כאן אנו מציגים פרוטוקול לדימוי בעל תוכן גבוה (high-content imaging) ועיבוד נתונים סטנדרטיים של תאים שצבעו ב-propidium iodide (PI)/Hoechst 33342, במטרה לבצע ניתוח בר-שחזור של חיוניות תאים באמצעות זרימות עבודה אוטומטיות של רכישת וניתוח תמונות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
כאן אנו מציגים פרוטוקול לדימוי בעל תוכן גבוה (high-content imaging) ועיבוד נתונים סטנדרטיים של תאים שצבעו ב-propidium iodide (PI)/Hoechst 33342, במטרה לבצע ניתוח בר-שחזור של חיוניות תאים באמצעות זרימות עבודה אוטומטיות של רכישת וניתוח תמונות.
כדי להתמודד עם אתגרי השחזוריות הנמוכה הנובעת משינויים תפעוליים בדימוי מחקרי מדעי, ועם המורכבות של ניתוח מספר רב של דגימות בשיטות קונבנציונליות, אנו מציגים פרוטוקול לצביעת תאי HT22 ב-PI וב-Hoechst 33342, ולאחר מכן לדימוי וניתוח הנתונים באמצעות מערכת High-Content Imaging. תהליך עבודה זה נועד להגדיר פרמטרים חזקים להגדרות הדימוי ותקני בקרת איכות קפדניים. הוא מדגים את הגדרות הדימוי של המכשיר ואת תהליך העבודה עבור שלוש שיטות שונות לעיבוד תמונות המסופקות על ידי המכשיר: Multi-Wavelength Cell Scoring (Multi), Live-Dead (Live) ו-Custom Module Editor (CME). שיטות עיבוד התמונות מושוות ומאומתות אל מול השיטה המסורתית, ImageJ, כדי להבטיח את יעילותן. המחקר מסכם בסופו של דבר תהליך עבודה לשימוש במערכת High-Content Imaging לקביעת חיוניות תאים באמצעות שיטת כפל-צביעה של PI ו-Hoechst. על ידי סטנדרטיזציה של כל תהליך הדימוי ועיבוד הנתונים, המחקר משפר משמעותית את השחזוריות והאמינות של דימוי במחקר מדעי, ובכך מספק תמיכה מתודולוגית מוצקה להשוואת נתונים בין מעבדות ומקדם את המחקר המדעי.
מערכת דימות בעלת תוכן גבוה (High-Content Imaging System) משמשת ככלי מרכזי במחקר מדעי מודרני, ומאפשרת דימות במהירות גבוהה והערכה רב-פרמטרית של תאים פגועים או בריאים1,2,3. היא ממלאת תפקיד בלתי ניתן להחלפה בתחומים שונים. בתחום מדעי החיים, היא מסייעת לחוקרים לחקור את העולם המיקרוסקופי של תאים ורקמות4,5. לדוגמה, זיהוי מדויק של מולקולות ומבנים מסומנים פלואורסצנטית בתוך תאים מאפשר ויזואליזציה ברורה של מבנים תאיים עדינים ושינויים דינמיים6. במחקר נוירומדעי, היא יכולה לבצע דימות תלת-ממדי של נוירונים, ובכ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול זה משתמש בקו תאים מסחרי (HT22, ATCC) ואינו כולל נבדקים אנושיים או רקמות אנושיות ראשוניות. לא נעשה שימוש בבעלי חיים במחקר זה.
1. הכנה סטנדרטית של הדגימות
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
השפעת הכנה סטנדרטית על איכות הדימוי
פרמטרי הפלטה הוגדרו כדי להבטיח שהמכשיר יוכל לאתר באופן מהימן את שכבת תמונת התאים. דגימות שהוכנו כשכבה אחת של תאים עם התלכדות (confluence) מתונה הקלו על מיקוד התמונה בהגדגות שונות של העדשה ושיפרו את זיהוי התמונות ואת הניתוח הכמותי. הכנה סטנדרטית של הדגימות ופרמטרי פלטה מותאמים צמצמו ביעילות אפקטים של שוליים, חפיפת תאים וגורמים אחרים התורמים لديמוג באיכות נמוכה (איור 1).
השוואה .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בעזרת שיטת כביכור כפול של PI ו-Hoechst לקביעת חיוניות תאים, למשל, יכול המכשיר לסריקה רב-מרכיבית (high-content instrument) לחשב במהירות ובסריקה רחבה את חיוניות התאים בתוך אותה סדרה באמצעות מודולי אלגוריתם מובנים. לשיטה זו מספר יתרונות, הכוללים נפח דגימה נמוך, עלות נמוכה, נזק מינימלי לתאים, דהיית פלואורסצנציה חלשה, עמידות בפני השתקה (quenching) ויכולת ללכוד תמונות מרובות. בנוסף, זמן הדימות עבור פלטה בעלת 96 בארות הוא בדרך כלל רק 30–45 min20.
בפרוטוקול הניסויי, כדי להבטיח .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
כל המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים. במהלך תרגום כתב היד, נעשה שימוש ב-Zhipu AI אך ורק לצורכי תרגום ולא ליצירת נתוני מחקר, תוצאות ניסיוניות או תוכן אקדמי מרכזי. המחברים נושאים באחריות מלאה לתוכן כתב היד.
המחברים מודים על התמיכה שניתנה על ידי קרן בית הספר של אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית. המחברים מודים על התמיכה ממענק MPRC2022034. מימון זה שימש לפיתוח שיטת דימוי דינמי בתלת-ממד של חיידקי מעיים עבור Erchen Decoction לטיפול בעכבריםB עם השמנה פשוטה. המחברים מודים על פלטפורמת המחקר שסופקה על ידי המכון החדשני לרפואה ורוקחות סינית של אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית והמכון ללימודים בין-תחומיים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מבחנה לצנטריפוגה 1.5 mL | Labigic Technology Co., Ltd. | MCT-001-150 | |
| טיפים לפיפט 1000 µL | Labigic Technology Co., Ltd. | 35423003E | |
| מבחנה לצנטריפוגה 15 mL | Labigic Technology Co., Ltd. | CT-002-15A | |
| טיפים לפיפט 2.5 µL | Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd. | B10T | |
| טיפים לפיפט 200 µL | Labigic Technology Co., Ltd. | T-001-200 | |
| מבחנה לצנטריפוגה 50 mL | Labigic Technology Co., Ltd. | CT-002-50A | |
| פלטת תרבית תאים בעלת 96 בארות | Corning Incorporated | 3599 | |
| פיפט בעל ערוץ יחיד עם התאמה, 0.1–2.5 μL | Eppendorf SE | 3120000216 | |
| פיפט בעל ערוץ יחיד עם התאמה, 100–1000 μL | Eppendorf SE | 3120000267 | |
| פיפט בעל ערוץ יחיד עם התאמה, 20–200 μL | Eppendorf SE | 3120000259 | |
| פיפט בעל ערוץ יחיד עם התאמה, 2–20 μL | Eppendorf SE | 3120000232 | |
| צלחת לתרבית תאים | Corning Incorporated | 430167 | |
| מבחנות קריוגניות | Labigic Technology Co., Ltd. | BS-20-ST | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | D8371 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies Limited | 11966-025 | במחקר זה, ה-DMEM המלא הוכרס באמצעות 10% FBS, 1% תמיסת פניצילין-סטרפტომייסין, ו-89% DMEM. |
| אינקובטור ESCO CelCulture CO2 | Esco Micro Pte. Ltd. | CCL-170B-8 | |
| סרום בקר עוברי (FBS, Superfine) | Procell Life Science & Technology Co.,Ltd. | 164210-50 | |
| צבעי פלואורסצנציה Hoechst 33342 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | B8040 | |
| תאי HT22 | Procell Life Science & Technology Co.,Ltd. | CL-0697 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ היא אחת מתוכנות עיבוד התמונות ששימשו בכתב היד. | |
| מערכת ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging | Molecular Devices, LLC | ImageXpress Micro Confocal | בכתב היד, השתמש במונח "High-Content Imaging System" כתחליף לשם המכשיר. |
| צנטריפוגת הקפאה במהירות נמוכה | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd. | L530R | |
| תוכנת MetaXpress לרכישה וניתוח תמונות High-Content | Molecular Devices, LLC | תוכנה זו היא תוכנה נלווית למערכת ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging. בכתב היד, "תוכנת הניתוח המסופקת עם המכשיר" מתייחסת לתוכנה זו. | |
| מCבנת זרימה למינרית אנכית OptiMair | Esco Micro Pte. Ltd. | ACB-4E1 | |
| Parafilm M | Pechiney Plastic Packaging Inc. | PM996 | |
| PBS | Shanghai Yuchun biology science and technology co., ltd | YC-5013 | |
| תמיסת פניצילין-סטרפტომייסין | Procell Life Science & Technology Co.,Ltd. | PB180120 | |
| תמיסת Propidium Iodide (PI) | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | C0080 | |
| תמיסת Trypsin-EDTA | BasalMedia Technology Co.,Ltd. | S310KJ |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מאמר זה פורסם
הסרטון יגיע בקרוב