מודל של אנגיוגנזה תלת-ממדית מבוסס חרוזי מיקרו-נשא המשתמש בתאי אנדותל של וריד הטבור האנושי

סיכום

פרוטוקול זה מתאר מודל אנגיוגנזה תלת-ממדית מבוסס חרוזים מיקרו-נשאים המשתמש בתאי אנדותל של ורידי הטבור האנושיים. הבדיקה מאפשרת הדמיה ישירה של נביטה אנדותלית ויצירת מבנה דמוי לומן, וניתן ליישם אותה במחקרים של מנגנוני אנגיוגניים והתערבויות טיפוליות.

תקציר

אנגיוגנזה היא תהליך ביולוגי רב-שלבי הכולל הפעלה של תאי אנדותל, נדידה, הארכה, יצירת לומן, הסתעפות ואנסטומוזה. מערכות תרביות דו-ממדיות קונבנציונליות שימושיות להערכה ראשונית של תרופות, גנים או תנאי תרבית, אך אינן משחזרות כראוי את הארגון המרחבי של מורפוגנזה אנדותליאלית בתוך מטריצה תלת-ממדית חוץ-תאית. הפרוטוקול הנוכחי מתאר בדיקת אנגיוגנזה תלת-ממדית מבוססת מיקרו-נשא באמצעות תאי אנדותל של וריד הטבור האנושי (HUVECs). ה-HUVECs נזרעים תחילה על חרוזי מיקרו-נשא הנושאים קולגן חזיר מסוג I מחובר בחומצה, ולאחר מכן מוטמעים במטריצת ממברנה בסיסית. לאחר מכן נזרעים פיברובלסטים ריים דרך הפה על גבי הג'ל כדי לספק תמיכה פרקרינית לנביטת אנדותל וליצירת מבנה דמוי כלי דם. מדיום התרבית מוחלף כל יומיים, והתנהגות הנביטה ופנוטיפים אנגיוגניים מנוטרים במיקרוסקופיה הפוכה. בתנאי תרבית מתאימים, נבטים אנדותליים מופיעים תוך מספר ימים, ואחריהם נוצרים מבנים דמויי לומן וקשרים בין נבטים. שיטה זו מספקת פלטפורמה נוחה וניתנת לשחזור למחקרים מבחנתיים של מורפוגנזה אנדותלית, וניתן ליישם אותה גם בחקירות מניפולציה גנטית, התערבות פרמקולוגית ומודלים של מחלות.

מבוא

נביטת אנדותל היא אירוע מרכזי באנגיוגנזה וכוללת הופעה, נדידה, התרבות ויישור של תאי אנדותל ממבנים וסקולריים קיימים, ואחריה היווצרות לומן והקמת רשתות כלי דם מקושרות ^1,2. למרות שמערכות תרבית דו-ממדיות קונבנציונליות ובדיקות היווצרות צינורות מבוססות ג'ל הן פשוטות מבחינה טכנית, הן מוגבלות ביכולתן לשחזר את העיצוב המרחבי של תאי אנדותל בתוך מיקרו-סביבה תלת-ממדית ^3,4. בדיקת הנביטה התלת-ממדית הקלאסית המבוססת על חרוזי מיקרו-נשא משחזרת מספר שלבים של אנגיוגנזה במבחנה, כולל נביטה אנדותלית, הארכה, יצירת לומן והרכבת רשת, ולכן ה....

פרוטוקול

תאי האנדותל של ורידי הטבור האנושיים ששימשו בפרוטוקול זה בודדו והורבדו מרקמות חבל הטבור שנאספו ממחלקת המיילדות, בית החולים העממי הראשון של מחוז יונאן. התקבלה הסכמה בכתב מדעת מכל התורמים לפני איסוף הדגימה. כל ההליכים הכוללים חומרים שמקורם בבני אדם אושרו על ידי ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים הראשון של מחוז יונאן (אישור מס' KHLL2023-KY198). פיברובלסטים רירית אורלית (HOMFs) בבני אדם סופקו בנדיבות על ידי קבוצת המחקר של ד"ר ג'יימיי זאי בבית החולים הסטומטולוגי המסונפ של אוניברסיטת קונמינג לרפואה. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת תאים

1. תרב תאי ....

תוצאות

אנגיוגנזה במודל התלת-ממדי HUVEC

בתרביות שהתבססו בהצלחה, תאי האנדותל מפוזרים באופן אחיד על פני שטח חרוזי המיקרו-נשאי, ולא נצפתה הצטברות חרוזים ברורה. תצפית דינמית הראתה נביטה מתקדמת של האנדותל ויצירת רשת מיקרווסקולרית בימים 7, 9 ו-11 (איור 1A). ניתוח כמותי אישר עוד יותר את התגובה האנגיוגנית הפרוגרסיבית במודל זה. בהסתמך על יום 7 כקו בסיס, קצב האנגיוגנית נקבע ל-0% ביום השביעי והגיע ל-66.94% ± 18.49% ביום התשיעי ו-169.......

דיון

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מודל נביטה תלת-ממדי תלת-ממדי המבוסס על חרוזי מיקרו-נשאי. איור 3 מספק סקירה סכמטית של זרימת העבודה הניסויית. הפרוטוקול הותאם מבדיקת האנגיוגנזה הקלאסית שדווחה על ידי נקאטסו ויוז ואופטימיזציה כדי לעמוד ביעדי המחקר הנוכחי ^8,9. במערכת הקלאסית, תאי האנדותל מצופים על חרוזי מיקרו-נשא מצופים קולגן, מוטמעים במטריצה תלת-ממדית, ומעובדים יחד עם פיברובלסטים לתמיכה בנביטה, הארכה, יצירת.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1.5 mL microcentrifuge tube	Beyotime	FTUB306	Clear, nuclease-free
15 mL centrifuge tube	Haier	311005	Conical-bottom, sterile, bag-packed
24-well cell culture plate	Haier	612003	Flat-bottom, tissue culture-treated, individually wrapped, for adherent cell culture
Automated cell counting slide	Countstar	12-0005-50	Disposable slide for automated cell counter, 50 slides/box
CO2 cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	3110	Used for cell culture at 37 °C with 5% CO2
Cytodex 3 microcarriers	Cytiva	17048503	Dry powder; collagen-coated dextran microcarrier beads
Dotted Line plugin	N/A	N/A	Region-of-interest visualization plugin used for displaying outlined vascularized areas
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose	EvaCell (EVA Life Sciences)	E2102	DMEM basic (1×), containing 4.5 g/L D-glucose, L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate, 500 mL
Endothelial Cell Medium (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Endothelial cell culture medium supplemented with additional FBS to a final concentration of 10% before use
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10099141C	Qualified, single-use format, Australia origin, 500 mL
Human oral mucosal fibroblasts (HOMFs)	Jiemei Zhai research group, The Affiliated Stomatological Hospital of Kunming Medical University	N/A	Primary fibroblasts isolated from human oral mucosa; kindly provided by another laboratory
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)	In-house	N/A	Primary endothelial cells isolated from human umbilical veins; no catalog number
ImageJ software	National Institutes of Health (NIH), USA	N/A	Open-source software; version 1.54p
Inverted microscope	Olympus, Japan	N/A	For bright-field, phase-contrast, and fluorescence imaging
Laser scanning confocal microscope	Nikon, Japan	N/A	For confocal imaging;model not specified
Matrigel basement membrane matrix	Corning	354262	High concentration (HC), phenol red-free, LDEV-free, 10 mL
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)	Gibco	15140-122	Penicillin-streptomycin solution for cell culture, 100×, 100 mL
Phosphate-buffered saline (PBS)	LiJi Bio	AC08L011	1×, sterile, 500 mL
T25 cell culture flask	ABCBIO	ABC707008	T25, vented cap, tissue culture-treated, for adherent cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200-056	0.25% trypsin-EDTA solution, 100 mL