ניתוח ביואינפורמטיקה פאן-סרטנית בשילוב עם אימות ניסויי לסרטן המעי הגס: מחקר על TMED3 כסמן ביולוגי אבחוני ותחזיתי

סיכום

פרוטוקול זה משלב ניתוח ביואינפורמטיקה פאן-סרטנית עם אימות אימונוהיסטוכימי בסרטן המעי הגס כדי להעריך ביטוי, חשיבות פרוגנוסטית, אסוציאציות חיסוניות ונתיבים ביולוגיים קשורים באמצעות מאגרי מידע ציבוריים של מולטיאומיקס ודגימות רקמה קליניות.

תקציר

תחום העברת חלבון טרנסממברנלי Emp24 3 (TMED3), חבר במשפחת חלבוני p24, נקשר להתרבות גידולים, פלישה והגירה. מחקר זה נועד להעריך את דפוסי הביטוי, המשמעות הפרוגנוסטית, הקשרים החיסוניים והפונקציות הביולוגיות הפוטנציאליות של TMED3 בין סוגי סרטן שונים, באמצעות ניתוח ביואינפורמטיקה פאן-סרטנית בשילוב עם אימות אימונוהיסטוכימי (IHC) בסרטן המעי הגס. מערכי נתונים של Multiomics מתוך מאגרי הנתונים Cancer Genome Atlas, Genotype-Tissue Expression, UALCAN, Human Protein Atlas ו-cBioPortal נותחו כדי לחקור ביטוי TMED3 ושינויים גנטיים בסרטן הפאן-סרטני. בוצעה אימונוהיסטוכימיה להערכת ביטוי חלבון TMED3 ברקמות סרטן המעי הגס. ניתוח הישרדות קפלן–מאייר וניתוח רגרסיה של קוקס שימשו להערכת הערך הפרוגנוסטי של TMED3. ניתוח קורלציה של ספירמן בוצע כדי להעריך את הקשרים בין TMED3 לעומס מוטציות גידול, חוסר יציבות מיקרו-לוויין (MSI), חדירת תאי חיסון ונקודות ביקורת חיסוניות. בוצע ניתוח העשרת קבוצות גנים כדי לחקור מסלולים ביולוגיים אפשריים הקשורים ל-TMED3 בסרטן המעי הגס. ביטוי TMED3 היה מוגבר ברוב סוגי הגידולים והיה קשור להישרדות כללית לא רצויה ולהישרדות ספציפית למחלה בקרצינומה אדרנוקורטיקלית, אדנוקרצינומה של המעי הגס ומלנומה עינבה. השכיחות הגבוהה ביותר של שינויים גנטיים ב-TMED3 זוהתה במזותליומה, כאשר הגברה מייצגת את סוג השינוי הדומיננטי. בנוסף, ביטוי TMED3 הראה מתאמים משמעותיים עם נטל מוטציות הגידול ואי-יציבות מיקרוסליטיין בקרצינומה של תאי כליה שקופים, אדנוקרצינומה בקיבה וקרצינומה של רירית הרחם בגופ. ביטוי TMED3 היה קשור גם לחדירת מערכת חיסון ולביטוי נקודות ביקורת חיסונית במספר גידולים. ניתוח IHC הראה ביטוי מוגבר של TMED3 ברקמות סרטן המעי הגס בהשוואה לרקמות מעי הגס הרגילות והראה קשר לשלב T. ניתוח העשרה פונקציונלית זיהה מסלולים הקשורים לריבוזום, עיבוד והצגת אנטיגן, פוספורילציה חמצונית ופנטוז פוספט. ממצאים אלו מצביעים על כך ש-TMED3 עשוי לייצג סמן ביולוגי מבטיח לאבחון ולהערכה פרוגנוסטית של סרטן המעי הגס וכן של סוגי גידולים נוספים.

מבוא

משפחת החלבונים של תחום Emp24 טרנסממברנלי (TMED) מורכבת מארבע תת-משפחות (α, β, γ ו-δ) שקיימות בדרך כלל כמונומרים, דימרים או קומפלקסים אוליגומריים בתאים אאוקריוטיים. חברי משפחת TMED מעורבים בסחר תוך-תאי בוסיקולות והיו מעורבים במגוון מחלות אנושיות, כולל סרטן, הפרעות חיסוניות, סוכרת, מחלות ניווניות עצביות, מחלת כבד שומני לא-אלכוהולית, קרדיומיופתיה מורחבת, מחלת כליות מוצין 1 (MKD) ותסמונת שוגרן (SS)¹. חלבון טרנסממברנלי emp24 המכיל דומיין 3 (TMED3), חבר במשפחת חלבוני p24, הוא חלבון טרנסממברנלי מסוג I חד-מעבר שמור מאוד, המקודד על כרומוזום 15q25.1 בבני אדם ^2,3. ראיות מצטברות הראו כי TMED3 מתבטא באופן חריג במספר מאירויות ומעורב בהתחלת גידול, התפשטות, פלישה, גרורות והתקדמות גידול. דווח על ביטוי מוגבר של TMED3 באוסטאוסרקומה⁴, קרצינומה של תאי קשקשי ריאה⁵, סרטן השד⁶, קרצינומה רירית הרחם⁷, וסרטן המעי הגס⁸. מחקרים ניסיוניים הראו כי דיכוי ביטוי TMED3 מעכב התרבות תאי הגידול, יכולת גרורות ופעילות אנטי-אפופטוטית, ובכך מגביל את התקדמות הגידול. בגליומה, ביטוי יתר של TMED3 נקשר לדרגת גידול גבוהה יותר ולפרוגנוזה גרועה יותר, ו-TMED3 דווח כמקדם התקדמות גליובלסטומה באמצעות ויסות^{ZBTB7A 9}. למרות שמחקרים קודמים בחנו את התפקיד הביולוגי של TMED3 בסוגי גידולים מסוימים, דפוסי הביטוי שלו, המשמעות הפרוגנוסטית והתפקודים המולקולריים שלו ברחבי הסרטן הפאן-סרטני טרם אופו באופן שיטתי.

התקדמות אחרונה במאגרי מידע מולטיאומיקס וניתוח ביואינפורמטיקה אפשרה הערכה שיטתית של ביטוי גנים, פרוגנוזה, מאפייני מערכת החיסון ושינויים מולקולריים בין סוגי גידולים שונים. בהשוואה למחקרים חד-קבוצה, ניתוח פאן-סרטן משולב באמצעות מאגרי מידע זמינים לציבור מספק גישה רחבה יותר לזיהוי סמנים ביולוגיים פוטנציאליים ומטרות טיפוליות בסוגי סרטן. במחקר הנוכחי נערכו ניתוחים מקיפים של ביואינפורמטיקה כדי לבחון את תפקיד TMED3 במגוון סוגי סרטן באמצעות מאגרי מידע מולטיאומיקס זמינים לציבור, כולל The Cancer Genome Atlas (TCGA), Genotype-Tissue Expression (GTEx), UALCAN, Human Protein Atlas ו-cBioPortal. המחקר העריך באופן שיטתי דפוסי ביטוי TMED3, מאפיינים קליניים-פתולוגיים, חשיבות פרוגנוסטית, קשרים חיסונים ותפקודים ביולוגיים פוטנציאליים בפאן-סרטן. בנוסף, בוצע ניתוח אימונוהיסטוכימי (IHC) ברקמות סרטן המעי הגס כדי לאמת את ביטוי חלבון TMED3 ואת הקשר שלו לתכונות קליניקופתולוגיות. הניתוח הפאן-סרטני שלנו משמש כאסטרטגיית סקר לזיהוי סמנים ביולוגיים מועמדים. לאחר מכן ביצענו אימות ניסיוני במיוחד בסרטן המעי הגס (CRC). התוצאות מראות כי TMED3 הוא סמן ביולוגי פרוגנוסטי מבטיח ב-CRC, אם כי רלוונטיותו לסוגי סרטן אחרים דורשת בדיקה נוספת.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים רקמות אנושיות בוצעו בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית והאתיות המוסדיות ובתוך ארון בטיחות ביולוגית מוסמך. פרוטוקול המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה המחקרית של בית החולים המרכזי טאנגשאן (מס' TZYL/K/2023-16), והסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המשתתפים לפני איסוף הדגימות.

איסוף נתונים
נתוני פרופיל ביטוי TMED3 מרקמות תקינות שונות של גידולים ורקמות לא מזווגות התקבלו ממאגרי TCGA ו-GTEx^10,11 (TCGA: https://portal.gdc.cancer.gov/; GTEx: https://gtexportal.org/; ניגש ב-1 ביולי 2025). בוצעו בדיקות סכום דירוג של וילקוקסון לניתוח ביטוי TMED3 שונה בין רקמות גידול לרקמות תקינות לא מזווגות. מטריצות ביטוי ריצוף RNA מנורמל (TPM) שהורדו מ-UCSC Xena שימשו לניתוחים במורד הזרם. ערכי הביטויים תואמו באמצעות טרנספורמציה log₂ (TPM + 1) לפני ניתוח סטטיסטי. נתוני ביטוי TMED3 עבור 33 סוגי גידולים ורקמות תקינות תואמות הורדו לאחר מכן ממאגר TCGA. בדיקות דירוג חתום של וילקוקסון שימשו להערכת ביטוי TMED3 שונה בין גידולים לרקמות תקינות. ביטוי חלבון TMED3 שונה בין גידול לרקמות תקינות התקבל ממאגר UALCAN¹² (http://ualcan.path.uab.edu; ניגש ב-1 ביולי 2025). מודול ניתוח הפרוטאומיקה, ונבחרה האפשרות "תצוגת פאן-סרטן" לניתוח. ניתוחי ביטוי חלבון בוצעו באמצעות מאגרי הנתונים CPTAC הזמינים דרך מודול "Pan-cancer View" של UALCAN, עם הגדרות ברירת מחדל של פלטפורמה וללא סינון דגימות נוסף.

ניתוח מאפיינים קליניקופתולוגיים
נאסף מידע קליניקופתולוגי מ-33 סוגי גידולים במאגר TCGA כדי לבדוק את הקשר בין ביטוי TMED3 לשלב הפתולוגי. שלבי הגידול סווגו לשלבים מוקדמים (שלבים I–II) ושלבים מתקדמים (שלבים III–IV). ההבדלים בביטוי TMED3 בין קבוצות שלבים הוערכו באמצעות בדיקות סכום דירוג של וילקוקסון בין סוגי סרטן שונים.

ניתוח פרוגנוסטי
נתוני זמן הישרדות וסטטוס הישרדות מ-33 סוגי גידולים נאספו לניתוח פרוגנוסטי. מקרים תקינים ומקרים ללא מידע קליני הוצאו. ערכים חסרים טופלו בהתאם להיעדרות של כל משתנה. ביטוי TMED3 חולק לקבוצות ביטוי גבוה ונמוך לפי ערך הביטוי החציוני. חבילת ההישרדות (גרסה 3.2-7) בתוכנת R לניתוח סטטיסטי (גרסה 4.2.1) שימשה לביצוע ניתוח רגרסיה של סיכונים פרופורציונליים של קוקס. התוצאות הוצגו באמצעות חבילות survminer ו-ggplot2. הישרדות כוללת (OS) הוגדרה כמרווח האבחון למוות מכל סיבה, בעוד שהישרדות ספציפית למחלה (DSS) הוגדרה כמרווח האבחון ועד המוות המיוחס לסרטן הספציפי, כאשר מקרי מוות שאינם קשורים לממאירות טופלו כאירועים מצונזרים. לאחר מכן בוצעו ניתוחי הישרדות של קפלן–מאייר להערכת הקשרים בין ביטוי TMED3 לבין OS ו-DSS באדנוקרצינומה של המעי הגס (COAD).

ניתוח מוטציות
מאגר הנתונים cBioPortal (www.cbioportal.org; ניגש ב-5 ביולי 2025) שימש לניתוח תדירות השינויים הגנטיים ב-TMED3 ב-33 סוגי סרטן¹³. אתר cBioPortal ניגש, ו"TMED3" הוזן לסרגל החיפוש המהיר כדי לנתח את פרופיל המוטציות של TMED3 במספר סוגי סרטן. שינויים גנטיים ב-TMED3 כללו בעיקר מוטציה, הגברה, מחיקה עמוקה ושינויים מרובים. מחקרים פאן-סרטניים ברירת מחדל והגדרות שאילתות זמינות ב-cBioPortal שימשו לניתוח מוטציות ללא סינון נוסף.

ניתוח קורלציה של מתילציה של DNA
ניתוח מתילציה של DNA בוצע להערכת מצב המתילציה של הפרומוטר של TMED3 בגידול וברקמות תקינות באמצעות מאגר הנתונים UALCAN (https://ualcan.path.uab.edu/; נגיש ב-5 ביולי 2025). מצב המתילציה של ה-DNA באזור פרומוטר TMED3 נותח באמצעות נתוני מתילציה ברמה 3 שנוצרו מפלטפורמת Illumina Infinium HumanMethylation450K ב-TCGA. רמות המתילציה הוצגו בערכי β , שחושבו כ-β = עוצמת גלאי מתילציה / (עוצמת גלאי מתילציה + עוצמת גלאי לא מתילציה), עם ערכים הנעים בין 0 (לא מתילציה) ל-1 (מתילציה מלאה). גשושי CpG הממוקמים בטווח של 1500 bp במעלה הזרם מאתר תחילת השעתוק (TSS), כולל אזורי TSS200 ו-TSS1500 שהוגדרו על ידי UALCAN, נותחו להערכת מצב המתילציה של המקדם. UALCAN חילצה אוטומטית את כל גלאי ה-CpG הזמינים באזור המקדם של גן היעד ללא סינון נוסף. הושגו ערכי β מתילציה מרקמות פאן-סרטניות ותקנות, ובוצעו בדיקות טסטוסטרון דו-מדגימותיות לא מזווגות כדי להשוות הבדלים בין קבוצות. נעשה שימוש בסף מובהקות של α = 0.05, ו-P < 0.05 נחשב למובהק סטטיסטית.

ניתוח הקשר בין TMED3, נטל המוטציה של הגידול ואי-יציבות מיקרו-סליטליט
נותחו עומס מוטציות גידולי (TMB) ואי-יציבות מיקרו-סליטליטית (MSI) כדי לבדוק את הקשר ביניהם לביטוי TMED3 במספר סוגי סרטן. מערכי נתונים פאן-סרטניים מעובדים באופן אחיד הורדו ממאגר UCSC Xena (https://xenabrowser.net/; ניגש ב-5 ביולי 2025), ופרופילי ביטוי TMED3 הופקו לניתוחים נוספים. נתוני וריאציה פשוטה של נוקלאוטידים ברמה 4 עבור דגימות TCGA שנוצרו באמצעות MuTect2 התקבלו ממאגר הנתונים הגנומיים (GDC) (https://portal.gdc.cancer.gov/)¹⁴. נתוני הביטוי של TMED3 שולבו עם מערכי הנתונים של TMB, וערכי הביטויים ננורמו באמצעות טרנספורמציה log₂(x + 1) לפני ניתוח סטטיסטי. ציוני MSI לסוגי גידולים בודדים נאספו ממחקרים שפורסמו^{בעבר 15} ובהמשך אוחדו עם נתוני ביטוי TMED3 לאחר אותו תהליך נרמול. הקשרים בין ביטוי TMED3 ל-TMB/MSI הוערכו באמצעות ניתוח קורלציה של ספירמן במאגרי נתונים פאן-סרטניים^16,17.

ניתוח מאפייני החיסון של TMED3
אלגוריתם ESTIMATE יושם לחישוב ציוני סטרומל, ציוני מערכת החיסון וציוני ESTIMATE עבור סוגי גידולים שונים. ציוני חדירת הסטרומל והחיסון במאגרי נתונים פאן-סרטניים נוצרו באמצעות חבילת ההערכה (גרסה 1.0.13) בתוכנת הניתוח הסטטיסטי. ההבדלים בציון סטרומלי, ציון חיסון וציון ESTIMATE בין קבוצות עם ביטוי TMED3 גבוה ונמוך הוערכו באמצעות מבחני סכום דירוג של וילקוקסון. בנוסף, נערכו ניתוחים הקשורים לנקודת ביקורת חיסונית כדי לבחון את הקשרים בין ביטוי TMED3 ומולקולות נקודת ביקורת חיסוניות, כולל חלבון מוות תאי מתוכנת 1 (PD-1), ליגנד מוות מתוכנת 1 (PD-L1), וחלבון 4 המקושר ל-T-לימפוציטים ציטוטוקסי (CTLA4), בין סוגי סרטן שונים. נתוני ביטוי STAR-count ומידע קליני מתאים עבור COAD הורדו ממאגר הנתונים של TCGA. מטריצות ביטוי בפורמט TPM הופקו ונרמלו באמצעות טרנספורמציה log₂ (TPM + 1). פרופילי ביטוי של שמונה גנים הקשורים לנקודות ביקורת חיסונית התקבלו לאחר מכן מדגימות COAD, ונותחו מתאמים בין ביטוי TMED3 לסמני נקודות ביקורת חיסוניות באמצעות ניתוח קורלציה של ספירמן.

ניתוח רגישות לתרופות
ניתוח רגישות תרופתית בוצע באמצעות פלטפורמת GSCALite כדי לבדוק את הקשר בין ביטוי TMED3 לבין תגובתיות תרופות אנטי-סרטניות^{בין סוגי} סרטן שונים. נתוני ריצוף RNA ברמה 3 ומידע קליני מתאים לדגימות COAD התקבלו ממאגר הנתונים של TCGA. תגובות כימותרפיות צפויות לכל מדגם נוצרו באמצעות נתונים ממאגר הגנומיקה של רגישות תרופתית בסרטן (GDSC) (https://www.cancerrxgene.org/). חיזוי תגובת התרופות בוצע באמצעות חבילת pRRophetic בתוכנת הניתוח הסטטיסטי. ערכי הריכוז המעכב החצי-מקסימלי (IC₅₀) חושבו באמצעות רגרסיית רכס עם הגדרות ברירת מחדל, כולל תיקון אפקט אצווה באמצעות אלגוריתם הקרב וניתוחי התאמה ספציפיים לרקמה. מדידות ביטוי גנים משוכפלות נמדדו בממוצע לפני הניתוח במורד הזרם.

ביטוי ותחזית של TMED3 בסרטן המעי הגס
פרופילי ביטוי TMED3 ונתונים קליניקופתולוגיים תואמים לאדנוקרצינומה של המעי הגס התקבלו ממאגר TCGA. ביטוי TMED3 שונה בין רקמות סרטן המעי הגס לרקמות תקינות לא תואמות הוערך באמצעות מבחני סכום דירוג של וילקוקסון, בעוד שקשרים בין ביטוי TMED3 לתכונות קליניקופתולוגיות נותחו באמצעות מבחני חי-ריבוע. החולים חולקו לקבוצות ביטוי גבוה ונמוך לפי רמת הביטוי החציונית של TMED3. לאחר מכן בוצע ניתוח הישרדות קפלן–מאייר כדי להשוות הבדלים פרוגנוטיים בין שתי הקבוצות. נערכו ניתוחי רגרסיה חד-משתניים ורב-משתניים של סיכוני Cox פרופורציונליים כדי להעריך את המשמעות הפרוגנוסטית של ביטוי TMED3 בסרטן המעי הגס. בנוסף, בוצע ניתוח עקומות מאפייני הפעלה של מקלט תלוי זמן (ROC) כדי להעריך את הביצועים החיזויים של ביטוי TMED3 עבור מערכת הפעלה של 1, 3 ו-5 שנים. ניתוחי ROC בוצעו באמצעות חבילת timeROC בתוכנת הניתוח הסטטיסטי, ונוצרה הדמיה גרפית באמצעות חבילת ggplot2.

ניתוח אימונוהיסטוכימיה
בסך הכל נבחרו באקראי 60 דגימות רקמת סרטן המעי הגס ו-20 רקמות לא סרטניות מבית החולים המרכזי טאנגשאן. המחקר אושר על ידי הוועדה המקומית לביקורת מוסדית (מס' TZYL/K/2023-16), והתקבלה הסכמה מדעת בכתב מכל המטופלים לפני הניתוח. כל דגימות הרקמה נאספו ממטופלים שעברו ניתוח כריתה ללא כימותרפיה או אימונותרפיה קודמת. הקבוצה כללה 39 מטופלים גברים ו-21 נשים בגילאי 20–87. לפי קריטריוני השלב של דיוק, 33 מטופלים סווגו כשלב I+II ו-27 מטופלים כשלב III+IV. התפלגות השלבים של הקוהורט עשויה להכניס הטיית בחירה פוטנציאלית לכיוון שלבי מחלה מתקדמים; לכן, יש לפרש בזהירות ממצאים הקשורים להישרדות.

דגימות רקמה מוטמעות בפרפין חולקו לפרוסות של 4 מיקרון, ולאחר מכן בוצעו דה-פרפיניזציה והחזרת נוזלים. פעילות פרוקסידאז אנדוגנית הוקפאה באמצעות 4%_H2O₂, וקישור לא ספציפי נחסם לאחר מכן באמצעות סרום עזים. החתכים נדגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם נוגדן ראשוני TMED3 בדילול של 1:100. ביום הבא הוחל פולימר IgG נגד ארנבים (PV-6000) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. פעילות אימונוריאקטיבית הוצגה באמצעות צביעת דיאמינובנזידין, והחלקים הורכבו עם שרף ניטרלי. צביעת היסטולוגיה נבדקה תחת מיקרוסקופ אופטי בהגדלה גבוהה. עוצמת צביעת החיסון דורגה כ-0 (שלילי), 1 (חלש), 2 (בינונית) ו-3 (חזקה), בעוד ששיעור תאי הגידול החיוביים דורג כ-1 (1%–25%), 2 (26%–50%), 3 (51%–75%) או 4 (76%–100%). ציוני האימונוהיסטוכימיה הסופיים חושבו על ידי הכפלת עוצמת הצביעה באחוז של תאי גידול חיוביים. רמות הביטוי של TMED3 סווגו כשליליות/ביטוי נמוכות (ציון ≤ 6) או ביטוי יתר (ציון > 6)¹⁹.

ניתוח העשרת גנים של TMED3 בסרטן המעי הגס
בוצע ניתוח העשרת גנים כדי להעריך את הפונקציות הביולוגיות הפוטנציאליות ומסלולי האיתות הקשורים לביטוי TMED3 בסרטן המעי הגס. גנים שביטאו באופן שונה בין קבוצות עם ביטוי TMED3 גבוה ונמוך נבדקו באמצעות חבילת DESeq2 בתוכנת הניתוח הסטטיסטי. נתוני ספירה גולמיים שהושגו מ-TCGA נורמל באמצעות שיטת נורמליזציה של יחס חציוני שיושמה ב-DESeq2. גנים בעלי ביטוי נמוך עם מספרים <10 ביותר מ-50% מהדגימות הוצאו לפני הניתוח. גנים המובעים באופן שונה זוהו באמצעות סף |log₂ (FC)| ≥ 1 ו-P מותאם < 0.05 לאחר תיקון בדיקות מרובות של Benjamini–Hochberg (BH). כל הפרמטרים האנליטיים נקבעו כדי להבטיח שחזור של הניתוח.

לאחר מכן, ניתוח העשרת קבוצות גנים (GSEA) בוצע באמצעות חבילת clusterProfiler ב-R, המבוססת על ערכות גנים של קיוטו (KEGG) (גרסה 7.5.1) שהתקבלה ממאגר החתימות המולקולריות (MSigDB). נוצרה רשימת גנים מדורגת מראש לפי ערכי שינוי הקיפול log2 בין קבוצות ביטוי TMED3 גבוה ונמוך. ניתוח העשרה בוצע באמצעות 1000 פרמוטציות פנוטיפיות, ומערכות גנים המכילות 15–500 גנים נכללו בניתוח. מסלולים עם ערכים מוחלטים של ציון העשרה מנורמל (NES) של >1, P מותאם < 0.05, ושיעור גילוי שגוי (FDR) < 0.25 נחשבו להעשרים באופן משמעותי. ההעשרה של מסלול מחלת פרקינסון נשמרה משום שמסלול זה קשור קשר הדוק לתפקוד לקוי של מיטוכונדריה ותהליכים ביולוגיים הקשורים לזרחון חמצוני, המעורבים גם בתכנות מחדש מטבולי של הגידול ובהתקדמות הסרטן.

ניתוח סטטיסטי
כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת הניתוח הסטטיסטי. הבעה שונה בין קבוצות הוערכה באמצעות מבחני וילקוקסון דו-צדדיים לסכום דירוג עבור דגימות לא מזווגות ומבחני דירוג חתום של וילקוקסון עבור מדגמים זוגיים. הוערכו הקשרים בין ביטוי TMED3 למשתנים קליניקופתולוגיים באמצעות מבחני חי-ריבוע. בוצעו ניתוחי הישרדות באמצעות חבילת הישרדות (גרסה 3.3-1), ועקומות הישרדות קפלן–מאייר נוצרו עם חבילת הסורבמיינר. ההבדלים בתוצאות ההישרדות בין קבוצות הושוו באמצעות מבחן ה-log-rank. מודלים של רגרסיה לסיכונים פרופורציונליים של קוקס יושמו לזיהוי גורמים פרוגנוסטיים הקשורים למערכת ההפעלה (OS). המטופלים סווגו לקבוצות ביטוי גבוה ונמוך בהתאם לרמת הביטוי החציונית של TMED3. ניתוחי ROC תלויי זמן בוצעו באמצעות חבילת timeROC, והנתונים נוצרו באמצעות חבילת ggplot2. אלא אם צוין אחרת, המובהקות הסטטיסטית הוגדרה כערך P דו-צדדי של < 0.05.

בוצע ניתוח קורלציה של ספירמן כדי להעריך את הקורלציות בין ביטוי TMED3 לתכונות החיסוניות, TMB ו-MSI. נתוני ביטוי כמותיים מנורמלים שהושגו ממאגרי המידע הציבוריים המתאימים שימשו לכל ניתוחי המתאמים. לנתוני ריצוף RNA של TCGA, ערכי ביטוי בפורמט TPM הומרו באמצעות נורמליזציה log₂(TPM + 1) לפני ניתוח כאשר הדבר רלוונטי. דגימות עם נתונים קליניים או מולקולריים חסרים הוצאו לפני ניתוח סטטיסטי. ניתוחי קורלציה של ספירמן נערכו כמבחנים דו-זנביים לא פרמטריים. ערכי P גולמיים שימשו לניתוחים שכללו השוואות מוגבלות, כולל מבחני וילקוקסון, ניתוחי קורלציה של ספירמן וניתוחי הישרדות. לניתוחי ביואינפורמטיקה רחבי היקף ובעלי תפוקה גבוהה, כולל ניתוח ביטוי גנים שונה, ניתוח העשרת KEGG ו-GSEA, בוצעה תיקון בדיקות מרובות באמצעות שיטת BH FDR. ערכי FDR מותאמים של <0.05 נחשבו מובהקים סטטיסטית.

תוצאות

ניתוח ביטוי של TMED3 בפאן-סרטן
ניתוח מאגרי הנתונים של TCGA ו-GTEx הראה כי ביטוי חומצה ריבונוקלאית שליח (mRNA) של TMED3 היה גבוה משמעותית ברוב רקמות הגידול בהשוואה לרקמות תקינות מתאימות, כולל קרצינומה אדרנוקורטיקלית (ACC), קרצינומה של שלפוחית השתן (BLCA), קרצינומה פולשנית של שד (BRCA), קרצינומה של תאי קשקש צוואריים ואדנוקרצינומה אנדוקרוויקלית (CESC), כולנגיוקרצינומה (CHOL), אדנוקרצינומה של המעי הגס (COAD), לימפומה של תאי B גדולים מפוזרת (DLBC), קרצינומה של הוושט (ESCA), גליובלסטומה מולטיפורמה (GBM), קרצינומה של תאי כליה שקופים בכליה (KIRC), קרצינומה של תאי פפילריה בכליה (KIRP), גליומה במוח בדרגה נמוכה יותר (LGG), קרצינומה כבדית בכבד (LIHC), אדנוקרצינומה ריאתית (LUAD), קרצינומה של תאי קשקש ריאה (LUSC), ציסטדנוקרצינומה סרואית בשחלות (OV), אדנוקרצינומה של הלבלב (PAAD), פיאוכרומוציטומה ופארגנגליומה (PCPG), אדנוקרצינומה של הערמונית (PRAD), אדנוקרצינומה של הרקטום (READ), מלנומה עורית (SKCM), אדנוקרצינומה בקיבה (STAD), גידולי תאי נבט אשכים (TGCT), קרצינומה של בלוטת התריס (THCA), תימומה (THYM), קרצינומה רירית הרחם (UCEC) וקרצינוסרקומה ברחם (UCS), בעוד שביטוי מופחת נצפה בקרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר (HNSC) ובלוקמיה מיאלואידית חריפה (LAML) (איור 1A). רקמות תקינות סמוכות שימשו כאמצעי בקרה לניתוחי ביטוי זוגיים. ניתוח TCGA זוגי אישר עוד עלייה משמעותית בביטוי TMED3 ברקמות BLCA, BRCA, CHOL, COAD, כרומופוב כליות (KICH), KIRP, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PRAD, STAD ו-UCEC בהשוואה לרקמות תקינות מזווגות (איור 1B). בנוסף, ניתוח ביטוי חלבונים באמצעות מאגר הנתונים UALCAN/Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) הראה עלייה ברמות חלבוני TMED3 ברקמות גידול BRCA, COAD, GBM, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, OV ו-UCEC, בעוד שביטוי חלבון מופחת נצפה ב-PAAD בהשוואה לרקמות תקינות (איור 1C). עם זאת, ביטוי חלבון TMED3 היה נמוך יותר ב-PAAD מאשר ברקמות רגילות. פער זה בין דפוסי ביטוי mRNA וחלבונים עשוי לשקף מנגנוני ויסות פוסט-שעתוק או פוסט-תרגום. ממצאים אלו מצביעים על כך ש-TMED3 מווסת באופן חריג במספר סוגי סרטן וייתכן שהוא קשור למאפיינים אבחנתיים ותחזיתיים במספר סוגי סרטן.

איור 1. פרופילי ביטוי TMED3 על פני סרטן אנושי. (א) ביטוי mRNA שונה של TMED3 בין גידול לרקמות תקינות במספר סוגי סרטן בהתבסס על מערכי נתונים של TCGA ו-GTEx. רמות הביטוי מוצגות כ-log₂(TPM + 1). (B) ניתוח זוגי של ביטוי mRNA של TMED3 בין רקמות גידול לרקמות תקינות סמוכות תואמות ממאגרי נתונים של TCGA. (C) ביטוי שונה של חלבון TMED3 בין רקמות תקינות לגידולים ראשוניים במאגרי CPTAC/UALCAN, כולל קרצינומה פולשנית של השד (BRCA), אדנוקרצינומה של המעי הגס (COAD), גליובלסטומה מולטיפורמה (GBM), קרצינומה של תאי כליה שקופים בכליה (KIRC), קרצינומה כבדית כבדית (LIHC), אדנוקרצינומה ריאתית (LUAD), קרצינומה של תאי קשקש ריאה (LUSC), ציסטדנוקרצינומה סרובית בשחלות (OV), אדנוקרצינומה של הלבלב (PAAD) וקרצינומה רירית הרחם (UCEC). הנתונים מוצגים כגרפים קופסה. המשמעות הסטטיסטית נותחה באמצעות מבחני סכום דירוג וילקוקסון או מבחני דירוג חתום של וילקוקסון, לפי הצורך. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001; NS, לא משמעותי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

ניתוח תכונות קליניקופתולוגי
ניתוח שלב קליני הראה כי ביטוי TMED3 היה גבוה משמעותית בגידולים בשלבים מתקדמים (שלבים III–IV) בהשוואה לגידולים בשלבים מוקדמים (שלב I–II) ב-ACC, KIRC, KIRP ו-LUAD (איור 2). לעומת זאת, ביטוי TMED3 ירד באופן משמעותי ברקמות UCEC בשלב מתקדם. ממצאים אלו מצביעים על כך שביטוי מוגבר של TMED3 עשוי להיות קשור להתקדמות הגידול במספר סוגי סרטן.

איור 2. הקשר בין ביטוי TMED3 לשלב הפתולוגי במספר סוגי סרטן. גרפים של כינור המראים רמות ביטוי mRNA של TMED3 בגידולים בשלבים מוקדמים (שלב I–II) ובגידולים בשלב מתקדם (שלב III–IV) בקרצינומה אדרנוקורטיקלית (ACC), קרצינומה של תאי כליה שקופים בכליה (KIRC), קרצינומה של תאי פפילריה בכליה (KIRP), אדנוקרצינומה ריאתית (LUAD) וקרצינומה רירית הרחם (UCEC). רמות הביטוי מוצגות כ-log₂(TPM + 1). המובהקות הסטטיסטית הוערכה באמצעות מבחני סכום דירוג של וילקוקסון. *P < 0.05, ***P < 0.001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

ניתוח פרוגנוסטי
ניתוחי רגרסיה והישרדות של Cox הראו כי ביטוי גבוה של TMED3 היה קשור למערכת הפעלה נמוכה יותר ב-ACC, COAD, LUAD ו-UVM (איור 3A). ניתוח DSS חשף בנוסף כי ביטוי TMED3 מוגבר היה קשור באופן משמעותי ל-DSS שלילי ב-ACC, COAD, GBM, KIRP ו-UVM (איור 3B). ראוי לציין כי ACC, COAD ו-UVM הראו בעקביות פרוגנוזה לקויה הן ל-OS והן ל-DSS אצל מטופלים עם ביטוי TMED3 גבוה. אסוציאציות פרוגנוסטיות ברמת מגמה נצפו גם בסוגי גידולים נבחרים, כולל LUAD, KIRC ו-LGG. ממצאים אלו מצביעים על כך שלביטוי TMED3 עשוי להיות רלוונטיות פרוגנוסטית במספר ממאירויות.

איור 3. משמעות פרוגנוסטית של ביטוי TMED3 בניתוח פאן-סרטן. (א) תרשים יער המראה את הקשר בין ביטוי TMED3 לבין הישרדות כוללת (OS) במספר סוגי סרטן. (B) תרשים יער המראה את הקשר בין ביטוי TMED3 להישרדות ספציפית למחלה (DSS) בין סוגי סרטן שונים. יחסי סיכון (HRs) ורווחי ביטחון של 95% (רווח סמך 95%) חושבו באמצעות ניתוח רגרסיה סיכונים פרופורציונלית של Cox. דופק > 1 מצביע על פרוגנוזה לקויה הקשורה לביטוי גבוה של TMED3. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

ניתוח מוטציות
ניתוח שינוי גנטי באמצעות מאגר cBioPortal הראה כי שינויים ב-TMED3 בסוגי סרטן כללו בעיקר מוטציות, הגברות, מחיקות עמוקות ושינויים מרובים (איור 4). השכיחות הגבוהה ביותר של שינויים ב-TMED3 נצפתה במזותליומה (MESO), בעיקר מונעת על ידי הגברת גנים (2.3%). ESCA הראה סוגי שינויים מעורבים, כולל מוטציה (0.55%), הגברה (1.1%) ומחיקה עמוקה (0.55%). לעומת זאת, לא זוהו שינויים גנטיים ניתנים לזיהוי ב-TMED3 במערכי הנתונים LIHC, KICH, THCA, PCPG, CHOL, UVM, LAML, UCS, DLBC, KIRC, TGCT ו-GBM. ממצאים אלו מצביעים על כך ששינויים גנומיים ב-TMED3 מתרחשים באופן ספציפי לגידול ועשויים לתרום להטרוגניות בסרטן.

איור 4. נוף השינוי הגנטי של TMED3 בין סוגי סרטן. תדירות וסוגי שינויים גנטיים ב-TMED3 בין מערכי נתונים פאן-סרטניים שהתקבלו ממאגר cBioPortal. קטגוריות שינוי כללו מוטציה, הגברה, מחיקה עמוקה ושינויים מרובים. ציר ה-y מציין תדירות שינוי (%) בין סוגי סרטן. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

ניתוח מתילציה של DNA
ניתוח מאגר הנתונים של UALCAN הראה כי רמות המתילציה של TMED3 במיתילציה של פרומוטר TMED3 עלו באופן משמעותי ברקמות גידול BRCA, COAD, ESCA, HNSC, KIRC, KIRP, LIHC, LUAD, PAAD ו-PRAD בהשוואה לרקמות תקינות מתאימות (איור 5). לעומת זאת, נצפו רמות מתילציה מופחתת של TMED3 ברקמות BLCA, TGCT ו-UCEC ביחס לביקורת תקינה. ממצאים אלו מצביעים על כך שמתילציה חריגת של פרומוטר TMED3 עשויה לתרום לוויסות ספציפי של ביטוי TMED3.

איור 5. רמות מתילציה של TMED3 במקדמים בסרטן. השוואה בין רמות המתילציה של TMED3 בין רקמות הגידול לרקמות תקינות בסרטן האורותליאל של שלפוחית השתן (BLCA), קרצינומה פולשנית של השד (BRCA), אדנוקרצינומה של המעי הגס (COAD), קרצינומה הוושט (ESCA), קרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר (HNSC), קרצינומה של תאי כליה שקופים בכליה (KIRC), קרצינומה של תאי פפילריה בכליה (KIRP), קרצינומה כבדית של הכבד (LIHC), אדנוקרצינומה ריאתית (LUAD), אדנוקרצינומה של הלבלב (PAAD), אדנוקרצינומה של ערמונית (PRAD), גידולי תאי נבט באשכים (TGCT) וקרצינומה רירית הרחם (UCEC) שהושגו מ-UALCAN. הנתונים מוצגים כערכי β בגרפים של קופסה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

ניתוח מתאמים TMED3, TMB ו-MSI
ניתוח המתאם של ספירמן הראה כי ביטוי TMED3 היה בקורלציה חיובית עם TMB ב-ACC, ESCA, KIRC, LGG, PAAD, STAD, THYM ו-UCEC, בעוד שקורלציות שליליות נצפו ב-CESC, LUAD ו-TGCT (איור 6A). בנוסף, ביטוי TMED3 היה קשור באופן חיובי ל-MSI ב-DLBC, KIRC, SKCM, STAD ו-UCEC (איור 6B). ראוי לציין כי ביטוי TMED3 הראה מתאמים חיוביים עם TMB ו-MSI ב-KIRC, STAD ו-UCEC, מה שעשוי להצביע על קשרים פוטנציאליים לאימונוגניות גידולים בסרטנים אלו.

איור 6. קורלציה בין ביטוי TMED3 לעומס מוטציוני של גידול וחוסר יציבות מיקרוסליטיין בניתוח פאן-סרטן. (א) גרף רדאר המראה את הקשר בין ביטוי TMED3 לבין נטל המוטציה של הגידול (TMB) בין סוגי סרטן. (B) תרשים רדאר המראה את המתאם בין ביטוי TMED3 לאי-יציבות מיקרו-לווית (MSI) בין סוגי סרטן. מקדמי הקורלציה חושבו באמצעות ניתוח קורלציה של ספירמן. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

ניתוח תכונות חיסון
ניתוח ESTIMATE הראה כי ביטוי TMED3 היה בקורלציה שלילית עם ציון סטרומל, ציון חיסון וציון ESTIMATE ב-BCLA, ESCA, LAML, LUAD, LUSC, PAAD, PRAD, SKCM, STAD, THCA ו-UCEC (איור 7A). לעומת זאת, נצפו מתאמים חיוביים בין ביטוי TMED3 לבין ציונים אלו הקשורים למערכת החיסון ב-LGG, LIHC ו-PCPG. לא זוהו מתאמים משמעותיים ב-ACC, CHOL, DLBC, GBM, KICH, KIRC, KIRP, OV ו-UCS. ממצאים אלו מצביעים על כך ש-TMED3 עשוי להשפיע על מיקרו-סביבת הגידול וחדירת תאי מערכת החיסון באופן התלוי בסוג סרטן. ניתוח קורלציה בנקודות ביקורת חיסונית הראה עוד כי ביטוי TMED3 היה קשור שלילית לגנים הקשורים לנקודות ביקורת חיסונית CD274 (PD-L1), PDCD1 (PD-1) ו-CTLA4 ב-BLCA, BRCA, CESC, ESCA, HNSC, LUAD, LUSC, PRAD, SKCM ו-THCA (איור 7B). זוהו מתאמים חיוביים בין ביטוי TMED3 לגנים של נקודות ביקורת חיסוניות ב-LIHC וב-UVM, בעוד שלא נצפו קשרים משמעותיים ב-GBM, KICH, LAML, MESO, OV, PCPG, READ ו-TGCT. תוצאות אלו מצביעות על כך ש-TMED3 עשוי להיות קשור לוויסות חיסוני של הגידול ולאיתות נקודות ביקורת חיסוניות בסרטן נבחר.

איור 7. קשרים בין ביטוי TMED3 לבין מאפייני החיסון של הגידול. (א) מפת חום המציגה מתאמים בין ביטוי TMED3 לציון סטרומלי, ציון חיסון וציון ESTIMATE בין סוגי סרטן, המחושבת באמצעות אלגוריתם ESTIMATE. (B) מפת חום המראה קשרים בין ביטוי TMED3 לגנים הקשורים לנקודות ביקורת חיסוניות, כולל CD274 (PD-L1), PDCD1 (PD-1) ו-CTLA4. מקדמי הקורלציה נקבעו באמצעות ניתוח קורלציה ספירמן. סולם הצבע מציין עוצמת קורלציה. *P < 0.05. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

ניתוח רגישות לתרופות
ניתוח רגישות לתרופות באמצעות פלטפורמת GSCALite המבוססת על מערכי נתונים של GDSC הראה כי ביטוי TMED3 היה בקורלציה שלילית לערכי הריכוז המעכב החצי-מקסימלי (IC₅₀) של 17-AAG, lapatinib, PD-0325901, RDEA119 ו-trametinib (איור 8). ממצאים אלו מצביעים על כך שגידולים עם ביטוי TMED3 גבוה עשויים להראות רגישות מוגברת לתרופות אנטי-סרטניות אלו, מה שמרמז על קשרים פוטנציאליים בין ביטוי TMED3 לרגישות טיפולית.

איור 8. קורלציה בין ביטוי TMED3 לרגישות לתרופות אנטי-סרטניות. תרשים בועה המראה מתאמים בין ביטוי mRNA ב-TMED3 לרגישות לתרופות אנטי-סרטניות שהושגו מנתוני Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC) דרך פלטפורמת GSCALite. גודל הבועה מייצג מובהקות סטטיסטית המבוססת על שיעור גילוי שגוי (FDR), והצבע מציין ערכי מקדם קורלציה. קורלציות שליליות מצביעות על רגישות מוגברת לתרופות הקשורה לביטוי גבוה של TMED3. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

ביטוי ותחזית של TMED3 בסרטן המעי הגס
ניתוח ביטוי TMED3 הראה עלייה משמעותית ברמות mRNA של TMED3 ברקמות סרטן המעי הגס בהשוואה לרקמות המעי הגס התקינות במאגרי TCGA (איור 9A). ניתוח זוגי באמצעות רקמות תקינות סמוכות תואמות כביקורת אישר עוד יותר ביטוי מוגבר של TMED3 ברקמות סרטן המעי הגס (איור 9B). בהתאם לממצאי הטרנסקריפטומיה, ניתוח ביטוי חלבונים באמצעות מאגרי נתונים של UALCAN/CPTAC וצביעה אימונוהיסטוכימית הראה ביטוי חלבוני TMED3 מוגבר ברקמות סרטן המעי הגס בהשוואה לרקמות המעי הגס הרגילות (איור 9C–9E). ניתוח עקומת ROC הראה ערך שטח מתחת לעקומה (AUC) של 0.869, מה שמעיד על ביצועים אבחנתיים חיוביים של TMED3 להבחנה בין רקמות סרטן המעי הגס לרקמות רגילות (איור 9F). ניתוח קליניקופתולוגי הראה כי ביטוי TMED3 היה קשור באופן מובהק לשלב T, בעוד שלא נצפו קשרים משמעותיים לגיל, מגדר, שלב N או שלב TNM (טבלה 1). ממצאים אלו תומכים במשמעות האבחנתית הפוטנציאלית של TMED3 בסרטן המעי הגס.

איור 9. ביטוי, ערך אבחוני ואימות אימונוהיסטוכימי של TMED3 בסרטן המעי הגס. (א) ביטוי mRNA שונה ב-TMED3 בין רקמות סרטן המעי הגס לרקמות המעי הגס התקינות מתוך מערכי נתונים של TCGA. (ב) ניתוח זוגי של ביטוי mRNA של TMED3 ברקמות סרטן המעי הגס וברקמות תקינות סמוכות תואמות. (ג) ביטוי חלבון TMED3 בסרטן המעי הגס וברקמות תקינות שהושגו ממאגרי CPTAC/UALCAN. (D) צביעה אימונוהיסטוכימית מייצגת של TMED3 ברקמת המעי הגס התקינה. (ה) צביעה אימונוהיסטוכימית מייצגת של TMED3 ברקמת סרטן המעי הגס המראה ביטוי מוגבר של TMED3. (ו) עקומת מאפיין הפעולה של מקלט (ROC) המעריכה את הערך האבחנתי של TMED3 בסרטן המעי הגס. פסי קנה מידה = 100 מיקרון. השטח מתחת לעקומה (AUC) היה 0.869 עם רווח סמך (CI) של 95% של 0.813–0.924. המשמעות הסטטיסטית נותחה באמצעות מבחני סכום דירוג וילקוקסון או מבחני דירוג חתום של וילקוקסון, לפי הצורך. P < 0.001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

סוג		TMED3		ערך P	χ2
		ביטוי נמוך	הבעה גבוהה
גיל
≤ 55	25	15	10	0.13	2.34
> 55	35	14	21
מגדר
נקבה	21	10	11	0.94	0.007
זכר	39	19	20
שלב T
T1+T2	23	15	8	0.04	4.26
T3+T4	37	14	23
שלב N
N0	30	12	18	0.2	1.67
N1+N2	30	17	13
שלב TNM
I+II	33	13	20	0.13	2.35
III+IV	27	16	11

טבלה 1: קשר בין ביטוי TMED3 לבין מאפיינים קליניים-פתולוגיים בסרטן המעי הגס. מאפיינים קליניקופתולוגיים של חולי סרטן המעי הושוו בין קבוצות עם ביטוי TMED3 נמוך וגבוה. נותחו קשרים בין ביטוי TMED3 למשתנים קליניים-פתולוגיים, כולל גיל, מין, שלב T, N ו-TNM, באמצעות מבחני כי-ריבוע (χ²). הנתונים מוצגים כמספר המטופלים בכל תת-קבוצה. המובהקות הסטטיסטית הוגדרה כ-P < 0.05.

ניתוח הישרדות KM הראה כי מטופלים עם ביטוי TMED3 גבוה הציגו OS גרועים משמעותית (P = 0.031) ו-DSS (P = 0.020) בהשוואה למטופלים עם ביטוי TMED3 נמוך (איור 10A ו-10B). ניתוח ROC תלוי זמן הראה כי ביצועי החיזוי של ביטוי TMED3 עבור OS הניבו ערכי AUC של 0.620, 0.564 ו-0.575 בשנים 1, 3 ו-5 שנים, בהתאמה (איור 10C). בנוסף, ניתוחי רגרסיה חד-משתניים ורב-משתניים של קוקס זיהו את שלב T, שלב M, שלב פתולוגי וביטוי TMED3 כגורמים פרוגנוסטיים הקשורים להישרדות כוללת בסרטן המעי הגס (טבלה 2). תוצאות אלו מצביעות על כך שביטוי מוגבר של TMED3 קשור לתחזית לקויה בסרטן המעי הגס, אם כי ניתוח ה-ROC התלוי זמן הראה רק ביצועים חיזויים מתונים.

איור 10. חשיבות פרוגנוסטית של ביטוי TMED3 בסרטן המעי הגס. (א) עקומות הישרדות כלליות (OS) של קפלן–מאייר (KM) השוואה בין מטופלים עם ביטוי גבוה ונמוך של TMED3 בסרטן המעי הגס. (B) עקומות הישרדות ספציפיות למחלה קפלן–מאייר (DSS) השוות מטופלים עם ביטוי TMED3 גבוה ונמוך. (C) עקומות מאפייני מקלט תלויות זמן (ROC) המעריכות את הביצועים החיזויים של ביטוי TMED3 עבור מערכת הפעלה של 1, 3 ו-5 שנים. הבדלי הישרדות נותחו באמצעות מבחן log-rank. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

מאפיינים	ניתוח חד-משתני		ניתוח רב-משתני
	יחס סיכון (CI 95%)	ערך P	יחס סיכון (CI 95%)	ערך P
מגדר	1.101(0.746–1.625)	0.627
שלב T	3.072(1.423–6.631)	0.004	3.817(1.174–12.407)	0.026
שלב N	2.592(1.743–3.855)	<0.001	0.587(0.223–1.584)	0.28
שלב M	4.193(2.683–6.554)	<0.001	2.272(1.314–3.930)	0.003
שלב פתולוגי	2.947(1.942–4.471)	<0.001	3.115(1.032–9.401)	0.044
TMED3	1.537(1.037–2.277)	0.032	1.599(1.039–2.462)	0.033

טבלה 2: ניתוחי רגרסיה חד-משתניים ורב-משתניים של סיכוני קוקס פרופורציונליים של גורמים פרוגנוסטיים הקשורים להישרדות כוללת בסרטן המעי הגס. בוצעו ניתוחי רגרסיה חד-משתניים ורב-משתניים של סיכונים פרופורציונליים של קוקס כדי להעריך את המשמעות הפרוגנוסטית של מאפיינים קליניקופתולוגיים וביטוי TMED3 אצל חולי סרטן המעי הגס. יחסי סיכון (HR) מוצגים עם רווחי ביטחון של 95% (CI של 95%). המשתנים כללו מין, שלב T, שלב N, שלב M, שלב פתולוגי וביטוי TMED3. המובהקות הסטטיסטית הוגדרה כ-P < 0.05.

ניתוח רגישות לתרופות הראה כי מטופלים בקבוצת הביטוי הגבוה של TMED3 הציגו ערכי IC₅₀ מוערכים נמוכים יותר עבור 5-פלואורורציל, לפטיניב וטרמטיניב בהשוואה לקבוצת הביטוי הנמוך של TMED3 (איור 11). ממצאים אלו מצביעים על כך שחולי סרטן המעי הגס עם ביטוי גבוה של TMED3 עשויים להראות רגישות מוגברת לחומרים כימותרפיים וממוקדים אלו, מה שמרמז על קשרים פוטנציאליים בין ביטוי TMED3 לתגובה הטיפולית.

איור 11. קורלציה בין ביטוי TMED3 לרגישות תרופתית כימותרפית בסרטן המעי הגס. תרשימי קופסה המציגים ערכי ריכוז מעכב חצי-מקסימלי מוערך (IC₅₀) עבור 5-פלואוראורציל, לפאטיניב וטרמטיניב בין קבוצות ביטוי TMED3 נמוך (G1) וביטוי TMED3 גבוה (G2). ערכי IC₅₀ נמוכים יותר מעידים על רגישות גבוהה יותר לתרופות. המשמעות הסטטיסטית נותחה באמצעות מבחני סכום דירוג של וילקוקסון. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

ניתוח העשרת גנים
GSEA באמצעות מערכי נתונים של KEGG ממאגר MSigDB הראה כי גנים הקשורים ל-TMED3 בסרטן המעי הגס הועשרו באופן משמעותי במסלולים הקשורים לריבוזום, עיבוד והצגת אנטיגן, פוספורילציה חמצונית ונתיב הפנטוז פוספט (איור 12). ממצאים אלו מצביעים על כך ש-TMED3 עשוי להשתתף בהתקדמות הגידול דרך המסלולים הנ״ל בסרטן המעי הגס.

איור 12. ניתוח העשרת קבוצות גנים (GSEA) של גנים הקשורים ל-TMED3 בסרטן המעי הגס. גרפים של GSEA המראים העשרה של גנים הקשורים ל-TMED3 במסלולים הקשורים לעיבוד והצגת אנטיגן, ריבוזום, פוספורילציה חמצונית ומסלול פנטוז פוספט בסרטן המעי הגס. ערכי ציון העשרה מנורמל (NES), ערך P נומינלי, ושיעור גילוי שגוי (FDR) מסומנים בכל פאנל. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

מחקר זה הראה כי TMED3 מתבטא באופן חריג במספר סוגי סרטן והיה קשור להתקדמות גידול, פרוגנוזה, תכונות חיסוניות, TMB, MSI ורגישות לתרופות. בסרטן המעי הגס, ביטוי יתר TMED3 היה קשור לתוצאות הישרדות שליליות ולעלייה בערך האבחון. ניתוח העשרה פונקציונלית הציע עוד כי TMED3 עשוי להשתתף במסלולי מטבוליה ואיתות הקשורים לסרטן. ביחד, ממצאים אלו תומכים בחקירה נוספת של TMED3 כסמן ביולוגי אבחוני פוטנציאלי בפאן-סרטן, במיוחד בסרטן המעי הגס.

זמינות נתונים:
מערכי הנתונים שנותחו במחקר זה התקבלו ממאגרי מידע ציבוריים, כולל The Cancer Genome Atlas (TCGA; https://portal.gdc.cancer.gov/projects/; ניגש ב-1 ביולי 2025), UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/; ניגש ב-1 ביולי 2025), cBioPortal (https://www.cbioportal.org/; ניגש ב-5 ביולי 2025), ופלטפורמת Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC) דרך GSCA (https://guolab.wchscu.cn/GSCA/#/drug; ניגש ב-5 ביולי 2025). כל הנתונים המעובדים שנוצרו במהלך מחקר זה כלולים במאמר.

דיון

חלבוני TMED הם חלבונים שמורים מאוד המכילים את דומיין emp24 הקיימים כמונומרים או דימרים בתוך תאים אאוקריוטיים²⁰. חברי משפחת TMED הם חלבוני ממברנה מסוג I המשתתפים בהעברת חלבונים בתיווך וזיקולות ובהובלה תוך-תאית²⁰. משפחת חלבוני p24 כוללת 10 חברי TMED, כולל TMED3. עדויות הולכות וגדלות הראו כי TMED3 מתבטא באופן חריג במספר ממאירות, כגון קרצינומה של רירית הרחם, אוסטאוסרקומה, קרצינומה של תאים שקופים, סרטן כבד תאורי, סרטן הערמונית וסרטן השד 4,6,21,22,23. ביטוי מוגבר של TMED3 נקשר גם לתחזית שלילית בסוגי גידולים מרובים 3,5,17,18,19. בקרצינומה של תאי קשקש ריאות, TMED3 הוכח כמסייע בהתקדמות הגידול באמצעות ויסות של אזרין, בעוד שהשתקת TMED3 דיכאה התרבות תאים, יצירת מושבה, נדידה והפרעת ויסות חלבונים הקשורה לאפופטוזיס^. יחד, מחקרים אלו מצביעים על כך ש-TMED3 מעורב באופן הדוק בהתפתחות והתקדמות הסרטן; עם זאת, תפקידיו הביולוגיים והמנגנונים המולקולריים בפאן-סרטן טרם הוברו במלואם.

במחקר הנוכחי, שולבו מספר מאגרי מידע ציבוריים כדי להעריך באופן מקיף את דפוסי הביטוי, המשמעות הפרוגנוסטית, המאפיינים החיסוניים והפונקציות הביולוגיות הפוטנציאליות של TMED3 בין סוגי סרטן. ביטוי TMED3 עלה משמעותית ב-26 סוגי גידולים, וממצאים אלו אושרו עוד באמצעות ניתוחי גידול זוגיים ורקמות תקינות סמוכות במספר סוגי סרטן. באופן עקבי, נתוני CPTAC חשפו ביטוי מוגבר של חלבוני TMED3 ב-BRCA, COAD, GBM, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, OV ו-UEC. מעניין לציין שלמרות שהביטוי של mRNA ב-TMED3 היה מוגבר ברקמות PAAD, נצפה ביטוי חלבון מופחת במאגר הנתונים של UALCAN, מה שמרמז כי ויסות לאחר שעתוק, פירוק חלבונים או שינויים לאחר תרגום עשויים לתרום לפער זה. מחקרים קודמים הראו כי ביטוי יתר של TMED3 בתאי סרטן השד מקדם הצטברות של β-קטנין ואקסין-2 הן בציטופלזמה והן בגרעין של תאי MCF-7 ומגביר את הביטוי של מטרות Wnt/β-catenin במורד הזרם, כולל c-myc, MMP7 ו-TCF4, ובכך מקל על התפשטות, נדידה ופלישה של תאי הגידול²⁴. באופן דומה, דווח כי TMED3 מווסת יותר בסרטן ריאות לא קטן, והשתקת TMED3 מדכאת התרבות תאי הגידול ויכולת הפולשה²⁵. במחקר הנוכחי, ניתוחים קליניקופתולוגיים הראו כי ביטוי TMED3 היה גבוה בשלבים מתקדמים של ACC, KIRC, KIRP ו-LUAD, בעוד שהבעה נמוכה יותר נצפתה בשלבים מתקדמים של UCEC, מה שמעיד על תפקידים ביולוגיים ספציפיים אפשריים של TMED3 במהלך התקדמות הסרטן. ניתוחי הישרדות הראו גם קשרים משמעותיים בין ביטוי גבוה של TMED3 לבין OS ו-DSS לא רצויים ב-ACC, COAD ו-UVM, התומכים בערך הפרוגנוסטי הפוטנציאלי של TMED3 במאירויות מרובות. בנוסף, ניתוח מתילציה של פרומטר חשף רמות מתילציה מוגברות של TMED3 ב-BRCA, COAD, ESCA, HNSC, KIRC, KIRP, LIHC, LUAD, PAAD ו-PRAD, בעוד שרמות מתילציה נמוכות יותר זוהו ב-BLCA, TGCT ו-UCEC. ממצאים אלו מצביעים על כך שמתילציה של פרומטרים חריגים עשויה לתרום לדיסרגולציה של ביטוי TMED3 באופן תלוי בגידול ועלולה להשתתף בהתפתחות סרטן.

MSI מייצג תת-סוג מולקולרי מובחן של סרטן שלעיתים קרובות קשור לשיפור בתגובה לאימונותרפיה, משום שגידולים אלו מציגים לעיתים קרובות עומס מוטציה מוגבר והגברת ביטוי PD-L1^26,27. גידולים עם TMB גבוה יכולים לייצר ניאואנטיגנים רבים שמקורם במוטציות סומטיות, ובכך לשפר את פעילות החיסון האנטי-גידולי המתווכת על ידי תאי T ואולי להעלות את הרגישות לחסימת נקודות ביקורת חיסונית^28,29. במחקר הנוכחי, ביטוי TMED3 הראה מתאמים חיוביים עם TMB ו-MSI ב-KIRC, STAD ו-UCEC, מה שמעיד כי TMED3 עשוי להיות קשור לאימונוגניות הגידול ולתגובה האימונותרפית בסוגי סרטן אלו. עדויות הולכות וגדלות הראו כי המיקרוסביבה של הגידול, במיוחד מרכיבי מערכת החיסון והסטרומלית, ממלאת תפקיד קריטי בהתקדמות הסרטן, תגובה טיפולית, חזרה ותחזית המטופל. אלגוריתם ESTIMATE מחשב ציוני סטרומל, חיסון ו-ESTIMATE לפי דפוסי ביטוי גנים הקשורים לחסינות, ומחקרים קודמים דיווחו על קשרים משמעותיים בין ציונים אלו לתוצאות קליניות בסרטן הערמונית, גליובלסטומה וסרטן המעי הגס 30,31,32. הניתוחים שלנו הראו כי ביטוי TMED3 היה קשור באופן משתנה לציון סטרומלי, ציון חיסון וציון ESTIMATE בין סוגי גידולים שונים, מה שמרמז כי TMED3 עשוי לתרום להתפתחות הגידול באמצעות מודולציה של מיקרו-סביבת הגידול. יתרה מזאת, ביטוי TMED3 היה קשור למספר גנים הקשורים לנקודות ביקורת חיסוניות, כולל CD274 (PD-L1), PDCD1 (PD-1) ו-CTLA4, אם כי כיוון וגודל הקשרים הללו השתנו בין סוגי הגידולים. זוהו מתאמים חיוביים משמעותיים בין TMED3 לסמני נקודות ביקורת חיסוניות ב-ACC, KIRP, LGG, LIHC, THYM ו-UVM, מה שמרמז כי גידולים עם ביטוי מוגבר של TMED3 בסרטנים אלו עשויים להראות רגישות מוגברת לאימונותרפיה. ניתוחי רגישות לתרופות חשפו גם קשרים בין ביטוי TMED3 ותגובתיות ל-17-AAG, lapatinib, PD-0325901, RDEA119 ו-trametinib, מה שמעיד על קשר פוטנציאלי בין ביטוי TMED3 ליעילות טיפולית.

סרטן המעי הגס נבחר לאימות אימונוהיסטוכימי, והתוצאות אישרו כי ביטוי TMED3 היה גבוה משמעותית ברקמות סרטן המעי הגס בהשוואה לרקמות המעי הגס הרגילות, בהתאם לממצאים קודמים⁷. ניתוחים קליניים-פתולוגיים חשפו גם קשר משמעותי בין ביטוי TMED3 לבין שלב T בסרטן המעי הגס. בנוסף, TMED3 הראה ערך אבחוני פוטנציאלי, בעוד שהבעה מוגברת של TMED3 הייתה קשורה לתחזית גרועה יותר של המטופלים. עם זאת, ניתוחי ROC התלויים בזמן הראו שערכי AUC לחיזוי OS של 1, 3 ו-5 שנים היו רק מעט מעל 0.5, מה שמעיד על דיוק חיזוי מוגבל למרות מובהקות סטטיסטית. ממצאים אלו מצביעים על כך של-TMED3 יש כיום ערך רב יותר כסמן ביולוגי פרוגנוסטי חקרני מאשר כחיזוי חזק ליישום קליני שגרתי. ניתוחי רגרסיה חד-משתניים ורב-משתניים של Cox זיהו עוד יותר את שלב T, שלב M, שלב פתולוגי וביטוי TMED3 כגורמים פרוגנוסטיים עצמאיים הקשורים ל-OS בסרטן המעי הגס. ניתוחי רגישות לתרופות הצביעו על כך שמטופלים עם ביטוי גבוה של TMED3 עשויים להיות רגישים יותר לתרופיה נפוצה, כולל 5-פלואורורציל, לפטיניב וטרמטיניב. יתרה מזאת, ניתוחי העשרה פונקציונלית חשפו כי גנים הקשורים ל-TMED3 בסרטן המעי הגס הועשרו בעיקר במסלולים הקשורים לריבוזום, עיבוד והצגת אנטיגן, פוספורילציה חמצונית ומסלול הפנטוז פוספט.

מחקר זה העריך באופן שיטתי את פרופילי הביטוי, הערך הפרוגנוסטי והמאפיינים הקשורים למערכת החיסון של TMED3 במספר סוגי סרטן. עם זאת, יש לקחת בחשבון מספר מגבלות. רוב הממצאים נגזרו מניתוחי ביואינפורמטיקה ומולטיאומיקס המבוססים על מערכי נתונים ציבוריים, והאימות הניסויי הוגבל לניתוח אימונוהיסטוכימי ברקמות סרטן המעי הגס. יתרה מזאת, לא נערכו ניסויים פונקציונליים לחקור את המנגנונים המולקולריים המדויקים שמאחורי תפקידו של TMED3 בהתקדמות הגידול. לכן, נדרשים מחקרים נוספים במבחנה ו-in vivo כדי להבהיר עוד יותר את הפונקציות הביולוגיות ואת המשמעות הטיפולית הפוטנציאלית של TMED3 במאירויות שונות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.5% Ammonia Solution	חברת Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:1336-21-6	N/A
1% Acid Alcohol	Ningbo Chiwell Biotechnology Co., Ltd	CWGQ-HE-1001	N/A
10% Neutral Buffered Formalin	Wuhan Huntz Biotechnology Co., Ltd	H-H8060	N/A
100% Ethanol	חברת Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
70% Ethanol	חברת Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
80% Ethanol	חברת Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
95% Ethanol	Shandong Lirun Medical Technology Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
Alcian Blue Stain	Baso Diagnostics Inc., Zhuhai	BA4121	N/A
cBioPortal	מרכז הסרטן Memorial Sloan Kettering	N/A	SCR_014555
Citrate-Based Antigen Retrieval Buffer	Leica Biosystems Newcastle Ltd	AR9640-CN	N/A
clusterProfiler package	Bioconductor	N/A	SCR_016884
DESeq2 package	Bioconductor	N/A	SCR_015687
Diaminobenzidine Tetrahydrochloride Hydrate	Leica Biosystems Newcastle Ltd	DS9800-CN	N/A
ESTIMATE package	R package	Version 1.0.13	N/A
GSCALite platform	GSCALite	N/A	N/A
GTEx database	GTEx Consortium	N/A	SCR_013042
Hematoxylin	Ningbo Chiwell Biotechnology Co., Ltd	CWGQ-HE-1001	N/A
Hydrogen Peroxide	OriGene Technologies, Inc	PV-6000D	N/A
Kaplan–Meier Survival Analysis	survival R package	Version 3.2-7	SCR_021137
KEGG Gene Sets	MSigDB	Version 7.5.1	SCR_016863
Light Microscope	Zeiss Technology (Suzhou) Co., Ltd	N/A	N/A
Paraffin Embedding Medium	PATHO-Reagent Department of YL Company	CAS:8002-74-2	N/A
Polymer-Based Detection System	Leica Biosystems Newcastle Ltd	PV-6000	N/A
R statistical analysis software	R Foundation for Statistical Computing	Version 4.2.1	SCR_001905
Secondary Rabbit Anti-Mouse IgG	Leica Biosystems Newcastle Ltd	DS9800-CN	N/A
TCGA database	National Cancer Institute	N/A	SCR_003193
TMED3 Primary Antibody	CUSABIO Technology, Houston, USA	CSB-PA897107LA01HU	N/A
Tris-Buffered Saline (TBS)	Leica Biosystems Newcastle Ltd	AR9590-CN	N/A
UALCAN database	UALCAN	N/A	SCR_015827
Wilcoxon Statistical Analysis	stats R package	N/A	SCR_003005
Xylene	חברת Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:1330-20-7	N/A