מאמר שיטה

עריכת גנום באמצעות CRISPR-Cas9 ב- Mesorhizobium ciceri דרך שיבוש של nodC למחקרי סימביוזה בחומוס

0 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71513

⸱

25 בספטמבר 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Root Nodule Symbiosis Laboratory, National Institute of Plant Genome Research, 2Microbial Engineering Laboratory, International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיבוש של לוקוס nodC ב-Mesorhizobium ciceri באמצעות CRISPR-Cas9, תוך שימוש בתיקון מודרך על ידי הומולוגיה (HDR) וסריקה מבוססת GFP, כדי ליצור מוטנטים פגומים בסימביוזה למחקרי גנומיקה פונקציונלית בריזוביה הקשור לחומוס.

תקציר

Mesorhizobium ciceri, סימביונט מקבע חנקן של חומוס (Cicer arietinum), נותר מאתגר מבחינה גנטית למניפולציה באמצעות גישות קונבנציונליות של רקומבינציה הומולוגית, שהן עתירות עבודה ולעתים קרובות משאירות סממני ברירה לא רצויים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים אסטרטגיה יעילה לעריכה גנומית באמצעות מערכת Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) בעלת טווח מאוכלים רחב, שהותאמה עבור M. ciceri. אנו מדגימים את יעילותה של שיטה זו על ידי תקיפת nodC, המקודד ל-N-acetylglucosaminyltransferase הדרוש לסנתזה של שלד הקיטין ב-Nod factors, מולקולות האיתות העיקריות המעורבות בתקשורת מולקולרית סימביוטית. פרוטוקול זה מפרט את התכנון השיטתי של RNA מנחה בודד (sgRNAs) ואת בניית תבנית לתיקון מכוון הומולוגיה (HDR). תבנית ה-HDR תוכננה כדי להקל על אינטגרציה ספציפית לאתר של רפורטר חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המקיף את אתר החיתוך של nodC. לאחר העברת מבנה ה-Cas9/sgRNA/HDR באמצעות הזיווג ביו-הורי (biparental mating), זוהו מוטנטים פוטנציאליים באמצעות גישת סריקה מבוססת פלואורסצנציה. שיבוש מוצלח של לוקוס nodC בגודל 1.3 kb בתוך קסטת הנודולציה (nod) נסרק תחילה על ידי ויזואליזציה של ביטוי GFP במושבות מוטנטיות באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה. השיבוש תוקף עוד יותר על ידי עיכול רסצטרי, הגברה של הקסט המשולבת מ-DNA גנומי, וריצוף סנגר. ביטוי GFP נמדד בנוסף באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית עם שעתוק הפוך (RT-qPCR). כדי לתקף את ההשפעה הפונקציונלית של המוטציה, בוצעו בדיקות הדבקה של חומוס, שהדגימו פגיעה בנודולציה בצמחים שהוחדרו עם ΔnodC M. ciceri בהשוואה לזן הפרא. באופן כללי, פרוטוקול זה מספק מסגרת יעילה וניתנת לשחזור לשיבוש גנים מדויק ומחקרי גנומיקה פונקציונלית ב-Mesorhizobium.

מבוא

מערכת הנוקלאז Cas9 (חלבון 9 המשויך לרצפים קצרים פלינדרומיים מרוחקים ומקבצים - CRISPR), שזוהתה במקור כמנגנון חיסון אדפטיבי בפרוקריוטיים, הותאמה לכלי יעיל ואמין לעריכת גנום1,2. המערכת משתמשת ב-RNA מנחה סינתטי (sgRNA) כדי לזהות רצפי DNA מטרה באמצעות צימוד בסיסים של ווטסון-קריק. ה-sgRNA כולל 20 נוקלאוטידים המשלימים לאזור הגנומי הסמוך לרצף ה-PAM (protospacer adjacent motif) מסוג NGG. Cas9 יוצר שבר דו-גדילי (DSB) באתר ספציפי בתוך רצף המטרה, בדרך כלל 3 זוגות בסיסים (bp) במעלה הזרם מאתר ה-PAM1. ניתן לתקן את ה-DSBs הנוצרים על ידי חיבור קצוות לא-הומולוגי או על ידי תיקון מכוון הומולוגיה (HDR) באמצעות תבנית תורמת3,4. אסטרטגיה זו יושמה באופן נרחב לגישות של שיבוש גנים, knock-in ו-knock-out בחיידקים5,6,7,8. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לפתח שיטה יעילה לעריכת גנום עבור Mesorhizobium ciceri באמצעות מערכת CRISPR-Cas9 בעלת טווח מאכסנים רחב.

M. ciceri הוא חיידק קרקע גרם-שלילי המשמש כאנדוסימביונט חיוני לקיבוע חנקן של חומוס (Cicer arietinum)9. זן אחד, M. ciceri CC1192, מראה יעילות גבוהה ביצירת קשרי שורשים (nodulation), וגנומו רצף10. למרות חשיבותו החקלאית, מניפולציה גנטית של מיני Mesorhizobium נותרה מוגבלת. מערכות מבוססות CRISPR הוטמעו בעבר בריזוביה אחרים, כולל הפרעה מבוססת CRISPR‏ (CRISPRi) ב- Rhizobium etli11, עריכה גנומית ב- Sinorhizobium meliloti12, ועריכת בסיסים ב- S. meliloti13. עם זאת, לא דווח על פלטפורמה חסונה לעריכה גנומית עבור M. ciceri. גישות קונבנציונליות מסתמכות על רקומבינציה הומולוגית בתיווך פלסמיד-התאבדות, תהליך עתיר עבודה, הדורש סבבים מרובים של סלקציה, ולעיתים קרובות מותיר סממני עמידות לאנטיביוטיקה כצלקות גנומיות14.

כדי להתגבר על מגבלות אלו, מערכת הווקטור pCasPP, שפותחה במקור עבור Paenibacillus polymyxa, הותאמה לשימוש ב-M. ciceri15. תשתית ה-pCasPP משתמשת ב-Cas9 מ-Streptococcus pyogenes שעבר אופטימיזציית קודונים עבור אקטינומיצטים בעלי תכולת GC גבוהה, ומכילה קסטת lacZ לסריקת כחול-לבן של שיבוט sgRNA תחת מקדם gapdh קונסטיטוטיבי8. הצמדה דו-הורית (Biparental mating) בוצעה בין זן התורם Escherichia coli לבין זן המקבל Mesorhizobium כדי להעביר את ווקטור העריכה16. כדי לשפר את יעילות הסריקה, גרסת החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) מסוג bjGFP, שעברה במקור אופטימיזציית קודונים עבור Bradyrhizobium diazoefficiens, שולבה בתבנית התורם של ה-HDR16. אסטרטגיית סריקה זו, המבוססת על פלואורסצנציה, יושמה כדי להתמקד בלוכוס nodC החיוני, הדרוש לשלבים המוקדמים של האיתות הסימביוטי בין החיידק לחומוס17,18.

פרוטוקול זה מספק חלופה מדויקת ויעילה לגישות של מוטגנזה כימית אקראית או בקרינה על-סגולה (UV). בניסויי תיקוף, למעלה מ-80% מהמושבות שהופקו הראו פלואורסצנציית GFP, ומושבות ערוכות מייצגות אושרו בהמשך באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR) וריצוף סנגר. מוטנטי ה-ΔnodC M. ciceri שהתקבלו מהווים משאב שימושי לחקר סיגנלינג סימביוטי ואינטראקציות בין מאחס למיקרוב. באופן כללי, מסגרת זו מציעה לקהילת חוקרי הריזוביום גישה יעילה וניתנת להרחבה למחקרי גנומיקה פונקציונלית ב-Mesorhizobium.

פרוטוקול

כל הפרוטוקולים הניסויים הכוללים גידול צמחים, הדבקה מיקרוביאלית וטיפול בחיידקים שעברו שינוי גנטי בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות המוסדיות. גידול הצמחים וההדבקות החיידקיות בוצעו בתנאים מבוקרים של תא גידול. זן ה-M. ciceri ששימש במחקר זה מסווג כמיקרואורגניזם ברמת בטיחות ביולוגית 1 (BSL-1). מכיוון שכל הניסויים בוצעו בתנאי מעבדה סגורים ללא שחרור לשטח, אישור בטיחות ביולוגית מוסדי רשמי לא היה נדרש, בהתאם למדיניות הבטיחות הביולוגית המוסדית. כל הפסולת הביולוגית שנוצרה במהלך המחקר עברה עיקור באוטוקלאב לפני השלכתה.

1. הכנת תאים כשירים

תאי E. coli DH5α ותאי E. coli S17-1λpir בעלי כשירות כימית הוכנו ותוקפו בהתאם לנוהל המתואר ב-קובץ משלים 1.

2. תכנון ה-Guide RNA

  1. תכנון של Guide RNAs
    1. פתחו את פלטפורמת Benchling (https://benchling.com/). התחברו לחשבון Benchling קיים או צרו חשבון חדש.
    2. צרו פרויקט חדש ופתחו את כלי תכנון ה-CRISPR Guide.
    3. העלו או הדביקו את רצף ה-DNA המטרה המלא עבור תכנון ה-guide RNA. בחרו באפשרות התכנון “Single Guide” והגדירו את אורך ה-guide ל-20 bp.
    4. בחרו את רפרנס הגנום מתוך האפשרויות הזמינות. עבור תכנון guide RNA המכוון ל-M. ciceri, בחרו ב-Bradyrhizobium diazoefficiens USDA 110 כגנום הרפרנס. השתמשו ב-NGG כרצף ה-protospacer adjacent motif (PAM) הנדרש לפעילות של Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9).
    5. השתמשו באלגוריתם של Hsu et al.19 כדי לחשב תדרי חיתוך חזויים מחוץ למטרה (off-target). שמרו על סף ציון של ≥50 כדי למזער חיתוך לא ספציפי על רקע גנום הרפרנס.
    6. השתמשו באלגוריתם Doench-Root20 כדי לחשב ציוני יעילות חזויים במטרה (on-target). הגדירו סף בחירת מטרה של ≥60 כדי לזהות guides עם יעילות חיתוך Cas9 חזויה נוחה בלוכס המטרה.
    7. לחצו על “Finish” כדי להפיק את רשימת ה-guide RNAs המועמדות.
  2. בחירת Guide RNAs
    1. פתחו את פאנל הפלט של ה-guide RNA.
    2. תנו עדיפות ל-sgRNAs מועמדות שחזוי שייצרו שבר בדו-גדיל (double-strand break) בטווח של 100 bp מקודון ההתחלה התרגומי (ATG), ובכך להגדיל את הסבירות להפקת חלבון שאינו תפקודי.
    3. העריכו את ציוני ה-off-target וה-on-target. תנו עדיפות לציון off-target גבוה יותר על פני ציון on-target גבוה מעט יותר, כדי להפחית את הסיכון לחיתוך לא מכוון מחוץ למטרה.
    4. בחרו guide RNAs בודדות (sgRNAs) מועמדות אחת או שתיים העומדות בכל קריטריוני הבחירה.
  3. הכנת אוליגונוקלאוטידי gRNA
    1. הפיקו את רצף המשלי ההפוך (reverse-complement) של ה-guide RNA שנבחר.
    2. הוסיפו את הרצף 5′-ACGC לקצה ה-5′ של ה-guide RNA והוסיפו את הרצף 5′-AAAC לקצה ה-5′ של הגדיל המשלי ההפוך.
    3. הזמינו את שני האוליגונוקלאוטידים עם פוספורילציה ב-5′ וטיהור PAGE בקנה מידה סינתזה של 25 nmol.
  4. התחבּרות (Annealing) של אוליגונוקלאוטידי gRNA
    1. הכינו באפר HEPES 30 mM על ידי המסה של 7.15 g HEPES free acid בערך 800 mL מים מזוקקים. התאימו את ה-pH ל-7.8 באמצעות נתרן הידרוקסיד והביאו את הנפח הסופי ל-1 L.
    2. המיסו מחדש כל אוליגונוקלאוטיד מפוספורל במים נקיים מנוקלאז (nuclease-free water) לריכוז סופי של 100 µM. ערבבו 5 µL מכל אוליגונוקלאוטיד עם 90 µL באפר HEPES 30 mM במבחנה מיקרו-צנטריפוגית סטרילית.
    3. בצעו וורטקס קצר וצנטריפוגה כדי לאסוף את הנוזל. בצעו התחבּרות לאוליגונוקלאוטידים בטרמוסייקלר על ידי אינקובציה ב-95°C למשך 5 min וקירור ל-4°C בקצב ירידה של 0.1°C/s.
    4. דללו את האוליגונוקלאוטידים המחוברים פי 10 באמצעות מים נקיים מנוקלאז.
  5. הרכבת gRNA לתוך וקטור pCasPP
    1. השיגו את וקטור pCasPP שתואר בעבר על ידי Rütering et al.15.
    2. רצף הפלסמיד סופק על ידי Jochen Schmid, והבנאי (construct) ששימש במחקר זה הושג באמצעות ד"ר Syed Shams Yazdani (ICGEB).  
    3. הרכיבו תגובת Golden Gate המכילה 100 ng וקטור pCasPP, 0.3 µL אינסרט של אוליגונוקלאוטיד מחובר, 2 µL באפר T4 DNA ligase 10×, 1 µL T4 DNA ligase, 1 µL אנזים הגבלה BbsI, ומים נקיים מנוקלאז לנפח סופי של 20 µL.
    4. הכינו תגובת ביקורת שלילית על ידי החלפת האינסרט במים נקיים מנוקלאז.
    5. ערבבו את התגובות בעדינות ובצעו צנטריפוגה קצרה.
  6. תנאי מחזורי הרכבת Golden Gate
    1. הכניסו את מבחנות התגובה לטרמוסייקלר. בצעו תשעה מחזורים המורכבים מ-37°C למשך 10 min ולאחר מכן 16°C למשך 10 min.
    2. דגרו את התגובות ב-50°C למשך 5 min ואז ב-65°C למשך 20 min. שמרו את התגובות ב-4°C עד לשימוש.
  7. טרנספורמציה של תגובות ההרכבה
    1. המיסו 50 µL תאי Escherichia coli DH5α קומפטנטיים על קרח למשך 10–15 min.
    2. הוסיפו 3 µL מכל תגובת הרכבת Golden Gate לתאים הקומפטנטיים. עבדו את תגובת הביקורת השלילית במקביל. דגרו את התערובות על קרח למשך 30 min.
    3. בצעו הלם חום לתאים ב-42°C למשך 45 s והחזירו מיד את המבחנות לקרח למשך 2 min. הוסיפו 950 µL מתווך Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC).
    4. הכינו מתווך SOC המכיל 0.5% תמצית שמרים, 2% טריפטון, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄, ו-20 mM גלוקוז. סטריליזו את המתווך בסינון באמצעות מסנן מזרק של 0.4 µm בתנאים אספטיים.
    5. דגרו את התרביות ב-37°C וב-180 rpm למשך 1 h.
  8. בחירת טרנספורמנטים חיוביים
    1. הכינו צלחות LB agar בתוספת 50 µg/mL נאומיצין, 0.2 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), ו-32 mg/L 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal). פזרו 100 µL מתרבית ההתאוששות על הצלחות הבחירה. דגרו את הצלחות ב-37°C למשך 12–16 h.
    2. בחרו מושבות לבנות והשליכו מושבות כחולות. ודאו שצלחת הביקורת השלילית מכילה פחות מחמש מושבות.
  9. סריקה והתרחבות של קלונים חיוביים
    1. העבירו שלוש עד ארבע מושבות לבנות עצמאיות לצלחות LB agar סלקטיביות טריות.
    2. דגרו את הצלחות ב-37°C למשך 12–16 h. זרעו מושבות בודדות לתוך 10 mL מתווך LB בתוספת 50 µg/mL נאומיצין.
    3. עבדו כל בנאי (construct) של guide RNA באופן עצמאי לאורך זרימת העבודה הבאה.
  10. תיקוף של בנאי pCasPP-gRNA
    1. אספו את התרביות הבקטריאליות על ידי צנטריפוגה. בודדו DNA פלסמידי באמצעות ערכה לטיהור פלסמיד בעמודי סיליקה.
    2. בצעו עיכול של ה-DNA הפלסמידי המבודד עם XbaI ו-EcoRI בבאפר התגובה המתאים למשך 1 h ב-37°C.
    3. הפרידו את תוצרי העיכול על ג'ל אגרוז 1% שהוכן בבאפר 1× Tris-acetate-EDTA (TAE) המכיל אתידיום ברומיד בריכוז סופי של 0.5 µg/mL.
    4. הריצו את הג'ל ב-90–110 V עד שחזית הצבע נדחפת על פני כ-70–80% מאורך הג'ל. הדמינו את מקטעי ה-DNA באמצעות טרנס-אילומינטור UV.
    5. אשרו קלונים חיוביים על ידי זיהוי מקטע של 1,280 bp, וזהו ביקורות של וקטור ריק על ידי זיהוי מקטע של 1,630 bp. וקטור pCasPP ריק הוא באורך של כ-9,663 bp ומכיל גן lacZ; הכנסת אוליגונוקלאוטיד gRNA באורך 24 bp מסירה את מקטע ה-lacZ, ויוצרת בנאי pCasPP קטן יותר המכיל gRNA. אתרי ההגבלה XbaI ו-EcoRI המקיפים את אזור ה-lacZ משמשים לאישור דיאגנוסטי של שיבוץ ה-gRNA.
  11. הכנת מאגרי גליצרול
    1. גדלו קלון חיובי מאושר במתווך LB סלקטיבי.
    2. הכינו מאגר גליצרול על ידי ערבוב של 700 µL תרבית בשלב ה-log עם 300 µL גליצרול 50% סטרילי. העבירו את התערובת למבחנות קריו סטריליות. שמרו את מאגרי הגליצרול ב-−80°C.
      הערה: הימנעו ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים. הכינו מספר מנות (aliquots) כדי לשמור על יציבות הפלסמיד ועל חיות הבקטריה. תגובת הרכבת Golden Gate שהושלמה ניתנת לאחסון ב-4°C למשך לילה או ב-−20°C למשך 1–2 שבועות לפני הטרנספורמציה.

3. הרכבת תבנית לתיקון מכוון הומולוגיה

  1. הכנת מקטע ה-insert של החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP)
    1. השג את הפלסמיד pRJPaph-bjGFP המכיל את קסטת הדיווח הפלואורסצנטית16 (Table 1)10,15,16,21,22,23. הפלסמיד סופק על ידי פרופ' Hans-Martin Fischer (ETH Zurich, שוויץ) וזמין דרך Addgene (Plasmid #67032).
    2. גזור את קסטת ה-gfp מתוך pRJPaph-bjGFP באמצעות עיכול רסטריקציה עם SacI ו-KpnI כפי שמתואר ב-Supplementary File 2 (שלב 3.1). רצף ה-gfp ב-pRJPaph-bjGFP הוא גן bjGFP סינתטי שעבר אופטימיזציית קודונים עבור Bradyrhizobium diazoefficiens.
    3. טהר את מקטע ה-gfp הצפוי בגודל 1081 bp.
  2. בניית pUC18-gfp
    1. השג את שלד ה-pUC18 (Addgene plasmid #50004)21.
    2. בצע לינאריזציה ל-pUC18 באמצעות SacI ו-KpnI כפי שמתואר ב-Supplementary File 2 (שלב 3.2).
    3. בצע ליגציה של מקטע ה-gfp המטוהל לתוך וקטור pUC18 הלינארי כפי שמתואר ב-Supplementary File 2 (שלב 3.2).
    4. בצע טרנספורמציה לתאי E. coli DH5α קומפטנטים באמצעות הליך הטרנספורמציה המתואר בשלב 2.7, כאשר תערבב את תערובת הליגציה שהופקה בשלב 3.2.3 במקום תגובת ה-Golden Gate assembly.
    5. בחר טרנספורמנטים חיוביים ואמת את הכנסת ה-gfp באמצעות PCR של מושבות (colony PCR) כפי שמתואר ב-Supplementary File 2 (שלב 3.2).
  3. הגברה של זרועות הומולוגיה
    1. תכנן פריימרים להגברת זרועות הומולוגיה עליונות (UHA) ותחתונות (DHA) באורך של כ-400–500 bp מ-DNA גנומי של M. ciceri (Table 2).
    2. שלב אתרי רסטריקציה של SacI/EcoRI בפריימרים של ה-UHA ואתרי רסטריקציה של XbaI/KpnI בפריימרים של ה-DHA. השתמש בפריימרים F_nodC_Up_EcoRI ו-R_nodC_Up_SacI להגברת ה-UHA, ובפריימרים F_nodCdown_KpnI ו-R_nodCdown_XbaI להגברת ה-DHA (Table 2).
    3. בודד DNA גנומי של M. ciceri בהתאם ל-Weerakkody et al.25.
    4. הגבר וטהר את מקטעי ה-UHA וה-DHA כפי שמתואר ב-Supplementary File 2 (שלב 3.3).
  4. בניית pUC18-UHA-gfp
    1. שבט את מקטע ה-UHA לתוך pUC18-gfp באמצעות EcoRI ו-SacI כפי שמתואר ב-Supplementary File 2 (שלב 3.4).
    2. אשר את הרכבת הפלסמיד הנכונה באמצעות עיכול רסטריקציה עם XbaI ו-KpnI. הרכבה מוצלחת אמורה להניב מקטעים של כ-500 ו-3725 bp.
    3. המשך עם שיבוט אחד מאומת.
  5. בניית pUC18-UHA-gfp-DHA
    1. שבט את מקטע ה-DHA לתוך pUC18-UHA-gfp באמצעות KpnI ו-XbaI כפי שמתואר ב-Supplementary File 2 (שלב 3.5).
    2. אשר את ההרכבה הנכונה באמצעות עיכול רסטריקציה עם SacI ו-EcoRI. הרכבה מוצלחת אמורה להניב מקטעים של כ-400 ו-4271 bp.
    3. אמת 5–6 שיבוטי מועמדים באמצעות ריצוף סנגר (Sanger sequencing) בעזרת הפריימרים F_nodC_Up_EcoRI, BjGFP_BP_F1 ו-R_nodCdown_XbaI (Table 2), אשר יחד מכסים את מרבית רצף קסטת ה-Homology-Directed Repair (HDR).
  6. הגברה וטיהור של תבנית ה-HDR הסופית
    1. הגבר את קסטת ה-HDR המלאה באמצעות הפריימרים F_FL_nodCgfp_XbaI ו-R_nodCdown_XbaI (Table 2).
    2. טהר את מקטע ה-HDR הצפוי בגודל 2012 bp ובצע עיכול של תוצר ה-PCR המטוהל עם XbaI כפי שמתואר ב-Supplementary File 2 (שלב 3.6).
  7. הכנת וקטורי pCasPP-gRNA
    1. השג את הפלסמידים pCasPP-gRNA1 ו-pCasPP-gRNA2 שהופקו בשלב 2.
    2. בצע לינאריזציה לפלסמידים עם XbaI ובצע דה-פוספורילציה לשלד הווקטור כפי שמתואר ב-Supplementary File 2 (שלב 3.7).
  8. שיבוט של תבנית ה-HDR לתוך וקטורי pCasPP-gRNA
    1. בצע ליגציה של קסטת ה-HDR לתוך pCasPP-gRNA1 או pCasPP-gRNA2 שעברו לינאריזציה עם XbaI, כפי שמתואר ב-Supplementary File 2 (שלב 3.8).
    2. בצע טרנספורמציה לתאי E. coli DH5α קומפטנטים ובחר טרנספורמנטים על מצע LB agar המכיל 50 µg/mL נאומיצין.
  9. סריקה של שיבוטים המכילים HDR
    1. סרוק את הטרנספורמנטים לזיהוי פלואורסצנציית GFP באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי המצויד בסט פילטרים סטנדרטי ל-GFP (עירור 470–488 nm; פליטה 507–510 nm).
    2. סווג מושבות כ-GFP-חיוביות על סמך נוכחות של פלואורסצנציה ירוקה אחידה ובולטת העולה בבירור מהאוטופלואורסצנציה החלשה הנצפית במושבות ביקורת שליליות שלא נערכו.
    3. הרחב שיבוטים GFP-חיוביים ובודד DNA פלסמידי.
  10. תיקוף של הרכבת וקטור ה-HDR
    1. אשר את הכנסת ה-HDR באמצעות עיכול רסטריקציה עם XbaI.
    2. אמת את ההרכבה המוצלחת על ידי שחרור של מקטע ה-HDR הצפוי בגודל 2012 bp יחד עם שלד וקטור pCasPP-gRNA בגודל של כ-9,300 bp.
      הערה: לאחר אינאקטיבציה תרמית של אנזימי הרסטריקציה והפוספטאז, ניתן לשמור את תערובות התגובה ב-4°C למשך לילה או ב-−20°C למשך עד חודש אחד. שמור מבני פלסמיד מאומתים ב-−20°C לשימור לטווח ארוך.
זן או פלסמידתיאורספרות מקור
Mesorhizobium ciceri CC1192זן המקבל ששימש לעריכת גנום באמצעות CRISPR-Cas9 ולבדיקות של יצירת קשרי שורשים בחומוס.Haskett et al10
pCasPPוקטור לעריכת גנום באמצעות CRISPR-Cas9 המשמש לשיבוט RNA מדריך ולהעברת תבנית HDR.Rütering et al15
pRJPaph-bjGFPפלסמיד דגלי GFP המשמש כמקור לקסטת ה-GFP
(פלסמיד Addgene מס' 67032)		לדרמן ואח'.16
pUC18וקטור שיבוט כללי המשמש להרכבת תבנית HDR
(פלסמיד Addgene מס' 50004)		.Norrander et al21
Escherichia coli S17-1λפיר (PIR)זן תורם המשמש לקונגוגציה דו-הוריתסימון ושות'22
Escherichia coli DH5αמארח שיבוט המשמש להפצת פלסמידיםהנאהן ואח'.23

טבלה 1: זנים חיידקיים ופלסמידים ששימשו במחקר זה. טבלה זו מפרטת את הזנים החיידקיים והפלסמידים ששימשו להרבאת פלסמידים, עריכה גנומית באמצעות CRISPR-Cas9, הרכבת תבנית לתיקון מכוון בהומולוגיה (HDR), הזיווג הבי-הורי וסימון פלואורסצנטי של Mesorhizobium ciceri CC1192.

קטגוריהשםרצף (5′ figure-protocol-1 3′) או תיאור
זן חיידקיEscherichia coli DH5αזן מאחס לשיבוט
זן חיידקיEscherichia coli S17-1λפיר (PIR)זן תורם להכלאה דו-הורית
וקטור שיבוטpUC18וקטור שלד לשיבוט
וקטור CRISPRpCasPPוקטור CRISPR-Cas9 בעל טווח מאבחים רחב
פלסמיד רפורטרpRJPaph-bjGFPפלסמיד דגיש GFP
פריימרF_guide1_BbsIpACGCTGTTTACAGAGGCATGCAAG
פריימרמדריך_R1_BbsIpAAACCTTGCATGCCTCTGTAAACA
פריימרF_guide2_BbsIpACGCGCTTGTTCGGATCCGACCGT
פריימרמדריך_R2_BbsIpAAACACGGTCGGATCCGAACAAGC
פריימרF_nodC_Up_EcoRIAAAGAATTCCTCATTGCAAGCCAGCAGT
פריימרR_nodC_Up_SacIAAAGAGCTCCGGAAAGCTTGTTTCGGATCC
פריימרF_nodCdown_KpnIAAAGGTACCTCGAGAGCACCGCATAAGAC
פריימרR_nodCdown_XbaIAATTCTAGATGGTTCGGTACTTTCGTGCA
פריימרF_FL_nodCgfp_XbaIAAATTCTAGACTCATTGCAAGCCAGCCAGT
פריימרBjGFP_BP_F1GAAGTTCATCTGCACCACCG
פריימרBjGFP_BP_R1GTCCTTGAACGAGATGGTGC
פריימרBjGFP_BP_F2CCAACTTCAAGATCCGCCAC
פריימרGFP_RCCAACTTCAAGATCCGCCAC
פריימרBjGFP_BP_R2CTTGTACAGCTCGTCCATGC
פריימר16S_F1ATCCTGGCTCAGAACGAACG
פריימר16S_R1ATTCCCACGCGTTACTCACC
פריימר16S_F2AGTCCGAGAGGGTGAGTGG
פריימר16S_R2GTCAGTACCGAGCCAGTGAG
פריימרF1_nodCCGATTTCCAGAACCGTCGTC
פריימרnodC_RCGATTTCCAGAACCGTCGTC
פריימרR1_nodCTCCCCTGCTACAATGAGGAC
פריימרF2_nodCAGTGACTCCGCAATTCCAGA
פריימרR2_nodCTGTCGGTAAAAGTGTTTCCC
פריימרF1_nodBTGGTTCGGTACTTTCGTGCA
פריימרR1_nodBAGTCGCGTGGATCAATGGAC
פריימרF1_nodATGATCGTCGCTGAATTGGGC
פריימרR1_nodACAACTGATGGAGCACTGGGT
פריימרF1_nodDTGGCCTTAAGAGACGTGTCG
פריימרR1_nodDAAATGCCTGACCAGCCGTAA

טבלה 2: זנים חיידקיים, פלסמידים ופריימרים של אוליגונוקלאוטידים ששימשו במחקר זה.טבלה זו מפרטת את הזנים החיידקיים, הפלסמידים ופריימרים של אוליגונוקלאוטידים ששימשו לבניית RNA מנחה יחיד (sgRNA), הרכבת תבנית לתיקון מכוון להומולוגיה (HDR), תגובת שרשרת פולימראז (PCR) לאבחון, ריצוף סנגר (Sanger sequencing) ותגובת שרשרת פולימראז כמותית עם שעתוק הפוך (RT-qPCR). רצפי הפריימרים מוצגים בכיוון 5′ figure-protocol-2 3′. הערה: BjGFP_BP_F2 ו-GFP_R מתייחסים לאותו רצף אוליגונוקלאוטידי, אך הם מופיעים תחת שמות פריימר שונים כיוון ששימשו בבדיקות ניסוייות שונות.

4. הזווגה דו-הורית להעברת פלסמיד לתוך M. ciceri CC1192

  1. טרנספורמציה של תאי תורכן E. coli
    1. בצע טרנספורמציה לתאי E. coli S17-1λpir עם מבני pCasPP-gRNA1-HDR או pCasPP-gRNA2-HDR בהתאם לנוהל המתואר ב-Supplementary File 3 (שלב 4.1).
    2. בצע ברירה של הטרנספורמנטים על מצע LB agar המכיל 50 µg/mL neomycin.
    3. סרוק את הטרנספורמנטים לזיהוי פלואורסצנציית GFP באמצעות עירור באורך גל של כ-488 nm וגילוי פליטה באורך גל של כ-510–520 nm.
    4. סווג מושבות כ-GFP-חיוביות אם הן מראות פלואורסצנציה ירוקה אחידה ובולטת שאינה קיימת במושבות ביקורת של E. coli S17-1λpir לא-טרנספורמיות, כאשר הן נבחנות תחת הגדרות מיקרוסקופ זהות.
    5. הכן מstocks גליצרין משיבוטי תורכן מאושרים מסוג GFP-חיובי.
  2. הכנת תרביות זריעה (Seed) ותרביות התחלה (Starter)
    1. הכן תרביות התחלה של תורכן E. coli S17-1λpir ומקבל M. ciceri בהתאם ל-Supplementary File 3 (שלב 4.2).
    2. גדל את תרביות ההתחלה עד ל-OD₆₀₀ של 0.3–0.4, המתאימה לצפיפות תאים מוערכת של כ-1 × 108 CFU/mL.
  3. הכנת תרביות משנה להזדווגות דו-הורית (Biparental Mating)
    1. הכן תרביות משנה של התורכן והמקבל וגדל אותן עד לשלב הצמיחה האקספוננציאלית הנדרש בהתאם ל-Supplementary File 3 (שלב 4.3).
    2. מדוד את הצפיפות האופטית ב-600 nm (OD600) באמצעות ספקטרופוטומטר UV–visible בהתאם לנוהל מדידת הצפיפות האופטית המתואר ב-Supplementary File 1 (שלב 1.2.3).
  4. נוהל הזדווגות דו-הורית
    1. בצע הזדווגות דו-הורית באמצעות מסנן ממברנה בהתאם ל-Supplementary File 3 (שלב 4.4).
    2. טפטף ארבעה מנות (aliquots) של תגסוס ההזדווגות על מסנן ממברנת polyvinylidene fluoride (PVDF) סטרילית בנקבוביות של 0.22 µm (קוטר 47 mm), תוך הבטחת מרווח מספיק בין הנקודות למניעת ערבוב.
  5. החלמה וברירה של טרנסקונג'וגנטים (Transconjugants)
    1. בצע החלמה של הטרנסקונג'וגנטים וברירה באמצעות אנטיביוטיקה כפולה בהתאם ל-Supplementary File 3 (שלב 4.5).
    2. בצע מעברים חוזרים של הטרנסקונג'וגנטים על מצע המכיל carbenicillin בלבד כדי להסיר פלסמידים ששרידו.
    3. אשר את הסרת הפלסמיד (plasmid curing) על ידי אי-צמיחה של המושבות על מצע המכיל neomycin ועל ידי PCR דיאגנוסטי המדגים את היעדרו של שלד ה-pCasPP תוך שימור קסטת ה-HDR המשולבת בכרומוזום.
      הערה: נדרשים מעברים רצופים כדי לוודא את יציבות המודיפיקציה המשולבת ולהסיר פלסמידים אפיזומליים ששרידו.
  6. סריקת מושבות GFP-חיוביות
    1. סרוק טרנסקונג'וגנטים מטוהרים לפלואורסצנציית GFP והשווה אותם לביקורות של M. ciceri מסוג wild-type בהתאם ל-Supplementary File 3 (שלב 4.6).
    2. בחר מושבות פלואורסצנטיות כזנים פוטנציאליים מסוג HDR-חיובי.
    3. סווג מושבות כ-GFP-חיוביות אם הן מראות פלואורסצנציה ירוקה אחידה ובולטת שאינה קיימת במושבות M. ciceri wild-type תחת הגדרות מיקרוסקופ ותנאי חשיפה זהים.
    4. אשר מושבות GFP-חיוביות באמצעות PCR דיאגנוסטי לפני המעבר לשלבי תיקוף (validation) המשכיים.
    5. שמור מושבות מאושרות על מצע yeast mannitol (YM) agar בטמפרטורה של 4°C לתחזוקה לטווח קצר, או כ-stocks גליצרין המכילים 20%–25% גליצרין בטמפרטורה של −80°C לשימור לטווח ארוך.

5. תיקוף של מוטנטים של nodC

  1. תיקוף השילוב של GFP בלוקוס nodC
    1. החדירו מושבה בודדת של M. ciceri המבטאת GFP לתוך 10 mL של ציר שמרים ומניטול (YMB) המועשר ב-100 µg/mL carbenicillin24. דגרו את התרבית ב-28°C עם ניעור ב-180 rpm למשך 20–24 שעות.
    2. קצרו את התאים הבקטריאליים באמצעות סנטריפוגציה ב-8,000 × g למשך 10 דקות ב-25°C. אספו את משקע התאים ובודדו DNA גנומי בהתאם ל-Weerakkody et al.25.
    3. בצעו PCR אבחנתי תוך שימוש ב-DNA גנומי כתבנית (טבלה 2). הכינו תגובת PCR בנפח 10 µL המכילה 5 µL של 2× PCR Master Mix, ריכוז של 0.2 µM של הפריימרים F1_nodB ו-nodC_R או F1_nodB ו-gfp_R, ו-50 ng של DNA גנומי.
    4. תכנתו את התרמוסייקליסט לדנטורציה ראשונית ב-95°C למשך 5 דקות, ולאחריה 35 מחזורים של 95°C למשך 1 דקה, 62°C למשך 30 שניות, ו-72°C למשך 45 שניות, עם הארכה סופית ב-72°C למשך 5 דקות.
    5. הפרידו את תוצרי ה-PCR על ג'ל אגרוזה בריכוז 1% (w/v) כפי שתואר קודם לכן. אששו את שילוב ה-GFP על ידי זיהוי תוצר של כ-430 bp בזן הבר (WT) ותוצר של כ-1500 bp במוטנט המשובש באמצעות F1_nodB/nodC_R, ותוצר של כ-1000 bp במוטנט (ללא תוצר ב-WT) באמצעות F1_nodB/gfp_R.
    6. כללו בקרות מתאימות במהלך תיקוף ה-PCR. השתמשו ב-DNA פלסמידי המכיל את הרצף המטרה כביקורת חיובית, ובביקורת ללא תבנית (NTC) המכילה מים נקיים מנוקליאז כביקורת שלילית.
  2. כימות ביטוי GFP באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית עם שעתוק הפוך (RT-qPCR)
    1. בודדו RNA כולל מתרביות WT ומוטנט של M. ciceri באמצעות ריאגנט TRIzol לפי הוראות היצרן.
    2. טפלו את ה-RNA ב-DNase I לפי הוראות היצרן כדי להסיר DNA גנומי מזוהם. ודאו את הסרת ה-DNA המלאה באמצעות ביקורת ללא שעתוק הפוך (−RT) במהלך ה-qPCR.
    3. סנתזו cDNA של הגדיל הראשון מ-1 µg של RNA כולל באמצעות ערכה מסחרית לסנתזת cDNA של הגדיל הראשון לפי הוראות היצרן. הכינו תגובה בנפח 20 µL המכילה RNA, פריימרים מסוג oligo(dT), dNTPs, באפר תגובה, מעכב RNase ושעתוק הפוך.
    4. דגרו את תגובת סנתזת ה-cDNA ב-42°C למשך 60 דקות, ולאחריה אינאקטיבציה תרמית ב-70°C למשך 5 דקות. שמרו את ה-cDNA ב-−20°C עד לשימוש.
    5. הכינו תגובות RT-qPCR בשלוש חזרות טכניות. הרכיבו תגובות בנפח 10 µL המכילות 5 µL של 2× SYBR Green Master Mix, ריכוז של 0.2 µM של הפריימרים BjGFP_BP_F1 ו-BjGFP_BP_R1 להגברת GFP, או פריימרים 16S_F1 ו-16S_R1 להגברה של הגן הייחוס (טבלה 2), 2 µL של תבנית cDNA (כ-20 ng), ומים נקיים מנוקליאז.
    6. בצעו RT-qPCR תחת תנאי המחזור הבאים: דנטורציה ראשונית ב-95°C למשך 2 דקות, ולאחריה 40 מחזורים של 95°C למשך 15 שניות ו-58°C למשך 45 שניות, ולאחריהם ניתוח עקומת התכה (melt-curve) מ-65°C עד 95°C.
    7. בצעו qRT-PCR באמצעות מערכת Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Detection System. נתחו תרשימי הגברה, ערכי Ct ועקומות התכה באמצעות תוכנת Bio-Rad CFX Manager.
    8. חשבו את ביטוי הגן היחסי באמצעות שיטת 2−ΔΔCt. נרמלו את הביטוי לגן הייחוס 16S rRNA והשתמשו בזן M. ciceri WT כדגימת כיול. נתחו שלוש חזרות ביולוגיות, שכל אחת מהן נמדדה בשלוש חזרות טכניות.
  3. הערכת פוטנציאל נודולציה
    1. הכנת האינוקולום הבקטריאלי
      1. החדירו מושבות בודדות של זני WT ומוטנט לתוך YMB סלקטיבי המכיל 100 µg/mL carbenicillin. דגרו את התרביות ב-28°C עם ניעור ב-180 rpm למשך 30–36 שעות.
      2. דללו את התרביות ביחס של 1:100 לתוך YMB סלקטיבי טרי ועקבו אחר הצמיחה על ידי מדידת OD600 באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Visible. בצעו כיול (blank) של המכשיר עם YMB ללא אינוקולצייה והמשיכו בדגירה עד שהתרביות מגיעות ל-OD600 של 0.3–0.4, המקביל לכ-1 × 108 CFU/mL.
      3. השתמשו ב-3 mL של התרחיף הבקטריאלי הסטנדרטי לאינוקולציה של כל צמח.
    2. בדיקת הדבקת צמחי חומוס
      1. השיגו זרעים של C. arietinum מזן BDG25618,24 מ-ICAR–Indian Agricultural Research Institute (IARI), ניו דלהי, הודו.
      2. שטפו את הזרעים היטב תחת זרם מים מהברז ולאחר מכן במים מזוקקים מסוג Milli-Q. בצעו סטריליזציה של פני הזרעים ב-1% נתרן היפוכלוריט למשך 5 דקות עם ערבוב ושטפו חמש פעמים במים מזוקקים סטריליים.
      3. טפלו את הזרעים ב-0.1% קוטל פטריות Bavistin (אבקה נרטבת של 50% carbendazim) למשך 2–3 שעות בטמפרטורת החדר. שטפו את הזרעים המטופלים פעמיים במים מזוקקים סטריליים.
      4. הניחו את הזרעים על נייר סינון סטרילי לח בתוך צלחות פטרי סטריליות (110 מ"מ × 40 מ"מ), אטמו עם Parafilm, ודגרו בחשיכה ב-28°C ± 2°C למשך 3 ימים.
      5. העבירו את השתילים הנבטים באופן פרטני לחול סטרילי. סטרילו את החול ב-121°C ובלחץ של 15 psi למשך 20 דקות לפני השימוש.
      6. הכינו תמיסת הזנה של McKnight נטולת חנקן על ידי המסה של 6.0 g CaSO₄, 1.0 g MgSO₄·7H₂O, 1.0 g KH₂PO₄, 1.5 g KCl, 14.3 mg H₃BO₃, 0.4 mg CuSO₄·5H₂O, 0.08 mg MnSO₄·4H₂O, 0.45 mg H₂MoO₄, ו-1.1 mg ZnSO₄·7H₂O במים מזוקקים סטריליים לנפח סופי של 5 L.
      7. גדלו את השתילים בעציצים בקוטר 10 ס"מ המכילים חול סטרילי, תוך שמירה על ארבעה צמחים לכל עציץ. השקו כל עציץ פעמיים בשבוע ב-20 mL של תמיסתו של McKnight נטולת חנקן.
      8. שמרו על הצמחים תחת תנאים מבוקרים של 22°C ± 2°C (יום), 18°C ± 2°C (לילה), 55%–60% לחות יחסית, פוטו-פרודיום של 16 שעות אור/8 שעות חושך, ועוצמת אור של 200 µmol photons m⁻2 s⁻1. גדלו את השתילים למשך 6–7 ימים לפני האינוקולציה.
      9. מרססו 3 mL של תרחיף בקטריאלי ישירות על כל שתיל. שמרו על ביקורות שעברו טיפול דמה (mock-treated) על ידי מרסס של 3 mL YMB סטרילי. השתמשו ב-16 צמחים כחזרות ביולוגיות לכל קבוצת טיפול.
      10. קצרו את השורשים והנבטים 20 ימים לאחר האינוקולציה. ספרו את הנודולים באופן ידני ורשמו את הביומסה הטריה מיד לאחר הקציר.
      11. ייבשו את הרקמות ב-65°C עד להשגת משקל קבוע. הגדירו משקל קבוע כשתי מדידות רצופות שהתקבלו לאחר מרווחי ייבוש של 24 שעות השונות ב-<0.01 g, ולאחר מכן רשמו את הביומסה היבשה.
      12. הציגו את התוצאות כממוצע ± שגיאת תקן (SE). בצעו ANOVA חד-כיווני ולאחריו מבחן השוואות מרובות של Tukey באמצעות GraphPad Prism גרסה 10.0, כאשר P < 0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית.
        הערה: שמרו על תנאי סטריליות לאורך כל תהליכי סטריליזציית הזרעים, הנבטה, אינוקולציה וגידול הצמחים.
        זהירות: טפלו בתמיסות נתרן היפוכלוריט וקוטלי פטריות באמצעות ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות והגנה על העיניים.

תוצאות

בפרוטוקול זה, הותאמה עריכת גנום באמצעות CRISPR-Cas9 עבור M. ciceri CC1192 על ידי ת targeting של הלוקוס nodC. כדי לעודד אובדן תפקוד, תוכננו sgRNAs למטרה באזור הפרוקסימלי של קצה ה-5′ של רצף הקידוד של nodC, ובכך נגרם DSB בתוך אזור הקידוד הראשוני כדי להפריע לתרגום של החלבון המקודד (איור 1A).

figure-results-1
איור 1. תכנון של RNA מנחה יחיד (sgRNAs) המכוון לאתר nodC ב-Mesorhizobium ciceri. (A) ייצוג סכמטי של אתר M. ciceri nodC המראה את המיקומים של שני ה-sgRNAs באורך 20-bp שתוכננו למיקוד באמצעות CRISPR-Cas9. אתרי המטרה של ה-sgRNA מוצגים בכחול. (B) רצפי הנוקלאוטידים של sgRNA1 ו-sgRNA2 המכוונים לאתר nodC. מוטיב ה-PAM (protospacer adjacent motif; 5′-NGG-3′) מסומן באדום, וקוдон הפתיחה של תרגום nodC ‏(ATG) מודגש בצהוב. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

שתי רצפי מטרה באורך 20 bp זוהו מיד במעלה הזרם של רצף PAM מסוג 5′-NGG-3′ (איור 1B). ניתוח in silico של sgRNAs מועמדים אלו באמצעות האלגוריתם של Hsu et al.19 הניב ציוני ספציפיות של 100, המצביעים על ספציפיות התמסרות גבוהה ללא זיהוי של קומפלמנטריות משמעותית מחוץ למטרה (off-target) בתוך הגנום של M. ciceri. הבדלים מינוריים נצפו בציוני יעילות ההתמסרות למטרה (on-target efficiency) החזויים של ה-sgRNAs שנבחרו (טבלה 3), אשר שימשו לבחירת המדריכים להערכה ניסיונית בהמשך.

מיקום המטרה
(bp)		גדילרצף sgRNA (5′ figure-results-2 3′)PAMציון ספציפיותציון יעילות
77+TGTTTACAGAGGCATGCAAGCGG10043.58
139+GCTTGTTCGGATCCGACCGTTGG99.747.63

טבלה 3: מועמדים ל-single-guide RNAs‏ (sgRNAs) שתוכננו לעריכה של הגן nodC ב-Mesorhizobium ciceri בתיווך CRISPR-Cas9. ה-sgRNAs המועמדים תוכננו באמצעות כלי תכנון המדריכים של Benchling CRISPR כאשר Bradyrhizobium diazoefficiens USDA 110 שימש כגנום הייחוס. המדריכים דורגו על פי ציוני ספציפיות ויעילות on-target חזויים, ונבחרו אלו המכוונים לרצפים הסמוכים לקודון הפתיחה התרגומי של nodC ומכילים את מוטיב ה-PAM (protospacer adjacent motif) מסוג NGG הנדרש עבור Cas9 מ-Streptococcus pyogenes (SpCas9).

כדי להקל על HDR ועל סריקה מבוססת פלואורסצנציה של מוטנטים פוטנציאליים, הורכב קסט HDR באמצעות וקטור השבט pUC18 (איור 2). קסט הדוחות gfp הוצא מ-pRJPaph-bjGFP על ידי עיכול רסטריקציה באמצעות SacI ו-KpnI, ושובש לתוך שלד pUC18 שלינארי (איור 2A). לאחר טרנספורמציה לתוך E. coli, זוהו קלונים חיוביים פוטנציאליים באמצעות סריקה כחול-לבן. האינטגרציה של המקטע gfp לתוך שלד pUC18 תוקפה בהמשך על ידי הגברת PCR באמצעות פריימרים ספציפיים לגן, אשר הניבו את האמפליקון הצפוי בגודל 500 bp בקלונים חיוביים (איור 2A).

figure-results-3
איור 2. בניית מערכת CRISPR-Cas9 לתיקון מכוון הומולוגיה (HDR) עבור שיבוש nodC. (A) בנייה ותיקוף של הפלסמיד הביניים pUC18-gfp. הפאנל העליון מציג את מפת הפלסמיד של pUC18-gfp שנוצר על ידי הכנסת קסטת החלבון הפלואורסצנטי הירוק (gfp) לתוך שלד pUC18. הפאנל האמצעי מציג מושבות מייצגות לאחר סינון כחול-לבן. הפאנל התחתון מציג תיקוף של מושבות באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR) תוך שימוש בזוג הפריימרים BjGFP_BP_F1 ו-BjGFP_BP_R2. (B) הרכבה רצפית של תבנית ה-HDR בשלד pUC18. מפות פלסמידים ואנליזות עיכול אנזימטי מאשרות את ההכנסה של זרוע ההומולוגיה העליונה (UHA), זרוע ההומולוגיה התחתונה (DHA), וקסטת ה-HDR המלאה UHA-gfp-DHA. (C) שיבוט ותיקוף של קסטת ה-HDR מסוג UHA-gfp-DHA אל תוך וקטור ה-CRISPR-Cas9 מסוג pCasPP. הפאנל העליון מציג את מפת הפלסמיד הסופית pCasPP-HDR, והפאנל התחתון מציג עיכול אנזימטי המאשר את הכנסת קסטת ה-HDR. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

בשלב הבא הורכב נשוא ה-HDR על ידי החדרת זרועות הומולוגיה של nodC המקיפות את קסטת ה-gfp. UHA באורך 500 bp ו-DHA באורך 400 bp, שמוקמו בסמוך לאתר החיתוך החזוי של Cas9, שיבטו באופן רצפי לתוך נשוא ה-pUC18-gfp באמצעות עיכול רסטריקציה וליגציה (איור 2B). הרכבת קסטת ה-UHA-gfp-DHA אוששה על ידי ניתוח עיכול רסטריקציה, אשר הניב את הפרגמנט הצפוי באורך 2012 bp (איור 2B). לאחר מכן, קסטת ה-HDR המלאה שובטה לתת-נשוא לתוך וקטור ה-CRISPR בעל טווח מאוכלים רחב pCasPP (איור 2C). ניתוח עיכול רסטריקציה אישש את שלמות הנשוא הסופי ואת ההרכבה המוצלחת של וקטור ההעברה לעריכה גנומית עבור M. ciceri (איור 2C).

ביצעו הזדווגות דו-הורית (Biparental mating) בין תורם מסוג E. coli S17-1λpir לבין זן מקבל של M. ciceri כדי להעביר את מבנה ה-pCasPP-gRNA-HDR אל תוך M. ciceri (איור 3A). איור 3B ממחיש את ארגון האופרון nod ואת ההחלפה החזויה של הלוכוס nodC על ידי קסטת gfp באמצעות רקומינציה הומולוגית תוך שימוש בתבנית HDR. מושבות של טרנסקונג'וגנטים זוהו בתחילה על ידי סריקת פלואורסצנציית GFP לאחר ההזדווגות הדו-הורית (איור 3B ו-3C). יותר מ-80% מהמושבות ששוחללו הראו פלואורסצנציית GFP עם gRNA2, ויותר מ-65% מהמושבות הראו פלואורסצנציה לאחר הכנסת gRNA1 (איור 3C). מכיוון שסריקת פלואורסצנציה לבדה אינה יכולה להבחין בין ביטוי GFP הנושא על פלסמיד לבין אינטגרציה גנומית מוצלחת, בוצע אימות מולקולרי בהמשך כדי לאשר את ההכנסה של קסטת הדגימה ללוכוס הספציפי.

figure-results-4
איור 3שיבוש באמצעות CRISPR-Cas9 של ה- nodC לוקוס ב- Mesorhizobium ciceri. (א) איור סכימטי של הזיווג הבי-הורי ששימש להעברת מבנה ה-pCasPP-gRNA-HDR מ- Escherichia coli S17-1λהזרקת תאי תורם אל תוך *M. ciceri* תאי מקבל. (ב) תרשים הממחיש החלפה המתווכת על ידי תיקון מכוון הומולוגיה (HDR) של ה- nodC לוקוס עם ה- GFP קסטה בעקבות שסוע CRISPR-Cas9. תבנית ה-HDR מכילה זרועות הומולוגיה של כ-500 bp במעלה הזרם (upstream) וכ-400 bp במורד הזרם (downstream) המקיפות את ה- gfp קסטה (ג) סריקה מבוססת פלואורסצנציה של טראנס-קונג'וגנט (transconjugant) *M. ciceri* מושבות. תמונות מייצגות של פלואורסצנציה ושל מיקרוסקופיה סטריאוסקופית בשדה בהיר של מושבות חיוביות ל-GFP מוצגות יחד עם אחוז הטרנס-קונג'וגנטים (transconjugants) הפלואורסצנטיים שהופקו לאחר הזיווג הבי-הורי (biparental mating) תוך שימוש במבנים (constructs) המכילים sgRNA1 או sgRNA2. פסי השגיאה מייצגים סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

כדי לתקף את השילוב של קסטת ה-gfp בלוכוס nodC, הועברו מושבות מייצגות חיוביות ל-GFP לניתוח PCR. הגברה של האזור הגנומי המשתרע בין nodB ל-nodC הניבה פרגמנט של 1511 bp בשיבוטים הערוכים, מה שעולה בקנה אחד עם שילוב קסטת הדגישה, בעוד שהזן הפראי (WT) הניב אמפליקון של 430 bp (איור 4A). הגברת PCR באמצעות פריימרים ספציפיים ל-gfp ופריימרים השלומיים את nodC הניבה פרגמנט נבדל של 997 bp בשיבוטים הערוכים, בעוד שבביקרת ה-WT לא זוהתה הגברה, ממצא התומך בהחדרה ספציפית ללוכוס. כיוון השבחה של קסטת הדגישה אומת באמצעות ריצוף סנגר. בנוסף, ביטוי GFP בזנים הערוכים הוערך באמצעות RT-qPCR, שהדגים הצטברות מוגברת של תמלילי GFP ביחס לזן ה-WT (איור 4B). ערכי הביטוי חושבו בשיטת 2−ΔΔCt ונורמלו לגן הייחוס 16s, כאשר זן ה-WT שימש כביקורת. הנתונים מייצגים את הממוצע ± SD של שלושה חזרות ביולוגיות (n = 3). מובהקות סטטיסטית נקבעה באמצעות ANOVA חד-כיווני ולאחריו מבחן Dunnett מול ביקרת ה-WT.

המגבלה הנוכחית של המחקר היא היעדרו של וקטור ביקורת, כגון pCasPP-HDR עם gRNA ריק, לקביעת מקדם הרקומינציה הבסיסי. מחקרים עתידיים צריכים לכלול ביקורת כזו.

figure-results-5
איור 4. תיקוף מולקולרי של מוטנטים של ΔnodC Mesorhizobium ciceri. (A) אישור של שיבוש nodC באמצעות PCR. הפאנל השמאלי מראה הגברה באמצעות זוג הפריימרים F1_nodB ו-nodC_R. נתיב M, סולם DNA; נתיבים 1–4, מוטנטים של ΔnodC M. ciceri; נתיב WT, M. ciceri מסוג בר. הפאנל הימני מראה הגברה באמצעות זוג הפריימרים F1_nodB ו-gfp_R. נתיב M, סולם DNA; נתיבים 1–4, מוטנטים של ΔnodC M. ciceri; נתיב WT, M. ciceri מסוג בר. גדלי האמפליקונים הצפויים מסומנים. (B) ביטוי יחסי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) במוטנטים של ΔnodC M. ciceri כפי שנקבע באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית עם שעתוק הפוך (RT-qPCR). ביטוי הגנים נורמל לגן הייחוס 16S ribosomal RNA (16S rRNA) של M. ciceri ובטא באופן יחסי לביקורת מסוג בר (WT) באמצעות שיטת 2^−ΔΔCt. פסי השגיאה מייצגים סטיית תקן. מובהקות סטטיסטית נקבעה ביחס לביקורת ה-WT. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ההשפעה הביולוגית של שיבוש nodC נבחנה באמצעות בדיקות הדבקה של חומוס. צמחים שהוחדרו ב-WT M. ciceri פיתחו קשרי שורשים נראים לעין, בעוד שצמחים שהוחדרו ב-ΔnodC M. ciceri הראו הפחתה ניכרת או היעדר של קשרי שורשים (איור 5A). צמחי הביקורת שלא הוחדרו נותרו ללא קשרי שורשים, מה שמאשר שמירה על תנאי ניסוי סטריליים (איור 5A). ניתוח כמותי של פרמטרי גדילה של הצמחים הדגימה הבדלים נוספים בין צמחים שהוחדרו ב-WT לבין צמחים שהוחדרו ב-ΔnodC M. ciceri, כולל אורך שורש, משקל שורש רטוב, משקל שורש יבש, אורך נבט, משקל נבט רטוב, משקל נבט יבש ומספר קשרי שורשים (איור 5B). צמחים שהוחדרו ב-WT הראו מספר גבוה יותר של קשרי שורשים ופרמטרים משופרים הקשורים לגדילה בהשוואה לצמחים שהוחדרו ב-ΔnodC M. ciceri ולצמחי ביקורת שלא הוחדרו. ממצאים אלו עולים בקנה אחד עם שיבוש התפקוד של קשרי השורשים הקשור ל-nodC, ותומכים בישימות של תהליך עבודה זה המבוסס על CRISPR-Cas9 למחקרי גנומיקה תפקודית ב-M. ciceri. נתונים כמותיים של פנוטיפ הצמח נבחנו כדי להשוות הבדלים בין קבוצות הטיפול. סך של 90 חזרות ביולוגיות נכללו בניתוח (n = 30 צמחים לכל קבוצת טיפול). הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. מובהקות סטטיסטית נבחנה באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA), ולאחריו מבחן השוואות מרובות post hoc של Tukey. הבדלים נחשבו למובהקים סטטיסטית ב-P < 0.05.

figure-results-6
איור 5. תיקוף פונקציונלי של מוטנטים של ΔnodC Mesorhizobium ciceri באמצעות בדיקת הדבקת חומוס. (A) צמחי חומוס (Cicer arietinum) מייצגים 20 ימים לאחר הדבקה ב-M. ciceri מסוג בר, ΔnodC M. ciceri, או בביקורות ללא הדבקה. (B) ניתוח כמותי של פרמטרי צמיחת צמחים ונודולציה, כולל אורך שורש, משקל שורש רטוב, משקל שורש יבש, אורך נבט, משקל נבט רטוב, משקל נבט יבש ומספר קשרי שורשים (nodules). הנתונים מוצגים עבור צמחים שהודבקו ב-M. ciceri מסוג בר, ΔnodC M. ciceri, או בביקורות ללא הדבקה. פסי השגיאה מייצגים סטיית תקן. מובהקות סטטיסטית נקבעה באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA) ולאחריו מבחן השוואות מרובות של Tukey. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1. פרוטוקול מפורט להכנה ותיקוף של תאי Escherichia coli בעלי כשירות כימית. קובץ משלים זה מספק את ההליך המלא להכנה ותיקוף של תאי Escherichia coli DH5α ו-E. coli S17-1λpir בעלי כשירות כימית, כולל הכנת תרבית חיידקים, השראת כשירות, קציר תאים, שטיפה עם בופר CaCl₂–glycerol, חלוקה למנות, שימור בהקפאה ותיקוף באמצעות בדיקת יעילות טרנספורמציה. קובץ זה כולל גם מדדי בקרת איכות קריטיים, המלצות לאחסון וקריטריונים לקבלת כשירות. אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2. פרוטוקול מפורט לבניית תבניות לתיקון מכוון הומולוגיה (HDR) והרכבת וקטורים לעריכה גנומית באמצעות CRISPR-Cas9.קובץ משלים זה מספק נהלים מפורטים לחיתוך קסטת החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP), בניית הפלסמיד הביניים pUC18-gfp, הגברה ושבט של זרועות הומולוגיה במעלה ובמורם הרצף, הרכבה של תבנית ה-HDR המלאה, הכנת וקטורי pCasPP-guide RNA (gRNA), הכנסת תבניות HDR לפלסמידי CRISPR-Cas9, סריקת שבטים מבוססת פלואורסצנציה, ותיקוף של פלסמידים רקומביננטיים באמצעות אנליזת הגבלה וריצוף סנגר. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 3. פרוטוקול מפורט להזדווגות דו-הורית ויצירת טרנס-קונג'וגנטים של Mesorhizobium ciceri המסומנים ב-GFP. קובץ משלים זה מתאר את הכנת זנקי התורם והמקבל, הזדווגות דו-הורית באמצעות מסנן ממברנה, התאוששות וברירה אנטיביוטית של הטרנס-קונג'וגנטים, הליכי ניקוי פלסמידים (plasmid-curing), סריקה מבוססת פלואורסצנציה של מושבות רקומביננטיות, אישור מולקולרי של זנקים שעברו עריכה גנומית, ושימור לטווח קצר וארוך של טרנס-קונג'וגנטים של M. ciceri מאושרים וחיוביים ל-GFP. תנאי תרבית מפורטים, פרמטרי הזדווגות והליכי ברירה מסופקים. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

דיון

הקמתו של מערכת עריכה גנומית מבוססת CRISPR-Cas9 ב-M. ciceri נותנת מענה למגבלה טכנית משמעותית במניפולציה גנטית של סימביונט זה, המקבע חנקן ובעל חשיבות חקלאית. באמצעות שיבוש של הלוקוס nodC תוך שימוש ברפורטר gfp ו-HDR, סבב עבודה זה מספק מסגרת מודרכת פלואורסצנציה לביצוע שינויים גנומיים ממוקדים ב-M. ciceri.

גישות מסורתיות למניפולציה גנטית בריזוביה הסתמכו בעיקר על מוטגנזה אקראית מבוססת Tn5 או על חליפת אללים בתיווך sacB19,26,27. למרות שגישות אלו נותרו בעלות ערך, הן דורשות עבודה רבה, לעיתים קרובות מחייבות מספר סבבים של ברירה נגדית (counter-selection), ועשויות להשאיר סמני עמידות לאנטיביוטיקה בתוך הגנום המסבכים סבבי עריכה עוקבים. לעומת זאת, עריכת גנום בתיווך CRISPR-Cas9 מציעה חלופה ממוקדת ויעילה יותר להנדסה גנומית. מחקרים אחרונים דיווחו על עריכת בסיסים מבוססת CRISPR ומערכות מבוססות Cas12e ב-S. meliloti כדי להפחית את הרעילות הקשורה ל-Cas912,13, בעוד שדיכוי שעתוק בתיווך dCas9 נחקר ב-R. etli11. למיטב ידיעתנו, מחקר זה מהווה את אחת היישומים הראשונים של שיבוש כרומוזומלי בתיווך CRISPR-Cas9 ב-M. ciceri. הפרוטוקול משלב תכנון מטרות מודרך על ידי sgRNA, העברה של פלסמידים דו-הורית, ורקומבינציה בתיווך HDR לעריכה ספציפית של לוקוס. שילוב של הגן המדווח gfp בתוך קסטת ה-HDR מקל גם על סינון מהיר מבוסס פלואורסצנציה של מושבות ערוכות פוטנציאליות, ובכך מפחית את מספר המושבות הדורשות תיקוף מולקולרי בהמשך התהליך.

מספר גורמים היו חשובים ליישום מוצלח של זרימת העבודה. בחירה של sgRNAs עם ספציפיות גבוהה שנחזתה מינמזה השפעות פוטנציאליות מחוץ למטרה (off-target) בתוך הגנום של M. ciceri, בעוד ששמירה על שלמות זרועות ההומולוגיה תמכה ביעילות הרקומינציה המתווכת על ידי HDR. בנוסף, אופטימיזציה של תנאי הצמיחה של התורם והמקבל במהלך הזיווג הבי-הורי שיפרה את התשואה של הטרנסקונג'וגנטים. סינון מבוסס פלואורסצנציה אפשר זיהוי מהיר של מוטנטים משוערים; עם זאת, תיקוף מולקולרי באמצעות PCR וריצוף סנגר עדיין היה נחוץ כדי לאשר אינטגרציה של קסטת הדגימה בלוקוס הספציפי. מחקרים עתידיים יוכלו להשתמש בביקורת של וקטור pCasPP-HDR עם gRNA ריק כדי לכמת את מקדם הרקומינציה הבסיסי.

מעבר לקידום מתודולוגי, פלטפורמה זו עשויה לתמוך במחקרים עתידיים שיבחנוו סיגנלינג סימביוטי וגנומיקה פונקציונלית בריזוביה הקשורה לחומוס28. חומוס (Cicer arietinum L.) מהווה גידול קטני בעל חשיבות עולמית ותורם מרכזי למערכות חקלאיות בר-קיימא29,30. זן ה-ΔnodC M. ciceri שנוצר במחקר זה מספק רקע גנטי שעשוי להיות שימושי לבחינת תאימות בין מאחס למיקרובה ומסלולי סיגנלינג הקשורים לנודולציה. מחקרים קודמים הצביעו על כך ש-sRNAs פועלים כאפקטורים רגולטוריים במהלך שלבים מוקדמים של סימביוזה של קשרי שורש31. כתוצאה מכך, זן ה-ΔnodC M. ciceri חסר היכולת לנודולציה המתואר כאן עשוי להקל על מחקרים עתידיים המתמקדים במנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התקשורת בריזוספירה וסימביוזה של קיבוע חנקן.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים פיננסיים או קונפליקטים של אינטרסים.

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי מחלקת הביוטכנולוגיה (DBT)-MK Bhan Grant HRD-16016/15/2023-AFS-DBT עבור ד"ר Nandita Pasari. עבודה זו נתמכת גם על ידי מענק ליבה שהוענק לד"ר Senjuti Sinharoy מהמכון הלאומי למחקר גנום של צמחים, ניו דלהי, הודו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אגרוז (Agarose)GenetixPG-40005אלקטרופורזה של ג'ל
נייר אלומיניוםRolia’sGF83048115שימוש כללי במעבדה
אגר בקטריולוגיHiMediaGRM026הכנת מצע גידול
פלטפורמת Benchling לעיצוב מדריכי CRISPRBenchlingN/Aעיצוב RNA מדריך (guide RNA)
חומצה בוריתHiMediaPCT0102הכנת תמיסת McKnight’s
בקבוק חרוטי מזכוכית בורוסיליקטSigmaCLS5100500הכנת תרבית
מבחנות מזכוכית בורוסיליקטSigmaDWK73500-1075הכנת תרבית
קלציום כלוריד דיהידראטHiMediaMB034הכנת תאים קומפטיבליים (Competent cells)
קלציום סולפט דיהידראטHiMediaGRM328הכנת תמיסת McKnight’s
קרבניסילין דיסודיוםDuchefa BiochemieDUC-C0109.005-18בשימוש בריכוז 100 µg/mL
ערכה לסינתזת cDNAThermo Fisher ScientificAB1543Aסינתזת cDNA
ניילון נצמדOA10954049שימוש כללי במעבדה
ערכת שיבוט/T4 DNA ligaseThermo Fisher ScientificK1422תגובות ליגציה
קונגו רד (Congo red)HiMedia573-58-0עבודה עם תרביות מיקרוביאליות
נחושת(II) סולפט פנטהידראטHiMediaPCT0104הכנת תמיסת McKnight’s
מבחנה לתרביתBorosil9800U08גידול של תרבית בקטריאלית ראשונית; 15 cm × 2.5 cm
מד pH דיגיטליEutech InstrumentsEC PH TUTOR DSכוונון pH
דיפוטסיום פוספטHiMediaTC596Mהכנת YMB
סולם DNA (DNA ladder)BIO-HELIXDM015-R500אלקטרופורזה של ג'ל
ערכה להסרת DNaseInvitrogenAM1907הסרת DNA מ-RNA מבודד
תערובת dNTPThermo ScientificR0181הגברת PCR
אתנולSigma-Aldrich1.00983.0511בשימוש בריכוז 75%
אתידיום ברומידSigma-AldrichE1510צביעת ג'ל DNA
FastAP Alkaline Phosphatase רגיש לטמפרטורהThermo Fisher ScientificEF0651דה-פוספורילציה של וקטור במהלך שיבוט
בופר FastDigestThermo Fisher ScientificB64עיכולים על ידי אנזימי הגבלה
ברזל(III) כלוריד ללא מיםHiMediaTC583הכנת תמיסת McKnight’s
מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטיNikonSMZ25סריקת GFP
קוטל פטריות, BavistinCrystal Crop ProtectionBavistin Carbendazim 50% WPטיפול בזרעים
ערכה למיצוי ג'לQIAGEN28704טיהור DNA
גליצרולThermo Fisher ScientificQ24505תאים קומפטיבליים/מלאי גליצרול
אינקובטור גידול עם שייקר אורביטליMRCLOM-150תרבית בקטריאלית
כפפות ידKimtech97612ציוד מגן אישי
HEPESHiMediaMB016הסנכרנת (annealing) של אוליגו-נוקלאוטידים
IPTGG BiosciencesRC1113Dסריקה כחולה-לבנה
מrepresents Laminar flow (מ chụp זרימה למינרית)BiolinkBL-H1300טיפול סטרילי
אגר LBHiMediaM1151צלחות תרבית בקטריאלית
ציר LB (LB broth)HiMediaG1245תרבית בקטריאלית
מגנזיום סולפטHiMediaGRM1281-500Gהכנת YMB
מגנזיום סולפט הפטהידראטHiMediaPCT0008הכנת תמיסת McKnight’s
מנגן(II) סולפט טטרהידראטSigma-AldrichM3634הכנת תמיסת McKnight’s
מניטולHiMediaMB198הכנת YMB
תמיסת McKnight’sהכנה מעבדתיתN/Aתמיסת תזונה לצמחים
טיפים מיקרו, 0.2–10 µLTarsons521000טיפול בנוזלים
טיפים מיקרו, 2–200 µLTarsons521010טיפול בנוזלים
טיפים מיקרו, 200–1000 µLTarsons521020Xטיפול בנוזלים
מבחנה למיקרוצנטריפוגה, 0.5 mLTarsons500000טיפול בדגימות
מבחנה למיקרוצנטריפוגה, 1.5 mLTarsons500010טיפול בדגימות
מבחנה למיקרוצנטריפוגה, 2.0 mLTarsons500020טיפול בדגימות
חומצה מוליבדיתSigma-Aldrich232084הכנת תמיסת McKnight’s
ספקטרופוטומטר NanoDropThermo Fisher Scientific13-400-519כימות DNA/RNA
נאומיציןDuchefa BiochemieM0135בשימוש בריכוז 50 µg/mL
מים ללא נוקלאז (Nuclease-free water)HiMediaML064-100MLשימוש בביולוגיה מולקולרית
PCR master mixThermo Fisher ScientificK01712× master mix
רצועות מבחנות PCR, 0.2 mLTarsons610040הכנת PCR
צלחות פטרי, 90 mmPSC2041צלחות אגר
פיפטה, 0.1–2.5 µLEppendorfN10178Mטיפול בנוזלים
פיפטה, 0.5–10 µLEppendorfH40069Lטיפול בנוזלים
פיפטה, 2–20 µLEppendorfH30046Mטיפול בנוזלים
פיפטה, 10–100 µLEppendorfI00395Mטיפול בנוזלים
פיפטה, 20–200 µLEppendorfM38186Mטיפול בנוזלים
פיפטה, 100–1000 µLEppendorfN20610Mטיפול בנוזלים
ערכה למיצוי DNA פלסמידיQIAGEN12143בידוד פלסמיד
אשלגן כלורידHiMediaTC010הכנת תמיסת McKnight’s
אשלגן דיהידרוגן פוספט ללא מיםHiMediaTC011Mהכנת תמיסת McKnight’s
מסנן ממברנת PVDF, 0.22 µm, 47 mmMilliporeSigmaGVWP04700הכלאה דו-הורית (Biparental mating)
מכשיר PCR כמותי בזמן אמת (Quantitative real-time PCR)Bio-RadCFX96RT-qPCR
צנטריפוגת שולחנית מקוררתEppendorf04-987-373קציר תאים
אנזים הגבלה, BbsIThermo Fisher ScientificER1011שיבוט gRNA
אנזים הגבלה, EcoRIThermo Fisher ScientificFD0274שיבוט
אנזים הגבלה, KpnIThermo Fisher ScientificFD0524שיבוט
אנזים הגבלה, SacIThermo Fisher ScientificFD1133שיבוט
אנזים הגבלה, XbaIThermo Fisher ScientificFD0684שיבוט
DNase ללא RNaseQIAGEN79254ניקוי RNA
חולRam SuratSandמצע גידול לצמחים
סיקוונסר (Sequencer)Applied BiosystemsABI3730xl DNA Analyzerריצוף סנגר (Sanger sequencing)
מצע SOCהכנה מעבדתיתN/Aהתאוששות לאחר טרנספורמציה
נתרן כלורידHiMediaTC046הכנת מצע גידול
נתרן הידרוקסידHiMediaPCT1325כוונון pH של HEPES
להב ניתוחי סטריליMedicare Surgical16020חיתוך ג'ל/טיפול ברקמה
מזרק סטריליHMD Dispovan10ml syringe without needleסינון סטרילי
מסנן מזרק סטרילי, 0.22 µmMerck Millex Durapore12766842סטריליזציה בסינון
SYBR Green master mixNew England BiolabsM3003ERT-qPCR
טטרהציקליןDuchefa BiochemieT01050בשימוש בריכוז 5 µg/mL
תרמוציקלר (Thermal cycler)Applied BiosystemsA24811הגברת PCR
גליל נייר סופגRolia’s07AAECR4885K1ZTשימוש כללי במעבדה
ריאגנט TRIzolInvitrogen15596026בידוד RNA
טרנס-אילומינטור UVAnalytik JenaTW-43ויזואליזציה של ג'ל
ספקטרופוטומטר UV-VisEppendorfD30מדידת OD600
קיובטות VisEppendorf30079345מדידת OD600
מיקסר וורטקס (Vortex mixer)NeuationiSWIX-VTערבוב דגימות
X-galG BiosciencesRC1233סריקה כחולה-לבנה
תמצית שמריםHiMediaRM668-500Gהכנת מצע גידול
אבץ סולפט הפטהידראטSigma-AldrichZ0251הכנת תמיסת McKnight’s

מקורות

  1. Doudna JA, Charpentier E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014;346(6213):1258096.
  2. Jiang W, Bikard D, Cox D, Zhang F, Marraffini LA. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology. 2013;31(3):233-9.
  3. Bertrand C, Thibessard A, Bruand C, Lecointe F, Leblond P. Bacterial NHEJ: a never ending story. Molecular microbiology. 2019;111(5):1139-51.
  4. Loureiro A, da Silva GJ. Crispr-cas: Converting a bacterial defence mechanism into a state-of-the-art genetic manipulation tool. Antibiotics. 2019;8(1):18.
  5. Altenbuchner J. Editing of the Bacillus subtilis genome by the CRISPR-Cas9 system. Applied and environmental microbiology. 2016;82(17):5421-7.
  6. Wang Y, et al. Bacterial genome editing with CRISPR-Cas9: deletion, integration, single nucleotide modification, and desirable “clean” mutant selection in Clostridium beijerinckii as an example. ACS synthetic biology. 2016;5(7):721-32.
  7. Oh J-H, van Pijkeren J-P. CRISPR–Cas9-assisted recombineering in Lactobacillus reuteri. Nucleic acids research. 2014;42(17):e131-e.
  8. Cobb RE, Wang Y, Zhao H. High-efficiency multiplex genome editing of Streptomyces species using an engineered CRISPR/Cas system. ACS synthetic biology. 2015;4(6):723-8.
  9. Wanjofu EI, et al. Nodulation and growth promotion of chickpea by Mesorhizobium isolates from diverse sources. Microorganisms. 2022;10(12):2467.
  10. Haskett T, et al. Complete genome sequence of Mesorhizobium ciceri strain CC1192, an efficient nitrogen-fixing microsymbiont of Cicer arietinum. Genome Announcements. 2016;4(3):10.1128/genomea. 00516-16.
  11. Bellahsen O, Díaz-Méndez R, Romero D. Genomic engineering in Rhizobium etli: implementation and evaluation of systems based on dCas9. Frontiers in Microbiology. 2025;16:1604430.
  12. Liu G, et al. An efficient CRISPR/Cas12e system for genome editing in Sinorhizobium meliloti. ACS Synthetic Biology. 2023;12(3):898-903.
  13. Wang L, Xiao Y, Wei X, Pan J, Duanmu D. Highly efficient CRISPR-mediated base editing in Sinorhizobium meliloti. Frontiers in Microbiology. 2021;12:686008.
  14. Schäfer A, et al. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum. Gene. 1994;145(1):69-73.
  15. Rütering M, et al. Tailor-made exopolysaccharides—CRISPR-Cas9 mediated genome editing in Paenibacillus polymyxa. Synthetic Biology. 2017;2(1):ysx007.
  16. Ledermann R, Bartsch I, Remus-Emsermann MN, Vorholt JA, Fischer H-M. Stable fluorescent and enzymatic tagging of Bradyrhizobium diazoefficiens to analyze host-plant infection and colonization. Molecular Plant-Microbe Interactions. 2015;28(9):959-67.
  17. Göttfert M. Regulation and function of rhizobial nodulation genes. FEMS microbiology reviews. 1993;10(1-2):39-63.
  18. Kant C, Pradhan S, Bhatia S. Dissecting the root nodule transcriptome of chickpea (Cicer arietinum L.). PLoS One. 2016;11(6):e0157908.
  19. Hsu PD, et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology. 2013;31(9):827-32.
  20. Doench JG, et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature biotechnology. 2016;34(2):184-91.
  21. Norrander J, Kempe T, Messing J. Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis. Gene. 1983;26(1):101-6.
  22. Simon R, Priefer U, Pühler A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Bio/technology. 1983;1(9):784-91.
  23. Hanahan D, Jessee J, Bloom FR. [4] Plasmid transformation of Escherichia coli and other bacteria. Methods in enzymology. 1991;204:63-113.
  24. Alexandre A, et al. Natural populations of chickpea rhizobia evaluated by antibiotic resistance profiles and molecular methods. Microbial Ecology. 2006:128-36.
  25. Weerakkody LR, et al. A rapid, inexpensive and effective method for the efficient isolation of genomic DNA from Gram-negative bacteria. Molecular Genetics and Genomics. 2024;299(1):26.
  26. Selbitschka W, Niemann S, Pühler A. Construction of gene replacement vectors for Gram− bacteria using a genetically modified sacRB gene as a positve selection marker. Applied microbiology and biotechnology. 1993;38(5):615-8.
  27. Yadav A, Singh RP, Singh AL, Singh M. Identification of genes involved in phosphate solubilization and drought stress tolerance in chickpea symbiont Mesorhizobium ciceri Ca181. Archives of microbiology. 2021;203(3):1167-74.
  28. Dicenzo GC, et al. Multidisciplinary approaches for studying rhizobium–legume symbioses. Canadian Journal of Microbiology. 2019;65(1):1-33.
  29. Calia C, et al. A bibliometric analysis of chickpea agronomic practices in the world during 45 years of scientific research. Legume Science. 2024;6(1):e219.
  30. Sandhu J, Tripathi S, Chaturvedi S. Chickpea nutritional status and value chain for sustainable development.  Sustainable food value chain development: Perspectives from developing and emerging economies: Springer; 2023. p. 175-83.
  31. Ren B, Wang X, Duan J, Ma J. Rhizobial tRNA-derived small RNAs are signal molecules regulating plant nodulation. Science. 2019;365(6456):919-22.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

עריכה באמצעות CRISPR-Cas9תיקון מכוון הומולוגיהרפורטר GFPמיקרוסקופיה פלואורסצנטיתריצוף סנגרבדיקת הדבקת חומוסגנומיקה תפקודית

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.