הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פנוטיפינג חי של נוירודגנריות דופמינרגית בזחלי דגי זברה באמצעות ניתוח התנהגותי ודימות תוכן גבוה

341 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71516

⸱

16 ביוני 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Pharmacy Practice, UC Irvine School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 2Robert A. Mah Molecular Innovation Center, University of California Irvine

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מספק שיטת סקר מורכבות סטנדרטית ובעלת תפוקה גבוהה, המשתמשת בדגי זברה בחיים לכימות אובדן נוירונים דופמינרגיים וליקויים התנהגותיים מוטוריים, ומאפשר סקר יעיל של תרכובות נוירו-מגנה.

תקציר

מחקר גילוי תרופות בנוירודגנונרציה מוגבל על ידי העלות הגבוהה והקצב הנמוך של מודלים מסורתיים של יונקים. צוואר בקבוק זה נצמד במיוחד במחקרי מחלת פרקינסון, שבהם מחקרים נוירודגנרציים דופמינרגיים (DA) קפדניים וניתנים להרחבה נשארים איטיים ודורשים משאבים. כדי להתמודד עם הפער הזה, אנו מציגים צינור פנוטיפינג סטנדרטי ובעל תפוקה גבוהה באמצעות מודל דג זברה טרנסגני המבטא ניטרורדוקטאז בנוירוני DA, כדי לחקור אובדן נוירוני DA בתוך חמישה ימים לאחר ההפריה. דגי זברה מציעים יתרונות מרכזיים למדעי המוח התרגומיים, כולל התפתחות מהירה של זחלים, שקיפות אופטית המאפשרת הדמיה מוחית מלאה ב-vivo , שימור חזק של גנים ונתיבים רלוונטיים למחלת פרקינסון, ומעגלים עצביים שלמים שאינם נגישים במודלים של תרביות תאים. הפרוטוקול שלנו משלב אבלציה כימוגנטית ודימות בעל תוכן גבוה ליצירת מערכי נתונים מהירים לסקר. נוירוני DA עוברים אבלט סלקטיבי באמצעות מטרונידאזול (MTZ), מה שמייצר נוירודגנרציה ייחודית וניתנת לכיוונון. טיפול ב-MTZ יוצר הפחתות תנועה התלויות במינון התואמות לפנוטיפים דמויי ברדיקינזיה, ומספק מתאם התנהגותי חזק לאובדן תאי DA. מכיוון שמחלת פרקינסון היא בעצם הפרעה מוטורית, אנו משלבים מדידות אנטומיות עם קריאות התנהגות פונקציונליות. פעילות התנועה מתועדת ישירות בלוח ומודדת באמצעות מעקב אוטומטי, תוך חילוץ מדדים הכוללים את המרחק הכולל שנעבר, תדירות השחייה והתחלת הפיצוץ. דגי זברה מספקים מערכת מודלים יעילה וניתנת להרחבה שבה ניתן לבדוק מאות זחלים בו-זמנית עם טיפול מינימלי. אופטימיזציה של פרוטוקול סקר סמים מבוסס צלחת בעל תפוקה גבוהה שנועד למזער שונות ניסיונית במחקר לתואר ראשון. פורמט סטנדרטי זה, מבוסס צלחת, לסינון תרכובות מועמדות להגנה נוירולוגית או הצלה פונקציונלית מבטיח שהנתונים שנאספו על ידי חוקרים שונים יישארו נתונים נתונים סטטיסטית דומים ויעילים לזיהוי מועמדים נוירופרוטקטיביים, ובכך לשפר את השחזוריות. ביחד, מתודולוגיה זו מספקת מסגרת חזקה וניתנת להרחבה למחקר נוירודגנרציה.

מבוא

מחקר גילוי תרופות בנאורודגנציה עצבית מתמודד עם צוואר בקבוק משמעותי ביעילות בשל העלות הגבוהה והקצב הנמוך של מודלים מסורתייםשל יונקים 1,2, מה שדורש תכנון ניסויי קפדני ושימוש בכוח עבודה גדול. המטרה הכללית של שיטה זו היא לספק גישה סטנדרטית ובעלת תפוקה גבוהה באמצעות Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry) מודל דג זברה טרנסגני, שבו ניטרורדוקטאז-mCherry מתבטא במיוחד בנוירונים דופמינרגיים (DA) כדי לחקור אובדן נוירון DA וליקויים בתנועה. ההיגיון מאחורי השימוש בטכניקה זו נובע מהצורך במודלים קפדניים, ניתנים להרחבה וכלכלית בחיים למחקר נוירודגנרציה 3,4,5. בעוד שתרביות תאים חוץ-גופיות מאפשרות סקר תרופתי מהיר, הן חסרות את המעגלים העצביים השלמים וההקשר של אורגניזם שלם, החיוניים לרלוונטיות תרגומית.6. לעומת זאת, מודלים של מכרסמים מספקים הקשר פיזיולוגי מצוין אך יקרים וגוזלים זמן לסקר ראשוני בקצב גבוה של תרכובות נוירו-פרוטקטיביות 7,8.

לדגי זברה התפתחות זחלים מהירה, שקיפות אופטית המאפשרת הדמיה מוחית מלאה ב-vivo, ושימור גנטי חזק של מסלולים רלוונטיים למחלות, במיוחד הקשורים לניוון עצבי 9,10,11. הפרוטוקול משלב באופן ספציפי טיפול סטנדרטי, אבלציה כימוגנטית באמצעות מטרונידאזול (MTZ), ודימות בתוכן גבוה בשילוב עם מעקב התנהגותי פונקציונלי. מדידת פעילות מוטורית ישירות מספקת מתאם התנהגותי חזק לאובדן נוירוני DA, שכן אובדן נוירוני דופמין קשור לחריגות התנהגותיות 12,13,14. הפורמט הסטנדרטי, המבוסס על פלטות, ממזער שונות ניסיונית בין אופרטורים, והקצב הגבוה של מערכת הזחלים של דג הזברה מאפשר מדגמים גדולים, וביחד מספקים כוח סטטיסטי מספק לזיהוי השפעות נוירופרוטקנטיות. דבר זה הופך את הפרוטוקול למתאים במיוחד ליישומים הדורשים סינון ניתן להרחבה ולשחזור, כולל מצבים שבהם חוויית החוקר עשויה להשתנות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל השיטות הכוללות שימוש בנבדקים בעלי חוליות בוצעו בהתאם להנחיות ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית (אישור IACUC AUP-25-098).

1. גידול דגי זברה

  1. שמירה על תנאי מערכת המים
    1. שמרו על מערכת המים המחזורית ב-28.5°C (טווח מקובל: 26°C–30°C), pH 7.1–7.8, ומוליכות של 600–700 מיקרו-שניות לס"מ. לשמור על דגי זברה בוגרים בצפיפות של כ-5 דגים לליטר באקווריום ביתי.
    2. יש לעקוב מדי יום אחר רמות אמוניה, ניטריט וניטראט באמצעות ערכת בדיקת איכות מים לאקווריום צבעוני, בהתאם להוראות היצרן. לשמור על אמוניה וניטריט ב-0 ppm וניטראט בין 10–20 ppm.
    3. לבצע החלפות מים כאשר אמוניה או ניטריט עולים על 0 ppm, ניטראט עולה על 20 ppm, קיימת עכירות או פסולת נראית לעין, או ערכי pH/מוליכות נופלים מחוץ לטווחי היעד המתוארים בשלב 1.1.1. המשיכו בהחלפות עד שהאמוניה והניטריט חוזרים ל-0 ppm, ניטראט חוזר ל-10–20 ppm, וערכי pH/מוליכות משוחזרים לטווח היעד.
    4. שמור על מחזור אור של 14 שעות ו-10 שעות כהה כדי לסנכרן את הקצב הצירקדי והרבייה.
  2. האכלת דגי זברה בשלבי התפתחות שונים
    1. האכיל דגים בוגרים 0.5 מ"מ כדורים שוקעים לאט פעמיים ביום. התקן את ההזנה לפי זמן הצריכה וספק רק את הכמות שנצרכה בתוך 3–5 דקות. השתמש באותו גודל כדור וסוג תזונה בעקביות בין קבוצות ניסיוניות.
    2. האכיל דגי זחל Gemma Micro 75 ZF, או תזונה מקבילה של דגי זברה עם גודל חלקיקים של כ-75 מיקרון, שלוש פעמים ביום. האכיל דגים צעירים (1 חודש) Gemma Micro 150 ZF, או תזונה מקבילה של דגי זברה בגודל חלקיקים של כ-150 מיקרון, שלוש פעמים ביום.
    3. החליפו תזונה מקבילה רק אם הן מותאמות לזחלים או צעירים של דגי זברה, מספקות גודל חלקיקים דומה, ומספקות מזון עשיר בחלבון ומלא חומרים מזינים המתאים לשלב ההתפתחות.
    4. הוסיפו תזונה של זחלים וצעירים עם שרימפס מלח חיים שבקעו זה עתה פעם ביום בצהריים בימי חול. בקעו ציסטות שרימפס במי מלח מאווררים למשך 24–36 שעות לפי הוראות היצרן.
    5. אספו נאופליים ששחו באופן פעיל, שטפו אותם במי מערכת, והאכיל רק את הכמות שנצרכה תוך 5–10 דקות.
    6. הימנעו מהאכלה מופרזת, שכן עודפי מזון מעלה את רמות האמוניה.
      הערה: הסירו אוכל שלא נאכל ופסולת נראית לעין מדי יום על ידי שאיבה עדינה. בדקו את האקווריום לאיתור דגים מתים או לא בריאים ונקו משטחים או מסננות כאשר נצפים הצטברות פסולת. שמרו על צפיפות המיכלים, האכלה, הניקוי וניטור איכות המים באופן עקבי בין קבוצות ניסוי. לפרטים נוספים על גידול דגי זברה, שלב התפתחותי, גידול שרימפס במלח ותחזוקה ארוכת טווח של מתקנים, ראו את Westerfield15 ו-Avdesh et al.16.

2. איסוף עוברים, הכנת תגובות וסינון טרנסגני

  1. הקמת הכלאות רבייה
    1. הרכיבו מיכלי חצייה עם מחיצה בערב שלפני איסוף העוברים.
    2. הניחו זכר אחד ושני דגי זברה נקביים בכל אקווריום חוצה, כאשר זכרים ונקבות מופרדים על ידי המחיצה במהלך הלילה.
    3. הסר את המחיצה בבוקר למחרת בתחילת מחזור האור ואפשר להטלה לתקופה קבועה של שעתיים. לאסוף עוברים מיד לאחר חלון ההטלה כדי למזער שונות בשלב ההתפתחות.
  2. איסוף ודגירה של עוברים
    1. איסוף עוברים על ידי שפיכת מים באקווריום דרך מסנן רשת של 400 מיקרון. שטפו עוברים בעדינות במי מערכת או מי ביצה כחולה (BEW) להסרת פסולת, ואז העבירו עוברים לצלחות פטרי 100 מ"מ באמצעות פיפט העברה חד-פעמי. למזער את הטיפול ולהימנע מחשיפת עוברים לאוויר לפרקי זמן ממושכים.
    2. העבר עוברים לצלחות פטרי 100 מ"מ המכילות 30 מ"ל BEW בצפיפות של 50–60 עוברים בכל צלחת. אין לעלות על 60 עוברים בכל צלחת כדי לשמור על התפתחות עקבית וזמינות חמצן.
    3. דגרו עוברים בטמפרטורה של 28.5°C במחזור חשוך של 14 שעות אור ו-10 שעות.
    4. הסר ביציות לא מופריות ועוברים לא חיוניים מדי יום.
      הערה: הכינו BEW עם 60 מ"ג מלח ים מיידי של האוקיינוס, 50 מיקרוליטר של 1% מתילן כחול, ו-1 ליטר מים דה-יוניים17.
  3. הכינו ומרחו את תמיסת 1-פניל-2-תיוראה (PTU)
    1. הכינו תמיסת חומר PTU של 100 מ"מ בדימתיל סולפוקסיד (DMSO).
    2. אחסן את תמיסת המלאי של PTU בטמפרטורה של 4°C מוגנת מאור.
    3. ב-24–36 שעות לאחר ההפריה (hpf), הוסף 60 מיקרוליטר של תמיסת PTU לכל צלחת המכילה 30 מ"ל BEW כדי להגיע לריכוז סופי של 200 מיקרומון.
    4. ערבבו PTU על ידי סיבוב עדין של צלחת פטרי בתנועה מעגלית 5–10 פעמים. הימנעו מפיפטינג ישיר על עוברים כדי למזער לחץ מכני.
      אזהרה: PTU עלול לגרום לגירוי נשימתי ועור. לטפל בכפפות ולבצע הכנה באזור מאוורר היטב.
  4. הכינו הרדמה טריקאין
    1. המיס 400 מ"ג טריקאין מתנסולפונאט במים של 97.9 מ"ל מילי-קיו.
    2. הוסף 2.1 מ"ל של בסיס טריס 1 מטר (pH 9) לתמיסה.
    3. כוונו את התמיסה ל-pH 7.0 באמצעות 0.1 מיליון נתרן הידרוקסיד או חומצה כלורית.
    4. העבירו את התמיסה לצינורות מסומנים ואחסנו בטמפרטורה של 4°C.
    5. מדלל את תמיסת המלאי ב-1:25 כדי לקבל ריכוז עבודה של 160 מיקרוגרם/מ"ל או מדלל 1:100 כדי לקבל 40 מיקרוגרם/מ"ל ליישומים במינון נמוך18.
      אזהרה: טריקאין מתנסולפונאט הוא חומר הרדמה כימי. לטפל בציוד מגן אישי מתאים.
  5. ביצוע חציאה חיצונית
    1. הומוזיגוט Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry) בוגרים עם דגי זברה מסוג בר AB על ידי הצבת בוגר טרנסגני הומוזיגוטי אחד ובוגר בר AB מהמין השני באקווריום עם מחיצה ללילה. הסירו את המחיצה בתחילת מחזור האור ואספו עוברים לאחר חלון הטלה קבוע של שעתיים.
  6. זחלים טרנסגניים מסך
    1. ב-3 ימים לאחר ההפריה (DPF), יש להרדים את הזחלים באמצעות טריקאין בריכוז סופי של 160 מיקרוגרם/מ"ל.
    2. צפו בזחלים תחת מיקרוסקופ סטריאופסקופ פלואורסצנטי באמצעות מערך מסנני mCherry (עירור ~587 ננומטר, פליטה ~610 ננומטר). השתמש באותן הגדרות סינון לכל הזחלים בניסוי, כולל הגדלה אובייקטיבית, זמן חשיפה, רווח ועוצמת האור.
    3. הגדר חשיפה ורווח באמצעות זחל טרנסגני חיובי ידוע כך שפלואורסצנציה של נוירוני DA תהיה נראית בבירור ללא רוויה, ואז שמור על הגדרות אלו עבור כל הזחלים שנותרו בניסוי.
    4. אשר את נוכחות אות mCherry-חיובי הממוקם באשכולות נוירוני DA בדיאנצפלון הוונטרלי בין העיניים ובמעט בטונטרלי לקו האמצע (איור 1A).
    5. זהה זחלים חיוביים כאלה שמראים פלואורסצנציה mCherry ניתנת לזיהוי בבירור באשכולות נוירוני DA הצפויים של הדיאנצפלון הוונטרלי. סווג זחלים כשליליים אם אין אות mCherry נראה מעל הרקע תחת הגדרות הסינון הקבועות, תוך שימוש בזחלים שליליים לא טרנסגניים או ידועים כבקרות רקע.
      הערה: 3 dpf הוא השלב המוקדם ביותר שבו נוירוני DA בדיאנצפלון הוונטרלי מייצרים אות פלואורסצנטי אמין לכמות.

figure-protocol-1
איור 1: סקר טרנסגני, הטמעת הזחלים ועיצוב לוחית. (A) תמונת פלואורסצנציה (mCherry channel, 4× אובייקטיבי) של זחל דג זברה טרנסגני המבטא ניטרורדוקטאז (NTR) בנוירונים דופמינרגיים (DA), המראה אשכולות נוירוני DA בדיאנצפלון הוונטרלי בין העיניים. (B) קצות פיפטות P200 מותאמות עם חיתוך של כ-1.5 מ"מ, המשמשות להעברת זחלים במהלך הטמעת אגרוז. (ג) פריסת לוחות 96 בארות מייצגת לסינון תרופות בתפוקה גבוהה, כולל בקרת רכב, בארות שטופלו במטרונידאזול (MTZ), ותנאי תרכובת סינון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

3. אבלציה כימוגנטית ודימות פלואורסצנציה

  1. הכינו מדיום הטמעת אגרוז
    1. ביום ההטמעה ב-4dpf, יש להכין אגרוז (LMA) בנקודת התכה נמוכה של 1.2% במי Milli-Q.
    2. חממו את תמיסת האגרוז במיקרוגל במרווחים קצרים של 5–10 שניות, תוך סיבוב עדין בין המרווחים, עד שהאגרוז מומס לחלוטין והתמיסה שקופה. הימנע מחימום יתר או חימום ממושך, שעלול לשנות את ריכוז האגרוז הסופי דרך אידוי.
    3. אליקווט את האגרוז לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
    4. המיס אליקוטים בטמפרטורה של 70°C ומאוזן אותם בבלוק חום של 42°C לפני השימוש.
    5. הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת מאגר טריקאין (4 מ"ג/מ"ל) לכל אליקווט אגרוז כדי להגיע לריכוז עבודה של כ-40 מיקרוגרם/מ"ל.
    6. מערבבים טריקאין לאגרוז המותך על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה 5–10 פעמים באמצעות פיפטה P200. הימנעו ממערבות או הכנסת בועות, שכן בועות עלולות להפריע למיקום הזחל ולדמותו.
  2. הרדמה והטמעה של זחלים
    1. הוסף תמיסת מאגר טריקאין לצלחת פטרי המכילה 4 זחלים DPF להשגת ריכוז סופי של 160 מיקרוגרם/מ"ל.
    2. דגרו את הזחלים בטריקאין למשך כ-5 דקות, או עד שהם מראים אובדן שחייה ספונטנית וללא תגובה למגע עדין עם הגלאי. יש להמשיך עם הטמעה רק לאחר שמגיעים לנקודת הסיום של ההרדמה.
    3. גזמו את הקצה המרוחק של קצה פיפטת P200 באמצעות מספריים נקיים או להב סטרילי ליצירת פתח של כ-1.5 מ"מ. בדוק את גודל הפתח באמצעות סרגל או סולם מכויל תחת מיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ לפני השימוש. להשליך קצות עם קצוות מחוספסים או פתחים צרים מדי כדי שהזחלים יוכלו לעבור דרכם ללא מגע (איור 1B).
    4. שאיפת זחל יחיד בנוזל מינימלי באמצעות קצה הפיפטה המותאם.
    5. טבל את קצה הפיפטה באגרוז אליקווט.
    6. יש לחלק 40 מיקרוליטר של אגרוז המכיל זחל אחד לבאר אחת של לוח שטוח עם תחתית שטוחה עם 96 בארות. השתמש בנפח אגרוז זהה לכל הבארות בתוך הניסוי. אם משתמשים בסוג צלחת שונה, יש לייעל את נפח האגרוז לפני תחילת הניסוי ולשמור על הנפח שנבחר בכל הבארות.
      הערה: השתמש בפלטות שטוחות כדי להבטיח דימות עקבי. אופטימיזציה של נפח אגרוזות על בסיס גאומטריית הלוחות.
  3. אוריינט והטמעה של זחלים
    1. הנח את הפלטה מתחת למיקרוסקופ סטריאוסקופ (מיקרוסקופ דיסקציה).
    2. השתמשו במלקחיים דקים או בגלאי בקוטר 0.25 מ"מ כדי לכוון את הזחל כך שהדיאנצפלון הגחוני פונה אל המטרה.
    3. מקמו את הזחלים בצד הגב כלפי מטה עבור מיקרוסקופים הפוכים, או את הצד הגבי כלפי מעלה עבור מיקרוסקופים עומדים.
    4. הכיוון מלא תוך דקה עד שתיים לפני שהאגרוז מתקשה.
    5. הטמעת זחל אחד לכל באר לפי מפת לוחות של 96 בארות מוגדרת מראש. שמרו שורה A לבקרות רכב, שורה H לבקרות MTZ בלבד, והקצו שורות B–G לתנאי מורכבות מועמדים או קבוצות תגובה במינון. אקראי את מיקום התרכובות בשורות B–G כאשר אפשר כדי להפחית הטיית מיקום. השתמש באותו מפת לוחות להדמיה בסיסית ואחרי הטיפול.
    6. לאחר התמצקות אגרוזות, הוסף BEW ללא טריקאין לכל באר כדי להביא את נפח הבאר הסופי ל-200 מיקרוליטר בדיוק. השתמש באותו נפח סופי לכל הבארות בתוך הפלטה כדי לשמור על דיפוזיה וחשיפה עקבית לטיפול.
  4. הכינו פתרונות לטיפול ב-MTZ
    1. הכינו פתרונות עבודה ב-MTZ ב-BEW עם תוספת של 1% DMSO ו-200 מיקרומולים PTU. הוסיפו אבקת MTZ לתמיסה ולמערבולת עד שלא יישארו חלקיקים גלויים. ערבב על נדנדה או סיבוב צינור מוגן מאור למשך 15–30 דקות בטמפרטורת החדר. ודאו שהתמיסה שקופה וללא משקעים גלויים לפני השימוש.
    2. הכינו ריכוזים של 3, 4.5 ו-9 mM לאופטימיזציית מינון-תגובה.
    3. הכן בקרת רכב המכילה 1% DMSO ב-BEW עם 200 מיקרו-מייל PTU.
    4. הכינו רק את ריכוז ה-MTZ המאומת לסינון שגרתי לאחר אופטימיזציה.
      זהירות: MTZ רגיש לאור. הכינו תמיסות טריות לכל ניסוי, הגנו מאור באמצעות נייר כסף, ואל תשתמשו שוב בתמיסות שנותרו.
      הערה: שמרו על ריכוזי DMSO סופיים זהים בכל קבוצות הטיפול והביקורת. אל תחליף נוסחאות MTZ חלופיות.
  5. רכוש תמונות פלואורסצנציה לפני הטיפול
    1. ב-4 dpf, לאחר ההטמעה, יש לצלם תמונות פלואורסצנציה בסיסיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה עם מטרה של 20× (איור 2).
    2. דמיינו כל באר באמצעות ערוץ mCherry (עירור ~587 ננומטר, פליטה ~610 ננומטר).
    3. השתמש בהגדרות הדמיה זהות לכל הבארות בתוך הניסוי. הגדר זמן חשיפה, עוצמת תאורה ורווח הגלאי באמצעות זחל בקרה כך שהפיקסלים הבהירים ביותר של נוירון DA יגיעו לכ-70%–80% מהטווח הדינמי של הגלאי ללא רוויה. רשמו את זמן החשיפה הסופי, עוצמת האור, רווח הגלאי, מטרה ופרופיל רכישה, ושמרו על הגדרות אלו לכל התמונות הבסיסיות ואחרי הטיפול.
    4. רכוש את כל התמונות במפגש אחד כאשר ניתן כדי למזער שונות בעוצמת המנורה או ברגישות הגלאי בין נקודות זמן. למערכות עם שליטה אוטומטית בבמה, השתמשו ברכישת ריבוי מיקומים כדי לשמור על קואורדינטות זהות בין סשנים של הדמיה.
    5. שמור את פרופיל הרכישה לשימוש חוזר במהלך הדמיה לאחר הטיפול (שלב 3.7) ובניסויים הבאים.
      הערה: מטרה של 20× מספקת איזון בין שדה הראייה לרזולוציה להדמיית אשכול נוירוני DA דיאנצפליים.
  6. החלו טיפול ב-MTZ לאחר הדמיה בסיסית
    1. מיד לאחר הדמיה בסיסית ב-4dpf, הוסף תמיסה המכילה MTZ או תמיסת רכב ישירות לכל באר כדי להביא את נפח הבאר הסופי ל-200 מיקרוליטר.
    2. לניסויי סינון תרכובות, הוסף תרכובות מועמדות יחד עם MTZ בשלב זה כך שהזחלים ייחשפו לתרכובת MTZ ± במהלך אותו תקופת טיפול של 24 שעות.
    3. דגירה של לוחות ב-28.5°C במחזור אור של 14 שעות ו-10 שעות למשך 24 שעות, מ-4 DPF עד 5 DPF.
    4. הימנע מהפרעה לצלחות במהלך הדגירה.
      הערה: לניסויי תגובה במינון, העריכו זמני דגירה נוספים (למשל, 12 ו-48 שעות) כדי למקסם את תנאי הטיפול.
      נקודת הפסקה: ניתן לשמור את הלוחות בתנאי דגירה למשך תקופת הטיפול המוגדרת לפני ההדמיה.
  7. רכשו תמונות פלואורסצנציה לאחר הטיפול
    1. ב-5 dpf, יש לצלם תמונות לאחר הטיפול באמצעות אותן הגדרות מיקרוסקופ המשמשות להדמיה בסיסית ב-4 dpf, כולל זמן חשיפה, עוצמת האור, רווח גלאי, מטרה ופרופיל רכישה (איור 2).
    2. אין לשנות את זמן החשיפה, רווח הגלאי, עוצמת האור, המיקוד, המטרה או הגדרות הרכישה בין בארות או בין מפגשי הדמיה לפני הטיפול ואחריו.
    3. אם המיקרוסקופ היה כבוי בין הסשנים, טען מחדש את פרופיל הרכישה השמור ובדוק את כל ההגדרות מול הפרמטרים המוקלטים לפני ההדמיה.
    4. בארות התמונה מתבצעות באותו סדר שבו משתמשים בהדמיה בסיסית כאשר ניתן, ומקבלות את כל התמונות לאחר הטיפול באותו מפגש הדמיה.
    5. עיצוב ההדמיה המשולב הזה מבקר את השונות הבין-אישית בפלואורסצנציה של נוירוני DA בסיסיים ומבטיח שהשינויים באות ייחסו לטיפול ולא להבדלי רכישה.

figure-protocol-2
איור 2: הפחתה תלויה במינון בפלואורסצנציה של נוירוני DA לאחר טיפול במטרונידאזול. תמונות פלואורסצנציה מייצגות (mCherry channel, 20× אובייקטיבי) של זחלי דג זברה טרנסגניים המראות נוירוני DA דיאנצפליים לאחר טיפול של 24 שעות בריכוזים משתנים של MTZ. עוצמת הפלואורסצנציה יורדת בהתאם למינון, מה שמעיד על אבלציה כימוגנטית מוצלחת של נוירונים המבטאים NTR. פס קנה מידה = 50 מיקרון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

4. בדיקת סמים מבוססת לוחות בתפוקה גבוהה

  1. יצירת וסינון של זחלים טרנסגניים
    1. ליצור קבוצה חדשה של זחלים טרנסגניים הומוזיגוטיים.
    2. לאסוף עוברים ולגדל אותם ב-BEW.
    3. לטפל בעוברים עם 200 מיקרומום PTU ב-24–36 שעות לאחר ההפריה (HPF) כפי שמתואר בשלב 2.3.
    4. ב-3dpf, זחלים מסוננים באמצעות ערוץ mCherry עם הגדרות מיקרוסקופ קבועות לכל הזחלים בניסוי. הגדר את זמן החשיפה, רווח הגלאי ועוצמת התאורה באמצעות זחל חיובי ידוע כדי לזהות בבירור פלואורסצנציה של נוירון DA ללא רוויה, ואז שמור על הגדרות אלו ללא שינוי במהלך הסקר.
    5. סווג את הזחלים כחיוביים אם פלואורסצנציה ברורה של mCherry נראית באשכולות נוירוני DA הצפויים של הדיאנצפלון הוונטרלי תחת הגדרות סקר קבועות. להשליך זחלים ללא אות מעל הרקע באזור זה או עם פלואורסצנציה חלשה, מפוזרת או חוץ-רחמית.
  2. הטמעת זחלים ורכישת תמונות בסיסיות
    1. ב-4 dpf, הטמעת זחלים בלוח של 96 בארות כפי שמתואר בשלבים 3.2–3.3, תוך שימוש בזחל אחד לכל באר.
    2. רכשו תמונות פלואורסצנציה בסיסיות לפני הטיפול כפי שמתואר בשלב 3.5.
  3. החלו MTZ ותרכובות מועמדות
    1. לאחר קבלת תמונות פלואורסצנציה בסיסיות ב-4 DPF, הוסף תמיסות טיפול ישירות לבארות לפי מפת הלוחות (איור 1C).
    2. לבארות בקרת רכב, הוסף BEW המכיל את אותו ריכוז DMSO סופי המשמש בבארות מטופלות בתרכובות.
    3. לבארות בקרה עם MTZ בלבד, הוסף תמיסת MTZ ללא תרכובת מועמדת.
    4. לבארות סינון מורכבות, יש להוסיף את MTZ והתרכובת המועמדת כך שהזחלים ייחשפו לשניהם באותה תקופת טיפול של 24 שעות.
    5. לסינון ראשוני, יש להשתמש בריכוז תרכובת יחידה, כמו 10 מיקרומון, אלא אם כן מסיסות, רעילות או נתוני תגובה במינון ספציפיים לתרכובת מצביעים על ריכוז שונה.
    6. כוון כל באר לנפח סופי של 200 מיקרוליטר. שמור על ריכוזי DMSO סופיים זהים בכל הבארות, כולל בקרת רכב, בקרת MTZ בלבד, ו-MTZ בתוספת בארות מורכבות.
    7. דגירה של לוחות ב-28.5°C במחזור אור של 14 שעות ו-10 שעות למשך 24 שעות, מ-4 DPF עד 5 DPF.
      הערה: פרוטוקול זה אינו כולל הסרת MTZ או שטיפה לפני חשיפה לתרכובת. תרכובות מועמדות מיושמות במקביל ל-MTZ מיד לאחר הדמיה בסיסית.
  4. צלם תמונות לאחר הטיפול וחשב שמירת פלואורסצנציה
    1. ב-5 dpf, יש לצלם תמונות פלואורסצנציה לאחר הטיפול באמצעות אותן הגדרות רכישה ששימשו להדמיה בסיסית ב-4 DPF.
    2. בארות תמונה באותו סדר המשמש בהדמיה בסיסית ככל שניתן.
    3. חשב שמירת פלואורסצנציה לכל זחל כך:
      figure-protocol-3
    4. נרמול ערכי שמירת הפלואורסצנציה לערך הבקרה הממוצע של הרכב מאותו לוחית.
    5. זהה תרכובות הגנה מועמדות כאלו עם ערכי שמירה על פלואורסצנציה גבוהים משמעותית מביקורת MTZ בלבד.
  5. זיהוי תרכובות פגיעה
    1. זהה תרכובות פגיעה כאלו עם יחס שמירת פלואורסצנציה גבוה משמעותית מקבוצת ביקורת שלילית (MTZ-בלבד).
    2. בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות מבחן ה-t של וולש להשוואה בין קבוצות ביקורת עם MTZ בלבד עם קבוצות טיפול ב-MTZ פלוס תרכובות.
    3. אימות תרכובות פגיעה באמצעות שכפולים ביולוגיים עצמאיים ובדיקות תגובה במינון. אשר פגיעות כתרכובות שמגבירות באופן שכפולי את שמירת הפלואורסצנציה יחסית לבקרת MTZ בלבד, עם p < 0.05 וללא רעילות נראית לעין של הזחל או מורפולוגיה חריגה.
    4. פגיעות מאומתות מראש לבדיקות משניות כגון ניתוח התנהגותי מוטורי, אימות מינון-תגובה, או בדיקות שכפול ביולוגיות עצמאיות.
      הערה: למסכי ספריית תרכובות, חשב את מקדם ה-Z לכל לוח באמצעות בקרות חיוביות ושליליות. מקדם Z > 0.5 מצביע על מבחן חזק המתאים לזיהוי פגיעה.

5. הערכת התנהגות מוטורית

  1. הקצאת הזחלים לקבוצות טיפול
    1. ב-4 dpf, הקצו את הזחלים מכל גנוטיפ לשלוש קבוצות טיפול עם לפחות 10 זחלים בכל קבוצה: BEW בלבד, בקרת כלי רכב DMSO וטיפול MTZ.
    2. הקצו קבוצות כדלקמן: (1) BEW בלבד (קו בסיס לא מטופל), (2) 1% בקרת כלי רכב DMSO, ו-(3) ריכוז MTZ אופטימלי (4.5 mM ב-1% DMSO/BEW עם 200 מיקרו-מ-PTU).
    3. כלול זחלים מסוג בר מסוג AB שטופלו ברכב או ב-MTZ בתנאים זהים. אשר השפעות התלויות ב-NTR אם MTZ מפחית תנועה ב-Tg(th:Gal4; זחלי UAS:NTR-mCherry) אך לא בזחלים מסוג בר AB.
  2. לבצע טיפול וזחלי לוחות
    1. לטפל בזחלים במשך 24 שעות בטמפרטורה של 28.5°C בהתאם לתנאים המוגדרים בשלב 5.1.2: BEW בלבד, 1% בקרת כלי רכב DMSO, או 4.5 mM MTZ ב-1% DMSO/BEW עם 200 מיקרו-מטר PTU.
    2. העבר חמישה זחלים לכל באר של לוח בן 6 בארות המכיל 2.5 מ"ל BEW טרי באמצעות פיפטת העברה רחבת קינה. מזער את נפח הנשיאה וטפל בזחלים בעדינות כדי להימנע מלחץ או פציעה.
      הערה: שימוש בחמישה זחלים בכל באר מאזן את תפוקת הנתונים ומפחית צפיפות יתר. צפיפויות גבוהות יותר מגבירה את חציית השביל ומכניסות שגיאות מעקב בניתוח התנהגותי.
  3. הגדרת תנאי תאורה
    1. הניחו את פלטת 6 הבארים על משטח תאורה LED לבן עם תאורה מפוזרת אחידה שנשמרת ב-25°C–28°C. השתמש באותו משטח אור, הגדרת בהירות ומיקום לוח בכל ההקלטות בניסוי (איור 3A).
    2. האיר את הלוח מלמטה ומלמעלה באמצעות מקורות אור מפוזרים כדי למזער צללים, סנוור והשתקפויות.
  4. הגדרת הגדרת הקלטת וידאו
    1. התקן מצלמה ברזולוציה גבוהה במצב קבוע מלמעלה למטה מעל הלוח באמצעות תמיכה יציבה (למשל, חצובה או תושבת זרוע) (איור 3B).
    2. הנח סרגל סמוך ללוח בשדה הראייה לכיול מרחבי.
    3. ודאו שהמצלמה ניצבת לפני הלוח כדי למזער עיוות פרלקה.
  5. תיעוד פעילות תנועה
    1. לבצע הקלטות במהלך שלב האור במחזור האור של 14 שעות:10 שעות כהה כדי למזער את השונות הצירקדית.
    2. אפשר לזחלים להסתגל במשך שעה לפני הרישום.
    3. תיעד פעילות תנועה למשך 60 דקות.
    4. אל תפריע להגדרות במהלך ההקלטה.
      הערה: בצע הקלטות באותה שעה ביום בכל הניסויים כדי למזער שונות צירקדית.
  6. הגדרת תוכנת מעקב התנהגותי
    1. ייבא את הווידאו המוקלט ל-EthoVision XT (תוכנת מעקב התנהגותי) (איור 3C).
    2. הגדר את ההגדרות הבאות: 6 זירות, 5 נושאים בכל זירה, זיהוי נקודת מרכז, מרחק במילימטרים, וזמן בשניות.
    3. כיילן את הסקאלה המרחבית באמצעות הסרגל שנמצא במסגרת הווידאו.
    4. הגדר גבולות ארנה לכל באר, תוך הבטחה שכל ארנה מכילה את פנים הבאר מבלי להתרחב מעבר לקצוות הבארות.
  7. אופטימיזציה של הגדרות זיהוי
    1. יצירת תמונת ייחוס באמצעות ממשק התוכנה (הגדרות זיהוי → תמונת ייחוס → התחל ללמוד).
    2. כוון את סף הגילוי כדי להבטיח מעקב מדויק אחרי כל הזחלים ללא גילוי שגוי.
    3. הרץ רכישת מבחן קצר (~2 דקות).
    4. בדוק את המסלולים המעקבים ויזואלית לפני שמתקדמים לניתוח מלא. אשר שכל הזחלים מזוהים ושהבועות, הפסולת, ההשתקפויות או קצוות הבאר אינם מזוהים בטעות כזחלים.
      הערה: ארטיפקטים נפוצים כוללים מעקב קצוות הנגרם מזירות גדולות מדי, זיהוי שגוי מבועות או פסולת, ואובדן מעקב במהלך חוסר פעילות ממושך.
    5. להוציא בארות מהניתוח אם כשל מעקב מתמשך, חציית מסלולים מופרזת, פסולת או בועות נראות, זחלים מתים, מורפולוגיה חריגה, או זחלים הכלואים בקצה הבאר מונעים כימות אמין.
    6. יישמו את אותם קריטריונים להדרה על כל קבוצות הטיפול לפני ניתוח סטטיסטי.
  8. ביצוע ניתוח מלא וייצא נתונים
    1. הרץ את כל תהליך הרכישה.
    2. יצירת ויזואליזציות של מסלולים ומפות חום (ניתוח → תוצאות → מסלולים ומפות חום).
    3. ייצא את גיליון הנתונים הגולמי המכיל מדדים לכל נבדק, כולל סך המרחק שנעבר (mm), מהירות ממוצעת (mm/s) ומספר התקפי תנועה.
    4. השתמשו במרחק הכולל שנלקח מעל 60 דקות כנקודת הסיום הראשית של המנוע (איור 3D).

figure-protocol-4
איור 3: הגדרת רישום התנהגותי מוטורי ותהליך ניתוח. (א) התקנה ניסיונית המציגה צלחת בעלת 6 בארות המכילה זחלי דגי זברה, הממוקמת על משטח אור עם סרגל לכיול מרחבי ומקור חום מבוקר טמפרטורה לשמירה על תנאי ניסוי. (ב) הגדרת רכישת וידאו עם מצלמה מלמעלה המשמשת להקלטת תנועת הזחל, עם שכבת מעקב מייצגת. (ג) מעקב התנהגותי מבוצע באמצעות EthoVision XT (תוכנת מעקב התנהגותי), המציג זיהוי ומעקב אוטומטי של תנועת הזחלים. (ד) סיכום זרימת העבודה המתאר את השלבים מרכישת וידאו ועד לניתוח כמותי של התנהגות תנועה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

6. ניתוח נתונים

  1. הכינו תמונות לניתוח
    1. זוגות תמונות פתוחים לפני ואחרי הטיפול בפיג'י (ImageJ, תוכנת ניתוח תמונה).
    2. אם תמונות נרכשות כ-Z-stacks, נוצר הקרנות בעוצמה מקסימלית (מחסניות תמונה → → פרויקט Z → עוצמה מקסימלית).
    3. כוון בהירות/ניגודיות באמצעות הגדרות תצוגה קבועות זהות לכל התמונות בתוך מאגר נתונים. אין להשתמש בקנה מידה אוטומטי למדידות כמותיות, ולבצע כימות פלואורסצנציה על התמונות המקוריות הלא מותאמות.
  2. הגדרת אזורי עניין (ROI)
    1. השתמשו בכלי בחירת הפוליגונים כדי לשרטט ROI סביב אשכול נוירוני DA דיאנצפליים בתמונה שלפני הטיפול. הגדר את גבול ה-ROI באמצעות נקודות ציון אנטומיות הנראות בתמונה הפלואורסצנטית, כולל הקצוות המדיאליים של העיניים וקו האמצע התחתוני של הדיאנצפלון (איור 2). ודא שה-ROI כולל את כל אשכול נוירוני DA מבלי להתרחב למבנים פלואורסצנטיים סמוכים. לצורך עקביות בין אופרטורים, שמרו תבנית ROI מייצגת והפיצו אותה לכל חברי הצוות כהתייחסות מרחבית.
    2. לחץ על "t" כדי להוסיף את ה-ROI למנהל ה-ROI.
    3. יישר את התמונות לפני ואחרי הטיפול באמצעות נקודות ציון אנטומיות, כולל העיניים והדיאנצפלון הגחני, לפני יישום ה-ROI. יש להחיל את אותו ROI על התמונה התואמת לאחר הטיפול רק לאחר אישור היישור.
    4. שמור את כל ה-ROI עבור כל לוח כדי לאפשר שחזוריות וניתוח מחדש.
  3. כמת עוצמת פלואורסצנציה
    1. הגדר הגדרות מדידה (ניתוח → הגדרת מדידות) ובחר "שטח" ו"ערך אפור ממוצע".
    2. מדדו כל תמונה (ניתוח → מדידות).
    3. למדוד פלואורסצנציה רקע מאזור לא נוירוני סמוך בתוך אותה תמונה ולהחסיר אותה ממדידת ROI של נוירון DA. חשב צפיפות משולבת מתוקנת רקע כך: IntDen מתוקן = IntDenROI − (areaROI × רקע ממוצע).
    4. חשב את יחס שמירת הפלואורסצנציה לכל זחל כ-IntDen (לאחר טיפול) / IntDen (לפני טיפול).
    5. נרמול את יחסי שמירת הפלואורסצנציה לערך הבקרה הממוצע של הרכב מאותו לוחית. חשב את ממוצע בקרת הרכב בנפרד עבור כל לוחית לפני השוואת קבוצות טיפול19.
      הערה: לניתוח בתפוקה גבוהה יותר, בצע את אותה כימות באמצעות CellProfiler (תוכנת ניתוח תמונות) עם זיהוי ROI אוטומטישל 20.
  4. בצע ניתוח סטטיסטי זוגי
    1. להשוואות בין קבוצת טיפול אחת לקבוצת ביקורת, יש לבצע מבחן t וולש דו-זנבי לא מזווג, שאינו מניח שונות שווה בין הקבוצות.
    2. השתמש במבחן זה כאשר השונות משתנה בין הקבוצות.
  5. ביצוע ניתוח סטטיסטי רב-קבוצתי
    1. לבצע ANOVA חד-כיווני לניסויים הכוללים מספר קבוצות טיפול.
    2. יישם את מבחן הפוסט-הוק של דאנט כדי להשוות כל קבוצת טיפול לקבוצת הביקורת באמצעות GraphPad Prism או תוכנה סטטיסטית מקבילה.
  6. דיווח על תוצאות סטטיסטיות
    1. הגדר את סף המובהקות על α = 0.05.
    2. דווח על ערכי p מדויקים במקום ספים קטגוריים.
    3. הצג נתונים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM) עם נקודות נתונים בודדות המונחות כגרפים פיזור באמצעות GraphPad Prism או תוכנת גרפים מקבילה.
    4. גודל מדגם דוח (n), מבחן סטטיסטי, סטטיסטיקת מבחן, דרגות חופש, וערך p מדויק באגדות האיור. למערכי נתונים גדולים, כלול פלטים סטטיסטיים מלאים בטבלה משלימה.
      הערה: לבדיקות סינון, יש לחשב את מקדם ה-Z עבור כל לוח כ-Z = 1 − [3(σp + σn)/|μp − μn|], כאשרσ p ו-μp הם סטיית התקן וממוצע קבוצת הביקורת של כלי הטיס,ו-σ n ו-μn הם סטיית התקן והממוצע של קבוצת הביקורת של MTZ בלבד. גורם Z > 0.5 נחשב מקובל לסקר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

טיפול ב-MTZ גורם לאובדן נוירון דופמינרגי תלוי במינון ולפגיעה בתנועה

כדי לקבוע את הפרמטרים האופטימליים לאבלציה בתיווך MTZ של נוירוני DA, הוערכו עוצמת הפלואורסצנציה, ששימשה כמדד להישרדות נוירוני DA, ומרחק התנועה לאורך ריכוזי MTZ של 3, 4.5 ו-9 מ"מ לאחר טיפול של 24 שעות. כל קבוצת טיפול כללה n = 10 Tg בודדים (th:Gal4; זחלים של UAS:NTR-mCherry) עם קבוצת ביקורת תואמת (1% DMSO ב-BEW עם 200 מיקרומום PTU, n = 10). הזחלים נגזרו מקן בודד שנאסף ממגדלים הומ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מציע צינור ניתן להרחבה, in vivo, לכימות אובדן נוירוני DA ולסינון תרכובות נוירופרוגנטיות באמצעות מערכת הכימוגנטית NTR–MTZ בדגי זברה טרנסגניים. תהליך העבודה הסטנדרטי, המבוסס על לוחות, פותח במיוחד עבור צוותי מחקר לתואר ראשון, כאשר תחלופת המפעילים גבוהה וניסיון החוקרים משתנה בין סמסטרים אקדמיים. כל שלב בזרימת העבודה בנוי כך שיעדיף שחזוריות וקלות האימון, מה שיאפשר ביצוע עקבי בין מספר משתמשים עם מינימום שונות. פרוטוקול זה מקדם שיטות נוירודגנרציה קיימות מבוססות דגי זברה על ידי שילוב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי עניינים פיננסיים.

תודות

אנו מודים לד"ר סו גואו (אוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו) על אספקת דג הזברה הטרנסגני, ולד"ר דאיסוק אום, ד"ר מייקל פרסונס ואדי הלו (אוניברסיטת קליפורניה, אירוויין) על מתן עוברים מסוג בר והכוונה בנושאי גידול דגי זברה ותחזוקת מתקני דגים. אנו גם מודים לצוות מרכז החדשנות המולקולרית רוברט א. מה ובניין החדשנות Falling Leaves (אוניברסיטת קליפורניה, אירוויין) על מתן תשתיות למתקן המים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תזונה לדגי זברה בוגרים, כדורים בגודל 0.5 מ"מZeiglerAH271משמשים להאכלת דגי זברה בוגרים במהלך טיפול שגרתי
אגרוזה, עם נקודת התכה נמוכה (LMA)Sigma-AldrichA9414-10Gמשמשים לשיבוץ זחלים בבארות לצורך מיצוב יציב במהלך הדמיה
רדיד אלומיניוםULINES-20197משמש להגנה על ריאגנטים רגישים לאור כמו MTZ במהלך הכנה ודגירה
CellProfilerBroad InstituteRRID: SCR_007358משמש לניתוח אוטומטי אופציונלי של תמונות פלואורסצנטיות
צינורות חרוטיים, 15 מ"לCorning352097משמשים להכנת ריאגנטים ולטיפול בדגימות
צינורות חרוטיים, 50 מ"לCorning352070משמשים להכנת ריאגנטים ואחסון תמיסות
טנקים לגידול (1.0 ליטר)AquaneeringZHCT100משמשים לגידול מבוקר של דגי זברה ואיסוף עוברים
Danio rerio (AB סוג בר)——קו שליטה לא טרנסגני המשמש לאישור ספציפיות של השפעות תלויות ניטרורדוקטאז
Danio rerio (Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry))——קו דגי זברה טרנסגני המבטא ניטרורדוקטאז-mCherry בנוירונים דופאמינרגיים לצורך השמדה כימוגנטית ממוקדת
דמתיל סולפוקסיד (DMSO), ללא מים (≥99.9%)Sigma-Aldrich472301-500MLממס ל-PTU, MTZ ותרכובות לסינון
EthoVision XTNoldusRRID: SCR_000441תוכנת מעקב התנהגותי המשמשת לכימות תנועת זחלים
Fiji (ImageJ)NIHRRID: SCR_003070תוכנת ניתוח תמונות המשמשת לכימות פלואורסצנציה
מלקטות עם קצה דק או מחוט 0.25 מ"מWorld Precision InstrumentsWPI0118משמשים לכיוון זחלים במהלך הטמעה באגרוזה
מיקרוסקופ פלואורסצנטיZeiss11845460משמש להדמיה של נוירונים דופאמינרגיים באמצעות פלואורסצנציה של mCherry
Gemma Micro 150 ZF (תזונה לצעירים, 100–200 μמ)Skretting10818945משמשים להאכלת דגי זברה צעירים
Gemma Micro 75 ZF (תזונה לזחלים, 50–100 μמ)Skretting10818935משמשים להאכלת זחלי דגי זברה
GraphPad PrismGraphPadRRID: SCR_002798תוכנת ניתוח סטטיסטי המשמשת לניתוח נתונים וציור
בלוק חום (יכולת 42°C ו-70°C)Thermo Fisher88870001משמש להמסה ושמירה על אגרוזה בטמפרטורות מבוקרות
מצלמת גבוהה ברזולוציה (תואמת להתקנה מלמעלה)Basler88-327משמשת להקלטת פעילות תנועתית של זחלים
חומצה הידרוכלורית (HCl), 0.1 מ"מFisher ScientificSA48-500משמשת להתאמת pH במהלך הכנת טריקאין
דגירה (28.5°C, 14 שעות אור:10 שעות חושך)MilliporeZ763314משמרת תנאי סביבה מבוקרים לפיתוח דגי זברה
מלח ים Instant OceanInstant OceanSS15-10משמש להכנת מים ביצה כחולים (BEW)
גיליון מפזר אור (או שווה ערך)Edmund Optics27-103משמש למתן תאורה אחידה ומיזעור זוהר במהלך הקלטת התנהגות
לוח אורLightcraftLC2004LEDמספק תאורה תחתונה במהלך מעקב תנועה
מטרונידזול (MTZ)Sigma-AldrichM3761-100Gמשמש להרס כימוגנטי של נוירונים דופאמינרגיים
כחול מתילן, תמיסה מימית 1%Sigma-AldrichM9140מוסיף ל-BEW למניעת צמיחת מיקרואורגניזמים בעוברים
צינורות מיקרוצנטריפוגה, 1.5 מ"לEppendorf22363204משמשים לחלוקת ריאגנטים ואחסון
מיקרופיפטה, P200GilsonFP10005Sמשמשת לטיפול בזחלים והכנת תמיסות
צלחות פטרי, 100 מ"מCorningCLS430167משמשים לאיסוף עוברים ודגירה
קצות פיפטה, 200 μלRAININ30389188משמשים

מקורות

  1. Haynes, E. M., Ulland, T. K., Eliceiri, K. W. A model of discovery: the role of imaging established and emerging non-mammalian models in neuroscience. Front Mol Neurosci. 15, 867010 (2022).
  2. Yang, W., Chen, X., Li, S., Li, X. J. Genetically modified large animal models for investigating neurodegenerative diseases. Cell Biosci. 11 (1), 218 (2021).
  3. Dodiya, R., et al. Zebrafish-based Parkinson’s disease models: unveiling genetic mechanisms and therapeutic pathways. CNS Neurol Disord Drug Targets. 24 (12), 900-920 (2025).
  4. Wasel, O., Freeman, J. L. Chemical and genetic zebrafish models to define mechanisms of and treatments for dopaminergic neurodegeneration. Int J Mol Sci. 21 (17), (2020).
  5. Kozol, R. A., et al. Function over form: modeling groups of inherited neurological conditions in zebrafish. Front Mol Neurosci. 9, 55 (2016).
  6. Jang, H., Kim, S. H., Koh, Y., Yoon, K. J. Engineering brain organoids: toward mature neural circuitry with an intact cytoarchitecture. Int J Stem Cells. 15 (1), 41-59 (2022).
  7. Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. J Pharm Bioallied Sci. 6 (1), 2-9 (2014).
  8. Malik, N., et al. Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons. Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).
  9. Hasani, H., et al. Whole-brain imaging of freely-moving zebrafish. Front Neurosci. 17, 1127574 (2023).
  10. Mattern, K., von Trotha, J. W., Erfle, P., Köster, R. W., Dietzel, A. NeuroExaminer: an all-glass microfluidic device for whole-brain in vivo imaging in zebrafish. Commun Biol. 3 (1), 311 (2020).
  11. Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using selective plane illumination microscopy. Front Neural Circuits. 7, 65 (2013).
  12. Noda, S., et al. Aging-related motor function and dopaminergic neuronal loss in C57BL/6 mice. Mol Brain. 13 (1), 46 (2020).
  13. Godoy, R., et al. Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae. J Neurochem. 135 (2), 249-260 (2015).
  14. Schallert, T., Tillerson, J. L. Intervention strategies for degeneration of dopamine neurons in parkinsonism: optimizing behavioral assessment of outcome. Cent Nerv Syst Dis. , 131-151 (2000).
  15. Westerfield, M. . The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
  16. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
  17. Nipu, N., et al. Methylene blue at recommended concentrations alters metabolism in early zebrafish development. Commun Biol. 8 (1), 120 (2025).
  18. Ohnesorge, N., et al. Assessment of the effect of tricaine (MS-222)-induced anesthesia on brain-wide neuronal activity of zebrafish larvae. Front Neurosci. 18, 1456322 (2024).
  19. Schroeder, A. B., et al. The ImageJ ecosystem: open-source software for image visualization, processing, and analysis. Protein Sci. 30 (1), 234-249 (2021).
  20. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
  21. Kim, G. H. J., et al. A zebrafish screen reveals renin-angiotensin system inhibitors as neuroprotective via mitochondrial restoration in dopamine neurons. eLife. 10, (2021).
  22. Kim, G. H. J., et al. In vivo dopamine neuron imaging-based small molecule screen identifies novel neuroprotective compounds and targets. Front Pharmacol. 13, 837756 (2022).
  23. Aponte, P. M., Gutierrez-Reinoso, M. A., Garcia-Herreros, M. Bridging the gap: animal models in next-generation reproductive technologies for male fertility preservation. Life (Basel). 14 (1), (2023).
  24. Fen, W., et al. A review for cell-based screening methods in drug discovery. Biophys Rep. 7 (6), 504-516 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

אבליציה כימוגנטיתטיפול במטרונידזולמודל למחלת פרקינסוןפעילות מוטוריתסריקת תרופותתרכובים נוירו-פרוטקטיביים
פנוטיפינג חי של נוירודגנריות דופמינרגית בזחלי דגי זברה באמצעות ניתוח התנהגותי ודימות תוכן גבוה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.