הופעתו של אתר ספציפי טכנולוגיה recombinase (SSR) ומערכת Cre / לקס הובילה להתקדמות רבים בתחום הביולוגיה המולקולרית, וכן הוכיחה את עצמה ככלי רב ערך להערכת תפקוד גן חיות טרנסגניות. בראיון זה מתאר את מנגנון רקומבינציה אתר ספציפי על ידי Cyclization recombinase (Cre) וכיצד להשתמש אנזים זה הוביל לפיתוח של mutagenesis מותנה, אשר יש יתרונות משמעותיים על פני המסורתיים לדפוק את אסטרטגיות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
אתר ספציפי recombinase (SSR) הטכנולוגיה מאפשרת מניפולציה של מבנה הגן כדי לחקור את תפקוד הגן הפך לכלי אינטגרלי של הביולוגיה המולקולרית. אתר ספציפי recombinases הם חלבונים אשר נקלטות על ידי רצפי DNA יעד מובחנים. המערכת Cre / לקס תוארה לראשונה בשנות ה 1980 של ב bacteriophages. Cre recombinase הוא סוג אני topoisomerase המזרז אתר ספציפי רקומבינציה של דנ"א בין שני loxP (מוקד P1-X ומעלה) באתרים. מערכת ה Cre / לקס אינו דורש שום cofactors. רצפים LoxP מכילים אתרי קישור נפרדים עבור recombinases Cre המקיפים רצף הליבה כיוונית בה רקומבינציה וגם סידור מתרחש. כאשר התאים מכילים אתרי loxP ומבטאים את recombinase Cre, אירוע רקומבינציה מתרחשת. פעמיים גדילי דנ"א נחתך בשני אתרים loxP ידי recombinase Cre, מחדש, ligated ("מספריים ודבק"). מוצרים של האירוע רקומבינציה תלוי בכיוון היחסי של רצפים סימטרית.
טכנולוגיית SSR משמש לעתים קרובות ככלי לחקור את תפקוד הגן. הנה הגן של עניין הוא מוקף עם Cre היעד אתרי loxP ("floxed"). חיות הן חצו אז עם חיות המבטא את recombinase Cre בשליטת היזם רקמות ספציפיות. ברקמות המבטאים את recombinase Cre הוא נקשר רצפים היעד excises הגן floxed. המחיקה גן מבוקרת מאפשרת חקירה של הפונקציה גנים ברקמות ספציפיות בנקודות זמן שונות. ניתוח של תפקוד הגן העסקת טכנולוגיית SSR --- mutagenesis מותנה - יש יתרונות משמעותיים על פני דפיקה-outs המסורתי שבו המחיקה הגן לעתים קרובות קטלני.
הדפסות חוזרות והרשאות
