מאמר שיטה

זרימת עבודה סטנדרטית לדימות בעל תוכן גבוה (High-Content Imaging) ועיבוד נתונים

35 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71863

⸱

21 באוגוסט 2026

 ,  , 
1College of Medical Technology, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Institute of Interdisciplinary Studies, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Life Science and Technology, Southeast University

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול לדימוי בעל תוכן גבוה (high-content imaging) ועיבוד נתונים סטנדרטיים של תאים שצבעו ב-propidium iodide (PI)/Hoechst 33342, במטרה לבצע ניתוח בר-שחזור של חיוניות תאים באמצעות זרימות עבודה אוטומטיות של רכישת וניתוח תמונות.

תקציר

כדי להתמודד עם אתגרי השחזוריות הנמוכה הנובעת משינויים תפעוליים בדימוי מחקרי מדעי, ועם המורכבות של ניתוח מספר רב של דגימות בשיטות קונבנציונליות, אנו מציגים פרוטוקול לצביעת תאי HT22 ב-PI וב-Hoechst 33342, ולאחר מכן לדימוי וניתוח הנתונים באמצעות מערכת High-Content Imaging. תהליך עבודה זה נועד להגדיר פרמטרים חזקים להגדרות הדימוי ותקני בקרת איכות קפדניים. הוא מדגים את הגדרות הדימוי של המכשיר ואת תהליך העבודה עבור שלוש שיטות שונות לעיבוד תמונות המסופקות על ידי המכשיר: Multi-Wavelength Cell Scoring (Multi), Live-Dead (Live) ו-Custom Module Editor (CME). שיטות עיבוד התמונות מושוות ומאומתות אל מול השיטה המסורתית, ImageJ, כדי להבטיח את יעילותן. המחקר מסכם בסופו של דבר תהליך עבודה לשימוש במערכת High-Content Imaging לקביעת חיוניות תאים באמצעות שיטת כפל-צביעה של PI ו-Hoechst. על ידי סטנדרטיזציה של כל תהליך הדימוי ועיבוד הנתונים, המחקר משפר משמעותית את השחזוריות והאמינות של דימוי במחקר מדעי, ובכך מספק תמיכה מתודולוגית מוצקה להשוואת נתונים בין מעבדות ומקדם את המחקר המדעי.

מבוא

מערכת דימות בעלת תוכן גבוה (High-Content Imaging System) משמשת ככלי מרכזי במחקר מדעי מודרני, ומאפשרת דימות במהירות גבוהה והערכה רב-פרמטרית של תאים פגועים או בריאים1,2,3. היא ממלאת תפקיד בלתי ניתן להחלפה בתחומים שונים. בתחום מדעי החיים, היא מסייעת לחוקרים לחקור את העולם המיקרוסקופי של תאים ורקמות4,5. לדוגמה, זיהוי מדויק של מולקולות ומבנים מסומנים פלואורסצנטית בתוך תאים מאפשר ויזואליזציה ברורה של מבנים תאיים עדינים ושינויים דינמיים6. במחקר נוירומדעי, היא יכולה לבצע דימות תלת-ממדי של נוירונים, ובכך לסייע בניתוח הקשרים המורכבים ומנגנוני העברת האותות של רשתות נוירונליות, ולספק רמזים מכריעים להבנת תפקודי המוח והפתוגנזה של מחלות נוירולוגיות7,8,9.

למרות היתרונות המשמעותיים של טכנולוגיית מערכות דימות בעתקת תוכן גבוהה (High-Content Imaging System), נותרו מספר בעיות בתהליך הדימות שלה. בשלב הכנת הדגימה קיימת רמה גבוהה של סובייקטיביות. בהכנת דגימות ביולוגיות, תהליכים כגון טיפול בתאים וצביעה חסרים סטנדרטים רלוונטיים. במונחים של פרמטרי דימות, קיימים הבדלים בולטים בזמני חשיפה ובבחירת פלטות הבארים בין מעבדות שונות ובדגמי מיקרוסקופים שונים בעתקת תוכן גבוהה. בשלב עיבוד הנתונים, חסרה סטנדרטיזציה החל מהסרת רעשים והתאמת ניגודיות של תמונות גולמיות, ועד לזיהוי הפרמטרים וקביעת מאפייני המטרה. בעיות אלו מובילות ישירות להטיות בתוצאות הדימות המיקרוסקופיות, מה שגורם למשבר בדמיון התוצאות (reproducibility).

פרוטוקול

פרוטוקול זה משתמש בקו תאים מסחרי (HT22, ATCC) ואינו כולל נבדקים אנושיים או רקמות אנושיות ראשוניות. לא נעשה שימוש בבעלי חיים במחקר זה.

1. הכנה סטנדרטית של הדגימות

  1. הכנת תאי HT22
    1. כאשר צפיפות התאים (confluence) של תאי HT22 מגיעה ל-80%10,11, שפכו את המצע הישן. השתמשו ב-0.25% trypsin כדי לנתק את התאים, והדגירו למשך 1–2 min בטמפרטורת החדר.
    2. הוסיפו Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) בנפח של פי 3 מנפח ה-0.25% trypsin כדי לעצור את הניתוק. העבירו את סספנסיית התאים לפסנטר (centrifuge tube) של 15 mL.
    3. סובבו בצנטריפוגה במהירות של 175 x g למשך 3 min בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שפכו את העילוי (supernatant). השעיקו מחדש את התאים ב-DMEM מלא כדי ליצור סספנסיית תאים בודדים.
    4. ספרו את התאים באמצעות תא ספירה. זרעו 5,000 תאים לכל באר ב-100 µL של מצע מלא לתוך פלטה של 96 באערים12.
    5. הדגירו את הפלטה ב-37 °C עם 5% CO2 למשך 24 h. בצעו את חלוקת הדגימות לקבוצות, את המינון ואת פעולות הצביעה בפלטת 96 הבאערים בהתאם למערך הניסוי.
      ​הערה: השתמשו בפלטת 96 באערים התואמת למערכת ההדמיה. בחרו פלטה עם עובי תחתון וגאומטריה מתאימים, לפי מפרטי היצרן. פלטות עם תחתית זכוכית (עובי תחתית של 130–170 µm) מומלצות כאשר נדרשת איכות תמונה גבוהה יותר13,14,15,16.
  2. פרוצדורת צביעה
    1. וודאו שהתאים יוצרים שכבה אחת (monolayer) מפוזרת היטב ושהצפיפות אינה עולה על 70% כדי למזער חפיפה בין התאים (Figure 1B).
    2. חלקו את הדגימות לקבוצות בהתאם לדרישות הניסוי והמשיכו לצביעה לאחר הטיפול. הכינו תמיסות עבודה של הצבע בריכוז סופי של 6.684 µg/mL עבור PI ו-10 µg/mL עבור Hoechst 3334217,18.
    3. שפכו את המצע הישן מפלטת 96 הבאערים ושטפו כל באר פעמיים עם 100 µL של PBS. הוסיפו את תמיסת העבודה של הצבע והדגירו בטמפרטורת החדר בחושך למשך 30 min לצורך הצביעה.
    4. שטפו כל באר פעמיים עם 100 µL של PBS, ולאחר מכן הוסיפו DMEM.
      הערה: מערכי ניסוי שונים עשויים לכלול שינויים בטעינת הדגימות ובפרמטרי הצביעה.

2. מפרטי הדמיה והגדרות פרמטרים

  1. סטנדרטים של פרמטרי דימוי
    ​הערה: מחקר זה מדגים רק את זרימת העבודה של דימוי בשדה רחב (widefield) עבור המכשיר לאחר צביעה ב-PI וב-Hoechst 33342.
    1. הפעילו את המכשיר ולאחר מכן הפעילו את המחשב. פתחו את תוכנת הניתוח המצורפת למכשיר.
    2. הכניסו את פלטת ה-96 בארות למכשיר. בחרו את שדה הראייה עם הדגימות לדימוי.
    3. בהגדרות העדשה (Objective) והמצלמה, הגדירו את ההגדלה ל-"20XPh1SPlanFluorELWDADM" (Nikon, S Plan Fluor, ELWD, 20X/0.45, ∞/0-2, WD 8.2-6.9, OFN22, Ph1, AMD, MRH48230), את ה-Camera binning ל-"2", ואת מצב הרכישה (Acquisition Mode) ל-"Widefield".
    4. במצב פלטה (plate mode), בחרו את הפרמטרים המתאימים לפלטת ה-96 בארות והתאימו את פרמטרי הפלטה בהתאם לנתוני גודל המוצר.
    5. תחת Site Option, בחרו בדרך כלל 9 שדות לכל בארה לדימוי צפוף. באפשרויות ה-Autofocus, בחרו ב-Enable laser-based focusing.
    6. התאימו את פרמטרי ה-laser autofocus תחת Autofocus, בהתבסס על עובי תחתית הפלטה הממוצע שנמדד מלפחות שלוש בארות דגימה. התאימו בהתאם את Bottom thickness, Bottom thickness max variation, Adjacent well max variation, Intra-well max variation, ו-Plate max variation.
    7. תחת Wavelengths, הגדירו את מספר אורכי הגל (Number of wavelengths) ל-3. עבור ההארה (Illumination) הראשונה, בחרו DAPI. ב-Shading Correction, בחרו ב-"Auto Correction for FL" (איור 2B).
    8. לאחר מציאת התמונה, הגדירו את החשיפה (Exposure) הראשונית (ms) ל-20–30. צפו בתמונות שנקלטו והתאימו את החשיפה באופן רציף כדי להשיג עוצמת פלואורסצנציה מתונה ללא חשיפת יתר, והגדירו את עומק הביט (bit depth) ל-16 (איור 2A).
    9. בחרו ב-Laser with z-offset לצורך התאמת פוקוס. אם הפוקוס אינו ברור, סמנו Use Z stack, לחצו על Calculate Offset, ובחרו מרחק מוקד מתאים. סמנו Digital Confocal (info) והגדירו את פרמטרי ההתאמה עבור Increase Sharpness ו-Reduce Noise ל-0.200.
      הערה: אם החשיפה או הבהירות של התמונה אינן מספקות, התאימו את החשיפה וחשבו מחדש את פרמטרי ה-offset.
    10. עבור ההארה השנייה, בחרו Cy3. בצעו את אותן הגדרות כפי שפורטו בשלבים 2.1.7-2.1.9.
    11. עבור ההארה השלישית, בחרו TL 25. בצעו את אותן הגדרות כפי שפורטו בשלבים 2.1.7-2.1.9.
      הערה: הגדירו את ה-Shading correction בהתאם לערוץ, ועבור TL 25 יש לבחור ב-Auto Correction for TL. ב-Wavelengths, יש להגדיר את ערוץ ה-TL לצורך מיקום תאים ותצפית מורפולוגית.
    12. בלשונית Run, תנו שם לפלטה לפי מוסכמות השמיות: שם הפלטה-סוג התא-מזהה ניסוי-תאריך-הגדלת עדשה-סוג דימוי. אשרו את הפרמטרים הקשורים לערוץ הדימוי תחת Description.
    13. לחצו על Acquire Plate כדי להתחיל את הדימוי. לאחר השלמת הדימוי, כבו את התוכנה, המכשיר והמחשב לפי הסדר.
      ​הערה: לאחר מכן, ניתן להפעיל את המחשב רק לצורך ייצוא תמונות, עיבוד נתונים וניתוח תוצאות.
  2. סטנדרטים ודרישות תפעול של הדימוי
    1. מרכזו את שדה הראייה על הבארה כדי למנוע אפקטי שוליים (איור 1A). במהלך הגדרת פרמטרי הדימוי, השתמשו בביקורת חיובית עם עוצמת הפלואורסצנציה הגבוהה ביותר כמרחב ייחוס. בנוסף, בעת מיקוד (focusing), בחרו שדה ראייה עם שכבה אחת של תאים, נקייה מלכלוך ושאריות.
    2. עבור המצלמה, השתמדו בערכי פיקסלים הנמוכים בקפדנות מ-60000 (הערך המקסימלי הוא 65535) כדי למנוע רוויה, שעלולה לגרום לאובדן קבוע של מידע. אם מופיעים נקודות או אזורים בהירים רווים, קצרו את זמן החשיפה. במקביל, אל תשאיר את זמן החשיפה נמוך מדי; אחרת, רעש ישליט על התמונה.
    3. עבור אותות פלואורסצנציה חלשים, תעדוף הגדלה קלה של החשיפה על פני העלאה מאולצת של הפרמטרים, כדי למנוע נזק בלתי הפיך הנגרם על ידי פוטובליצ'ינג (photobleaching).
      הערה: עבור דימוי בשדה בהיר (bright-field), ניתן להקל מעט על עקרונות אלו, אך המיקוד המרכזי נותר בשמירה על שלמות האות והגנה על הדגימה.
    4. וודאו שקווי המתאר של שולי הדגימה ניתנים להבחנה בבירור, וודאו שהמבנים הפנימיים העדינים (כגון גרנולות, סיבים, אברונים) בעלי טקסטורה מובחנת ולא מטושטשת, ושהאור המפוזר ברקע מפוזר באופן אחיד ללא נקודות בהירות מקומיות או הילות מטושטשות. הימנעו בקפדנות ממיקוד יתר (over-focusing) או חסר (under-focusing).
    5. וודאו שקיימות קבוצות נורמליות, חיוביות, שליליות וניסיוניות, ושלכל קבוצת טיפול יש לפחות 3 בארות מקבילות. מומלץ לסדר את הבארות המקבילות באופן אנכי.

3. עיבוד ואנליזה של תמונות

הערה: מסמך זה מפרט שלוש שיטות לעיבוד תמונות המסופקות על ידי התוכנה הנלווית למכשיר, אשר כולן מתאימות לפרוטוקול הצביעה שנעשה בו שימוש במחקר זה. בעוד ששיטות אלו חולקות את אותו עיקרון זיהוי בבסיסן, הן נבדלות בטכניקות עיבוד ספציפיות ובסוגי תוצאות הנתונים. זרימת העבודה של עיבוד התמונות הייתה זהה כדלקמן: פתח את הקובץ → טענו את התמונה המקורית עם שיטת העיבוד התואמת → הגדירו את פרמטרי הערוץ המתאימים → יצירת מסכה → הגדר את סוג נתוני המדידה ב-Measure → הרץ את הניתוח → השקיפו על התוצאות → ייצא את הנתונים.

  1. פתח את תוכנת הניתוח המסופקת עם המכשיר → לוחית בקרה → בחר צלחת.
  2. בתצוגת התאריך, בחר בסידור בארות (Well arrangement) ובחר שדה ראייה מקבוצת הביקורות החיוביות כנקודת ייחוס.
  3. תחת ניתוח הרצה (Run Analysis), בחרו את תוכנית העיבוד המתאימה והגדירו את פרמטרי עיבוד התמונה או ייצאו את התמונה.
  4. לאחר הגדרה ושמירה של הפרמטרים, בחרו ב-Run on all wells / Run on selections / Run on displayed site בהתאם לאובייקט הגדרת הפרמטרים.
  5. לאחר שהמחשב סיים לעבד את הנתונים, בחר בלשונית Measurements את תוכנית עיבוד הנתונים המתאימה תחת Analysis, ובחר תוצאות מדידה שונות תחת Measurement כדי לבדוק את הנתונים.
  6. לחצו על Open Log כדי להתחיל בייצוא הנתונים. הגדירו את הפרטים הבאים בהגדרות הפרמטרים עבור שלוש שיטות עיבוד התמונה:
    1. שיטת עיבוד תמונה אחת: ספירת תאים רב-אורכית (Multi-Wavelength Cell Scoring)
      1. בחר את תוכנית ספירת התאים רב-אורכיי (Multi-Wavelength Cell Scoring) והגדר את ההגדרות. הגדר את מספר אורכי הגל. בחר סטנדרט עבור האלגוריתם.
      2. הגדירו את פרמטרי הזיהוי עבור כל הגרעינים בהתבסס על תוצאות הצביעה ב-PI. תמונת המקור W1 כברירת מחדל היא ערוץ ה-DAPI.
      3. הגדירו את הרוחב המינימלי המשוער ל-8–10 µm ורוחב מקסימלי משוער של 30–35 µמ', בהתבסס על גודלם של האובייקטים הבודדים שיש לזהות.
      4. הגדירו את העוצמה מעל הרקע המקומי ל-2,000–10,000 רמות אפור (gray levels). השתמשו ב-Preview כדי לבחון ולהתאים את ההגדרות בהתבסס על תוצאות הזיהוי.
      5. הגדירו את פרמטרי W2 על בסיס תוצאות הצביעה ב-Hoechst 33342. תנו שם לערוץ זה. תמונית המקור של W2 היא Cy3.
      6. באזור Stained, בחר את האזור שנצבע בערוץ זה כ-Nucleus. עבור הגדרות המשך, פעל לפי אותן הגדרות כפי שפורטו בשלבים 3.6.1.3–3.6.1.4. ב-Configure Summary Log או ב-Configure Data Log (Cells), בחר את הגדרת הפרמטר (Parameter configuration) המתאימה בהתבסס על פרמטרי התוצאה הרצויים.
        הערה: בדרך כלל, Configure Summary Log משמש להגדרת סוגי הנתונים הנדרשים, בעוד ש-Configure Data Log (Cells) משמש כאשר נדרש סימון מיוחד של תאים בודדים.
      7. בצעו הרצת בדיקה (Test Run) כדי לצפות בזיהוי. אם תוצאות הזיהוי משביעות רצון, שמרו את ההגדרות.
    2. שיטת עיבוד תמונה שתיים: חי-מת (Live-Dead)
      1. בחרו בתוכנית Live-Dead והתחילו בהגדרת הפרמטרים. הגדירו את פרמטרי אורך הגל 1 (Wavelength 1 Parameters) ואת פרמטרי אורך הגל 2 (Wavelength 2 Parameters) באופן עוקב.
      2. תחת פרמטרים של אורך גל 1 (Wavelength 1 Parameters), הגדר את מקור אורך גל 1 (Wavelength 1 Source) ל-DAPI. אלגוריתם ברירת המחדל הוא "סטנדרט"
      3. הגדירו את סוג התא הצבוע (Stained cell type) כ"כל התאים" (All Cells) ואת האזור הצבוע (Stained area) כ"גרעין" (Nucleus), בהתבסס על תנאי הצביעה. הגדירו את הרוחב המינימלי המשוער (Approximate min width), הרוחב המקסימלי המשוער (Approximate max width) ואת העוצמה מעל הרקע המקומי (intensity above local background) באמצעות אותן הגדרות ששימשו בשיטת דירוג התאים רב-אורכיי הגל (Multi-Wavelength Cell Scoring).
      4. סמנו את Split touching objects והשתמשו ב-Preview כדי לבדוק.
      5. תחת פרמטרי אורך גל 2 (Wavelength 2 Parameters), הגדר את מקור אורך גל 2 (Wavelength 2 Source) ל-Cy3.
      6. הגדירו את סוג התא הצבוע (Stained cell type) כמת (Dead) ואת האזור הצבוע (Stained area) כגרעין (Nucleus) בהתאם לצביעה הספציפית. הגדירו את הרוחב המינימלי המשוער (Approximate min width), הרוחב המקסימלי המשוער (Approximate max width) ואת העוצמה מעל הרקע המקומי (intensity above local background) באמצעות אותן הגדרות המשמשות את שיטת דירוג התאים רב-אורכי הגל (Multi-Wavelength Cell Scoring).
      7. לחצו על Configure Summary Log ובחרו את הגדרת הפרמטרים (Parameter configuration) בהתאם לסוגי הנתונים הנדרשים. בצעו הרצת ניסיון (Test Run) כדי לבחון את הזיהוי. אם תוצאות הזיהוי משביעות רצון, שמרו את ההגדרות.
    3. שיטה שלישית לעיבוד תמונה: מצב מפתח CME
      1. בחר את תוכנית המודול המותאם אישית (CME) והתחל להגדיר את ההגדרות. הגדר את שמות התמונות ואת הערוצים.
        הערה: כדי להקל על הגדרות הפרמטרים בהמשך, הגדירו אותם בדרך כלל לפי שמות הערוצים שבהם נעשה שימוש במהלך הדימוי.
      2. ב-Find Objects, פתח את Simple Threshold כדי להגדיר את הזיהוי עבור ההערכה כולה.
      3. הגדירו את המקור (Source) כך שיתאים לשם התמונה (Image Name). בהתבסס על טווח ערכי גווני האפור של 16 סיביות, הזינו 0 בסף הנמוך (Threshold Low) ו-65535 בסף הגבוה (Threshold High).
      4. שם את תוצאת העיבוד ב-Result, השתמש ב-apply ובחן את מצב הסימון. ב-Find Objects, פתח את Find Blobs כדי להפיק תוצאת Mask.
      5. הגדירו את המקור (Source) כך שיתאים לשם התמונה (Image Name), כפי שנעשה ב-Simple Threshold. הגדירו את הרוחב המינימלי המשוער (Approximate min width), הרוחב המקסימלי המשוער (Approximate max width) ואת העוצמה מעל הרקע המקומי (intensity above local background) בהתאם להגדרות של Multi-Wavelength Cell Scoring.
      6. שם את תוצאת העיבוד ב-Result, הפעל ובחן את תוצאת הסימון. עבור תוצאת הזיהוי של Find Blobs, השתמש בכלי Modify Objects כדי לבצע סינון, הגדלה, הקטנה והיפוך.
      7. Under Measure, set Modified. In Measurement Inputs, input 1 for Standard Area Value and check Create Object Overlay.
      8. בסעיף Objects to Measure, בחרו את מקור האובייקטים המסומנים ב-Mask of Objects ואת תמונת המקור למדידה ב-Image to Measure. בחרו את שם המדידה (Measurement Name) המתאים בהתאם לפרמטרי תוצאות העיבוד הנדרשים, לחצו על apply וצפו בתוצאת זיהוי הפרמטרים.
      9. לאחר אישור הגדרות הפרמטרים, שמור את התצורה.
    4. שיטה כללית: ImageJ
      ​הערה: נתח את תוצאות הדימות באמצעות שיטת ImageJ עבור תמונות פלואורסצנטיות19 ולאחר מכן בצע ניתוח השוואתי בין שלוש השיטות של מכשיר זה.
      1. פתח את תוכנת ImageJ. ייבוא תמונה: File → פתח → בחר את תמונת גווני האפור המקורית לניתוח.
      2. המרה של התמונה ל-8 ביט: Image → סוג → 8-ביט. זיהוי ערכי גווני אפור: תמונה → כוון → סף → ברירת מחדל, אדום → בדוק רקע כהה → סט → אנא ספק את הטקסט באנגלית שברצונך לתרגם לעברית.
        הערה: אם זיהוי האזור האדום אינו מספק, החליפו את Default באחד מ-16 מודלי הזיהוי המובנים האחרים של ImageJ או כווננו את הסליידר בתיבת הדו-שיח.
      3. הגדרת פרמטרים: ניתוח → הגדירו מדידות (Set Measurements). בתיבת הדו-שיח שנפתחה, סמנו את Area, Mean gray value, Integrated density, Limit to threshold, Display label, Redirect to None by default, והזינו 2 עבור Decimal places (0-9). לחצו על OK.
      4. ניתוח תוצאות הזיהוי: נתח → מדוד. שמור תוצאות: בתיבת הדו-שיח הקופצת של התוצאות, קובץ → בחרו ב"שמירה בשם" (Save As), ובחרו את מיקום השמירה.
  7. ייצוא תמונות
    1. בחר שדה ראייה חיובי באיכות גבוהה כסטנדרט ייחוס.
      הערה: דרישות האיכות הבסיסיות הן אותנטיות, מיקוד מדויק, חשיפה מתאימה (16-ביט) וניגודיות הולמת (יחס אות לרעש גבוה יותר הוא עדיף). דרישות האיכות הגבוהה כוללות מאפיינים ברורים, ניגודיות, פרקטיות, שינויים מורפולוגיים אינטואיטיביים והדגשת נקודות מפתח.
    2. תחת Run Analysis (ניתוח הרצה), בחר ב-ExportPro בסעיף ה-Analysis (ניתוח), והפעל את Run Setup for Analysis (הגדרת הרצה לניתוח). ב-Select output options (בחירת אפשרויות פלט), בחר ב-Individual channel (ערוץ בודד), Color overlay (שכבת צבע), shrink image (הקטנת תמונה - רשות), ו-Scale bar (סרגל קנה מידה - רשות) בהתאם לדרישות התמונה.
    3. בחר את תמונות הערוצים הפלואורסצנטיים שיש לייצא עבור כל שדה ראייה. ב-Individual Channel, בחר צבע עבור כל ערוץ, לדוגמה, Blue עבור ערוץ ה-DAPI ו-Monochrome עבור ערוץ ה-TL.
    4. בסעיף Color overlay, בחר לפי הסדר את הערוצים המתאימים ל-BRIGHTFIELD, RED, BLUE ו-GREEN (בחר את אורך הגל לצורך השכבה הצבעונית). הגדר את המספר (Number) ל-100; התבונן בתמונת התצוגה המקדימה ואשר את תוצאת התצוגה.
    5. בסעיף Export to folder, בחר את התיקייה שבה יישמרו התמונות המיוצאות. הפעל את הריצה.
      הערה: אין לייצא תמונות מאותה סדרה בנפרד; סדרת תמונות מתייחסת לאוסף תמונות מארבע דגימות ליבה: ביקורת שלילית, ביקורת חיובית, קבוצת ביקורת בסיסית וקבוצת ניסוי המטרה, כאשר כולן הושגו תחת תנאי ניסוי עקביים לחלוטין.
  8. השוואה בין שיטות לעיבוד תמונה
    1. בחרו 9 שדות ראייה והשוו בין הספירה הידנית המסורתית של תאים מתים וחיים לבין השיטות Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead, CME ו-ImageJ לספירת תאים חיים, תאים מתים והיחס בין תאים מתים לחיים. השתמשו בתוכנה GraphPad Prism גרסה 10.1 לביצוע ניתוח שונות חד-כיווני (one-way ANOVA), בליווי מבחן השוואות מרובות של Tukey, כדי לנתח את ההבדלים.
    2. בחרו 81 שדות ראייה והשוו את ההבדלים בספירת התאים, בשטח ובבעוות בין השיטות: Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead, CME ו-ImageJ. השתמשו בגרסה 10.1 של GraphPad Prism לביצוע ניתוח שונות חד-כיווני (one-way ANOVA), בליווי מבחן השוואות מרובות של Tukey, כדי לנתח את ההבדלים.
      הערה: יש לבצע ניסויי תרבית תאים וצביעה בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית. יש להשליך נוזלים פסולים, טיפים ופסולת ניסויית אחרת בהתאם לנהלי המעבדה. יש להבטיח הגנה מלאה לאורך כל הניסוי.

תוצאות

השפעת הכנה סטנדרטית על איכות הדימוי

פרמטרי הפלטה הוגדרו כדי להבטיח שהמכשיר יוכל לאתר באופן מהימן את שכבת תמונת התאים. דגימות שהוכנו כשכבה אחת של תאים עם התלכדות (confluence) מתונה הקלו על מיקוד התמונה בהגדגות שונות של העדשה ושיפרו את זיהוי התמונות ואת הניתוח הכמותי. הכנה סטנדרטית של הדגימות ופרמטרי פלטה מותאמים צמצמו ביעילות אפקטים של שוליים, חפיפת תאים וגורמים אחרים התורמים لديמוג באיכות נמוכה (איור 1).

השוואה בין פונקציות שיטת חישוב התמונה

שיטת צביעה כפולה של PI/Hoechst 33342 שימשה להבחנה בין תאים חיים למתים. שיטות ה-Multi-Wavelength Cell Scoring, ה-Live-Dead וה-CME עיבדו בהצלחה את התמונות הללו על ידי זיהוי אובייקטים בהתבסס על עוצמת הפלואורסצנציה וגודל האובייקט, בעוד ש-ImageJ זיהה אובייקטים בהתבסס על ערכי גווני אפור. תוצאות הסימון שהתקבלו בשיטות אלו היו דומות באופן כללי (איור 3A–E).

שיטת ספירת התאים רב-אורכיי ה([[Multi-Wavelength Cell Scoring]]) דרשה צביעה גרעינית כדי לזהות את כל התאים (איור 4A). היא יכולה לעבד עד 7 ערוצי דימוי ולחשב פרמטרים הכוללים ספירת תאים, שטח וצפיפות אופטית.

שיטת ה-Live-Dead הייתה גמישה יותר משיטת ה-Multi-Wavelength Cell Scoring. שני הערוצים מספקים מודולים לצביעת גרעין, צביעת ציטופלזמה או צביעה משולבת של גרעין וציטופלזמה לזיהוי כל התאים, תאים חיים או תאים מתים. פונקציית ה-Split touching objects מפרידה אובייקטים חופפים, מה שמאפשר חישוב של מספר התאים, שטח וצפיפות אופטית. עם זאת, מכיוון שהיא עיבדה נתונים של שני ערוצים בלבד, היא הייתה מתאימה במיוחד לבדיקות חיות תאים בצביעה כפולה של PI/Hoechst 33342 (איור 4B).

שיטת ה-CME התבססsatellite על לוגיקת עיבוד תמונה שהוגדרה על ידי המשתמש. מספר הערוצים המעובדים תאם למספר הערוצים שנרכשו. תוצאות הזיהוי שופרו באמצעות פונקציות כגון Fill Holes, Invert Objects, Grow Objects, Shrink Objects, Logical Operations, Remove Border Objects, Keep Marked Objects, Grow Objects without Touching, Mark Object Centers, Watershed, Remove Marked Objects ו-Filter Mask כדי להסיר זיהומים ומקורות הפרעה אחרים. שיטה זו אפשרה גם חישוב של פרמטרים מרובים עבור אובייקטים לצורך ניתוח רב-ממדי.

ImageJ לא עיבד מספר ערוצים בו-זמנית. עבור קבוצות תמונות עם שונות משמעותית ברקע, נדרשו עיבוד ידני והתאמת סף, מה שהגביר את הסובייקטיביות והפחית את השחזוריות.

ניתוח הבדלים בתוצאות העיבוד

ניתוח השוואתי של שיטות עיבוד התמונות לא הראה הבדלים מובהקים בספירת התאים הכוללת, בספירת התאים המתים או ביחס בין התאים המתים לכלל התאים בין שיטות ה-Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead, CME, ImageJ ושיטות ספירה ידנית מסורתיות לאורך 9 שדות ראייה (איור 5A–C, קובץ משלים 1).

באופן דומה, לא נצפתה הבדל משמעותי ביחס בין שטח התאים המתים לבין השטח הכולל של התאים בשיטות Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead, CME ו-ImageJ. עם זאת, נצפה הבדל משמעותי ביחס שבין עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של תאים מתים לבין זו של כלל התאים בשיטות Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead ו-CME, בהסתמך על נתונים שהתקבלו מ-81 שדות ראייה (איור 5D–F).

על בסיס ממצאים אלו, נקבע תהליך עבודה סטנדרטי עבור מערכת הדימוי בעלת התוכן הגבוה (איור 6).

תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, תאים צבועים ב-DAPI ו-Cy3, שדה בהיר, ניתוח תאי.
איור 1: תוצאות דימוי באיכות נמוכה. (A) שדה הראייה קרוב לדופן הבאר, מה שחושף צלים מדופן הבאר (במקרה זה תאי BV2). (B) חצים a ו-b מצביעים על חפיפה של תאים בערוץ ה-DAPI ובערוץ ה-TL, עם התמסכות תאית (confluency) מוגברת, ואף שכבה שנייה או תאים צפים. (C) בשדה הראייה אין תאים; פרמטרי הפלטה שגויים; המיקוד אינו על שכבת התאים, או שהתאים אינם צבועים, מה שמוביל להיעדר תמונה בשדה ראייה זה. סרגל קנה מידה = 100 µm. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של איור זה.

הגדרת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, צביעת DAPI, הגדרות רכישת תמונות, ניתוח דימות תאים.
איור 2: הגדרות פרמטרי דימות. (A) חץ a מצביע על סמל עומק הביט (bit depth). (B) חץ b מצביע על מיקום תיקון ההצללה (Shading Correction). אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

סיווג תאים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית; דיאגרמה; מערך נתונים רב-צבעי; זיהוי סוגי תאים.
איור 3: תוצאות של אותו שדה ראייה שזוהו על ידי מספר שיטות. (A) תוצאות מסכת Multi-Wavelength Cell Scoring: האזורים האפורים והאדומים מייצגים את כל גרעיני התאים שזוהו בערוץ ה-DAPI, כאשר האזור האדום מייצג גרעיני תאים מתים שזוהו בערוץ ה-Cy3. (B) תוצאות מסכת Live-Dead: האזורים הירוקים והאדומים מייצגים את כל גרעיני התאים שזוהו בערוץ ה-DAPI, כאשר האזור האדום תואם לגרעיני תאים מתים שזוהו בערוץ ה-Cy3. (C) תוצאת מסכת CME: האזורים הצהובים והכחולים מייצגים את כל גרעיני התאים שזוהו בערוץ ה-DAPI, כאשר האזור הכחול תואם לגרעיני תאים מתים שזוהו בערוץ ה-Cy3. (D) תוצאת מסכת ImageJ ב-DAPI. (E) תוצאת מסכת ImageJ ב-Cy3. Scale bar = 100 µm. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מסכי הגדרה של מערך לדירוג תאים ברב-אורכי גל; פרמטרים לזיהוי גרעין בניתוח דימויים.
איור 4: דפי הגדרת פרמטרים חלקיים. (A) המיקום המסומן על ידי a מראה כי הערוץ הראשון של Multi-Wavelength Cell Scoring יכול לבחור רק את הגרעין; (B) b ו-c מציינים ש-Live-Dead יכול לעבד שני ערוצים בלבד, התומכים בצביעה כפולה של PI/Hoechst 33342 עבור תאים מתים וחיים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשימי עמודות של ניתוח חיוניות תאים; ספירות כוללות, תאים מתים ויחסים; תוצאות גרף השוואתי.
איור 5: הבדלים בתוצאות עיבוד תמונות פלואורסצנציה. (A) הבדלים בספירת כל התאים בין חמש שיטות העיבוד. (B) הבדלים בספירת התאים המתים בין חמש שיטות העיבוד. (C) הבדלים ביחס בין התאים המתים לכל התאים בין חמש שיטות העיבוד. (D) הבדלים ביחס בין התאים המתים לכל התאים בין ארבע שיטות העיבוד. (E) הבדלים ביחס בין שטח התאים המתים לשטח כל התאים בין ארבע שיטות העיבוד. (F) הבדלים ביחס בין עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של תאים מתים לזו של כל התאים בארבע שיטות העיבוד. כל פסי השגיאה בתרשימים מייצגים סטיות תקן. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיאגרמת תהליך הדמיה בתוכן גבוה: הזרעה, הולכת תרופות, צביעה פלואורסצנטית, עיבוד תמונה.
איור 6: תהליך פעולה סטנדרטי. זרימת עבודה המסכמת את הפרוצדורה הסטנדרטית להכנת דגימות, צביעה פלואורסצנטית, הדמיה בתוכן גבוה, עיבוד תמונה, ייצוא תמונות וניתוח נתונים. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1. נתונים גולמיים עבור ניתוח ספירת התאים, השטח ועוצמת הפלואורסצנציה המוצגים באיור 5.נא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

בעזרת שיטת כביכור כפול של PI ו-Hoechst לקביעת חיוניות תאים, למשל, יכול המכשיר לסריקה רב-מרכיבית (high-content instrument) לחשב במהירות ובסריקה רחבה את חיוניות התאים בתוך אותה סדרה באמצעות מודולי אלגוריתם מובנים. לשיטה זו מספר יתרונות, הכוללים נפח דגימה נמוך, עלות נמוכה, נזק מינימלי לתאים, דהיית פלואורסצנציה חלשה, עמידות בפני השתקה (quenching) ויכולת ללכוד תמונות מרובות. בנוסף, זמן הדימות עבור פלטה בעלת 96 בארות הוא בדרך כלל רק 30–45 min20.

בפרוטוקול הניסויי, כדי להבטיח את איכות הדימוי, התרכזו בשלבים הבאים: ראשית, וודאו צפיפות לוחיות מתאימה כדי למנוע צפיפות תאים מוגברת, שעלולה למלא את התמונה בתאים, או צפיפות נמוכה מדי, שעלולה לגרום לשטיפת התאים במהלך הצביעה והשטיפה. שנית, שטפו היטב את הצבע כדי למנוע משאריות צבע להשפיע על הדימוי. עבור תאים בעלי היצמדות נמוכה, בצעו את הוספת והסרת הנוזלים בעדינות ובאיטיות לפני ואחרי הצביעה, והימנעו מהוספה אנכית. השתמשו בהוספה דרך דופן הלוחית כדי למנוע אובדן תאים ממרכז שדה הראייה, והקפידו במיוחד על התנתקות תאים מתים במהלך בדיקות חיוניות. שקלו לבצע סבב של פלטת הדגימה כדי להפחית שגיאות ניסוייות במידת הצורך. שלישית, בחרו זמן חשיפה מתאים. חשיפה ארוכה מדי תגדיל את זמן הדימוי הכולל ועלולה לגרום להחמצת חלון הגילוי, מה שעלול להוביל לחשיפת יתר של חלק מהתאים או לזיהוי של הרקע. חשיפה קצרה מדי עלולה להוביל למידע חסר בתמונה ולאובדן פרטים מאפיינים.

אם לא ניתן למצוא תמונה ברורה במהלך הדמיה, יש לבחון את מקור הבעיה במצב התאים, שאריות צבע, הגדרות פרמטרים וגורמים אחרים. במהלך הניסוי, אם אין תאים בתחתית הבאר, לא תימצא תמונה בשדה הראייה. אם נוצרים בתחתית הבאר שניים או יותר שכבות תאים לא אחידות, הפוקוס הופך לקשה, מה שמוביל לתמונה מטושטשת. שאריות צבע מרובות עלולות להוביל לרקע חזק, ההופך את תמונת המטרה לפחות בולטת. שטחים נרחבים של שאריות צבע עלולים להסתיר תאים בשדה הראייה, בעוד שחלקיקי שאריות קטנים, שגודלם דומה לזה של תאים, עלולים להפריע לזיהוי ולסגמנטציה של התמונה בהמשך. אם גובה הפלטה וגובה הבאר לא הוגדרו בהתאם למפרטי היצרן עבור פלטת 96-בארים, לא תימצא תמונה בשדה הראייה, או שמיקום הדגימה עלול לזוז, מה שעלול לגרום לנזק לעדשת העדשה.

בהתחשב בגמישות ובפשטות התפעול, כמו גם בתוצאות עיבוד הנתונים הטובות, מודול עיבוד התמונה האופטימלי עבור שיטת הצביעה הכפולה של PI ו-Hoechst הוא Live-Dead. תוכנה זו מותאמת במיוחד לצבעי PI ו-Hoechst, ובהשוואה לשיטות ותוכנות אחרות, היא פשוטה לתפעול, מבצעת חישובים מהירים ומאפשרת טעינה קלה של קבוצות תמונות למסד הנתונים עם הגדרות פרמטרים עקביות. התוצאות ניתנות להשוואה במידה רבה יותר מאשר אלו המתקבלות בתוכנה הנפוצה כיום, ImageJ. ניתן להשתמש במצבי ניסוי שונים באמצעות שיטות קנייניות תואמות או במצב החישוב הכללי Multi-Wavelength Cell Scoring; השיטות הקנייניות נוחות יותר, בעוד שמצב החישוב הכללי כולל הגבלות פחותות על שיטות הצביעה. פרוטוקולי צביעה שונים דורשים מודולים שונים של עיבוד תמונה אופטימלי. פתחו שיטות חישוב המותאמות למטרות הניסוי. שיטת ExportPro לייצוא תמונות היא פשוטה וקלה ללמידה, ומאפשרת תצוגה מקדימה של אובייקטים למסמך ייחוס. היא ידידותית למתחילים, עם ממשק גרפי המסביר בבירור את משמעויות הפרמטרים ומפשט את המדידות, ובכך היא מסירה חסמי ניתוח המערבים מספר תוכנות וחוסכת זמן על למידת הכלים.

מחקר זה תיקף אך ורק פרוטוקול צביעה בסיסי. כנקודת ייחוס, פרוטוקולים ניסיוניים אחרים השונים משמעותית מזה עדיין דורשים תיקוף אל מול התקן החדש.

מערכת דימות בעלת תוכן גבוה (High-Content Imaging System) משמשת כפלטפורמת טכנולוגיה מרכזית המשלבת דימות ברזולוציה גבוהה, גילוי סינכרוני רב-פרמטרי, ניתוח כמותי אוטומטי וסריקה בתופעת גבוהה21,22,23. העיצוב המשולב של יכולות הדימות והחישוב של המכשיר צפוי לאפשר את הפיתוח והביסוס של פרוטוקולים ניסיוניים ומודלים חישוביים תואמים עבור ניסויי דימות קיימים רבים יותר7,24, ובסופו של דבר לשפר את העקביות וההשוואתיות של נתונים המתקבלים על ידי מפעילים שונים, בזמנים שונים ובסדרות שונות.

גילויים

כל המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים. במהלך תרגום כתב היד, נעשה שימוש ב-Zhipu AI אך ורק לצורכי תרגום ולא ליצירת נתוני מחקר, תוצאות ניסיוניות או תוכן אקדמי מרכזי. המחברים נושאים באחריות מלאה לתוכן כתב היד.

תודות

המחברים מודים על התמיכה שניתנה על ידי קרן בית הספר של אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית. המחברים מודים על התמיכה ממענק MPRC2022034. מימון זה שימש לפיתוח שיטת דימוי דינמי בתלת-ממד של חיידקי מעיים עבור Erchen Decoction לטיפול בעכבריםB עם השמנה פשוטה. המחברים מודים על פלטפורמת המחקר שסופקה על ידי המכון החדשני לרפואה ורוקחות סינית של אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית והמכון ללימודים בין-תחומיים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מבחנה לצנטריפוגה 1.5 mLLabigic Technology Co., Ltd.MCT-001-150
טיפים לפיפט 1000 µLLabigic Technology Co., Ltd.35423003E
מבחנה לצנטריפוגה 15 mLLabigic Technology Co., Ltd.CT-002-15A
טיפים לפיפט 2.5 µLQingdao Haier Biomedical Co., Ltd.B10T
טיפים לפיפט 200 µLLabigic Technology Co., Ltd.T-001-200
מבחנה לצנטריפוגה 50 mLLabigic Technology Co., Ltd.CT-002-50A
פלטת תרבית תאים בעלת 96 בארותCorning Incorporated3599
פיפט בעל ערוץ יחיד עם התאמה, 0.1–2.5 μLEppendorf SE3120000216
פיפט בעל ערוץ יחיד עם התאמה, 100–1000 μLEppendorf SE3120000267
פיפט בעל ערוץ יחיד עם התאמה, 20–200 μLEppendorf SE3120000259
פיפט בעל ערוץ יחיד עם התאמה, 2–20 μLEppendorf SE3120000232
צלחת לתרבית תאיםCorning Incorporated430167
מבחנות קריוגניותLabigic Technology Co., Ltd.BS-20-ST
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.D8371
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Life Technologies Limited11966-025במחקר זה, ה-DMEM המלא הוכרס באמצעות 10% FBS, 1% תמיסת פניצילין-סטרפტომייסין, ו-89% DMEM.
אינקובטור ESCO CelCulture CO2Esco Micro Pte. Ltd.CCL-170B-8
סרום בקר עוברי (FBS, Superfine)Procell Life Science & Technology Co.,Ltd.164210-50
צבעי פלואורסצנציה Hoechst 33342Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.B8040
תאי HT22Procell Life Science & Technology Co.,Ltd.CL-0697
ImageJNational Institutes of HealthImageJ היא אחת מתוכנות עיבוד התמונות ששימשו בכתב היד.
מערכת ImageXpress Micro Confocal High-Content ImagingMolecular Devices, LLCImageXpress Micro Confocalבכתב היד, השתמש במונח "High-Content Imaging System" כתחליף לשם המכשיר.
צנטריפוגת הקפאה במהירות נמוכהHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.L530R
תוכנת MetaXpress לרכישה וניתוח תמונות High-ContentMolecular Devices, LLCתוכנה זו היא תוכנה נלווית למערכת ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging. בכתב היד, "תוכנת הניתוח המסופקת עם המכשיר" מתייחסת לתוכנה זו.
מCבנת זרימה למינרית אנכית OptiMairEsco Micro Pte. Ltd.ACB-4E1
Parafilm MPechiney Plastic Packaging Inc.PM996
PBS Shanghai Yuchun biology science and technology co., ltd YC-5013
תמיסת פניצילין-סטרפტომייסיןProcell Life Science & Technology Co.,Ltd.PB180120
תמיסת Propidium Iodide (PI)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.C0080
תמיסת Trypsin-EDTABasalMedia Technology Co.,Ltd.S310KJ

מקורות

  1. Dariolli R, Nir R, Mushlam T, Souza GR, Farmer SR, Batista ML. Optimized scaffold-free human 3D adipose tissue organoid culture for obesity and disease modeling. SLAS Discovery. 2025;31:100218.
  2. Menduti G, Boido M. Recent advances in high-content imaging and analysis in iPSC-based modelling of neurodegenerative diseases. Int J Mol Sci. 2023;24(19).
  3. Park JC, Mook-Jung I. Toward brain organoid-based precision medicine in neurodegenerative diseases. Organoid. 2022;2.
  4. Geyer M, Schreyer D, Gaul LM, Pfeffer S, Pilarsky C, Queiroz K. A microfluidic-based PDAC organoid system reveals the impact of hypoxia in response to treatment. Cell Death Discovery. 2023;9:20.
  5. Huang CJ, Shieh PC, Yang JS, et al. Pterostilbene suppressed cell viability, induced apoptosis and autophagy of cisplatin-resistant gastric cancer cells. Anticancer Res. 2025;45(2):511-523.
  6. Wang G, Li Y, Sun T, et al. BMSC affinity peptide-functionalized β-tricalcium phosphate scaffolds promoting repair of osteonecrosis of the femoral head. J Orthop Surg Res. 2019;14(1):204.
  7. Uzoechi SC, Collins BE, Badeaux CJ, et al. Effects of amyloid beta (aβ) oligomers on blood–brain barrier using a 3D microfluidic vasculature-on-a-chip model. Appl Sci. 2024;14(9). doi:10.3390/app14093917
  8. Pereira JD, DuBreuil DM, Devlin AC, et al. Human sensorimotor organoids derived from healthy and amyotrophic lateral sclerosis stem cells form neuromuscular junctions. Nat Commun. 2021;12(1):4744.
  9. Cromwell EF, Leung M, Hammer M, Thai A, Rajendra R, Sirenko O. Disease modeling with 3D cell-based assays using a novel flowchip system and high-content imaging. SLAS Technol. 2021;26(3):237-248.
  10. Tabęcka-Łonczyńska A, Skóra B, Szlachcikowska D, et al. Impact of Hericium erinaceus and Ganoderma lucidum metabolites on AhR activation in neuronal HT-22 cells. Pharmacol Rep. 2025;77(6):1557-1572.
  11. Tang J, Chen R, Wang L, et al. Melatonin attenuates thrombin-induced inflammation in BV2 cells and then protects HT22 cells from apoptosis. Inflammation. 2020;43(5):1959-1970.
  12. Zhang W, Sun H, Zhao W, Li J, Meng H. Suppression of JNK pathway protects neurons from oxidative injury via attenuating parthanatos in glutamate-treated HT22 neurons. Sci Rep. 2024;14(1):25793.
  13. Thoudam T, Chanda D, Lee JY, et al. Enhanced Ca2+-channeling complex formation at the ER-mitochondria interface underlies the pathogenesis of alcohol-associated liver disease. Nat Commun. 2023;14(1):1703.
  14. Huang Z, Zhang Q, Wang Y, et al. Inhibition of caspase-3-mediated GSDME-derived pyroptosis aids in noncancerous tissue protection of squamous cell carcinoma patients during cisplatin-based chemotherapy. Am J Cancer Res. 2020;10(12):4287-4307.
  15. Andreyev AY, Yang H, Doulias PT, et al. Metabolic bypass rescues aberrant S-nitrosylation-induced TCA cycle inhibition and synapse loss in Alzheimer’s disease human neurons. Adv Sci. 2024;11(12):2306469.
  16. Backström A, Kugel L, Gnann C, et al. A sample preparation protocol for high throughput immunofluorescence of suspension cells on an adherent surface. J Histochem Cytochem. 2020;68(7):473-489.
  17. Hongxing Tang et al. Protective effects of hinokitiol on neuronal ferroptosis by activating the Keap1/Nrf2/HO-1 pathway in traumatic brain injury. J Neurotrauma. 2024;41(5-6):734-750.
  18. Teerawonganan P, Hasriadi, Dasuni Wasana PW, et al. Synthesis, cytotoxicity, and mechanistic evaluation of tetrahydrocurcumin-amino acid conjugates as LAT1-targeting anticancer agents in C6 glioma cells. Int J Mol Sci. 2024;25(20):11266.
  19. Shihan MH, Novo SG, Le Marchand SJ, Wang Y, Duncan MK. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 2021;25:100916.
  20. Gomez-Dopazo G, Nieves RJA, Rivera RLA, et al. Cellulose acetate microwell plates for high-throughput colorimetric assays. RSC Adv. 2024;14(22):15319-15327.
  21. DuBreuil DM, Chiang BM, Zhu K, et al. A high-content platform for physiological profiling and unbiased classification of individual neurons. Cell Rep Methods. 2021;1(1).
  22. Ronzetti M, Simeonov A. A comprehensive update on the application of high-throughput fluorescence imaging for novel drug discovery. Expert Opin Drug Discovery. 2025;20(6):785-797.
  23. Jiang X, Li M, Wang Y, et al. 1,2,4,5-tetrazine-tethered probes for fluorogenically imaging superoxide in live cells with ultrahigh specificity. Nat Commun. 2023;14(1):1401.
  24. Yu Y, Chen J, Zhang X, et al. Identification of anti-inflammatory compounds from zhongjing formulae by knowledge mining and high-content screening in a zebrafish model of inflammatory bowel diseases. Chin Med. 2021;16(1):42.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

PI HoechstHT22ImageJ

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.