פרוטוקול זה מתאר הליך להשראת התמיינות של תאי גזע וקדמון המטופואטיים אנושיים שמקורם בתאי מח עצם של המטופל ותאי דם חד-גרעיניים היקפיים. הבדיקה משתמשת במדיום תרבית חצי-מוצק התומך במחויבות לשושלת אריתרואיד ומיאלואידית ומשלבת מדדים סטנדרטיים לסיווג מושבות שניתן לשחזור לצורך אפיון תרופות פרה-קליני.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בדיקת יחידה ליצירת מושבות מותאמת לתאי מונו-גרעין בדם שמקורם במח עצם ובדם היקפיים שמקורם במטופל
במאמר זה
סיכום
תקציר
בדיקת יחידת יצירת מושבות (CFU) היא טכניקה בסיסית לחקר מחלות המטולוגיות, כולל תסמונות מיאלודיספלסטיות (MDS) ולוקמיה מיאלואידי חריפה (AML). מבחן זה עושה שימוש במדיה חצי-מוצקה בתוספת שילובי ציטוקינים מוגדרים לתמיכה בצמיחה תלת-ממדית ובהבדלה ייחודית לשושלת של תאי אב אריתרואידים ומיאלואידים. עם זאת, דגימות דם ומח עצם היקפיים שמקורן מטופלים מציבות אתגרים טכניים בשל ירידה בחיוניות, רגישות מוגברת לטיפול ושונות בגידול המושבות. יתרה מזאת, ההנחיות הקיימות לזיהוי וספירת מושבות מראות שונות משמעותית בהגדרת גודל המושבה וסוגי השושלת, מה שמגביל את השחזור בין מחקרים. הפרוטוקול המתואר כאן מותאם לצמיחה ולהבדיל של תאי גזע וקדמון המטופואטיים שהופרדו מדגימות מטופלים של MDS ו-AML. הפרוטוקול מדגיש טיפול עדין בתאים, עיבוד סטרילי של דגימות מטופלים, תנאי תרבית אופטימליים ומשך גדילה המותאמים לתאים שמקורם במטופל. פרוטוקול זה מספק מסגרת מעשית לבדיקות CFU באמצעות דגימות שמקורן מטופלים ומבסס מדד סטנדרטי לספירת מושבות עקביות וניתוח במחקר ממאירויות המטולוגיות.
מבוא
המטופואזיס הוא תהליך מוסדר היטב שבו תאי גזע המטופואטיים (HSCs) השוכנים בנישות מח עצם יוצרים את כל קווי תאי הדם הבוגרים. באמצעות סדרה היררכית של אירועי התמיינות, HSCs מייצרים אבות רב-עוצמתיים המתחייבים בהדרגה לקווים אדומים, מיאלואידים ולימפואידים לפני שהם עוברים הבשלה סופית לתאי דם תפקודיים. תהליך זה נשלט על ידי איתות מתואם בתוך מיקרו-סביבת מח העצם ועל ידי מנגנוני ויסות שעתוק ואפיגנטיים פנימיים. הפרעות למסלולי הוויסות הללו, במיוחד באמצעות הצטברות מוטציות גנטיות או סומטיות ב-HSCs, עלולות לפגוע בהבדלות תקינה ולהוביל להתרחבות קלונית של אבות לא תקינים. שינויים כאלה עלולים בסופו של דבר לגרום להפרעות המטולוגיות המאופיינות בהמטופואיזיס וציטופ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מחקר זה עושה שימוש בדגימות ביולוגיות אנושיות שאינן מזוהות, שהושגו מבנק ביולוגי במסגרת פרוטוקול מאושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית, "ביולוגיה מולקולרית של הפרעות המטולוגיות שפירות וממאירות" (פרוטוקול IRB #200536), במכללת אלברט איינשטיין/מרכז רפואי מונטיפיורי. כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות אתיות מוסדיות. כל החומרים והציוד מופיעים בטבלת החומרים.
1. הכנת מח עצם שמקורם במטופל או בתאי דם מונו-גרעיניים היקפיים
הערה: לפי הנחיות נפוצות לטיפול בדגימת מטופלים, מומלץ ללבוש מעיל מעבדה באורך מלא וכפפות חד-פעמיות עמידות לדמעות, ולעבוד מתחת למכסה תרבית....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1 ממחיש את צינור הבדיקה של המושבות מבידוד דגימות מטופלים ועד ניתוח ספירות המושבות ומורפולוגיית המושבות. איור 2 מציג הגדרות מפתח למושבות הדמיה במיקרוסקופ שדה בהיר. איור 3 ואיור 4 מציגים תמונות מייצגות של היווצרות מושבה מדגימה אחת שמקורה בחולה ב-13 ימים לאחר הציפוי. באיור 3, מושבות מדומים באמצעות מערכת הדמיה פלוא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המתואר כאן מתאר זרימת עבודה אופטימלית לביצוע בדיקות CFU באמצעות דגימות דם ראשוניות של מח עצם ודגימות דם היקפיות ממטופלים, עם דגש מיוחד על שמירה על חיוניות התאים והבטחת צמיחת מושבות ניתנת לשחזור. מספר שלבים בפרוטוקול קריטיים להשגת יצירת מושבות אמינה בעת עבודה עם דגימות שמקורן מטופלים. הפשרה מהירה של תאים מונוגרעיניים מוקפרים ואחריה קירור מיידי חיונית לשימור קיום התא, שכן הפשרה ממושכת עלולה להגדיל משמעותית את מוות התאים בדגימות ראשוניות שבריריות. טיפול עדין במהלך שלבי הכביסה וההש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים נוספים לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה במענק פיילוט ממרכז איידס ע"ש איינשטיין-רוקפלר-CUNY, במימון המכון הלאומי לבריאות (NIH): P30 AI124414. מתקן הליבה של איינשטיין FACS והשימוש המשותף במכשירים נתמכו על ידי מענקי NIH הבאים: P30CA013330, S10OD026833 ו-S10OD032169.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Blunt-End 16 G needles | STEMCELL Technologies | 28110 | למתן ופילוח MethoCult media |
| Cellometer Auto 2000 | Nexelcom Bioscience | 26407 | מונה תאים |
| CHT4 Counting Chambers (slides למונה תאים) | Revvity | CHT4-SD100-002 | slides למונה תאים |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Bioreagents | BP231-100 | המשמש לשחזור תרופות ותקינת תאים |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | לתרבית תאים |
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | לעיקור משטחי תרבית תאים |
| EVOS M7000 imaging system | ThermoFisher Scientific | AMF7000 | להדמיה של מושבות ותרבית תאים |
| Fetal bovine serum | BenchMark | 100-106 | תוסף מדיה לתרבית תאים והקפאה |
| IMDM Modified Culture media | Cytiva | SH30228.01 | מדיה מועשרת לטיפול בדגימות מטופלים |
| LuerLok Tip 3 mL Syringes | BD | 309657 | למתן ופילוח MethoCult media |
| MethoCult H4435 Enriched | STEMCELL Technologies | 04435 | מדיה מבוססת מתיל-צלולוזה למבחן מושבות |
| Multiwell 6-well plate | FALCON | 353046 | להפקת מושבות |
| Nikon Eclipse TS2FL Inverted Trinocular Phase Contrast Fluorescence Microscope | Coastal Microscopes | 51623 | להדמיה ואופיין מורפולוגיה של מושבות |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | תוסף אנטיביוטי לתרבית תאים |
| pyrimethamine | Sigma-Aldrich | 46706 | תרופה אנטיפולטית מאושרת על ידי ה-FDA |
| UltraPure Distilled water | Invitrogen | 10977-015 | להפקת מושבות |
| venetoclax | Selleck Chemical LLC | 50-136-6419 | כימותרפיה מאושרת על ידי ה-FDA |
| ViaStain AOPI Staining Solution | Revvity | CS2-0106 | צביעה למדידת חיוניות לספירת תאים חיים |
מקורות
- Papaemmanuil E, Gerstung M, Malcovati L, Tauro S, Gundem G, Van Loo P, et al. Clinical and biological implications of driver mutations in myelodysplastic syndromes. Blood. 2013;122(22):3616-27.
- Desai P, Mencia-Trinchant N, Savenkov O, Simon MS, Cheang G, Lee S, et al. Somatic mutations precede acute myeloid leukemia years before diagnosis. Nat Med. 2018;24(7):1015-23.
- Gaulin C, Kelemen K, Arana Yi C. Molecular pathways in clonal hematopoiesis: from the acquisition of somatic mutations to transformation into hematologic neoplasm. Life (Basel). 2022;12(8):1135.
- Menssen AJ, Walter MJ. Genetics of progression from MDS to secondary leukemia. Blood. 2020;136....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
