בדיקת יחידה ליצירת מושבות מותאמת לתאי מונו-גרעין בדם שמקורם במח עצם ובדם היקפיים שמקורם במטופל

סיכום

פרוטוקול זה מתאר הליך להשראת התמיינות של תאי גזע וקדמון המטופואטיים אנושיים שמקורם בתאי מח עצם של המטופל ותאי דם חד-גרעיניים היקפיים. הבדיקה משתמשת במדיום תרבית חצי-מוצק התומך במחויבות לשושלת אריתרואיד ומיאלואידית ומשלבת מדדים סטנדרטיים לסיווג מושבות שניתן לשחזור לצורך אפיון תרופות פרה-קליני.

תקציר

בדיקת יחידת יצירת מושבות (CFU) היא טכניקה בסיסית לחקר מחלות המטולוגיות, כולל תסמונות מיאלודיספלסטיות (MDS) ולוקמיה מיאלואידי חריפה (AML). מבחן זה עושה שימוש במדיה חצי-מוצקה בתוספת שילובי ציטוקינים מוגדרים לתמיכה בצמיחה תלת-ממדית ובהבדלה ייחודית לשושלת של תאי אב אריתרואידים ומיאלואידים. עם זאת, דגימות דם ומח עצם היקפיים שמקורן מטופלים מציבות אתגרים טכניים בשל ירידה בחיוניות, רגישות מוגברת לטיפול ושונות בגידול המושבות. יתרה מזאת, ההנחיות הקיימות לזיהוי וספירת מושבות מראות שונות משמעותית בהגדרת גודל המושבה וסוגי השושלת, מה שמגביל את השחזור בין מחקרים. הפרוטוקול המתואר כאן מותאם לצמיחה ולהבדיל של תאי גזע וקדמון המטופואטיים שהופרדו מדגימות מטופלים של MDS ו-AML. הפרוטוקול מדגיש טיפול עדין בתאים, עיבוד סטרילי של דגימות מטופלים, תנאי תרבית אופטימליים ומשך גדילה המותאמים לתאים שמקורם במטופל. פרוטוקול זה מספק מסגרת מעשית לבדיקות CFU באמצעות דגימות שמקורן מטופלים ומבסס מדד סטנדרטי לספירת מושבות עקביות וניתוח במחקר ממאירויות המטולוגיות.

מבוא

המטופואזיס הוא תהליך מוסדר היטב שבו תאי גזע המטופואטיים (HSCs) השוכנים בנישות מח עצם יוצרים את כל קווי תאי הדם הבוגרים. באמצעות סדרה היררכית של אירועי התמיינות, HSCs מייצרים אבות רב-עוצמתיים המתחייבים בהדרגה לקווים אדומים, מיאלואידים ולימפואידים לפני שהם עוברים הבשלה סופית לתאי דם תפקודיים. תהליך זה נשלט על ידי איתות מתואם בתוך מיקרו-סביבת מח העצם ועל ידי מנגנוני ויסות שעתוק ואפיגנטיים פנימיים. הפרעות למסלולי הוויסות הללו, במיוחד באמצעות הצטברות מוטציות גנטיות או סומטיות ב-HSCs, עלולות לפגוע בהבדלות תקינה ולהוביל להתרחבות קלונית של אבות לא תקינים. שינויים כאלה עלולים בסופו של דבר לגרום להפרעות המטולוגיות המאופיינות בהמטופואיזיס וציטופניות לא יעילות, כולל תסמונות מיאלודיספלסטיות (MDS) ולוקמיה מיאלואידית חריפה (AML)1,2,3,4,5.

בדיקת יחידת יצירת מושבות (CFU) היא טכניקה מבוססת במבחנה להערכת פוטנציאל ההתמיינות של תאי גזע וקדמון המטופואטיים (HSPCs). במקור פותחה כבדיקה קצרה טווח למדידת יכולת ההתרבות וההתמיינות של אבות המטופואטיים ^6,7,8, ומאז הפכה הבדיקה לכלי נפוץ הן בהמטולוגיה קלינית והן בניסוייה. במעבדות פרה-קליניות, הבדיקה משמשת לעיתים קרובות להערכת השפעת הפרעות גנטיות או טיפולים מועמדים על התמיינות המטופואטית. בהקשר של מחקרי MDS ו-AML, מבחני CFU מספקים קריאה פונקציונלית להבנת האופן שבו שינויים מולקולריים וגנטיים משפיעים על יכולת ההבדלה של מח עצם או תאי דם היקפיים שמקורם במטופל.

בדיקת CFU כוללת גידול HSPCs בתווך חצי-מוצק מבוסס מתילצלולוז, בתוספת גורמי גדילה מוגדרים התומכים בהרחבה ובהתמיינות ייחודית לשושלת. בתנאים אלו, תאי אב מתרבים ויוצרים מושבות נפרדות, שניתן לסווג אותן מורפולוגית לפי זהות שושלת. בפרוטוקול זה נעשה שימוש בתווך חצי-מוצק מבוסס מתילצלולוז הזמין מסחרית, המותאם להבדלת אריתרואידים ומיאלואידים. המדיום מכיל שילוב של ציטוקינים, כולל אינטרלוקין-3 (IL-3), אינטרלוקין-6 (IL-6), פקטור תאי גזע (SCF), אריתרופויטין (EPO), גורם מגרה מושבות גרנולוציטים (G-CSF), ופקטור מגרה מושבות גרנולוציטים-מקרופאגים (GM-CSF). יחד, גורמים אלו תומכים בצמיחת אבות אריתרואידים כגון אריתרואיד יחיד יוצר מושבות (CFU-E) ואריתרואיד יחיד יוצר פרץ (BFU-E), אבות גרנולוציטים-מקרופאגים מיאלואידיים (CFU-GM), ופרוגניטורים רב-עוצמתיים כגון גרנולוציט, אריתרוציטים, מונוציטים, אבות מגהקריוציטים (CFU-GEMM)^10,11.

למרות השימושיות הרחבה שלו, המדיום הסמי-מוצק שהוזכר לעיל מוגבל ביכולת ההבחנה שלו, שכן הוא אינו תומך כראוי בהבחנה של מגהקריוציטים וטסיות דם. ליישומים אלו, נוסחאות מתמחות יותר הכוללות גורמי גדילה של טסיות הן מתאימות יותר; עם זאת, הם מחוץ לתחום הפרוטוקול המפורט. בסך הכל, באמצעות בחירה קפדנית של נוסחת המדיה בשילוב עם הערכה מורפולוגית וניתוחים במורד הזרם כגון ציטומטריית זרימה, חוקרים יכולים להעריך ביעילות את רגישות התרופות באמצעות ניתוח מחויבות שושלת ופוטנציאל התמיינות¹².

במחקר זה, בדיקת CFU משמשת לבחינת הפוטנציאל הטיפולי של טיפולים משולבים לטיפול ב-MDS בסיכון גבוה שחוזר/עמיד. פירימתמין הוא אנטיפולאט מאושר קלינית המשמש לטיפול בטוקסופלזמוזה ומלריה טפילית, ונחקר לאחרונה כסוכן אנטי-סרטן 13,14,15. מחקרים עדכניים הראו כי טיפול בפיריתממין עשוי לפעול באמצעות עיכוב מסלולים מרכזיים המווסתים את סינתזת פירימידין דה נובו¹⁶. כאן בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בבדיקות CFU לבחינת היעילות הקלינית של פיריתמין כטיפול יחיד וכטיפול משולב עם Venetoclax, שהוא טיפול קו ראשון לטיפול MDS ו-AML^17,18.

למרות השימושיות הנרחבת שלה, מבחן ה-CFU מציב מספר מגבלות טכניות. זיהוי וסיווג מושבות נשענים במידה רבה על קריטריונים מורפולוגיים, שיכולים להכניס שונות בין הצופים ובין מרכזי מחקר 6,19,20,21. בנוסף, דגימות שמקורן במטופלים מאנשים עם MDS או AML מראות לעיתים קרובות ירידה בחיוניות התאים, שבריריות מוגברת והטרוגניות, מה שעלול לסבך את יצירת המושבות ואת הניתוחים בהמשך. הכנת מושבות לאפיון נוסף, כולל ציטומטריית זרימה, עשויה לדרוש טיפול זהיר לשמירה על שלמות התא. היעדר נהלים סטנדרטיים לזיהוי, ספירה וניתוח מושבות תורם עוד יותר לשונות בין המחקרים. שיקולים טכניים אלו מדגישים את הצורך בהליכים סטנדרטיים המותאמים במיוחד לדגימות המטופואטיות שמקורן במטופל.

פרוטוקול זה מתאר תהליך עבודה אופטימלי לביצוע בדיקות CFU באמצעות תאים מונו-גרעיניים שמקורם במח עצם ראשוני או דגימות דם היקפיות של מטופלים עם ממאירות המטולוגית. הגישה מתמקדת באסטרטגיות מעשיות לטיפול בתאים רגישים שמקורם במטופלים, הקמת תנאי תרבית אמינים ויישום קריטריונים עקביים לזיהוי וכימות מושבות. על ידי מתן הנחיות מתודולוגיות מפורטות והדגשת שיטות ניתנות לשחזור, פרוטוקול זה שואף להקל על הערכה אמינה יותר של התמיינות המטופואטית ותגובה טיפולית במחקרים פרה-קליניים של MDS ו-AML.

פרוטוקול

מחקר זה עושה שימוש בדגימות ביולוגיות אנושיות שאינן מזוהות, שהושגו מבנק ביולוגי במסגרת פרוטוקול מאושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית, "ביולוגיה מולקולרית של הפרעות המטולוגיות שפירות וממאירות" (פרוטוקול IRB #200536), במכללת אלברט איינשטיין/מרכז רפואי מונטיפיורי. כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות אתיות מוסדיות. כל החומרים והציוד מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת מח עצם שמקורם במטופל או בתאי דם מונו-גרעיניים היקפיים

הערה: לפי הנחיות נפוצות לטיפול בדגימת מטופלים, מומלץ ללבוש מעיל מעבדה באורך מלא וכפפות חד-פעמיות עמידות לדמעות, ולעבוד מתחת למכסה תרבית תאים במעבדה להגנה אישית מחשיפה לפתוגנים המועברים בדם. כל קצות הפיפטה והפיפטות הסרולוגיות שבאות במגע עם תאי המטופל צריכות להיות מושרות בתמיסת אקונומיקה של 10% לפחות 30 דקות לפני ההשלכה בפסולת ביולוגית מסוכנת.

1. הכנה ניסיונית
   1. מדיה חמה של IMDM, סרום בקר עוברי (FBS), ואנטיביוטיקה של פניצילין-סטרפטומיצין (Pen-Strep) עד 37 מעלות צלזיוס למשך לפחות 30 דקות.
   2. הפשרת מדיה חצי-מוצקה ב-4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. ביום ההגשה, חמם את הבקבוק לטמפרטורת החדר (RT) לפחות 30 דקות.
   3. חטא את מכסה התרבית עם חיטוי UV למשך 15 דקות, ואז רסס את משטחי המנוע, הפיפטות ומדפי הצינורות ב-70% אתנול (EtOH).
   4. הכינו בקבוק פסולת המכיל תמיסת אקונומיקה של 10% גדולה מספיק לאסוף קצות פיפטות מזוהמות ופיפטות סרולוגיות.
   5. השגת מח עצם או תאי דם חד-גרעיניים היקפיים המבודדים באמצעות שיטות צנטריפוגציה של גרדיאנט צפיפות. ניתן להשתמש בתאים באותו יום איסוף או מדגימות ביולוגיות קפואות.
2. אם דגימות מוקפאות, יש להפשיר אותן במהירות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד שרוב הקרח נמס ונשאר רק גביש קרח קטן. מניחים את הדגימות מיד על הקרח לאחר ההפשרה.
   הערה: דגימות מטופלים רגישות מאוד להפשרה. חשוב להפשיר דגימות במהירות ובמנות כדי למזער את מוות התאים.
3. תלות תאים במדיה מלאה מחוממת עם 5 מ"ל (מדיה IMDM עם 4% FBS ו-1% Pen-Strep).
4. קבעו את ריכוז התאים והכדאיות באמצעות צבע AO/PI ומונה תאים אוטומטי.
5. צנטריפוגה את התאים בעוצמה של 350 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להוציא את התאים לכדור. להשליך סופרנטנט.
6. החזירו תאים ב-5 מ"ל סליין מפופר-פוספט (DPBS) סטרילי של דולבקו. חזור על הצנטריפוגה לתאי פלט והשליך סופרנטנט.
7. השאירו תאים במדיום גדילה מלא לריכוז של 2 מיליון תאים חיים למ"ל. הכינו מספיק תאים ל-100K תאים/באר של צלחת 6 בארות.

2. הכנת תרופות ומתן טיפול.

הערה: פיריתמין מופק כאבקה ליופילית ומורכב מחדש בתוך הבית בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) בריכוז של 100 מ"מ; אליקווטים מאוחסנים בטמפרטורה של −80°C. ונטוקלקס נרכש מומס מראש ב-DMSO בריכוז של 10 מ"מ ומאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. לניסוי זה, ונינטוקלקס ופירימתמין ניתנים כמנה אחת באמצעות קליטה חופשית במקביל לתנאי טיפול DMSO בבקרת רכב.
אזהרה: פיריתמין, ונטוקלקס ו-DMSO הם סוכנים מסוכנים ביולוגית. לטפל רק מתחת למכסה המנוע, עם ציוד מגן אישי, והשתמש בזהירות רבה.

1. ביום ההכנות, הפשיר את התרופה אליקוט על קרח, מערבולת, וסובב במהירות מקסימלית על צנטריפוגה קטנה שולחנית למשך 30 שניות.
2. מערבבים ומערבבים בקבוק מדיה חצי-מוצקה בעוצמה עד שכל הרכיבים מתאחדים. השאירו את המכסה ללא הפרעה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי לאפשר לבועות לעלות לפני השטח.
3. הכינו 3 מ"ל אליקוטים של מדיה חצי-מוצקה בצינורות חרוטיים סטריליים של 15 מ"ל. אפשר לצינורות להישאר ללא הפרעה במשך 30 דקות כדי לאפשר לבועות לעלות לפני השטח. אליקווטים חצי-מוצקים נוספים יכולים להיות מוקפאים מחדש ומאוחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
4. הוסף לא יותר מ-10 מיקרוליטר של נפח תרופה למדיה חצי-מוצקה. לניסוי זה, ריכוזי ונטוקלקס ופירימתמין מותאמים בהתאם לתנאים סינרגטיים שנקבעו אמפירית. לקבוצת בקרת רכב, הוסיפו נפחים שווים של DMSO. הכינו אליקווטים כפולים של 3 מ"ל לכל מצב.
   הערה: חשוב לשמור על כמות התרופה שמוסיפה זניחה, כדי שלא תשפיע על הריכוז הסופי של התרופה במדיה החצי-מוצקה.
5. מדיה Vortex ב-4–5 פרקים קצרים כדי לשלב את התרופה במלואה במדיה.
   הערה: אין להחזיק תערובת תאים על המערבולת לפרקי זמן ממושכים, שכן זה עלול לגרום למוות תאים.
6. הוסיפו 100 מיקרוליטר תאים או נפח שווה ערך של 2,00,000 תאים ל-3 מ"ל אליקוות של מדיה חצי-מוצקה. תערובת וורטקס בפרקי זמן קצרים עד שהיא משולבת לחלוטין/הומוגנית.
7. חבר מחט קהה של 16 G למזרק של 3 מ"ל והטיל את המחט והמזרק לתערובת התאים. השאר ללא הפרעה למשך 30 דקות כדי לאפשר לבועות לעלות לפני השטח.

3. ציפוי של תאי השעיה מטופלים בתרופות.

1. באמצעות מחט ומזרק טבולים, יש לקחת את תערובת התאים והתרופה, תוך זהירות שלא לשאוף בועות אוויר. המתינו 3–5 דקות, ואז קחו את התערובת שנותרה שהצטברה בצידי צינור הקונוס של 15 מ"ל.
2. בלוח סטרילי עם 6 בארות, הוסף את תערובת התאים לכיוון הדרופ, תוך החלפת טיפות גדולות בין שתי בארות בעמודה חיצונית של הלוח. פזרו את התערובת על ידי הטיית הפלטה בעדינות בתנועות מעגליות כדי לכסות באופן שווה את כל תחתית הבארות. שני הבארות הללו מהווים שכפולים טכניים.
   הערה: אם נוצרות בועות או מתווספות בטעות לבארות, השתמש בקצה פילטר פיפטה כדי לפוצץ בעדינות או להזיז את הבועות לקצה הצלחת. כל בועה גדולה שנשארת בצלחת יכולה להשפיע על צמיחת המושבות.
3. הוסף את תערובת הבדיקה של המושבה רק לעמודים החיצוניים של צלחת 6 הבארות. לעמודה המרכזית, הוסיפו 5 מ"ל מים סטריליים לכל באר. הוספת מים לבארות תבטיח שיש מספיק לחות כדי למנוע מהמדיום החצי-מוצק להתייבש.
4. דגור את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5%_CO2. עוקב אחרי גדילה ורמות מים של תאים פעמיים בשבוע. התאים אמורים ליצור מושבות הנראות בעין בסביבות 7 ימים לאחר הציפוי, והצלחות צפויות להגיע ל-75%–80% מפגש בין 14–21 ימים לאחר הציפוי.

4. הדמיית מושבות וספירה

הערה: פרוטוקול זה מתאר פרמטרים שמאומתים לשימוש במערכת ההדמיה EVOS M7000. הגדרות אלו עשויות להיות מותאמות או מותאמות להתאמה למערכות הדמיית לוחות אחרות.

1. הסר את כיסוי מסנן האור המגן מפלטפורמת המיקרוסקופ. הפעל את המיקרוסקופ ופתח את התוכנה המתאימה.
2. הכנס מפזר אור לעדשה העליונה של מכשיר המיקרוסקופ.
3. הכנס את מיקום הלוח על הפלטפורמה כך שבאר A1 תהיה בפינה השמאלית העליונה.
4. בתוכנת ההדמיה, הזן את הגדרות המיקוד הבאות:
   1. בחר את הכלי שיימצם. בפרוטוקול זה משתמשים בלוח עם 6 בארות.
   2. הגדר את המטרה ל-4X.
   3. בחר את מקור האור כ-Trans או העבר את המיקרוסקופ למצב שדה בהיר.
   4. הדלק את נורית המיקרוסקופ וכיוון ידנית את עוצמת האור באמצעות הסליידר הגס. עבור המכשיר המשמש בפרוטוקול זה, הטווח האופטימלי למושבות הדמיה הוא סביב 0.03.
   5. אם יש פונקציית פוקוס אוטומטי בכלי, השתמש בה כדי לכוון את הפוקוס. אם צריך, כוון את המיקוד עוד יותר באמצעות הגדרות פוקוס ידניות.
5. הזן את הגדרות צילום התמונות האוטומטיות הבאות:
   1. בחר את כל אזור הבאר שיש לצלם בכל באר.
   2. בחר את צילום התמונה האוטומטי כדי להתחיל ממרכז הבאר ולספירלה החוצה לעבר קצוות הבאר.
   3. בחר הגדרות פוקוס אוטומטי כך שהכלי יתמקד מחדש בכל באר.
   4. בחר שהתמונות הגולמיות בכל באר יוצבעו/יתמזגו יחד.
   5. בחר שהתמונות יהיו הפוכות אופקית ואנכית.
   6. בחר הגדרות שמירת נתונים כדי לאסוף "תמונה מרוצפת" ו"תמונה ממוזגת"
   7. הרץ את סריקת הלוחיות האוטומטית. הכלי המשמש בפרוטוקול זה יפעל במהירות של 1.5 דקות לבאר.
   8. הסר את הלוח, הנח את כיסוי המסנן המגן מעל פלטפורמת המיקרוסקופ, כבה את המיקרוסקופ וסגר את התוכנה.
   9. לאחר הדמיה, יש לספור את כל המושבות הבודדות וכן לתתי-הסוגים של המיאלואידים והארית'רידים בכל באר באופן ידני באמצעות תמונות בארות מאוחדות מרוצפות.
6. הגדר מושבות לפי האפיון המורפולוגי הבא:
   1. נחשוב על מושבה בודדת או אשכול מושבה כמובחנת כאשר היא רחוקה מספיק מאוכלוסיית תאים אחרת, מרחק השווה לאורך שלה. אוכלוסיות שנמצאות בתוך מגבלת המרחק הזו מקובצות למספר מושבות אחד.
   2. ודאו שמושבות האריתרואידים פיגמנטניות עמוקות ונראות אדומות כהה. מושבות אלו מופיעות כקבוצות בודדות או קבוצות צפופות עם קצוות מוגדרים בבירור. מושבות אריתרואידיות קטנות יותר המורכבות מאוכלוסיות תאים לא בוגרות שגדלות לאט מסווגות כ-CFU-E. מושבות גדולות עם אוכלוסיות בוגרות יותר מסווגות כ-BFU-E.
   3. בדוק שהמושבות המיאלואידיות מכילות תאים שנראים שקופים יותר וצבעם בהיר יותר. מושבות המיאלואידים מפוזרות יותר ואינן מכילות קצוות מוגדרים בבירור. מושבות המיאלואידים נוטות לגדול יותר כקבוצות בודדות ולא כאשכולות, אם כי לעיתים ניתן לראות אשכולות. בשני המקרים, מושבות המיאלואידים מסווגות כ-CFU-GM.
   4. סווג את המושבות המעורבות המכילות גם את תתי-הסוגים האריתרואידים וגם המיאלואידים כ-CFU-GEMM.

5. איסוף והקפאה של תאים לניתוח במורד הזרם באמצעות ציטומטריית זרימה

1. בצע את השלבים הבאים לפני שמתחילים:
   1. a. הכינו וחמם בופר מיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה (buffer FACS, המורכב מ-DPBS/4% FBS) ומדיום הקפאה (FBS/10% DMSO) באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך לפחות 30 דקות.
2. הוסיפו 5 מ"ל של בופר FACS מחומם לפני השטח של כל באר. דגרו לוחות לפחות 30 דקות באינקובטור בטמפרטורה של 37°C כדי להמיס את המדיה החצי-מוצקה.
3. השעתי מחדש היטב את התאים באמצעות פיפטה של 5 מ"ל והעבר לצינור קונוסי סטרילי של 50 מ"ל.
4. באמצעות 5 מ"ל של בופר FACS מחומם, שטפו כל באר 3 פעמים והעבירו את כל הנפח לצינור הקוני של 50 מ"ל.
5. השעתי תאים היטב על ידי מערבולת ב-4–5 התפרצויות קצרות, ואז צנטריפוגה בעוצמה של 400 x g למשך 10 דקות ב-RT לתאי פלט. אם הכדור אינו נראה לאחר הצנטריפוגה, התאים נשארים תלויים במדיה חצי-מוצקה. ללא שאיבה, הוסף 10–15 מ"ל DPBS נוסף לצינור כדי לדלל עוד יותר את המדיום החצי-מוצק ולהחזיר את המצב היטב. אם צריך, דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10–15 דקות כדי להמיס את המדיה במלואה, ואז שוב תאי פלט.
6. שואף את הסופרנטנט ומשלים מחדש את התאים בבופר FACS של 10 מ"ל. צנטריפוגה ב-400 x g למשך 10 דקות ב-RT לתאי פלט.
7. להחזיר תאים למדיה מקפיאה ולהוסיף 3 מיליון תאים לקריוביאלי. הקפיאו בקבוקונים במיכל הקפאה בקצב מבוקר בטמפרטורה של -80°C למשך 24 שעות כדי להשיג קצב קירור של 1°C לדקה.
8. העבר את הקריוביאלים לאחסון חנקן נוזלי בהקדם האפשרי.
   הערה: דגימות שנשמרות בטמפרטורה של מינוס 20°C לפרקי זמן ארוכים יהיו בעלות חיוניות מופחתת. חשוב להעביר תאים לחנקן נוזלי לאחסון ארוך טווח.

תוצאות

איור 1 ממחיש את צינור הבדיקה של המושבות מבידוד דגימות מטופלים ועד ניתוח ספירות המושבות ומורפולוגיית המושבות. איור 2 מציג הגדרות מפתח למושבות הדמיה במיקרוסקופ שדה בהיר. איור 3 ואיור 4 מציגים תמונות מייצגות של היווצרות מושבה מדגימה אחת שמקורה בחולה ב-13 ימים לאחר הציפוי. באיור 3, מושבות מדומים באמצעות מערכת הדמיה פלוא...

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן מתאר זרימת עבודה אופטימלית לביצוע בדיקות CFU באמצעות דגימות דם ראשוניות של מח עצם ודגימות דם היקפיות ממטופלים, עם דגש מיוחד על שמירה על חיוניות התאים והבטחת צמיחת מושבות ניתנת לשחזור. מספר שלבים בפרוטוקול קריטיים להשגת יצירת מושבות אמינה בעת עבודה עם דגימות שמקורן מטופלים. הפשרה מהירה של תאים מונוגרעיניים מוקפרים ואחריה קירור מיידי חיונית לשימור קיום התא, שכן הפשרה ממושכת עלולה להגדיל משמעותית את מוות התאים בדגימות ראשוניות שבריריות. טיפול עדין במהלך שלבי הכביסה וההש...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Blunt-End 16 G needles	STEMCELL Technologies	28110	למתן ופילוח MethoCult media
Cellometer Auto 2000	Nexelcom Bioscience	26407	מונה תאים
CHT4 Counting Chambers (slides למונה תאים)	Revvity	CHT4-SD100-002	slides למונה תאים
Dimethyl sulfoxide	Fisher Bioreagents	BP231-100	המשמש לשחזור תרופות ותקינת תאים
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537	לתרבית תאים
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories, Inc.	2701	לעיקור משטחי תרבית תאים
EVOS M7000 imaging system	ThermoFisher Scientific	AMF7000	להדמיה של מושבות ותרבית תאים
Fetal bovine serum	BenchMark	100-106	תוסף מדיה לתרבית תאים והקפאה
IMDM Modified Culture media	Cytiva	SH30228.01	מדיה מועשרת לטיפול בדגימות מטופלים
LuerLok Tip 3 mL Syringes	BD	309657	למתן ופילוח MethoCult media
MethoCult H4435 Enriched	STEMCELL Technologies	04435	מדיה מבוססת מתיל-צלולוזה למבחן מושבות
Multiwell 6-well plate	FALCON	353046	להפקת מושבות
Nikon Eclipse TS2FL Inverted Trinocular Phase Contrast Fluorescence Microscope	Coastal Microscopes	51623	להדמיה ואופיין מורפולוגיה של מושבות
Pen Strep	Gibco	15140-122	תוסף אנטיביוטי לתרבית תאים
pyrimethamine	Sigma-Aldrich	46706	תרופה אנטיפולטית מאושרת על ידי ה-FDA
UltraPure Distilled water	Invitrogen	10977-015	להפקת מושבות
venetoclax	Selleck Chemical LLC	50-136-6419	כימותרפיה מאושרת על ידי ה-FDA
ViaStain AOPI Staining Solution	Revvity	CS2-0106	צביעה למדידת חיוניות לספירת תאים חיים