מודל של אנגיוגנזה תלת-ממדית מבוסס חרוזי מיקרו-נשא המשתמש בתאי אנדותל של וריד הטבור האנושי

סיכום

פרוטוקול זה מתאר מודל אנגיוגנזה תלת-ממדית מבוסס חרוזים מיקרו-נשאים המשתמש בתאי אנדותל של ורידי הטבור האנושיים. הבדיקה מאפשרת הדמיה ישירה של נביטה אנדותלית ויצירת מבנה דמוי לומן, וניתן ליישם אותה במחקרים של מנגנוני אנגיוגניים והתערבויות טיפוליות.

תקציר

אנגיוגנזה היא תהליך ביולוגי רב-שלבי הכולל הפעלה של תאי אנדותל, נדידה, הארכה, יצירת לומן, הסתעפות ואנסטומוזה. מערכות תרביות דו-ממדיות קונבנציונליות שימושיות להערכה ראשונית של תרופות, גנים או תנאי תרבית, אך אינן משחזרות כראוי את הארגון המרחבי של מורפוגנזה אנדותליאלית בתוך מטריצה תלת-ממדית חוץ-תאית. הפרוטוקול הנוכחי מתאר בדיקת אנגיוגנזה תלת-ממדית מבוססת מיקרו-נשא באמצעות תאי אנדותל של וריד הטבור האנושי (HUVECs). ה-HUVECs נזרעים תחילה על חרוזי מיקרו-נשא הנושאים קולגן חזיר מסוג I מחובר בחומצה, ולאחר מכן מוטמעים במטריצת ממברנה בסיסית. לאחר מכן נזרעים פיברובלסטים ריים דרך הפה על גבי הג'ל כדי לספק תמיכה פרקרינית לנביטת אנדותל וליצירת מבנה דמוי כלי דם. מדיום התרבית מוחלף כל יומיים, והתנהגות הנביטה ופנוטיפים אנגיוגניים מנוטרים במיקרוסקופיה הפוכה. בתנאי תרבית מתאימים, נבטים אנדותליים מופיעים תוך מספר ימים, ואחריהם נוצרים מבנים דמויי לומן וקשרים בין נבטים. שיטה זו מספקת פלטפורמה נוחה וניתנת לשחזור למחקרים מבחנתיים של מורפוגנזה אנדותלית, וניתן ליישם אותה גם בחקירות מניפולציה גנטית, התערבות פרמקולוגית ומודלים של מחלות.

מבוא

נביטת אנדותל היא אירוע מרכזי באנגיוגנזה וכוללת הופעה, נדידה, התרבות ויישור של תאי אנדותל ממבנים וסקולריים קיימים, ואחריה היווצרות לומן והקמת רשתות כלי דם מקושרות ^1,2. למרות שמערכות תרבית דו-ממדיות קונבנציונליות ובדיקות היווצרות צינורות מבוססות ג'ל הן פשוטות מבחינה טכנית, הן מוגבלות ביכולתן לשחזר את העיצוב המרחבי של תאי אנדותל בתוך מיקרו-סביבה תלת-ממדית ^3,4. בדיקת הנביטה התלת-ממדית הקלאסית המבוססת על חרוזי מיקרו-נשא משחזרת מספר שלבים של אנגיוגנזה במבחנה, כולל נביטה אנדותלית, הארכה, יצירת לומן והרכבת רשת, ולכן הפכה לשיטה נפוצה למחקר אנגיוגנזה.

בפרוטוקול הנוכחי נקבע מודל נביטה תלת-ממדי מבוסס חרוזים מיקרו-נשאים המשתמש בתאי אנדותל נורמליים של וריד הטבור האנושי. בהתבסס על בדיקות הנביטה של חרוזי מיקרונושא אנדותליאליים ^5,6,7 שדווחו בעבר, שיטה זו שומרת על המסגרת הבסיסית של ציפוי תאי אנדותל על חרוזי מיקרו-נשאי, הטמעה במטריצה תלת-ממדית, ותרבות שכבת פיברובלסטים, תוך החלפת מטריצת ממברנה בסיסית בג'ל הפיברין הקונבנציונלי כדי לפשט את התהליך ולהקל על הדמיה שגרתית. מטריצת ממברנת הבסיס נבחרה בפרוטוקול המותאם הזה מסיבות מעשיות וביולוגיות שונות. בניסוי, הוא מספק מטריצה תלת-ממדית מוכנה לשימוש המאפשרת יצירת ג'ל מהירה, הטמעת חרוזים פשוטה ותצפית מיקרוסקופית שגרתית נוחה ללא שלבי פולימריזציה נוספים הנדרשים להכנת ג'ל פיברין. ביולוגית, מטריצת הממברנה הבסיסית מכילה רכיבי מטריצה חוץ-תאית התומכים בהיצמדות תאי אנדותל, נדידה, הארכת נבט ויצירת מבנה דמוי לומן. לכן, שינוי זה מתאים למחקרים הדורשים ויזואליזציה ישירה של התנהגות הנביטה האנדותלית, השוואת פנוטיפים אנגיוגניים, והערכת התערבויות פרמקולוגיות או גנטיות בסביבת תרבית תלת-ממדית. עם זאת, מאחר שמטריצת ממברנת הבסיס שונה מג'ל פיברין בהרכב המטריצה, בתכונות המכאניות, בהתכלות וברמזים ביואקטיביים, יש לפרש את הבדיקה הנוכחית כמודל נביטה מיקרו-נושא מותאם המבוסס על חרוזים ולא כהחלפה ישירה של הבדיקה הקלאסית המבוססת על פיברין. הבדלים אלו הקשורים למטריצות עשויים להשפיע על קינטיקת הנבט, יציבות הלומן ומורפולוגיית הרשת, ויש לקחת בחשבון אותם בהשוואת תוצאות בין מערכות אנגיוגנזה תלת-ממדיות שונות. מודל זה מתאים לתצפית על התנהגות הנביטה האנדותליאלית בתלת-ממד וניתן ליישמו במחקרים של התערבות פרמקולוגית, מניפולציה גנטית ומנגנוני אנגיוגניים.

פרוטוקול

תאי האנדותל של ורידי הטבור האנושיים ששימשו בפרוטוקול זה בודדו והורבדו מרקמות חבל הטבור שנאספו ממחלקת המיילדות, בית החולים העממי הראשון של מחוז יונאן. התקבלה הסכמה בכתב מדעת מכל התורמים לפני איסוף הדגימה. כל ההליכים הכוללים חומרים שמקורם בבני אדם אושרו על ידי ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים הראשון של מחוז יונאן (אישור מס' KHLL2023-KY198). פיברובלסטים רירית אורלית (HOMFs) בבני אדם סופקו בנדיבות על ידי קבוצת המחקר של ד"ר ג'יימיי זאי בבית החולים הסטומטולוגי המסונפ של אוניברסיטת קונמינג לרפואה. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת תאים

1. תרב תאי אנדותל של ורידי הטבור האנושיים (HUVECs) במדיום גדילה של תאי אנדותל בתוספת סרום בקר עוברי (FBS) לריכוז סופי של 10% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% CO₂. התאים המשמשים לבדיקה צריכים להיות נקיים מזיהום, להציג צמיחה יציבה ולהיות בשלב הגדילה הלוגריתמי. השתמש בתאים במקטעים 4–6.
2. תרבית פיברובלסטים ריריים אורליים אנושיים (HOMFs) במדיום בסיסי עתיר גלוקוז, עם תוספת של 10% סרום בקר עוברי (FBS) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% CO₂. השתמש בתאים במקטעים 4–6.
3. לפני ציפוי חרוזי המיקרו-נשא, ודאו ששני סוגי התאים נמצאים במפגש מתאים. הימנעו מתרבויות מתרבות יתר או עיכול אנזימטי מופרז, שכן אלה עלולים להשפיע לרעה על הנבטה הבאה.

2. הכנת חרוזי מיקרו-נשא

1. הידרציה של 0.5 גרם חרוזי מיקרו-נשא יבשים ב-50 מ"ל PBS למשך לפחות 3 שעות. לאחר השטיפה, תלויים מחדש את החרוזים ב-50 מ"ל PBS כדי לקבל השעיית חרוזים מיקרו-נשא של 10 מ"ג/מ"ל, המקביל לכ-3 × 10⁴ חרוזים למ"ל.
2. העבר את המתלה לבקבוק זכוכית סיליקון, חטא אותו על ידי אוטוקלב ב-115 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ואחסן אותו ב-4 מעלות צלזיוס עד השימוש.
3. לפני ציפוי תאי האנדותל, יש להסיר את תמיסת האחסון ולשטוף את החרוזים עם PBS סטרילי. איזון את החרוזים במדיום גדילה של תאי אנדותל בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך לפחות 30 דקות.
4. תלו בעדינות את החרוזים המאוזנים מיד לפני השימוש כדי למנוע שקיעה והצטברות חרוזים.
5. לפני ציפוי התא, בדוק אליקו קטן של תליית החרוזים תחת מיקרוסקופ הפוך. המשך רק כאשר החרוזים מיובשים לחלוטין, תלויים באופן אחיד, וללא מצברים נראים לעין או חלקיקים מפורקים.

3. ציפוי תאי אנדותל על חרוזי מיקרו-נשא

1. נתק HUVECs באמצעות טריפסין והחזיר את התאים לתחום גדילה של תאי אנדותל.
2. ציפו את חרוזי המיקרו-נשא בצפיפות של 1,500 תאים לכל חרוז. מערבבים 3 ×^{10 6} HUVECs עם 2,000 חרוזי מיקרו-נשא ב-1.5 מ"ל של מדיום גדילה של תאי אנדותל.
3. העבר את תערובת התא-חרוזים לצינור מיקרוצנטריפוגה ודוגר במשך 12 שעות באינקובטור תרבית תאים. במהלך כל תקופת הדגירה של 12 שעות, יש להפוך בעדינות את הצינור פעם ב-20 דקות כדי לשמור על מגע מספק בין התאים לחרוזים ולקדם חיבור אחיד של תאי האנדותל.
4. לאחר 12 שעות, העבר את החרוזים המצופים לבקבוק תרבית^{תאים בגודל} 2 ס"מ המכיל 4 מ"ל של מדיום גדילה של תאי אנדותל וממשיך בדגירה לאורך הלילה כדי לאפשר חיבור יציב של תאי האנדותל לפני המיקרו-נשאי.
5. לפני ההטבעה, בדוק חרוזים מצופים מייצגים תחת מיקרוסקופ הפוך. המשך להטמעת מטריצה רק כאשר יותר מ-80% מהחרוזים שנבדקו מראים שכבת תאי אנדותל רציפה ואחידה יחסית על פני החרוז, עם תאים צפים חופשיים מינימליים, ללא גושים ברורים של תאים, וללא הצטברות חריצים חמורה. חרוזים עם ציפוי לא אחיד, אשכולות תאים גדולים או אגרגציה נרחבת לא צריכים לשמש להטמעה.
6. אם החרוזים נדבקים לתחתית הבקבוק, נער בעדינות את הבקבוקון כדי לשחרר אותם. הימנעו מפיפטציה נמרצת, שעלולה לגרום להצטברות חרוזים או להיפרדות תאים.

4. הטמעת החרוזים המצופים במטריצה תלת-ממדית

1. העבר את חרוזי המיקרו-נשא המצופים תאי אנדותל לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל ואפשר להם לשקוע בכוח הכבידה. הסירו את עודפי המדיום והוסיפו נפח מתאים של מדיום טרי.
2. מערבבים את תליית חרוזי המיקרו-נשא עם מטריצת ממברנת בסיס מקוררת מראש ביחס של 1:1 (v/v) לקבלת ריכוז סופי של 500 חרוזים/מ"ל.
3. הוסיפו 100 מיקרוליטר של תליית חרוז מטריצה למרכז כל באר בלוח 24 בארות, ומאפשרים לתערובת ליצור טיפת ג'ל בצורת כיפה אחת מבלי לגעת בדופן הבאר. ערבבו בעדינות את המתלים מיד לפני ההזנה והימנעו מהכנסת בועות אוויר.
4. השאירו את צלחת 24 הבארים בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות כדי לאפשר ג'לציה וייצוב ראשוני של טיפת הג'ל. לאחר מכן דגרו את הפלטה זקופה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-CO₂ של 5% למשך 15 דקות, ולאחר מכן דגירה נוספת של 15 דקות במצב הפוך כדי להבטיח ג'לציה מלאה ויצירת ג'ל נכונה.
5. לאחר שהג'ל התקשה לחלוטין, יש לעבור מיד לתרבות שכבת פיברובלסטים.

5. תרבית שכבת פיברובלסטים

1. החזירו 3 × 10⁴ פיברובלסטים פומיים (HOMFs) לתוך 1 מ"ל של מדיום גדילה של תאי אנדותל והוסף בעדינות את תליית התא לאורך דופן כל באר, כך שמאפשרים לתאים להתפזר על פני הג'ל מבלי להפריע ישירות לכיפה הג'לית.
2. המשך הדגירה במדיום גדילה של תאי אנדותל בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה עם 5% CO₂. פיברובלסטים ריריים אורליים אנושיים משמשים כתאים תומכים משום שהם מספקים אותות פרקריניים שמקורם בסטרומלים המקדמים הארכת נבטים, ייצוב ועיצוב מחדש דמוי כלי דם במערכת התרבית התלת-ממדית.

6. תחזוקת תרביות ותצפית מיקרוסקופית

1. תחליף את מדיום התרבות כל יומיים. במהלך החלפות מדיום, יש לשאוף לאט את המדיום המשומש ולהוסיף חומר תרבית טרי לאורך דופן הבאר כדי לא להפריע לג'ל.
2. צפו בתרביות מדי יום או כל יומיים תחת מיקרוסקופ הפוך באמצעות מצב שדה בהיר או ניגודיות פאזה. לניתוח כמותי לאורך זמן, בחר מספר שדות ראייה בכל באר ביום 7 וצלם את אותם שדות מוגדרים מראש בימים 9 ו-11.
3. בתנאי תרבית אופטימליים, נביטה אנדותלית נראית בדרך כלל בימים 4–6, מבנים דמויי לומן מופיעים בימים 5–7, ורשתות מיקרווסקולריות מקושרות נוצרות בהדרגה לאחר יום 7.
4. הגדר נביטה מוצלחת כנוכחות של מספר הרחבות אנדותליות הגדלות רדיאלית ממשטח החרוז אל המטריצה התלת-ממדית הסובבת. יש לספור נבט רק כאשר הוא מתפשט בבירור מעבר לפני החרוז ונשאר מחובר לשכבת תאי האנדותל הקשורה לחרוז.
5. הגדר היווצרות מבנה דמוי לומן כהופעת מבנים אנדותליים מוארכים עם מרחב מרכזי ברור נראה או מורפולוגיה דמוית צינור. חיבורים בין נבטים מוגדרים כמגעים ישירים או מבנים רציפים הנוצרים בין נבטים סמוכים.
6. תרביות עם מוות תאים נרחב, הצטברות חרוזים חמורה, מבנה ג'ל מופרע, בועות רבות, קריסת מטריצה, או בליטות תא קצרות ובלתי סדירות צריכות להיחשב כלא אופטימליות ולהיות מודרות מניתוח כמותי.

7. רכישת תמונות וניתוח כמותי

1. בחר מספר שדות תצוגה בכל באר ביום השביעי וקבל תמונות מאותם שדות מוגדרים מראש בימים 9 ו-11. יש לאסוף תמונות באמצעות הגדלה, הגדרות חשיפה ותנאי הדמיה זהים בכל נקודות הזמן.
2. כמת את מספר הנבטים לכל חרוז מיקרו-נשא ואת האזור הוסקולרי.
   1. למדידת שטח כלי דם, השתמשו בתוכנת ניתוח תמונות בקוד פתוח. פתח את התמונה שנרכשה והגדר ידנית את הגבול של אזור העניין הוסקולרי (ROI) באמצעות כלי הבחירה הפוליגוני או החופשי. הוסף את התשואה שנבחר למנהל התשואה (ROI).
   2. להמחשה, השתמשו בתוסף ויזואליזציה של אזור עניין כדי להציג את התשואה על ההשקעה המוגדרת. אפשר מדידת שטח בהגדרות המדידה ולמדוד את תשואה ה-ROI שנבחר כדי לקבל את האזור הוסקולרי. החלו את אותן הגדרות ניתוח על כל התמונות.
   3. לניתוח קצב אנגיוגני, השתמשו באזור הוסקולרי ביום השביעי כקו בסיס, וחשבו את השינוי היחסי באזור הווסקולרי בימים 9 ו-11.
3. ספרו את מספר הנבטים הבודדים באופן עצמאי על ידי שלושה צופים, והשתמשו בערך הממוצע לניתוח.

תוצאות

אנגיוגנזה במודל התלת-ממדי HUVEC

בתרביות שהתבססו בהצלחה, תאי האנדותל מפוזרים באופן אחיד על פני שטח חרוזי המיקרו-נשאי, ולא נצפתה הצטברות חרוזים ברורה. תצפית דינמית הראתה נביטה מתקדמת של האנדותל ויצירת רשת מיקרווסקולרית בימים 7, 9 ו-11 (איור 1A). ניתוח כמותי אישר עוד יותר את התגובה האנגיוגנית הפרוגרסיבית במודל זה. בהסתמך על יום 7 כקו בסיס, קצב האנגיוגנית נקבע ל-0% ביום השביעי והגיע ל-66.94% ± 18.49% ביום התשיעי ו-169...

דיון

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מודל נביטה תלת-ממדי תלת-ממדי המבוסס על חרוזי מיקרו-נשאי. איור 3 מספק סקירה סכמטית של זרימת העבודה הניסויית. הפרוטוקול הותאם מבדיקת האנגיוגנזה הקלאסית שדווחה על ידי נקאטסו ויוז ואופטימיזציה כדי לעמוד ביעדי המחקר הנוכחי ^8,9. במערכת הקלאסית, תאי האנדותל מצופים על חרוזי מיקרו-נשא מצופים קולגן, מוטמעים במטריצה תלת-ממדית, ומעובדים יחד עם פיברובלסטים לתמיכה בנביטה, הארכה, יצירת...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1.5 mL microcentrifuge tube	Beyotime	FTUB306	Clear, nuclease-free
15 mL centrifuge tube	Haier	311005	Conical-bottom, sterile, bag-packed
24-well cell culture plate	Haier	612003	Flat-bottom, tissue culture-treated, individually wrapped, for adherent cell culture
Automated cell counting slide	Countstar	12-0005-50	Disposable slide for automated cell counter, 50 slides/box
CO2 cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	3110	Used for cell culture at 37 °C with 5% CO2
Cytodex 3 microcarriers	Cytiva	17048503	Dry powder; collagen-coated dextran microcarrier beads
Dotted Line plugin	N/A	N/A	Region-of-interest visualization plugin used for displaying outlined vascularized areas
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose	EvaCell (EVA Life Sciences)	E2102	DMEM basic (1×), containing 4.5 g/L D-glucose, L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate, 500 mL
Endothelial Cell Medium (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Endothelial cell culture medium supplemented with additional FBS to a final concentration of 10% before use
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10099141C	Qualified, single-use format, Australia origin, 500 mL
Human oral mucosal fibroblasts (HOMFs)	Jiemei Zhai research group, The Affiliated Stomatological Hospital of Kunming Medical University	N/A	Primary fibroblasts isolated from human oral mucosa; kindly provided by another laboratory
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)	In-house	N/A	Primary endothelial cells isolated from human umbilical veins; no catalog number
ImageJ software	National Institutes of Health (NIH), USA	N/A	Open-source software; version 1.54p
Inverted microscope	Olympus, Japan	N/A	For bright-field, phase-contrast, and fluorescence imaging
Laser scanning confocal microscope	Nikon, Japan	N/A	For confocal imaging;model not specified
Matrigel basement membrane matrix	Corning	354262	High concentration (HC), phenol red-free, LDEV-free, 10 mL
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)	Gibco	15140-122	Penicillin-streptomycin solution for cell culture, 100×, 100 mL
Phosphate-buffered saline (PBS)	LiJi Bio	AC08L011	1×, sterile, 500 mL
T25 cell culture flask	ABCBIO	ABC707008	T25, vented cap, tissue culture-treated, for adherent cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200-056	0.25% trypsin-EDTA solution, 100 mL