העשרת תירוטרופ בלוטת יותרת המוח בעכברים עם תת-פעילות בלוטת התריס באמצעות מיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה מבוסס CD90

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את העשרת התירוטרופים מבלוטות יותרת המוח של עכברים בוגרים בתת-פעילות של בלוטת יותרת המוח באמצעות דיסוציאציה אנזימטית ומיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה מבוסס CD90, המאפשר ניתוחים מולקולריים במורד הזרם ותרבות ראשונית קצרה טווח של אוכלוסיית תאים מועשרת בתירוטרופ.

תקציר

תירוטרופים הם תאים אנדוקריניים מיוחדים בבלוטת יותרת המוח הקדמית, אשר מפרישים הורמון מגרה את בלוטת התריס (TSH) ומווסתים את פעילות בלוטת התריס. הפרשת TSH מווסתת באופן חיובי על ידי הורמון משחרר תירוטופינים היפותלמי ומוסדרת באופן שלילי על ידי הורמוני בלוטת התריס במחזור הדם. תירוטרופים מהווים רק חלק קטן מתאי יותרת המוח (~5%), מה שמקשה על המאמצים לבודד ולחקור את הפיזיולוגיה שלהם. כאן, אנו מתארים גישה משופרת לבידוד תירוקרופים מעכברים בוגרים תת-פעילות של בלוטת התריס. תת-פעילות של בלוטת התריס גרמה להרחבת אוכלוסיית התירוטרופ לפני התנתקות אנזימטית של בלוטת יותרת המוח הקדמית ומיון תאים מופעלים על ידי פלואורסצנציה באמצעות אנטיגן פני השטח CD90.2. עיבוד בלוטות יותרת המוח הקדמיות של שנים-עשר עכברים הניב כ-1.5 ×-¹⁰ 6 תאים חיוביים CD90.2 שהועשרו לביטוי RNA שליח Tshb . תאים חיוביים ל-CD90.2 ייצגו כ-25% מתאי יותרת המוח הקדמיים והראו ביטוי Tshb גבוה פי חמישה לעומת תאי CD90.2 שליליים, מה שמעיד על העשרה משמעותית של תירוטרופ. תאים מבודדים נשארו חיוניים בתרבות קצרה ושמרו על תגובתיות לטיפול בטריאודותירונין. פרוטוקול זה מאפשר העשרה ותרבות של תירוטרופים בעכברים לניתוחים מולקולריים, טרנסקריפטומיים, אפיגנומיים ופיזיולוגיים במורד הזרם.

מבוא

בלוטת יותרת המוח היא איבר אנדוקריני הממוקם בבסיס המוח ומפעיל שליטה היררכית על ההומאוסטזיס ההורמונלי. פעילותו מוסדרת על ידי אותות היפותלמים שמעוררים או מעכבים את ייצור הורמוני יותרת המוח, אשר בתורם שולטים בתפקוד האיברים האנדוקריניים ההיקפיים. הבלוטה מכילה אוכלוסייה הטרוגנית ודינמית של תאים, כולל תאי גזע/אב ותאים מייצרי הורמונים מובינים¹. בתגובה ללחץ פיזיולוגי או פציעה, תאי גזע/קדם יותרת המוח יכולים לפעול, להתחדש ולהתמיין למספר שושלות מפרישות הורמונים ^2,3. מבחינה מבנית, יותרת המוח מאורגנת לשני אונות עיקריות: האונה האחורית (PL), המורכבת מפיטויציטים וטרמינלים נוירוספקטוריים המשחררים אוקסיטוצין ווזופרסין, והאונה הקדמית (AL), הכוללת סוגי תאים אנדוקריניים מיוחדים המפרישים הורמון גדילה, פרולקטין, הורמון מגרה בלוטת התריס (TSH), הורמון אדרנוקורטיקוטרופי, והורמון מגרה זקיקים (FSH) והורמון לוטאיניזציה (LH). בהיפופיזה הקדמית מכילה גם סוגי תאים לא-הורמונליים, כגון תאי זקיקים חיוביים ל-S100B, תאי אנדותל ופריציטים, התומכים בתפקוד אנדוקריני ^4,5,6. מכרסמים גם מכילים מלנוטרופים באונה האמצעית של בלוטת יותרת המוח ^7,8.

העניין בתפקוד, התמיינות והתפתחות בלוטת יותרת המוח הוביל לפיתוח פרוטוקולים מרובים שמטרתם לבודד תאי גזע ותאי קדם בוגרים של יותרת המוח במודלים של מכרסמים. חולדות משמשות לעיתים קרובות במחקר פיזיולוגיה של יותרת המוח מכיוון שבלוטות יותרת המוח הגדולות שלהן מניבות מספר תאים גבוה יותר ומשפרות את ההתאוששות במהלך עיבוד רקמות ^4,9. לעומת זאת, בידוד תאי יותרת המוח מעכברים נותר מאתגר טכנית, והפרוטוקולים הסטנדרטיים מוגבלים. פרוטוקולים עדכניים המשתמשים באגרגטים של תאי גזע/אב בלוטת יותרת המוח בוגרים מספקים כלים שימושיים למידול התפתחות ותפקוד יותרת המוח¹⁰; עם זאת, מערכות אלו עדיין אינן מאפשרות בידוד ישיר של אוכלוסיות תאים אנדוקריניים ספציפיות. מבין סוגי התאים המייצרים הורמונים של ההיפופיזה הקדמית, תירוטרופים הם הרגולטורים העיקריים של ציר ההיפותלמוס–יותרת המוח–בלוטת התריס (HPT), השולטים בסינתזת והפרשה של הורמון בלוטת התריס (TH) ביונקים. ה-TSH המיוצר על ידי תירוטרופים הוא גליקופרוטאין הטרודימרי המורכב מתת-יחידה α משותפת (מקודדת על ידי CGA ומשותפת עם FSH ו-LH) ותת-יחידה β (מקודדת על ידי Tshb), שמעניקה ספציפיות לקולטנים. תאים אלו רגישים מאוד לרמות טריאודותירונין (T3) ותירוקסין (T4) במחזור הדם. אוכלוסיית התירוטרופ מתרחבת כאשר רמות T3 ו-T4 נמוכות במהלך תת-פעילות בלוטת התריס ומתכווצת במהלך היפרתירואידיזם באמצעות מנגנון משוב שלילי קלאסי 11,12,13.

למרות תפקידם הפיזיולוגי החיוני, תירוטרופים עדיין קשים למחקר משום שהם מהווים רק חלק קטן מתאי יותרת המוח הקדמיים (כ-5%) וחולקים תכונות פנוטיפיות עם אוכלוסיות אנדוקריניות אחרות. מחסור זה, יחד עם היעדר מודלים עמידים במבחנה, הגביל את המחקרים המכניים של ויסות התירוטרופ ובקרת ציר ה-HPT. קו תאי הגידול TαT1 מייצג מודל¹⁴ הדומה לתירוטרופ נפוץ, אך אינו משקף באופן מלא תגובות פיזיולוגיות; במיוחד, דיכוי Tshb התלוי ב-T3 לעיתים קשה להערכה בגלל רמת השעתוק הבסיסית הנמוכה מאוד¹⁵. כתוצאה מכך, מחקרים רבים הסתמכו על קווי תאים שאינם תירוטרופ כגון HEK293, COS, CV1, GH3 או JEG3 המבטאים מבני Tshb שונים¹⁵. עם זאת, אלו מערכות הטרולוגיות שיכולות להכניס ארטיפקטים רגולטוריים לא פיזיולוגיים, כולל השפעות המונעות על ידי עמודי שדרה של פלסמיד ולא על ידי מנגנוני שעתוק אנדוגניים.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב לבידוד תירוטרופים מבלוטת יותרת המוח של העכבר הבוגרת, מותאם משיטה מוכרת בעבר בחולדות⁹, ומותאם לגודל קטן יותר ולתכולת התירוטרופ הנמוכה יותר של יותרת המוח בעכבר. הוכנסו מספר שינויים מרכזיים לשיפור התפוקה של תאי הביטוי-Tshb ולהבטחת ניתוח אמין במורד הזרם. הפרוטוקול משתמש בביטוי של אנטיגן פני השטח CD90, סמן שטח מועשר בתירוטרופים. CD90 (המוכר גם בשם THY1) הוא חלבון ממברנה מעוגן גליקוזילפוספטידילינוזיטול ^16,17, המתווך איתות ג'וסטקרין באמצעות אינטראקציות הטרוטיפיות עם הליגנד אינטגרין β2 (ITGB2). למרות ש-CD90 מזוהה בדרך כלל עם אוכלוסיות תאי חיסון ועצבים, מחקרים קודמים בטרנסקריפטומיה זיהו העשרת Thy1 בתירוטרופים. איתות מגע התלוי ב-THY1 מתרחש בסוגי תאים מגוונים, כולל תאים המטופואטיים, תאי T, פיברובלסטים, תאי אנדותל ונוירונים, שם הוא מווסת הידבקות, נדידה, אפופטוזיס, דיכוי גידולים ופיברוזיס 18,19,20.

חשוב לציין כי פרופיל טרנסקריפטומי חד-תאי של יותרת המוח הקדמית של העכברוש זיהה את Thy1 כאחד הגנים הקשורים להידבקות המובע ביותר בתירוטרופ⁵, מה שמרמז ש-THY1 הוא סמן שטחי מועשר בתירוטרופים. יתרה מזאת, מערכי נתונים זמינים לציבור של ריבונוקלאית ריבונקלאית חד-תאית (RNA) של יותרת המוח בעכברים מצביעים על כך שביטוי Thy1/CD90 מועשר בתירוטרופ ^22,23. עם זאת, ביטויו אינו מוגבל לחלוטין לקו זה, עם ביטוי שניתן לזהות בתת-קבוצות של תאי שושלת PIT1, כולל סומטוטרופ ולקטוטרופים, וכן באוכלוסיות דמויות אבות. מחקרים טרנסקריפטומיים חד-תאיים הראו חפיפה משמעותית של שעתוק בין תאי יותרת המוח בקו PIT1, כולל זיהוי אוכלוסיית אבות משותפת של PIT1 המסוגלת לייצר סומטוטרופים, לקטוטרופים ותירוטרופים. באופן דומה, Thy1/CD90 אינו מזהה באופן בלעדי את אוכלוסיית התירוטרופ אלא עשוי לשמש להעשיר תירוטרופים בעכברים. בהתבסס על ממצאים אלו, השימוש בנוגדנים ממוקדים ל-THY1 באסטרטגיית הבידוד שלנו מספק שיטה יעילה להעשרת התירוטרופ לאחר התרחבות הנגרמת מתת-פעילות בלוטת תריס ומאפשר מחקרים פונקציונליים, כולל הערכת תגובות הורמונליות ל-T3.

הפרוטוקול מתחיל בהאכלת עכברים מסוג בר מסוג C57BL/6 בתזונה דלת יוד ועיכוב תפקוד בלוטת התריס באמצעות מתימיזול (MMI) ופרכלוראט אשלגן (KClO₄) במי השתייה²⁵. טיפול זה גורם לתת-פעילות משמעותית של בלוטת התריס בתוך שבוע ומרחיב את אוכלוסיית התירוטרופים המבטאים את Tshb בהיפופיזה הקדמית. תאים המפיקים TSH בתנאי תת-פעילות של בלוטת התריס עוברים התאמות פיזיולוגיות ומורפולוגיות משמעותיות, כולל היפרפלזיה, היפרטרופיה, שפע של ציטופלזמה ואקואולטית, תהליכים ציטופלזמיים בולטים וליזוזומים מוגדלים, המשקפים התאמה להיעדר משוב TH 26,27,28. לכן, ניתן להשתמש בהשראת תת-פעילות של בלוטת התריס כאסטרטגיה להרחבת אוכלוסיית התירוטרופים.

לאחר השראת תת-פעילות של בלוטת התריס, העכברים מורדמים באיזופלוראן ונחשפים לפרפוזיה לבבית עם תמיסת מלח חסרת Ca²⁺/Mg²⁺, ללא בופר HEPES, כדי למקסם את חיוניות התאים במהלך דיסוציאציה של רקמות. לאחר הקציר, בלוטת יותרת המוח הקדמית עוברת עיכול אנזימטי עדין ליצירת תלות חד-תאיות שמודגרות בנוגדן אנטי-CD90.2 פיקואריתרין-ציאנין 7-קונוגטי להעשרת התירוטרופ באמצעות מיון תאים מופעל בפלואורסצנציה (FACS). תאים מסומנים נאספים לאחר מכן או לתוך מדיום גדילה לתרבות קצרה או לטריזול להפקת RNA. כדי לאמת את אסטרטגיית ההעשרה, נמדד ביטוי RNA שליח Tshb באוכלוסיות ממוינות ונמצא כי הוא מועשר מאוד בתאים חיוביים ל-CD90. שיטה זו תומכת במגוון רחב של יישומים במורד הזרם בעכברים, כולל פרופילינג ביטוי גנים, ניתוחים טרנסקריפטומיים ואפיגנומיים, בדיקות במהירות גבוהה ותרבות תאים ראשונית, ומספקת פלטפורמה חשובה לחקר המנגנונים התאיים והמולקולריים שמאחורי תפקוד ותיקון התירוטרופים של ציר ה-HPT.

פרוטוקול

פרוטוקול זה מתאר את בידוד התירוטרופ מ-AL של בלוטות יותרת המוח שנחתכו זה עתה והתקבלו מעכברים בוגרים לאחר לפחות שבוע של השראה לתת-פעילות של בלוטת התריס. כל ההליכים לבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות מוסדיות ושל המכון הלאומי לבריאות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה. ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדית של סניף הרפואה של אוניברסיטת טקסס אישרה את כל ההליכים לבעלי חיים.

עכברים זכרים ונקבות אוחדו במהלך הניסויים כי לא נצפו הבדלים תלויי מין בתפוקת התירוטרופ או בניתוחים במורד הזרם. כ-12 עכברים שימשו בכל ניסוי, אם כי ניתן לעבד קבוצות גדולות יותר של עד 20 בעלי חיים על ידי קנה מידה יחסי של כל נפחי המגבים.

בידוד מוצלח תלוי בהזרמה מהירה ועקבית, זמן ניתוח מינימלי, הסרה מלאה של ה-PL וציפוי צפוף גבוה של התאים הראשוניים. זמן העיבוד המרבי המומלץ בין המתת חסד, פרפוזיה, כריתת יותרת המוח והתחלת עיכול אנזימטי היה 6 שעות. התאים צופו בצפיפות של 2.0–2.5 × 10⁵ תאים לכל באר בגודל 0.7^{ס"מ רבעה} (שטח הפנים של באר אחת במגלשת זכוכית בת 8 בארות). נדרשה חיוניות מינימלית של 95% לתמיכה בתרבות תירוטרופ לטווח קצר.

כל החומרים המשמשים לייצור מתלים חד-תאיים הוכנו בתנאים סטריליים. משטחי העבודה עברו חיטוי עם 70% אתנול, מכשירי הדיסקציה עברו אוטוקלב לפני השימוש, וכל שלבי הכנת תרבית התאים בוצעו בארון ביו-בטיחות בטכניקת אספטי. פרוטוקול זה הוגדר ל-12 בעלי חיים. קשור את כל נפחי התגובה באופן פרופורציונלי כאשר משתמשים במספר שונה של עכברים. עיין בטבלת החומרים לכל המגבים, הצרכנים והציוד.

במהלך השראת תת-פעילות בלוטת התריס, העכברים שוכנו בתנאים מסוימים ללא פתוגנים בטמפרטורה של 20°C–24°C ולחות יחסית של 40%–60% עם מחזור אור של 12 שעות ו-12 שעות חושך וגישה חופשית למזון ולמים. בעלי חיים הוכנסו לקבוצה (עד שלושה עכברים בכלוב) בכלובים מאווררים בנפרד, המכילים מצעים סטנדרטיים והעשרה סביבתית, כולל חומרי קינון ומחסה. השראת תת-פעילות מוצלחת של בלוטת התריס אושרה על ידי מדידת ביטוי היודותירונין דיאודינאז (Dio1) בכבד. הפחתה של לפחות 50% בביטוי mRNA שליח Dio1 ביחס לעכברים בשליטה של אוטירואיד נחשבה לסימן להצלחה בהשראת תת-פעילות בלוטת התריס.

1. השראת תת-פעילות בלוטת התריס בעכברים C57BL/6

הערה: יש לבצע הליך זה במשך 7–10 ימים כדי לגרום לתת-פעילות בלוטת התריס ב-vivo באמצעות תזונה חסרת יוד ועיכוב כימי של תפקוד בלוטת התריס. ראו איור 1A לעיצוב הניסוי ואיור 1B לאימות השראת תת-פעילות של בלוטת התריס.

איור 1. השראת תת-פעילות בלוטת התריס בעכברים C57BL/6. (א) ייצוג סכמטי של תהליך הניסוי ששימש לגרימת תת-פעילות בלוטת התריס בעכברים בוגרים מסוג C57BL/6. העכברים קיבלו 0.05% מתימזול (MMI) ו-0.1% אשלגן פרכלוראט (KClO₄) במי שתייה יחד עם תזונה חסרת יוד למשך 7 ימים לפני בידוד יותרת המוח הקדמית. (B) ניתוח תגובת שרשרת פולימראז כמותית עם שעתוק הפוך (RT-qPCR) של ביטוי חומצה ריבונוקלאית (mRNA) של שליח Dio1 בכבד בעכברים אוטירואידים ותת-פעילות בלוטת התריס. ציקלופילין A (CyA) שימש כגן ייחוס. הנתונים מוצגים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD) (n = 6 לכל קבוצה). המשמעות הסטטיסטית נקבעה באמצעות מבחן ה-t של הסטודנט. **P < 0.001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

1. הכינו מים לשתייה MMI/KClO₄
   1. המיס 1 גרם MMI ו-2 גרם KClO₄ ב-2 ליטר מים מסוננים.
   2. ערבבו את התמיסה בטמפרטורת החדר (20°C–25°C) במשך שעה עד להמסה מוחלטת.
      אזהרה: MMI ו-KClO₄ הם כימיקלים מסוכנים. לבשו כפפות, חלוק מעבדה והגנה על עיניים במהלך ההכנה והטיפול.
      הערה: MMI מעכב את ארגון היודיד, בעוד ש-KClO₄ חוסם את קליטת היודיד דרך סימפורטר נתרן–יודיד²⁵. החליפו את תמיסת השתייה כל יומיים כדי לשמור על המינון הנכון ולהפחית זיהום ממצעי, שאריות מזון וצמיחת מיקרואורגניזמים. אם לא משתמשים בו מיד, יש לאחסן את התמיסה במיכל אטום היטב עמיד לאור בטמפרטורה של 4°C למשך עד 14 ימים.
2. השראת תת-פעילות בלוטת התריס
   1. יש לאכלס עכברים זכרים או נקבות בני 8 שבועות C57BL/6 בקבוצות של עד שלושה בעלי חיים בכל כלוב, בתנאי מגורים ללא יוד.
      הערה: עכברי בית בתנאים מסוימים נטולי פתוגנים בטמפרטורה של 20°C–24°C ולחות יחסית של 40%–60% עם מחזור אור של 12 שעות ו-12 שעות חושך וגישה חופשית למזון ומים. לשמור על בעלי חיים בכלובים מאווררים בנפרד המכילים מצעים סטנדרטיים והעשרה סביבתית, כולל חומרי קינון ומקלט. הסתגל לחיות למשך 3 ימים לפני תחילת הטיפול. עכברים זכרים ונקבות בבית בנפרד. בניסויים המתוארים כאן, קבוצת התריס היוטירואידית כללה שישה זכרים ושש נקבות בכלובים נפרדים, וקבוצת תת-פעילות בלוטת התריס כללה שישה זכרים ושש נקבות בכלובים נפרדים. אוסף ALs מעכברים זכרים ונקבות באותה קבוצת טיפול במהלך הכנת התאים, מאחר שלא נצפו הבדלים תלויי מין בתפוקת התירוטרופ או בניתוחים במורד הזרם.
   2. האכיל את העכברים בדיאטה דלה ביוד בחופשיות למשך 7–10 ימים.
      הערה: התחל את התזונה חסרת יוד ואת הטיפול ב-MMI/KClO₄ בו זמנית.
   3. לספק מי שתייה המכילים 0.05% MMI ו-0.1% KClO₄ ad libitum לאורך כל תקופת הטיפול.
      הערה: שמרו על הטיפול עד להמתת חסד. עקבו מדי יום אחרי משקל הגוף, צריכת המזון, צריכת המים וסימנים קליניים לאורך כל תקופת ההשראה לתת-פעילות בלוטת התריס. השראה מוצלחת של תת-פעילות בלוטת התריס קשורה בדרך כלל להפחתת עלייה במשקל הגוף ולסימנים קליניים כמו ירידה בפעילות או פרווה עמומה בהשוואה לבקרת אוטירואידית. תקופות השראה של שבעה ימים ועשרה ימים מייצרות יעילות העשרת תירוטרופ דומה.

2. פרפוזיה קרדיאקית ודיסקציה של AL

הערה: בצע את ההליך בכ-15 דקות לכל עכבר כדי למקסם את חיוניות הרקמה ולשמור על שלמות התאים במהלך בידוד יותרת המוח.

1. הכנת תמיסות פרפוזיה ואיסוף
   1. הכינו תמיסת מלח עם זיכרון HEPES (HBSS) ללא Ca²⁺ ו-Mg²⁺
      1. משלבים 667 מ"ל של 0.9% NaCl, 20 מ"ל של 1 מ' HEPES, ו-313 מ"ל מים מזוקקים כפול (ddH₂O) להכנת 1 ליטר HBSS מותאם אישית ללא Ca²⁺ ו-Mg²⁺.
      2. אוטוקלב את התמיסה ואחסן אותו ב-4°C עד השימוש.
   2. הכינו HBSS הפריטיני ללא Ca²⁺ ו-Mg²⁺
      1. הוסף 27 מיקרול אנוקספארין נתרן (תמיסת מלאי של 100 מ"ג/מ"ל) ל-50 מ"ל של HBSS מותאם אישית ללא Ca^{2+ ו-Mg 2+}.
   3. הכנת מדיום איסוף (CM)
      1. שילוב של 440 מ"ל מדיום Eagle מותאם של Dulbecco, 50 מ"ל סרום בקר עוברי מושבת חום (FBS), 4 מ"מ L-גלוטמין ו-10 מ"ל של 1 מיליון HEPES לנפח סופי של 500 מ"ל.
      2. סנן את התמיסה באמצעות פילטר של 0.22 מיקרון ואחסן אותו בטמפרטורה של 4°C עד חודש.
         הערה: הכינו אליקווטים של 50 מ"ל תחת ארון בטיחות ביולוגית לפני האחסון כדי למזער זיהום.
      3. חממו את ה-CM ל-20°C–25°C לפני השימוש.
   4. חיטא כלי ניתוח
      1. סטריליזציה של מספריים, מלקחיים, פינצטה, מחזיקי מחטים, מלקחיים של קשתית, כפות ניתוח ופרובים קהים עם 75% אתנול לפני השימוש.
         הערה: אפשר למכשירים להתייבש באוויר לחלוטין לאחר עיקור אתנול לפני מגע הרקמה.
2. בצע פרפוזיה לבבית
   1. הרדמה עמוקה של העכבר באמצעות איזופלוראן המסופק ב-100% חמצן. השרה הרדמה בתא עם איזופלורן 5% ושמירה על הרדמה דרך חרוט אף עם איזופלורן 3% עם ניטור רציף וסילוק גזי פסולת.
      זהירות: בצע הליכי הרדמה איזופלורן בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות והשתמש במערכות איסוף מתאימות למזעור חשיפה לשאיפה.
   2. אשר הרדמה מלאה על ידי אימות היעדר רפלקס המשיכה של הדוושה באמצעות צביטת אצבע.
   3. רססו את החיה ב-75% אתנול והניחו אותו בשלב הפרפוזיה בתוך תבנית האיסוף.
   4. הצמיד את הגפיים כדי לחשוף את אזור הפריטונאלי.
   5. פתח את חלל החזה בזהירות תוך הימנעות מנזק לאיברים מרכזיים ולכלי דם.
   6. חתכו לאורך הצלעות ליצירת פתח חזה, קפלו את המכסה מעל הראש, ומקבעים אותו עם המוסטט.
   7. ייצוב את הלב באמצעות מהדק והכנס מחט 23 גייג' לקצה החדר השמאלי.
   8. חבר את המחט למשאבה פריסטלטית באמצעות צינור סיליקון.
   9. התחילו את הפרפוזיה עם HBSS הפריטיני ללא Ca^{2+ ו-Mg 2+} שנשמרו בטמפרטורת החדר.
   10. חתך את העלייה הימנית מיד לאחר תחילת הזרימה כדי לאפשר ניקוז.
   11. תזרמו את החיה במשך 5 דקות בקצב זרימה של 3 מ"ל לדקה.
       הערה: אשר פרפוזיה מוצלחת על ידי תצפית על חיוורון נראה לעין של הכבד.
3. בידוד ה-AL
   1. ערפו את ראש העכבר מיד אחרי הפרפוזיה.
   2. הסרת הקרקפת ועצמות הגולגולת באמצעות מספריים דקים ומלקחיים, כדי לחשוף את המוח.
   3. הכניס כף ניתוחית בין המוח לגולגולת.
   4. הרם את המוח בעדינות וחתוך את הכיאזמה האופטית.
   5. הסר את ממברנת קרום המוח הדקה (דורה מאטר) שמכסה את בלוטת יותרת המוח תחת מיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ באמצעות פינצטה דקה.
   6. נתח והשליך בזהירות את ה-PL כפי שמוצג באיור 2A.
      הערה: זהה את ה-AL כרקמה הוורודה הגדולה יותר הממוקמת ברוסטרלית. זהה את ה-PL כרקמה לבנה-שקופה קטנה יותר הממוקמת בגבי.
   7. גזם את רקמות החיבור הסמוכות ואת קרום המוח שנותר באמצעות גלאי קהה כדי לשפר את הגישה ל-AL.
   8. אחוז ב-AL עם פינצטה קהה והעבר אותו לצינור פוליפרופילן בנפח 15 מ"ל שמכיל 1.8 מ"ל ס"מ.
      הערה: הצטרפו ל-AL מ-12 בעלי חיים לאותו צינור איסוף.
   9. שמור את הדגימה בטמפרטורת החדר עד שכל הניתוחים יושלמו.
      הערה: אין לעלות על 3 שעות בין איסוף הרקמות להתחלת עיכול אנזימטי כדי למזער אובדן חיוניות התאים.
4. אשר השראה לתת-פעילות של בלוטת התריס
   1. אסוף דגימת כבד קטנה (כ-50 מ"ג) מכל עכבר.
   2. כימות ביטוי mRNA של Dio1 כבדי באמצעות תגובת שרשרת פולימראז הפוכה בזמן אמת והשווה אותו לבקרות אוטירואידים לא מטופלות (איור 1B).
      הערה: הגדיר השראה מוצלחת לתת-פעילות של בלוטת התריס כהפחתה של לפחות 50% בביטוי Dio1 בכבד ביחס לבקרות של אוטירואיד. ביטוי Dio1 מתאם באופן חיובי עם רמות TH במחזור²⁹; לכן, ביטוי Dio1 מופחת מאשר השראה מוצלחת של תת-פעילות בלוטת תריס.
5. איסוף רקמות חוזר
   1. חזור על שלבים 2.2–2.4. עד שנאספו ALs מ-12 עכברים.
   2. המשיכו מיד לשלב 3.

איור 2. הכנת תלייה חד-תאית מהיפופיזה הקדמית של העכבר. (א) תהליך עבודה המדגים דיסקציה של האונה הקדמית (AL), דיסוציאציה אנזימטית, והכנת תלייה חד-תאית למיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS). תהליך העבודה כולל הסרת האונה האחורית, עיכול קולגנאז, עיכול טריפסין–אתילנדיאמין טטראצטית (EDTA), וסינון לפני ניתוח FACS. (B) תמונות מייצגות של צביעת צבע חיוניות וספירת תאים אוטומטית של תאי יותרת המוח הקדמיים המנותקים מעכברי אוטירואיד ותת-בלוטת התריס. תפוקת תאים כוללת וריכוז תאים ברי קיימא נדרשים. פס קנה מידה = 200 מיקרון. (C) התפלגות קוטרי תאי יותרת המוח הקדמית לאחר פירוק רקמות והכנה לניתוח FACS במורד הזרם. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו. 

3. הכנת תלייה חד-תאית מעכבר AL

הערה: יש לבצע את ההליך בכ-60 דקות כדי ליצור תלייה חד-תאית מרקמת יותרת המוח הקדמית.

1. הכינו תמיסות עיכול אנזימטיות
   1. הכינו תמיסת קולגנאז 2%
      1. המיס 100 מ״ג קולגנאז מ-Clostridium histolyticum (>125 יחידות עיכול קולגנאז/מ״ג מוצק) ב-4.9 מ״ל ddH₂O.
      2. הוסף 100 מיקרוליטר של 1 מטר HEPES כדי לקבל נפח סופי של 5 מ"ל.
      3. חטא את התמיסה באמצעות פילטר של 0.22 מיקרון.
      4. מחלקים את התמיסה לנפחים של 200 מיקרוליטר ואחסנו בטמפרטורה של −30°C עד חודשיים.
         הערה: הימנעו ממחזורי הקפאה והפשרה חוזרים. אל תשתמש שוב באליקוות קולג'נאז מופשרות.
   2. הכינו 0.25% טריפסין–אתילנדיאמין טטראצטית (EDTA)
      1. מערבבים 1 מ"ל של 0.5% טריפסין–EDTA עם 1 מ"ל HBSS ללא Ca^{2+ ו-Mg 2+}.
      2. אחסן את התמיסה בטמפרטורה של 4°C עד השימוש.
         הערה: השתמש בתמיסת טריפסין–EDTA מדוללת ביום ההכנה. אין לאחסן או להשתמש מחדש בטריפסין–EDTA מדולל.
2. בצע עיכול קולגנאז
   1. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת קולגנאז 2% לרקמות AL שנאספו.
   2. ערבבו את הרקמה בעדינות על ידי פיפטינג עם מיקרופיפטה P1000 עם קצות החזקה נמוכים.
   3. דגור את המתלה באמבט מים של 37°C למשך 15 דקות.
      הערה: שמור על פקק הצינור סגור במהלך הדגירה כדי למזער זיהום.
   4. הקישו בעדינות על הצינור כל 5 דקות במהלך הדגירה.
3. בצע עיכול דאוקסיריבנוקלאז I (DNase I)
   1. הוסף 5 מיקרו-ליטר DNase I (1 U/μL) ישירות למתלה מבלי להסיר את הסופרנאנט.
   2. הקישו בעדינות על הצינור 10 פעמים כדי לערבב את התמיסה.
   3. החזק את המתלה ב-37°C למשך 5 דקות.
4. פלט את הרקמה
   1. צנטריפוגה את המתלה ב-100 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. הסר את הסופרנטנט בזהירות באמצעות פיפטה של 1 מ"ל.
      הערה: השאירו כ-50 מיקרוליטר נוזל שאריתי מעל הכדור במהלך הסרת הסופרנטנט כדי למזער אובדן תאים.
5. בצע עיכול טריפסין
   1. הוסף 2 מ"ל של 0.25% טריפסין–EDTA לכדור.
   2. יש לדגור את התלייה בטמפרטורה של 37°C למשך 10–15 דקות עד שלא יישארו שברי רקמה שלמים נראים לעין.
      הערה: אין לעלות על 15 דקות כדי למנוע עיכול רקמתי מופרז והפחתת חיוניות התאים.
6. עצור את העיכול האנזימטי ופירוק הרקמה
   1. הוסף 2 מ"ל CM כדי לעצור את הטריפסיניזציה.
   2. מרים בעדינות את המתלה למעלה ולמטה 10–20 פעמים באמצעות מיקרופיפטה שמכוונת ל-1 מ"ל עד שאין שברי רקמה נראים לעין.
      הערה: השתמש בקצות פיפטה עם החזקה נמוכה במהלך דיסוציאציה מכנית. תלייה חד-תאית מקובלת היא מתלה אחיד בעל צמיגות נמוכה המכיל בעיקר תאים בודדים עם מינימום אגרגטים או פסולת נראים לעין (≤5%–10% גושים בבדיקה מיקרוסקופית באמצעות הוצאת טרייפן בלו).
7. אסוף את המתלה החד-תאי
   1. צנטריפוגה את המתלה ב-100 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. הסר בזהירות את הסופרנטנט.
   3. המשיכו מיד לשלב 4.
      הערה: התחל בצביעה תוך 15 דקות מהכנת תלייה חד-תאית ומיין תאי מלא תוך שעה ככל האפשר. שמרו על התאים על הקרח במהלך תקופה זו כדי למזער אובדן חיוניות.

4. צביעה למיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה

הערה: יש לבצע את ההליך תוך כ-60 דקות כדי לצבוע תאי יותרת המוח הקדמיים המנותקים עבור FACS של תאי CD90 חיוביים.

1. הכינו את מתלה התא
   1. הוסף 350 מיקרוליטר בופר צביעה הכולל מלח מפוזר פוספט (PBS, 1×) המכיל 2% FBS ו-0.09% נתרן אזיד לכדור התא.
   2. החזר את הכדור בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים באמצעות מיקרופיפטה P1000 המצוידת בקצוות עמידה נמוכה כדי לקבל מתלה חד-תאים.
   3. העבר את המתלה לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל עם חיבור נמוך.
2. קביעת ריכוז התאים ויכולת היתכנות
   1. הסר אליקוט של 5 מיקרולטר מהמתלה לצורך ספירת תאים.
   2. מערבבים את האליקווט עם צבע חיוניות של 5 מיקרוליטר.
   3. טעין 10 מיקרוליטר מהתערובת לתוך מונה תאים אוטומטי.
      הערה: המשיכו ל-FACS כאשר עמידות התאים היא ≥85% כפי שנקבעת על ידי הדרת צבע חיוני וכאשר נצפים פסולת ואגרגטים מינימליים של תאים.
   4. אשר כי ריכוז התאים הכולל הוא כ-1 ×-10⁷ תאים/מ"ל לדגימות אוטירואיד ו-2 ×^{10 7} תאים/מ"ל לדגימות תת-פעילות בלוטת תריס (איור 2B). התפלגות גודל התא לאחר דיסוציאציה מוצגת באיור 2C.
3. הכנת בקרות פיצוי
   1. העבר 50 מיקרוליטר מתליית התא לבופר צביעה של 300 מיקרוליטר.
   2. חלק את המתלה לשלושה אליקוטים של 100 מיקרוליטר בצינורות מיקרוצנטריפוגה נפרדים בנפח 1.5 מ"ל.
   3. הכינו את הביקורת הבאות: (i) ביקורת לא מוכתמת, (ii) בקרה עם יודיד פרופידיום (PI) בלבד, ו-(iii) פיקואריתרין-ציאנין 7 (PE-Cy7) בקרה CD90.2 בלבד.
4. לצבוע את התאים
   1. הוסף 3 מיקרוליטר נוגדן אנטי-CD90.2 מצורף PE-Cy7 ל-300 מיקרוליטר תאי השעשה.
      הערה: ריכוז הנוגדנים נקבע על ידי ניסויי טיטרציה קודמים. דילול סופי של 1:100 סיפק הפרדה מיטבית בין אוכלוסיות חיוביות ושליליות תוך הפחתת צביעת רקע.
   2. הוסף 1 מיקרוליטר נוגדן לבקרת הפיצוי CD90.2 כדי לקבל דילול סופי של 1:100.
   3. דגרו את כל הדגימות על קרח בחושך למשך 30 דקות.
      הערה: ערבבו דגימות בעדינות כל 10 דקות במהלך הדגירה כדי לשמור על צביעה הומוגנית.
5. שטוף את התאים המוכתמים
   1. הוסיפו 1 מ"ל בופר לצביעה קרה לכל צינור.
   2. צנטריפוגה את הדגימות ב-210 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: אם זמין, כבה את בלם הצנטריפוגה כדי למזער הפרעה לכדור התא במהלך ההאטה.
   3. הסר והשליך את הסופרנטנט בזהירות.
6. להחזיר את התאים המוכתמים
   1. החזירו את המתלה של התא הראשי בבופר צביעה של 300 מיקרוליטר.
      הערה: הוסף PI מיד לפני המיון לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל.
   2. החזירו כל בקרת פיצוי בבופר צביעה של 100 מיקרוליטר.
7. סנן את מתלה התא
   1. מסנן את תליית התא דרך צינור ציטומטריית זרימה המצויד במסננת תא 35 מיקרון מיד לפני המיון.
8. המשך למיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה
   1. המשך מיד לשלב 5 ומיין את התאים המוכתמים באמצעות מיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה.

5. אסטרטגיית מיון ושערים של FACS

הערה: יש לבצע הליך זה בכ-60 דקות כדי לבודד תירוטרופים חיוביים ל-CD90.2 על ידי FACS.

1. הגדר את מיון התאים
   1. התקן פיה של 100 מיקרון על מיון התאים.
   2. הגדר את לחץ המעטפת ל-20 psi.
      הערה: השתמשו בנוזל מעטפת סטרילי מבוסס PBS המנוהל בטמפרטורת החדר.
2. ביצוע בקרת איכות כלי נגינה
   1. הרץ נהלי בקרת איכות של המכשירים בהתאם להוראות היצרן לפני רכישת הדגימה.
      הערה: ייתכן שתהליכי בקרת איכות מומלצים על ידי היצרן במערכות מיון תאים חלופיות.
   2. אמת את עיכוב הנפילה ויציבות הזרם באמצעות חרוזי כיול.
3. ביצוע פיצוי פלואורסצנציה
   1. רכוש בקרות פיצוי בצבע יחיד.
   2. בצע פיצוי פלואורסצנציה לפני השער ומיון.
      הערה: חשב את הפיצוי באמצעות בקרות לא מוכתמות ובודדות. בדוק והתאים ידנית את מטריצות הפיצוי לפני המיון כשצריך.
4. הגדר את אסטרטגיית השער
   1. החריגו פסולת באמצעות פרמטרים של פיזור קדמי ופיזור צד (איור 3A,B).
   2. תאי שער בודדים באמצעות גובה פיזור קדימה לעומת שטח פיזור קדימה וגובה פיזור צדדי לעומת שטח פיזור צדדי (איור 3A,B).
   3. להוציא תאים מתים על ידי סגירת תאי PI שליליים.
   4. תאי Gate CD90.2 חיוביים להעשרת תירוטרופ.
      הערה: הגדירו תאים חיוביים ל-CD90.2 כאירועים המציגים עוצמת פלואורסצנציה גבוהה מ-10³ בערוץ גילוי CD90 (איור 3C–F).
5. הכינו צינורות איסוף
   1. הכינו צינורות איסוף בהתאם ליישום המתוכנן במורד הזרם.
      הערה: מלאו מראש צינורות איסוף בעלי שימור נמוך עם תגובת ניתוח QIAzol של 1 מ"ל לבידוד RNA או ב-Medium 199 בתוספת 10% סרום בקר עוברי חסר פחם ליישומים של תרבית תאים.
6. מיין תירוטרופ חיובי CD90.2
   1. מיין תאים בודדים חיוביים CD90.2 לצינורות איסוף.
   2. איסוף תאים לניתוח RNA
      1. אסוף תאים ישירות לתוך תגובת ליזיס של 1 מ"ל.
      2. מערבולת את הצינורות למשך דקה אחת כדי לעבור את התאים.
      3. הקפיאו את הדגימות מיד על קרח יבש.
      4. אחסן את הדגימות בטמפרטורה של −80°C עד להוצאת ה-RNA.
   3. איסוף תאים לתרבות ראשונית
      1. אסוף תאים למדיום תרבית בתוספת 10% סרום בקר עוברי מפוחם ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
      2. זרע את התאים לתוך תאי זכוכית עם 8 בארות בצפיפות של לפחות 2 ×^{10 5} תאים לבאר בנפח סופי של 200 מיקרוליטר.
      3. תרבית התאים עד 72 שעות ב-37°C באינקובטור לח המכיל 5% CO₂.
         הערה: ביצועי תרבית מקובלים מיועדים על ידי הצמדה נראית לעין בתוך 24 שעות, יעילות התקשרות של כ-60%–80%, ו-≥70%–80% חיוניות לאחר 72 שעות.
      4. הוסף 100 ננומטר T3 למדיום התרבית כשצריך.
         הערה: התחילו טיפול ב-T3 לאחר חיבור התאים, בדרך כלל 24 שעות לאחר הציפוי, ושמרו על הטיפול עד לאיסוף הדגימה ב-72 שעות. הכינו תמיסת T3 במלאי של 40 מ"מ NaOH וכללו את הבקרות המטופלות ברכב בריכוז הממס הסופי הזהה.
         הערה: סרום ללא פחם שומר על סביבה של תרבית דלה מ-TH ומשפר את זיהוי דיכוי ביטוי Tshb התלוי ב-T3 שנגרם בניסוייה.

איור 3. אסטרטגיית שער FACS ואימות העשרת תירוטרופים. (א,ב) אסטרטגיית שער סדרתית משמשת לבידוד תאי יותרת המוח הקדמיים יחידים ברי קיימא. שערים כוללים הוצאת פסולת באמצעות שטח פיזור קדמי (FSC-A) ושטח פיזור צדדי (SSC-A), הבחנת סינגלטים באמצעות גובה פיזור קדמי (FSC-H) לעומת FSC-A וגובה פיזור צד (SSC-H) לעומת SSC-A, והשלמת תאים מתים חיוביים ליודיד פרופידיום (PI). (C–F) גרפים מייצגים של FACS המראים זיהוי והעשרה של אוכלוסיות תאים חיוביים ל-CD90.2 ו-CD90.2 שליליים באמצעות נוגדן אנטי-CD90.2 מצורף ל-phycoerythrin-cyanine 7 (PE-Cy7). (G–I) אימות ריברסיבציה כמותית של תגובת שרשרת פולימראז (RT-qPCR) של העשרת תירוטרופ באוכלוסיות תאים ממוינות. קיצורים: FSC-A, אזור פיזור קדמי; SSC-A, אזור פיזור צדדי; FSC-H, גובה פיזור קדמית; SSC-H, גובה פיזור צד; PI, פרופידיום יודיד; PE-Cy7, פיקואריתרין–ציאנין 7; נוירוטיפ, לא מטופל. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

6. ניתוח ביטוי גנים של mRNA ל-Tshb בתאים חיוביים ל-CD90 לעומת תאי CD90 שליליים באמצעות תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת

הערה: יש לבצע את ההליך בכ-5 שעות כדי לכמת את ביטוי ה-mRNA של Tshb באוכלוסיות תאים ממויינות.

1. איסוף תאים ממוינים לצורך חילוץ RNA
   1. אסוף מספר שווה של תאי CD90 חיוביים ותאי CD90 שליליים (2.5 × 10⁵ תאים) לצינורות נפרדים בנפח 1.5 מ"ל המכילות 1 מ"ל ריג'נט ליזיס.
2. לייז את התאים
   1. סחרור את הדגימות בעוצמה במשך דקה אחת כדי לעבור את התאים לגמרי ומניח אותן על קרח.
      הערה: יש לאחסן דגימות מפורקות בטמפרטורה של −80°C לפני חילוץ ה-RNA במידת הצורך.
3. הפקת RNA כולל
   1. חלץ RNA כולל לפי הוראות היצרן שסופקו עם ערכת חילוץ ה-RNA.
      הערה: יש לבצע עיכול DNase במהלך הטיהור באמצעות DNase I ללא RNase בהתאם להוראות היצרן להסרת שאריות חומצה גנומית דאוקסיריבונוקלאית (DNA) לפני השחרור.
   2. למדוד ריכוז RNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
      הערה: השתמשו בדגימות עם יחס A260/A280 של כ-1.8–2.1 ויחס A260/A230 גבוה מ-1.8 לסינתזת DNA משלים (cDNA).
4. סינתז cDNA
   1. סינתז cDNA מ-RNA כולל של 100 ng לפי הוראות היצרן המסופקות עם ערכת סינתזת cDNA לגדיל הראשון.
      הערה: השתמש בפריימרים אוליגו(dT) במהלך סינתזת cDNA.
   2. הכינו את תערובת התבנית-פריימר לפי טבלה 1.
   3. ערבבו בעדינות את החומרים והפכו בצנטריפוגה לזמן קצר כדי לאסוף את הדגימה בתחתית הצינור.
   4. דנאטור את תערובת התבנית-פריימר בטמפרטורה של 65°C למשך 10 דקות.
   5. מקרר את הדגימות מיד על הקרח.
   6. הכינו את תערובת תגובת השעתוק ההפוכה לפי טבלה 2 כדי לקבל נפח סופי של 20 מיקרוליטר.
      הערה: הכינו תערובת מאסטר על ידי כפלת נפחי המגיב המפורטים בטבלה 2 במספר הדגימות הכולל והוספת נפח עודף של 10% נוספים כדי להתחשב בשונות הפיפטינג.
   7. מערבבים את התגובה בעדינות בלי מערבולת וצנטריפוגה לזמן קצר.
   8. דגרו את התגובה בטמפרטורה של 50°C למשך 60 דקות.
   9. השבית את התגובה בטמפרטורה של 85°C למשך 5 דקות.
   10. קרר את הדגימות על הקרח.
   11. המשיכו ישירות לתגובת שרשרת פולימראז כמותית עם שעתוק הפוך (RT-qPCR) או אחסנו את ה-cDNA בטמפרטורה של −30°C עד לשימוש.
       הערה: cDNA יכול להישמר בטמפרטורה של −30°C עד 6 חודשים בתנאים ללא נוקלאז. הימנעו ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים.
       הערה: בצע שלבי סינתזת cDNA בתרמחזור המצויד במכסה מחומם כדי למזער את האידוי.
5. הכינו את תערובת התגובה RT-qPCR
   1. הכינו את תערובת התגובה RT-qPCR לפי טבלה 3.
6. טעין את לוחית RT-qPCR
   1. יש להוסיף תערובת תגובת RT-qPCR של 9 מיקרוליטר לכל באר של לוח עם 96 בארות.
   2. הוסף תבנית cDNA של 1 מיקרוליטר המתאימה למכפלה המתועתקת הפוך שנוצרה מ-5ng של RNA כולל קלט.
   3. מערבבים את הדגימות בעדינות וצנטריפוגה לזמן קצר.
7. בצע RT-qPCR
   1. בצע RT-qPCR לפי הוראות היצרן המסופקות עם תערובת המאסטר של SYBR Green.
      הערה: השתמשו בצעד הניקוי הראשוני של 95°C למשך 2 דקות, ואחריו 40 מחזורים של 95°C למשך 5 שניות ו-60°C למשך 30 שניות. רכוש פלואורסצנציה בסוף כל שלב הארכה. בצע ניתוח עקומת התכה מ-65°C עד 95°C במרווחים של 0.5°C כדי לאמת הגברה של מוצר יחיד.
8. נרמול ביטוי Tshb
   1. נרמול ביטוי Tshb לביטוי ציקלופילין A (CyA) באמצעות שיטת ΔCt.
      הערה: אימות יציבות CyA לפני ניתוח על ידי אישור שונות מינימלית ב-Ct בין קבוצות ניסוי.
9. חישוב ביטוי גנים יחסי
   1. חשב ביטוי יחסי של Tshb בתאים חיוביים ל-CD90 ביחס לתאים שליליים ל-CD90 באמצעות שיטת 2^−ΔΔCt .
      הערה: בצע ניתוח RT-qPCR באמצעות שמונה דגימות ביולוגיות, כל אחת מנותחת בתגובות טכניות כפולות (איור 3G–I).

ריאגנט	כרך	כמות/ריכוז סופי
RNA כולל	משתנה	100 נגרם
פריימר אוליגו(dT)18 מעוגן (50 pmol/μL)	1 מיקרוליטר	2.5 מיקרומטר
מים בדרגת PCR	משתנה	כוון לנפח כולל של 13 מיקרוליטר
סך הכל	13 מיקרוליטר	—

טבלה 1: הכנת תערובת תבנית–פריימר לסינתזת חומצות דאוקסיריבונוקלאית משלימה. תגובות, נפחים וכמויות סופיות ששימשו להכנת תערובת התבנית-פריימר לסינתזה משלימה של חומצה דאוקסיריבונוקלאית (cDNA). כל תגובה הכילה 100 ng חומצה ריבונוקלאית כוללת (RNA), פריימר מעוגן אוליגו(dT)18, ומים בדרגת PCR (תגובת שרשרת פולימראז) שהותאמו לנפח סופי של 13 מיקרוליטר. הריכוז המדווח של 2.5 מיקרומום מתייחס לריכוז הפריימר בתערובת התבנית-פריימר של 13 מיקרוליטר לפני הוספת רכיבי תגובת השעתוק ההפוכה.

ריאגנט	כרך	כמות/ריכוז סופי
בופר תגובת טרנסקריפטאז הפוך (5×)	4 מיקרוליטר	1×
מעכב RNase מגן (40 U/μL)	0.5 מיקרוליטר	20 U
תערובת דאוקסינוקלאוטידים (10 מילימטר כל אחד)	2 מיקרוליטר	1 מילימטר כל אחד
טרנסקריפטאז הפוך לטרנסקריפטור (20 U/μL)	0.5 מיקרוליטר	10 U
תערובת תבנית–פריימר (טבלה 1)	13 מיקרוליטר	—
סך הכל	20 מיקרוליטר	—

טבלה 2: תערובת תגובת שעתוק הפוך לסינתזת חומצות דאוקסיריבונוקלאית משלימה. תגובות, נפחים וריכוזים סופיים המשמשים לסינתזת חומצה דיאוקסיריבנוקלאית משלימה (cDNA) של גדיל ראשון. נפח התגובה הסופי היה 20 מיקרוליטר. הריכוזים המדווחים של טריפוספט דאוקסינוקלאוטידים (1 מילימטר כל אחד) מתייחסים לריכוזים הסופיים בתערובת התגובה המלאה.

ריאגנט	כרך	כמות/ריכוז סופי
PowerTrack SYBR Green Master Mix (2×)	5 מיקרוליטר	1×
פריימרים קדמיים ואחוריים של Tshb (ראו טבלת חומרים)	0.5 מיקרוליטר	400 ננומטר
מים בדרגת PCR	3.5 מיקרוליטר	כוון לנפח תגובה של 9 מיקרו ליטר
נפח תגובה תת-כולל	9 מיקרוליטר	—
תבנית cDNA	1 מיקרוליטר	5 נגרם
נפח התגובה הסופי	10 מיקרוליטר	—

טבלה 3: הכנת תערובת תגובת שרשרת פולימראז כמותית בתהליך שעתוק הפוך. תגובות, נפחים וריכוזים סופיים המשמשים להגברת תגובת שרשרת פולימראז כמותית (RT-qPCR) של חומצה ריבונוקלאית שליח Tshb (mRNA). נפח תערובת התגובה לפני הוספת התבנית היה 9 מיקרוליטר. הוסף 1 מיקרוליטר תבנית חומצה דאוקסיריבונוקלאית משלימה (cDNA) מיד לפני ההגברה כדי לקבל נפח תגובה סופי של 10 מיקרוליטר.

תוצאות

שנים-עשר עכברים בני 8 שבועות עם C57BL/6 (6 זכרים ו-6 נקבות) טופלו ב-MMI ו-KClO₄ במי שתייה יחד עם תזונה דלה ביוד למשך שבוע אחד כדי לגרום לתת-פעילות בלוטת התריס (איור 1A). ביטוי ה-mRNA של Dio1 בכבד מסוג 1 נמדד בעכברים של אאותירואיד ותת-פעילות בלוטת התריס כדי לאשר השראה מוצלחת של תת-פעילות בלוטת התריס²⁹. עכברים עם תת-פעילות בלוטת התריס הראו ירידה של כ-60% בביטוי mRNA של Dio1 בכבד בהשוואה לביקורת של אוטירואיד, מה שמאשר ה...

דיון

פרוטוקול ה-FACS המבוסס על CD90 המתואר כאן מספק שיטה ניתנת לשחזור להעשרת תירוטרופ ראשוני מרקמת יותרת המוח של עכבר בוגר, תוך שמירה על תגובתיות הורמונלית. שיטה זו מתמודדת עם מגבלה טכנית ארוכת שנים בלימוד ביולוגיית התירוטרופ וויסות ציר ה-HPT. היסטורית, מחקרים על ויסות התירוטרופ הסתמכו רבות על קו התאים TαT1; עם זאת, תאי TαT1 מציגים ביטוי בסיסי נמוך מאוד של Tshb ואינם מראים באופן עקבי דיכוי קנוני המתוווך על ידי T3, מה שמגביל את הרלוונטיות הפיזיולוגית^{שלהם 14,15,20}

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.22 µm פילטר	Corning	430769	לסטריליזציה של מדיום האיסוף
מסנן מזרק 0.22 µm	Pall Life Sciences	PN4602	לסטריליזציה של קולגנאז
0.5% Trypsin–EDTA	Gibco	15400-054	לניתוק תאים
צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל נמוכי קשירה	Invitrogen	AM12450	לצביעת FACS
צינורות פוליפרופילן 15 מ"ל	Falcon	352097	לאיסוף האונות הקדמיות ולניתוק תאים
מחט 23-גאוג'	BD Vacutainer Safety-Lok	367283	לחדירה לבבית
תא זכוכית 8-רווחים	Millipore	PEZGS0816	לתרבית פוסט-FACS
חרוזי Accudrop	BD Biosciences	345249	לכיול עיכוב טיפה במהלך FACS
נוגדן PE-Cy7 אנטי-עכברי anti-CD90.2	Invitrogen	25-0902-82	לצביעת FACS
מונה תאים אוטומטי	DeNovix	s-10700	לספירת תאים
סרום עוברי בקר חסר פחם	Gibco	12676029	לתרבית פוסט-FACS של תאים תירוטרופים
קולגנאז מ-Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9263	לניתוק תאים
מגש איסוף	מגש ניתוח מעבדה סטנדרטי	N/A	לחדירה לבבית
תמיסת מלח HEPES מחוץ לרכב מוכנה מראש (HBSS) ללא Ca2+ ו-Mg2+	N/A	N/A	לחדירה ולניתוק תאים
פריימר אוליגונוקלאוטיד Cyclophilin A (CyA) קדימה	Integrated DNA Technologies	5′-GCC GAT GAC GAG CCC TTG-3′	ל-RT-qPCR
פריימר אוליגונוקלאוטיד Cyclophilin A (CyA) לאחור	Integrated DNA Technologies	5′-TGC CGC CAG TCG CAT TAT-3′	ל-RT-qPCR
DMEM, 1×	Gibco	11965-092	למדיום איסוף
תמיסת DNase I	Promega	M6101	לניתוק תאים
זריקת Enoxaparin נתרן	Sandoz	0781-3119-64	לחדירה
סרום עוברי בקר (FBS)	Cytiva HyClone	SH30088.02HI	למדיום איסוף
חיץ צביעת ציטופלומטריה	Invitrogen	00-4222-26	לצביעת FACS
מחזיק המופסטט	Fine Science Tools	13008-12	ליציבות חלל החזה
HEPES, 1 M	Gibco	15630-080	למדיום איסוף
HEPES, 1 M	Teknova	H1035	להכנת HBSS
דיאטה חסרת יוד	Envigo	TD.95007	להשראת תת-תפקוד בלוטת התריס חיות
מלקטות קשתית	Fine Science Tools	11065-07	לניתוח בלוטת היות
Isoflurane	Piramal Critical Care	66794-017-25	להרדמה
L-גלוטמין	Gibco	35050-061	למדיום איסוף
מדיום 199	Gibco	11150-059	לתרבית פוסט-FACS
Methimazole (MMI)	Sigma-Aldrich	M8506-100G	להשראת תת-תפקוד בלוטת התריס חיות
צלחת תגובה 96-בורות MicroAmp Fast	Applied Biosystems	4346907	ל-RT-qPCR
פניצילין–סטרפטומצין	Gibco	15140122	לתרבית פוסט-FACS
משאבת פריסטלטית	Fisher Scientific	GP1000	לחדירה לבבית
אשלגן פרכלורט (KClO4)	Sigma-Aldrich	241830-500G	להשראת תת-תפקוד בלוטת התריס חיות
ערכת PowerTrack SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A46109	ל-RT-qPCR
Propidium iodide	eBioscience	00-6990-50	לצביעת חיוניות במהלך FACS
חומר הרפיה QIAzol	Qiagen	79306	להפקת RNA
צינור סיליקון	Cole-Parmer	EW-96410-13	לחדירה לבבית
סטריאומיקרוסקופ	Nikon	SMZ-745T	לניתוח בלוטת היות
מערכת StepOnePlus Real-Time PCR	Applied Biosystems	4376600	ל-RT-qPCR
כף ניתוח	Fine Science Tools	10090-13	להחזקת המוח במהלך חשיפת בלוטת היות
ערכת Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit	Roche	4379012001	להכנת cDNA
Trypan Blue	Thermo Fisher Scientific	T10282	לספירת תאים
פריימר אוליגונוקלאוטיד Tshb קדימה	Integrated DNA Technologies	5′-TCT GTG CTG