective electrode-based methods for fluoride analysis. Caries Res. 2011;45(1):3-12. doi:10.1159/000321657
  28. Boivin G, Chapuy MC, Baud CA, Meunier PJ. Fluoride content in human iliac bone: results in controls, patients with fluorosis, and osteoporotic patients treated with fluoride. J Bone Miner Res. 1988;3(5):497-502.
  29. Yamashita S, Okamoto M, Fujiwara N, Achong-Bowe R, Brueckner S, Mendonca M, et al. Developmental vulnerability to fluoride toxicity: enamel and clearance differences in adolescent versus mature mice. Arch Toxicol. 2025.
  30. Chiba K, Hisamatsu, S., Takizawa, Y, Katsura, K. Determination of fluoride in biological materials by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1982;245:8.
  31. Ikenishi K, Chiba, K., Hisamatsu, S, Takizawa, Y. Determination of fluoride in biological samples by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1988;437:8.
  32. Venkateswarlu P, Reddy, D.S., Reddy, T.S. Spectrophotometric determination of fluoride using the SPADNS method. Analyst 1971;96:5.
  33. Kakabadse G. KN, Davies C.W. The Spectrophotometric Determination of Fluoride with SPDNS-Zirkonium Lake. Analyst. 1971;96:8.
  34. Mendham J, Denney RC, Barnes JD, Thomas MJK. Vogel's Textbook of Quantitative Chemical Analysis. 6th ed. Harlow, England: Prentice Hall; 2000.
  35. Kučera J, Štefánik, M. & Veselka, P. Fluorine determination in biological and environmental samples with INAA using fast neutrons from a p(19 MeV)+Be neutron generator. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry 2019;322:7.
  36. Okamoto M, Yamashita S, Memida T, Mendonca M, Brueckner S, Nakamura S, et al. Microhardness Measurements on Tooth and Alveolar Bone in Rodent Oral Disease Models. J Vis Exp. 2024(206). doi:10.3791/66583
  37. Okamoto M, Yamashita S, Mendonca M, Brueckner S, Achong-Bowe R, Thompson J, et al. Ultrastructural evaluation of adverse effects on dentine formation from systemic fluoride application in an experimental mouse model. Int Endod J. 2025;58(1):128-40.
  38. Frant MS, Ross JW, Jr. Electrode for sensing fluoride ion activity in solution. Science. 1966;154(3756):1553-5.
  39. Umezawa Y, Umezawa, K and Sato, H. Selectivity coefficients for ion-selective electrodes: recommended methods for reporting KRB values, 1995.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

כימות פלורידדיפוזיית HMDSפלוריד בסרוםפלוריד בעצםפלוריד בשןדגימות ביולוגיותעקומת סטנדרטשקיעה ברקמות

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.