יצירת ציבריד טרנס-מיטוכונדריאלי מטסיות mtDNA של מטופלים: פרוטוקול יעיל לאופטימיזציה של בחירת מושבות ואימות פונקציונלי

סיכום

אנו מתארים פרוטוקול אופטימלי ליצירת סייבריד טרנס-מיטוכונדריאלי מטסיות mtDNA של מטופלים, תוך דגש על פרמטרי גדילה ובידוד מושבה. גישה זו מאפשרת חקר וריאנטים של DNA מיטוכונדריאלי ברמות הטרופלזמיה משתנות ברקע גרעיני משותף כדי לכמת את חשיבותם הפונקציונלית על פעילות אנזימטית של שרשרת העברת אלקטרונים ויכולת נשימתית משולבת.

תקציר

יצירת קו תאי סייבריד טרנס-מיטוכונדריאלי מייצגת את השיטה הסטנדרטית ביותר לקביעת פתוגניות על ידי אפשרות ניתוחים ביוכימיים של וריאנט DNA מיטוכונדריאלי ספציפי (mtDNA) באחוזים גבוהים ונמוכים (רמות הטרופלזמיה) בתוך רקע זהה של mtDNA וגנום גרעיני. היסטורית, תהליך יצירת הסייברידים היה מייגע ויעיל מאוד. כאן, אנו מתארים פרוטוקול יעיל ויעיל במיוחד ליצירת קווי תאים טרנס-מיטוכונדריאליים של סייבריד על ידי מיזוג טסיות אנושיות עם קו תאים סטנדרטי של אוסטאוסרקומה 143B, כדי לספק רקע גרעיני איזוגני שהתרוקן מ-mtDNA (תאי Rho⁰ ). מבודדי תאים לוכדים גנום mtDNA מסוים כדי להקים קווי תאים יציבים המכילים דרגות שונות של הטרופלזמיה, או להשוות השפעות שונות של הפלוגרופונים מיטוכונדריאליים שונים. מכיוון שסייברידים מחולים מיטוכונדריאליים עשויים להיות קשים יותר להיבנות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים, שיטה זו מתמקדת בבידוד וריאנטים של mtDNA שבהם פעילות שרשרת העברת האלקטרונים מושפעת. כאן אנו מראים שטכניקות בחירת מושבות מקצרות את הזמן ומשפרות את התפוקה של יצירת קווי סייברידים מוטנטים mtDNA ברמה גבוהה בהטרופלזמה. ניתנה מחקר מקרה של יצירת סייבריד עבור וריאנט בעל משמעות לא ידועה ב-MT-ND1, m.3985G>A (עמ' E227K). אנו מנתחים את יעילות תהליך יצירת הסייבריד באמצעות פרוטוקול זה ומבצעים מחקרים פונקציונליים המתבצעים באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה. מוטנטים של הטרופלזמיה ברמה גבוהה MT-ND1 m.3985G>A שנוצרו על ידי פרוטוקול זה הוכחו כבעלי פגיעה בנשימה מיטוכונדריאלית מורכבת תלויה ב-I ביחס לבקרה מסוג פראי, מה שמראה ש-m.3985G>A ככל הנראה פתוגני.

מבוא

קביעת פתוגניות של מוטציות DNA מיטוכונדריאלי (mtDNA) היא מאתגרת בשל נדירותן, הטרופלזמיה הכוללת רמות משתנות של גנומים מוטנטים ו-wild-type mtDNA ברקמות שונות, מנגנונים פתופיזיולוגיים מגוונים ואינטראקציות מורכבות עם רקעי גנום גרעיני 1,2,3,4 . מסיבות אלו, קווי תאי הסייברידים הטרנס-מיטוכונדריאליים נשארים השיטה הסטנדרטית להוכחת פתוגניות של וריאנטים של mtDNA, כאשר "סייברידים" מייצגים את המיזוג של גרעין תא אחד עם מיטוכונדריה של תא אחר 5,6,7,8,9,10 (איור 1). קווי תאי סייבריד מכילים רקע גרעיני איזוגני ומיטוכונדריה עם אחוז מוגדר של הטרופלסמיה עבור וריאנט ה-mtDNA הנבדק^11,12. בדרך זו, ניתן לבצע בדיקות פונקציונליות כמו רספירומטריה (באמצעות פולרוגרפיה) או פעילות אנזימי העברת אלקטרונים (באמצעות ספקטרופוטומטריה) בקווי סייבריד הנעים בין 0% ל-100% הטרופלזמה כדי לקבוע את ההשפעות הפתוגניות האפשריות של וריאנט mtDNA נתון, וכן את ההשפעה היחסית של הפלוגרופי מיטוכונדריה שעשויות להשתנות בין קווי הסייבריד¹. סוגי תאים אחרים יכולים לשמש לחקר פתוגניות, והם משמשים בצורה הטובה ביותר להשלמת יצירת סייברידים וניתוח פונקציונלי, שכן לכל סוג תא יש יתרונות וחסרונות משלו. פיברובלסטים של מטופל מקורם ישירות מהמטופל אך מוגבלים בהטרופלזמיה תורשתית וחסרים שליטה גרעינית איזוגנית לביטול השפעות הגנים הגרעיניות. עריכת mtDNA הופכת לפופולרית יותר אך סובלת מעריכה לא מדויקת ואתרים מוגבלים לעריכה ב-mtDNA¹³. תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) יכולים להיות מופרזים כדי לחקור את השפעת מוטציה על סוגי תאים שונים, כגון נוירונים ותאי גנגליון רשתית, אך השראה של פלוריפוטנטיות עלולה להוביל לאובדן וריאנט ה-mtDNA הרלוונטי או להוביל לווריאנטים דה נובו נוספים¹⁴. מחקר סייבריד כולל יצירת מערכת מלאכותית יותר המבוססת על רקע גרעיני של קו תאי סרטן (קלאסית 143B אוסטאוסרקומה), אך גדלה היטב באופן קלאסי, מה שהופך אותה לניתנת לשימוש במחקרי סקר בעלי תפוקה גבוהה של התערבויות מועמדות. מגבלות ליצירת סייברים ברמה גבוהה של הטרופלסמיה כוללות איכות טסיות, הטרופלזמיה התחלתית, והחסרונות הסלקטיביים של המיטוכונדריה המוטנטית, אשר נדונים בהרחבה בפרוטוקול זה.

למרות שיצירת סייברידים היא הסטנדרט הזהב לקביעת תפקוד של פתוגניות וריאנט mtDNA, מעטות המעבדות מייצרות סייברידים למחקר מחלת מיטוכונדריה 9,10,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25^{, 26, 27}. במקום זאת, נוצרים יותר סייברידים כדי לחקור סרטן והזדקנות^28,29. כאן, אנו משתמשים במחקר מקרה של מטופל חשוד במחלת מיטוכונדריה כדי להדגים אסטרטגיות אופטימיזציה שפותחו כדי להקל על יצירת ציבריד מטסיות mtDNA, כולל תהליכי בחירה והכנות תאים הנדרשות להקמת קווי תאי סייבריד עם רמות הטרופלזמה גבוהות לעומת נמוכות עבור וריאנט mtDNA היעד. באופן ספציפי, אנו מדגימים את המתודולוגיה ליצירת קווי תאי סייבריד עבור תת-יחידה מורכבת I (CI) בשם MT-ND1 וריאנט m.3985G>A, שבו אנו מבצעים מחקרים ביוכימיים המדגימים את אופיו הפתוגי של וריאנט זה. איור 2 מציג את ציר הזמן ליצירת סייברידים, שבו שלבים מתודולוגיים מרכזיים כוללים שיטות היתוך, סלקציה ובידוד ליצירת מושבות מובחנות.

פרוטוקול

טסיות דם נאספו לפי מחקר IRB של בית החולים לילדים של פילדלפיה (CHOP) 08-6177.

1. הכנת טסיות

1. יום 1: לשאוב דם לצינורות חומצה-ציטראט-דקסטרוז בעת השאיבה.
   הערה: יש להניח דם על הסיבוב מיד. הטסיות נאספות באופן אידיאלי מקסימום של 4 שעות לאחר לקיחת הדם.
2. הקלט את עוצמת הדם. מומלץ לצרוך נפח של 5–6 מ"ל דם.
3. דם בצנטריפוגה ב-200 × גרם למשך 20 דקות ב-12 מעלות צלזיוס.
   הערה: צנטריפוגציה בטמפרטורה של 12 מעלות צלזיוס שומרת על שלמות הדגימה ומונעת הפעלת טסיות.
4. העבר את הסופרנטנט (פלזמה) לצינור צנטריפוגה חדש.
5. הקלט את עוצמת הפלזמה.
6. צנטריפוגה את הפלזמה ב-1500 × גרם למשך 20 דקות ב-12 מעלות צלזיוס.
7. רשום את נפח כדורי הטסיות המשוער.
   הערה: יותר מדי טסיות יכול להיות מסורבל בפרוטוקול זה. לאחר איחוי, בעת ציפוי^תאי Rho 0 וטסיות, עודף טסיות יכול להידבק לתחתית הבקבוק ולמנוע היצמדות לתאי Rho⁰ . מומלץ להשתמש בפחות מ-50 מיקרוליטר מנפח הפלט של הטסיות עבור ההיתוך. ניתן להקפיא את הטסיות העודפות על ידי פיצול הטסיות בשלבים הבאים.
8. הסר את הסופרנטנט.
   הערה: אם הכדור גדול, ניתן לבצע הסרת הכדור באמצעות שאיבה. טסיות המטופל לפעמים מצטמצמות משמעותית ואינן דביקות במיוחד. אם זה המצב, השתמש בפיפטה כדי להסיר את הפלזמה באיטיות.
9. אם ממשיכים עם טסיות חדשות, יש להחזיר את הכדור ל-1 מ"ל של שינוי ספינר של מדיום Minimum Essential Eagle's (SMEM), ולהעביר אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה.
10. אם מקפיאים, יש להחזיר את הכדור (הטסיות) ל-1.05 מ"ל של SMEM ו-450 מיקרוליטר של תמיסת הקפאה לטסיות (350 מיקרו-ליטר של סרום בקר עוברי [FBS] + 100 מיקרו-ליטר דימתיל סולפוקסיד [DMSO]).
    הערה: חלק מהטסיות במטופלים אינם יציבים במהלך הליך ההקפאה, ולא ניתן לקבל סייבריד מוטנטי גבוה לאחר ההקפאה. מומלץ להשתמש בהכנה הטרייה.
11. אם תאי Rho⁰ אינם מוכנים בזמן, יש למקם את הטסיות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם רעידות קלות ב-60 סל"ד.
    הערה: בסופו של דבר, עדיף לתזמן את הטסיות ותאי Rho⁰ כך שיהיו מוכנים בו זמנית. לא מומלץ להמתין יותר משעתיים.

2. הכנת תאי Rho ⁰

1. השתמשו בתאי Rho⁰ באוסטאוסרקומה 143B שהופשרו זה עתה, או בתאי Rho⁰ שגדלו קרוב למפגש ביניהם.
   הערה: מומלץ להשתמש בתאי Rho⁰ שגדלו באינקובטור עד כמעט למפגש ביניהם. ניתן להשתמש בתאי Rho⁰ שהופשרו טריים, ומומלץ להשתמש בבקבוקון קפוא של תאי Rho⁰ בעלי צפיפות תאים גבוהה. אפשר לתאים להתחבר לשעתיים או יותר לפני המיזוג.
2. שטוף את הבקבוקון T75 עם 5 מ"ל PBS.
3. הוסיפו 1 מ"ל של Trypsin-EDTA 0.25% כדי לכסות את תאי Rho⁰ .
4. דגרו במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
5. אחרי שאני מנענע את הבקבוקון, שטוף את תחתית הבקבוקון ב-5 מ"ל SMEM.
6. אסוף תאי Rho⁰ בצינור קוני של 15 מ"ל.
7. צנטריפוגה ב-200 × גרם למשך 5 דקות לריכוז למדידת ספירת תאים.
8. הסר את הסופרנטנט ותשהה מחדש ב-1 מ"ל SMEM.
9. תספור את התאים.
   הערה: רצוי שיהיו 1.5 מיליון תאים לכל איחוי; עם זאת, בוצעו איחודים מוצלחים עם רק 30,000 תאים.
10. מחברים 1.5 מיליון תאים ל-1.5 צינורות מיקרוצנטריפוגה ומביאים את הנפח ל-1 מ"ל.
    הערה: ודא שיש לך צינור "מיזוג מדומה" נוסף. צינור זה יכיל רק תאי Rho⁰ וישמש לסייע בהכוונת תהליך הבחירה.
11. צנטריפוגה את הטסיות ב-1700 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: תאי Rho⁰ רגישים לטמפרטורה קרה.
12. הסר את הסופרנטנט מהטסיות.
13. הוסף 1 מ"ל תאי Rho⁰ מעל כדור הטסיות.
14. צנטריפוגה את תאי Rho⁰ ואת הטסיות ב-200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.

3. היתוך

1. הסר את הסופרנטנט מתאי Rho⁰ ומהכדור של הטסיות.
2. הוסיפו 150 מיקרוליטר של בופר היתוך (50% פוליאתילן גליקול [PEG]/10% DMSO) וצרו טריטורציה במשך 90 שניות להשעיה מחדש.
   הערה: חלק מהפלטים דביקים מאוד וצריך לערבב ולפרק אותם ידנית בנוסף לפיפטינג למעלה ולמטה. תקליט אם הכדור היה דביק.
3. הוסף 12 מ"ל מדיום סייבריד (DMEM) + 10% FBS + 50 מיקרוגרם/מ"ל אורידין לבקבוק T75.
4. הוסיפו לבקבוק את 1 מ"ל של טסיות מותכות ותאי Rho⁰ .
5. התאים מודגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%_CO2 בלחות גבוהה.
   הערה: כל שלבי צמיחת התאים מתקיימים בתנאים אלה.

4. צמיחה

1. יום 2: הסרת מדיום סייבריד והוספה 12 מ"ל מדיום סייבריד טרי + 10% FBS + 50 מיקרוגרם/מ"ל אורידין.
   הערה: תאי Rho⁰ לוקחים כשבוע לשלב את ה-mtDNA.
2. יום 5: הסרת מדיום סייבריד והוספה 12 מ"ל מדיום סייבריד טרי + 10% FBS + 50 מיקרוגרם/מ"ל אורידין.
   הערה: אם תאי Rho⁰ נמצאים במפגש של 80%, חלק את התאים לשני בקבוקים.

5. בחירה

1. יום 8: הסר את המדיה ושטוף את התאים ב-5 מ"ל PBS.
2. הסר PBS והוסף 1 מ"ל טריפסין.
3. כסו את תחתית הבקבוק בטריפסין ודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
4. הוסף 5 מ"ל מדיום סייבריד + 10% FBS + 50 מיקרוגרם/מ"ל אורידין.
5. תספור את התאים.
   הערה: הסלקציה צריכה להתחיל ב-10% מפגש (מפגש של 10%), כלומר 125,000 תאים בצלחת פטרי מטופלת ב-T75 או בתרבית רקמה. מומלץ להשתמש בצלחות פטרי אם מעדיפים את שיטת האיסוף במושבה. השתמש ב-T75 אם משתמשים בשיטת דילול.
6. הוסיפו 125,000 תאים למיכל המתאים ומוסיפים את שאר הנפח עד 12 מ"ל עם מדיית סלקציה (DMEM).
   הערה: מדיום סלקציה מיועד להפריד בין תאי 143B ממוזגים עם מיטוכונדריה לתאי Rho⁰ . תאי Rho⁰ זקוקים לפירובט ואורידין כדי לשרוד. FBS עם דיאליזציה אינה מכילה פירובט ואורידין ויש להשתמש בה רק לבחירה. השתמש בשתי מדיות בחירה שונות אם אפשר. אחד צריך להיות 10% FBS דיאליזציה, והשני צריך להיות פחות מגביל את הצמיחה, כמו 20% FBS דיאליזציה + 50 מיקרוגרם/מ"ל אורידין. במקביל מוצע מדיום ברירה פחות מגביל עבור מוטנטים חמורים.
7. הקפיאו את התאים הנותרים בשני קריוביאלים עם 1 מ"ל של תמיסת הקפאה כל אחד.
   הערה: אלו תאי בחירה מוקדמת, וניתן לנסות בחירות שונות בהמשך.
8. להחליף את המדיה כל יומיים במשך כשבוע.
   הערה: תאי Rho⁰ יצופים כשהם מתים וישטפו לאחר שינוי המדיה. השתמשו בתאי המיזוג ה"מדומים" כדי לקבוע מתי הבחירה הושלמה (אין עוד תאים בבקבוק). הבקבוקון הזה יהיה ריק לחלוטין כי כל תאי Rho⁰ יישטפו. מומלץ להמתין יום נוסף, גם כאשר הבקבוקון המדומה ריק, כי תאים מאוחים יכולים לספק את החומרים המזינים במדיה כדי לעזור לתאי Rho⁰ אחרים להישאר בבקבוק. אם התאים גדלים ליותר מ-20% מפגש באזור, יש להתפצל ולהחליף את הפלטה. יותר צמיחה תסתיר את הבחירה.

6. שיטת גידול בחירת מושבות

1. גדלו את המושבות עד שהן נראות בעין עם Cybrid medium + 20% FBS + 50 מיקרוגרם/מ"ל אורידין.
   הערה: הטה את הצלחת והחזיק אותה מול האור. המושבות נראות כמעגלים מעוננים. מתחת למיקרוסקופ, לא אמורות להיות הרבה תאי רקע בין המושבות.
2. הקיפו מושבות עצמאיות שאינן חופפות עם טוש בתחתית הבקבוקון תוך החזקתן מול האור.
3. השתמש ב-P20 גם לגרד (להפריע מכנית לתאים המחוברים לתחתית הבקבוקון) ולשאוף 20 מיקרוליטר בו זמנית בתוך המעגל המצויר כדי למקם תאים מהמושבה הנבחרת בקצה ה-P20.
   הערה: גירוד ידני מנתק את התאים ומשיכת 20 מיקרוליטר מעלה אוספת את התאים בקצה הפיפטה.
4. הצלח כל מושבה לבאר נפרדת בלוח של 96 בארות.
   הערה: היתרון של שיטה זו הוא שתאי 143B נוטים לגדול היטב יחד, כך שלא אמורה להיות בעיה לגדול וניתן לקבל תוצאות מהירות. החיסרון הוא שייתכן שתהיה אוכלוסייה מעורבת.

7. שיטת גידול הדילול

1. כאשר התאים מגיעים ל-75% מפגש במדיה סייבריד + 20% FBS + 50 מיקרוגרם/מ"ל אורידין, שטפו את התאים ב-5 מ"ל PBS.
2. הסר PBS והוסף 1 מ"ל טריפסין.
3. כסו את תחתית הבקבוק בטריפסין ודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
4. הוסיפו 5 מ"ל מדיום סייבריד + 20% FBS + 50 מיקרוגרם/מ"ל אורידין.
5. תספור את התאים.
6. הוסף 1 × 10-5 תאים ב-20 מ"ל של מדיום סייבריד + 20% FBS + 50 מיקרוגרם/מ"ל אורידין לצינור קוני של 50 מ"ל 1.
   הערה: זהו 5000 תאים/מ"ל, שזה יהיה 500 תאים ב-100 מיקרוליטר כאשר צופים בלוח עם 96 בארות.
7. הכינו צינור קוני בנפח 50 מ"ל עם דילול של 100 פעמים (200 מיקרוליטר מצינור 1 ב-20 מ"ל מדיום סייבריד + 20% FBS + 50 מיקרוגרם/מ"ל אורידין).
   הערה: זה בערך 5 תאים בכל באר.
8. הכינו צינור קוני 3 בנפח 50 מ"ל עם דילול 1:1 (10 מ"ל מצינור 2 ב-10 מ"ל מדיום סייבריד + 20% FBS + 50 מיקרוגרם/מ"ל אורידין).
   הערה: זה בערך 2.5 תאים לכל באר.
9. הכינו צינור קוני 4 בנפח 50 מ"ל עם דילול 1:1 (10 מ"ל של צינור 3 ב-10 מ"ל מדיום סייבריד + 20% FBS + 50 מיקרוגרם/מ"ל אורידין).
   הערה: זה בערך תא אחד לכל באר.
10. צינורות לוחות 2, 3 ו-4 בלוחות 96 בארות עם 100 מיקרוליטר כל אחד.
    הערה: ודא לערבב את התאים לפני הציפוי. קשה לבדוק ביום האירוע אם יש תא אחד בכל באר כי התאים צריכים לשקוע לקרקעית ולהתחבר. היתרון של שיטה זו הוא שתא בודד גדל למושבה, מה שמבטיח היעדר רקע מעורב. החיסרון הוא שמוטנטים חמורים עלולים לא לשרוד אם הם מבודדים.
11. למחרת, מחקו בארות שיש בבירור יותר מתא אחד בכל באר.
12. אחרי כמה ימים, תבדוק שוב את הבארות.
    הערה: עכשיו אמורות להיות מושבות, וזה בולט יותר אם יש תאים בודדים ליד קצוות הבארות. אם יש יותר ממושבה אחת, הסר את הבארות האלה. אם אין תא, הסר את הבאר.

8. צמיחה

1. התחל בלוח עם 96 בארות והעבר תאים לצלחות גדולות יותר לפי הצורך.
   הערה: תאים אלה אוהבים לגדול הכי טוב עם צפיפות תאים גבוהה, ואי העברת מספיק תאים עלולה לגרום למוות. תמיד תשמור את הפלטה הקודמת עם כמה תאים ותסמן איזו באר הגיעה מאיפה כדי שתוכל תמיד לחזור אם צריך. חשוב לציין שתאי 143B מתים ומתנתקים אם הם מתחברים יתר על המידה, אז בדוק את התאים האלה כל יום.

9. אישור גנטי

1. צנטריפוגה את התאים המיוצרים ב-450 × גרם למשך 5 דקות.
2. הסר מדיה.
3. הוסף 5 מיקרוליטר של בופר חילוץ DNA (50 mM NaOH).
   הערה: מספר זה יכול להשתנות אם יש הרבה תאים. כדורי תאים משמעותיים יכולים להיות ב-10 מיקרוליטר של בופר.
4. דגרו בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
5. הוסיפו נפח שווה של בופר ייצוב DNA (0.1 M Tris-HCl; pH 8) לבופר החילוץ.
6. לבצע תגובת שרשרת פולימראז (PCR) בהתאם להנחיות האנזים.
   הערה: חלק מהמוטנטים הנקודתיים יכולים להשתמש באנזימי הגבלה כדי להבחין בין תאי ביקורת לתאי מטופל. מוטציות נקודתיות אחרות אינן ניתנות להבחנה ודורשות ריצוף. במקרה זה, חשוב להשתמש בתערובות PCR ללא צבעים לתוצאות איכותיות. ניתן להשתמש בריצוף סנגר וברצף מהדור הבא. 2.5 מיקרוליטר DNA מספיקים לתגובה של 25 מיקרוליטר.
7. השתמש במגברים של PCR הייחודיים למוטציה זו לצורך ריצוף סנגר.
   הערה: המגברים של ה-PCR נשלחו לצורך ריצוף של סנגר. רמת ההטרופלזמיה של המוטציה אושרה הן לאחר התרחבות השיבוט והן לאחר ניתוח תפקודי.

10. רספירומטריה ברזולוציה גבוהה באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה

1. בצע כיול אוויר בהתאם להנחיות הרספירומטר (למשל, Oroboros Instruments).
2. שטוף סייברידים בבקבוק T75 עם PBS.
   הערה: התאים לא אמורים להיות מתאחדים מדי; חיבור של 70%–80% הוא אידיאלי.
3. הוסיפו 1 מ״ל טריפסין ודגרו במשך 4 דקות.
4. הוסף 5 מ"ל של מדיום Cybrid וספר תאים.
5. הוסף 500,000 תאים לצינור לצנטריפוגה ב-450 × גרם למשך 5 דקות.
   הערה: מספר התאים והנפחים של הספירומטר הם עם תא ה-0.5 מ"ל.
6. שוטף תאים על ידי השעיה מחדש עם PBS וצנטריפוגה שוב.
7. החזירו תאים ל-510 מיקרוליטר של בופר MiR05 והוסיפו לתא ריק.
8. לאחר הייצוב, הוסף 0.65 מיקרוליטר דיגיטונין (50 מ"ג/מ"ל), 0.8 מיקרוליטר מלאט (2.5 מ'), ו-2 מיקרוליטר פירובט (2.5 מ').
   הערה: לפני הוספת דיגיטונין, כאן מתבצעת מדידת הנשימה הבסיסית. כל שלב נוסף צריך להתבצע לאחר הייצוב.
9. הוסף 12 מיקרוליטר של אדנוזין דיפוספט (ADP) (0.25 מ').
10. הוסף 4 מיקרוליטר גלוטמט (2.5 מ').
11. הוסיפו 12 מיקרוליטר סוקסינאט (1.25 מ').
12. הוסף 1 מיקרוליטר אוליגומיצין (1 מ"ג/מ"ל).
13. הוסף 1 מיקרוליטר של קרבוניל ציאניד-p-טריפלואורומתוקסיפנילהידראזון [FCCP] (0.2 מ"מ).
    הערה: יש לכוון עם מספר תוספות עד שלא נצפה עלייה נוספת (בדרך כלל 3–5).
14. הוסף 1 מיקרו-ליטר רוטנון (2 מ"מ).
15. הוסף 1 מיקרו-ליטר אנטימיצין A (1 מ"ג/מ"ל).
16. הוסף 0.5 מיקרוליטר אסקורבט (0.8 מ') ו-0.5 מיקרוליטר טטראמתילפנילנדיאמין [TMPD] (0.2 מ').
17. פתח את התא עם מרווח למשך 20 דקות.
18. סגור את התא ומייצב את המצב למשך 5 דקות.
19. הוסף 22.5 מיקרוליטר אזיד (4 מ').
20. אסוף תאים לכימות חלבונים באמצעות ערכת בדיקה של חומצה ביצינכונינית (BCA).
21. בצע חישובים לאחר ייצוב קצב צריכת החמצן ונרמל באמצעות חלבון. נשימה בסיסית היא קצב צריכת החמצן היציב לאחר הוספת תאים לתא.
    הערה: כל שאר המדידות נלקחות לאחר המצע או המעכב שצוין.
22. חשב_{רווח בר-סמך} אוקספוס: (גלוטמט-אנטימיצין A)/(FCCP-אנטימיצין A).
23. חשב OXPHOS_CI+CII: (סוקסינט-אנטימיצין A)/(FCCP-אנטימיצין A).
24. חשב_{ETS CI+CII:} (FCCP-אנטימיצין A).
25. חשב_{ETS CII:} (רוטנון-אנטימיצין A)/(FCCP-אנטימיצין A).
26. חשב LEAK_CI+CII: (אוליגומיצין-אנטימיצין A)/(FCCP-אנטימיצין A).
27. חשב_{OXPHOS CIV:} (TMPD/ASC-Azide)/(FCCP-Antimycin A).
28. השתמש בלפחות 4–6 שכפולים ביולוגיים למדידות רספירומטריה.

תוצאות

כדי להדגים הבדלים מתודולוגיים והדרך לאופטימיזציה של הפרוטוקול, אנו מציגים את תוצאות יצירת הסייבריד ממטופל אחד עם מחלת מיטוכונדריה חשודה, אשר נושא וריאנט בעל משמעות לא ידועה (VUS) ב-MT-ND1 של קומפלקס I (CI) בשרשרת העברת האלקטרונים. לאחר ריצוף גנום mtDNA מהדור הבא במספר רקמות בשתי מעבדות אבחון קליניות מאושרות על ידי CLIA, הווריאנט היחיד שחשד לפתולוגיות היה MT-ND1 m.3985G>A. ההטרופלזמיה בדם המטופל של מוטציית MT-ND1 m.3985G>A (p.E227K) הייתה 50%. תובנות אופטימיזציה...

דיון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול יעיל במיוחד ליצירת קווי תאי סייבריד טרנס-מיטוכונדריאליים מטסיות mtDNA של מטופלים. אנו מראים את היישום באמצעות מחקר מקרה של וריאנט MT-ND1 בעל משמעות לא ודאית, את החשיבות של בחינה זהירה של פרמטרי גדילה ובחירה. לאחר שהבעיות העיקריות הללו מתוקנות, הבחירה המוצלחת של סייברידים המכילים וריאנטים של mtDNA שעלולים לפגוע בתפקוד שרשרת הנשימה. פרוטוקול זה יכול לשמש ליצירת סייברידים עם מוטציות mtDNA.

ציר הזמן למחקר המקרה שלנו מראה כי יצירת ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ADP	Sigma Aldrich	A5285-1G
Antimycin A	Sigma Aldrich	A8674-25MG
Ascorbate	Sigma Aldrich	11140-250G
Azide	Sigma Aldrich	S2002-100G
Dialyzed FBS	Fisher Scientific	35071CV
Digitonin	Sigma Aldrich	D141-100MG
DMEM	Corning	10-013-CV	מדיה ציבריד
DMEM	Corning	10-017-CM	מדיה סלקציה
FBS	Cytiva	SH30910.03
FCCP	Apex Bio	B5004
Glutamate	Sigma Aldrich	G5889-100G
Graphpad Prism	Graphpad
Hybri-Max	Sigma Aldrich	P7306	מאגר מיזוג
Malate	Sigma Aldrich	M1000-100G
MiR05 buffer	Oroboros Instruments	60101-01
O2K respirometor	Oroboros Instruments	C-0050
Oligomycin	Sigma Aldrich	O4876-5MG
Pyruvate	Sigma Aldrich	P2256-100G
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875-1G
SMEM	Sigma	M8167
Succinate	Sigma Aldrich	S2378-100G
TMPD	Sigma Aldrich	T3134-5G
Trypsin-EDTA 0.25%	Thermo Scientific	25200056
Uridine	Sigma Aldrich	U3750-25G