מדידת השפעות התרכובות הפרמקולוגיות על מורפולוגיית המיטוכונדריה במודלים של הזדקנות עכברים

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטות למדידת השפעות התרופות הניתנות באמצעות מיני-משאבות אוסמוטיות להשתלה על מורפולוגיית המיטוכונדריאלית במודלים של עכברים מזדקנים. מתבצעת הדמיה קונפוקלית תלת-ממדית (3D) ברזולוציה על-גבוהה של כבד עכברים, ופותחה מסלול לסגמנטציה בלתי מוטה, סיווג וניתוח כמותי של מבנים מיטוכונדריאליים.

תקציר

הצטברות נזק מולקולרי הקשור להזדקנות יכולה לתרום לשינויים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית ובתפקוד מטבולי לקויה, במיוחד ברקמות עם השקעת אנרגיה גבוהה. תרכובות פרמקולוגיות שמשפרות תפקוד מטבולי לקוי ומשקמות מורפולוגיות מיטוכונדריות בריאות ו'צעירות' עשויות אפוא לייצג דרכים יעילות להארכת תוחלת הבריאות (כלומר, החלק מהחיים החופשי מעומס מחלות כרוניות הקשורות להזדקנות) ביונקים. כאן מתוארות שיטות לביצוע השתלות משאבות אוסמוטיות תת-עוריות בעכברים מבוגרים לצורך אספקה יציבה של תרכובות פרמקולוגיות הידרופוביות. לאחר מכן, הרקמות מקובעות, מקריאות, צובעות, ומודמות באמצעות מיקרוסקופיית אור קונפוקלי ברזולוציה על. לבסוף, מוצג צינור אוטומטי לסגמנטציה תלת-ממדית, סיווג ומדידה כמותית של מבני מיטוכונדריה. לכן, שיטות אלו עשויות להיות שימושיות להערכת כמותית של שינויים במבנה התלת-ממדי של מיטוכונדריה ברקמות שונות לאורך חיי העכבר. יתרה מזאת, טכניקות אלו עשויות לסייע בזיהוי חוזר של תרופות מולקולות קטנות שמפחיתות תפקוד מטבולי לקוי הקשור להזדקנות.

מבוא

מיטוכונדריה הן אברונים כפולים הקשורים לממברנה, המאורגנים במרחב-זמן כדי להתאים לדרישות המטבוליות הנוכחיות של תא המארח והרקמה^שלהם. אינפליקטציות בממברנה הפנימית, הנקראות קריסטה, נוצרות ומאורגנות באמצעות תיאום דינמי בין פוספוליפידים פנימיים שאינם דו-שכבתיים כמו קרדיוליפין ופוספטידילאתנולאמין, שורות של דימרים של ATP סינתאז בקצות הקריסטה, אוליגומרים קושרי קרדיולפין של אטרופי אופטי 1 (OPA1) דמויי דינמין GTPase בראש הקריסטה, וקומפלקסים של אתר מגע מיטוכונדריאלי ומערכת ארגון קריסטה (MICOS) בצמתים¹. מבני הממברנה הפנימית הללו מחלקים את המיטוכונדריה ליחידות פונקציונליות בודדות² ומספקים שטח פנים מוגבר שבו קומפלקסי הנשימה המייצרים פוטנציאל טרנסממברנלי מיטוכונדריאלי יכולים להתאסף¹. כאברונים דינמיים עם פונקציות תאיות משניות הקשורים לאיתות אפופטוטי³, Ca²⁺ וההומאוסטזיס של מיני חמצן תגובתי³, וביוסינתזה של שומנים⁴, מבנים מורפולוגיים של מיטוכונדריה רגישים מאוד לשינויים סביבתיים כגון ירידה בזמינות החמצן⁵ ושחרור מוגבר של Ca²⁺ מהרשת האנדופלזמית ^6,7.

הצטברות נזק מולקולרי תורמת לשינויים במבנה ותפקוד המיטוכונדריה במהלך גיל⁸. מחקרים פורצי דרך של טומוגרפיית קריו-אלקטרון (קריו-ET) שנערכו על ידי קבוצת קילברנדט במספר אורגניזמים מודליים הראו מתאם ברור בין צפיפות הקריסטה ליכולת הנשימה, וכן ירידה תלויה בגיל בצפיפות הקריסטה ואובדן נלווה של דימרים סינתאז^{ATP 9,10}. יתרה מזאת, שינויים בנפח המיטוכונדריה יכולים לנבוע מפגיעה בדינמיקת ביקוע ומיזוג¹¹, הצטברות שומנים מוגברת¹², ועלייה בנפיחות¹³. בשריר שלד, VO₂ max, שהוא מנבא חזק לתוחלת החיים^14,15, ניתן לחיזוי מדויק בהתבסס על מידת פיצול מיטוכונדריה בין-מימיופיברילית וצפיפות^{קריסטה 16}.

לא מפתיע ששינויים מבניים ותפקודיים הקשורים להזדקנות במיטוכונדריה יכולים לתרום לפתוגנזה של מספר מחלות כרוניות 17,18,19,20. פיצול מיטוכונדריאלי מוגבר ושינויים בביוגנזה ובמורפולוגיה של המיטוכונדריה קשורים הן למחלת אלצהיימר והן^למחלת פרקינסון. שינויים אלו גורמים להפרעות במורכבי הזרחון החמצוני, הפוגעים ביצירת כוח המניע של הפרוטונים ומובילים לייצור יתר של מיני חמצן תגובתי 20,21,22. בתפקוד לבבי לקוי ובאי ספיקת לב הקשורה להזדקנות, פיצול מיטוכונדריאלי מוגבר, נפיחות, ואוקווליזציה ואובדן צפיפות הקריסטה תורמים לירידה בייצור ATP^23,24. שינויים מבניים אלו עשויים להיות קשורים בחלקם לשינוי בטיפול ב-Ca²⁺ של המיטוכונדריאלי ולפעילות מוגברת של נקבובית המעבר לחדירות המיטוכונדריאלית 6,7,13,25. כגורם מווסת לכאורה למיטופגיה, פתיחה מופרזת של נקבוב מעבר החדירות במהלך ההזדקנות עלול להיות הרסני ולהוביל למוות תאים בלתי מבוקר¹³. לבסוף, ידוע כי ליקויים הקשורים להזדקנות במטבוליזם השומנים של המיטוכונדריה ובמיטופגיה יכולים גם הם לתרום^{להתפתחות} מחלת כבד שומני שאינה אלכוהולית. בפרט, סטטוזה כבדית הוכחה כמלווה בעלייה בלחץ חמצוני ובהיווצרות מוגברת של מבנים מיטוכונדריאליים דמויי סופגניה ^3,27.

כתוצאה מכך, יש עניין רב בפיתוח טיפולים המתמקדים בירידות בתפקוד המיטוכונדריה הקשורות להזדקנות כדי לשפר את איכות החיים של אנשים הסובלים ממחלות כרוניות מסוימות. Forzinity (אלמיפרטיד), פפטיד אינטראקטיבי עם שומנים שמפחית את פוטנציאל פני השטח הפנימי^{של הממברנה 28} ומעלה את דור ATP המיטוכונדריאלי^29,30, הפך לאחרונה לתרופה הראשונה שאושרה על ידי ה-FDA המיוקדת למיטוכונדריה לטיפול בתסמונת ברת'. תסמונת ברת' היא הפרעה הקשורה ל-X שבה פגמים בשיקום קרדיוליפין תורמים לקרדיומיופתיה, חולשת שרירי השלד ותמותה מוקדמת^. למרות שטיפול קצר טווח לא הצליח לעורר שינויים ניתנים לזיהוי בגיל הביולוגי של השרירים בעכברים^{מבוגרים 32}, טיפול באלאמיפרטיד הראה שיפורים חוזרים בפרמטרים התפקודיים של ההזדקנות, כגון שבר הפליטה הלבבית ומתח אורך גלובלי^32,33, עייפות שרירים ויצירת כוח 33,34,35, ושבריריות ³². אורוליטין A, אלגיטנין שמקורו במעיים שגורם למיטופאגיה³⁶, הראה גם שיפורים קליניים בסיבולת וכוח השרירים האירוביים^37,38, בנוסף להשפעות חיוביות על תפקוד לקוי של הלב בעכברים וחולדות מבוגרים במודלים של אי ספיקת לב מושרה³⁹. מטפורמין, תרופה אנטי-סוכרתית שהוכחה כמגיבה עם קומפלקס I⁴⁰, הוצע גם כחיקוי חלקי של הגבלת קלוריות^41,42. עם זאת, בעוד שטיפול במטפורמין נקשר להפחתת הסיכון לסרטן ולעיכוב בירידה קוגניטיבית בנתונים אפידמיולוגיים קודמים^43,44, השפעותיו על תוחלת החיים והבריאות אצל חולים שאינם סוכרתיים עדיין פתוחות^. לבסוף, טיפול בניקוטינאמיד ריבוזיד, קדם-NAD+, יכול להעלות את הביוגנזה המיטוכונדריאלית ואת תגובת החלבון הפתוחה של המיטוכונדריה לשיפור ייצור האנרגיה 46,47,48,49, אך הטיפול ארוך הטווח בעכברים UM-HET3 לא השפיע באופן משמעותי על אורך החיים החציוני או ה-90 של העכבר 50.

כאן מתוארות שיטות להכנת רקמות מעכברים מבוגרים שטופלו בתרכובות פרמקולוגיות להדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה של מורפולוגיית מיטוכונדריה. הוכחה השתלה מוצלחת של מיני-משאבות אוסמוטיות למתן תרופות מתמשך בעכברים, ובדיקות כבד לבדיקת השפעות הטיפול על מבנה הממברנה החיצונית. לבסוף, מוצגת צינור ניתוח למדידה כמותית בלתי מוטה, שכפולה של נפח, שטח פנים וספיריות מיטוכונדריאלית, וכן סיווג מיטוכונדריה למבנים שונים. לכן, שיטות אלו ישימות הן ללימוד שינויים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית לאורך חיי היונקים והן לזיהוי תרכובות פרמקולוגיות העשויות למתן ירידות בבריאות מטבולית הקשורה להזדקנות.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים בעלי חיים מחקריים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות לשימוש בבעלי חיים במעבדה ואושרו על ידי וועדות טיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים של בית החולים בריגהם ונשים ובית הספר לרפואה של הרווארד לפי פרוטוקול מס' 2016N000368. חוקרים המעוניינים ליישם פרוטוקול זה במדינות אחרות צריכים להתייעץ עם הגופים המוסדיים והרגולטוריים המקומיים שלהם כדי להבטיח עמידה בתקנות רווחת בעלי החיים החלות.

1. השתלת משאבה אוסמוטית תת-עורית

הערה: ניתוחי בעלי חיים צריכים להתבצע רק על ידי צוות מנוסה ומיומן, ויש לנקוט זהירות רבה כדי לצמצם לחץ וסבל אצל בעלי חיים. בצע הליכים הכוללים בעלי חיים מחקריים רק כפי שמתואר בדיוק בפרוטוקולים מאושרים לבעלי חיים. כל מחקר הכולל שימוש בבעלי חיים צריך להקפיד בקפדנות על 3Rs – החלפה, הפחתה ושיפור. פרוטוקול זה מפרט השתלת משאבה אוסמוטית תת-עורית, המסווגת כניתוח קטן. ניתן גם לבצע השתלות במשאבה אוסמוטית תוך-פריטוניאלית, אך זהו הליך מורכב יותר שמסווג כניתוח מרכזי. לכן, מומלץ לבצע את ההליך התת-עורי אלא אם יש הצדקה מדעית חזקה התומכת בהשתלה תוך-פריטונאלית.

1. מילוי משאבות אוסמוטיות
   הערה: הכנת תמיסות תרופות ומילוי משאבות אוסמוטיות צריכות להתבצע בארון בטיחות ביולוגית בטכניקת סטרילית. יש לבחור מודלים של משאבות על פי נפח המאגר הרצוי ואורך הטיפול. למחקר זה נעשה שימוש בדגם 2004 (~200 מיקרוליטר נפח מאגר, אספקת טיפול למשך 4 שבועות).
   1. הכינו את תמיסת התרופה בממס התואם למשאבות האוסמוטיות. עיין https://alzet.com/formulating-the-solution/. השתמשו בקצב הזרימה (μL/h) המופיע באצווה של משאבות האוסמוטיות המוזמנות כדי לקבוע את ריכוז התרופה הנדרש להשגת המינון היומי היעד.
      הערה: תמיסה של 50% v/v DMSO ו-50% v/v PEG₃₀₀ ממיסה באופן יציב תרכובות הידרופוביות ותואמת למשאבות האוסמוטיות. כל התרכובת(ים) והממס צריכים להיות בדרגת פרמצבטיקה כשאפשר.
   2. סנן את תמיסת התרופה באמצעות מסנן מזרק של 0.22 מיקרון ושמר בטמפרטורת החדר.
   3. הכניסו מתון זרימה למשאבה ודחפו אותו למטה עד שהוא נכנס לצינור מיקרופוג'. אל תדחוף את מודרטור הזרימה עד הסוף.
   4. בצע איזון אנליטי על צינור מיקרופוגה ריק, ואז רשם את משקל המשאבה האוסמוטית.
   5. חבר את צינור המילוי למזרק של 1 מ"ל ומשוך לפחות פי 1.5 מנפח המאגר של המשאבה. הסר בועות אוויר על ידי משיכת הבוכנה כלפי מטה, הפעלת המזרק ודחיפה כלפי מעלה עד שנוזל נוצר בחלק העליון של צינור המילוי.
   6. הסר את מתון הזרימה תוך כדי החזקת המשאבה זקופה.
   7. הכנס את צינור המילוי דרך הפתח שבחלק העליון של המשאבה עד שהוא לא יכול להתקדם יותר.
   8. לחץ לאט את הבוכנה למטה תוך כדי שמירה על המשאבה זקופה. תמשיך למלא עד שהתמיסה תופיע בשקע. לאחר מכן, הסר את צינור המילוי ונגב את התמיסה העודפת במגבון עדין.
   9. הכנס את מתון הזרימה עד שהפקק ישר לחלק העליון של המשאבה.
   10. החזר את המשאבה המלאה לצינור מיקרופוג' ושוקל. קבע את משקל התמיסה ואמת שנפח המילוי הוא לפחות 90% מנפח המאגר (הפרש משקל במיליגרם ≈ נפח במיקרוליטרים).
   11. מלאו צינור קונוסי בנפח 15 מ"ל ב-5 מ"ל של מי מלח סטריליים 1× מופזר-פוספט (PBS) והוסיפו את המשאבה המלאה מראש. אטימו עם שכבת פרפין ופתחו את המשאבה(ות) על ידי דגירה בטמפרטורה של 37°C למשך הזמן הנדרש על ידי דגם המשאבות האוסמוטיות. לדגם 2004, זה 40 שעות.
2. הכנת מלוקסיקאם
   הערה: יש לבצע זאת בארון בטיחות ביולוגית בטכניקת סטרילית. Meloxicam, תרופה אנטי-דלקתית שאינה סטרואידית (NSAID), אינה חומר מבוקר אך עשויה לדרוש רישיון לחומרים מבוקרים כדי לרכוש.
   1. באמצעות מחט 27-G ומזרקת Luer-lok בנפח 3 מ"ל, מדלל את מאגר המלוקסיקאם של 5 מ"ג/מ"ל ל-1 מ"ג/מ"ל באמצעות PBS סטרילי בבקבוקון זכוכית סטרילי בנפח 5 מ"ל. הכינו את היום ואחסן בטמפרטורת החדר.
3. הכנת אתר הניתוח
   הערה: אין צורך לבצע השתלת משאבה אוסמוטית בתוך ארון בטיחות ביולוגית, וגם לא ניתן לשמור על סטריליות במהלך ניתוחים. עם זאת, אתר הניתוח צריך עדיין לעמוד בסטנדרטים מחמירים של ניקיון ובפרקטיקה אספטית. אתר הניתוח צריך להיות נקי, נקי מבלגן ולחוות תנועה מועטה. באופן אידיאלי, יש גם אתר הכנה (כלומר, לגילוח ושפשוף מים) וגם אתר ניתוח (כלומר, לביצוע השתלת המשאבה).
   1. חטא לחלוטין את אזור הניתוח עם 70% אתנול ונגב יבש עם מגבות נייר.
   2. הפעל את חומר החיטוי של חרוזי הזכוכית ומכוון אותו ל-250 מעלות צלזיוס. תן לזה להתחמם ל-15–30 דקות.
   3. הדלק את האידוי והגדר את כרית החימום ל-65%. קבע את משקל גוף החיה וקבע את אחוז האיזופלורן ל-3.2%.
   4. הדביקו אחד ממכשירי הטמפרטורה לפני השטח של כרית החימום. תן לכרית החימום להתחמם ל-35–37 מעלות צלזיוס.
   5. הסר את מזרק האידוי. דחוף את הלשונית הירוקה עד הסוף ומלא באיזופלוראן על ידי חיבור לבקבוק איזופלוראן ומשיכה אחורה של הבוכנה.
   6. חבר מחדש את המזרק למאדה ופתח את המזרק.
   7. הניחו כרית חימום שנייה מתחת לכלוב חיות נקי לצורך התאוששות. הנח את הכלוב חצי על כרית החימום, חצי מחוץ לכרית החימום.
4. השתלת משאבה
   הערה: כל כלי הניתוח צריכים להיות מנוקים ומאוטוקלבים מראש. לחיטוי כלים כירורגיים בין בעלי חיים, ניתן להשתמש בחומר חיטוי חרוזים מזכוכית. ניתן להשתמש בו רק לקבוצות של עד 5 בעלי חיים. ודאו שאתם כוללים רצועת אינדיקטור לאוטוקלאב כדי לוודא שפרמטרי החיטוי עמדו. ציוד מגן אישי (PPE) מתאים כולל מעיל מעבדה נקי, מסכת ניתוח, כפפות כירורגיות סטריליות וכיסוי שיער. בעלי חיים שעוברים ניתוח לא צריכים להיות בעיני בעלי חיים אחרים.
   1. תפסו את העכבר בבסיס הזנב והניחו אותו בתא ההרדמה. שחרר את הצינורות והפעיל את זרימת האיזופלוראן (3.2%) לתא. הניחו שני לוחות וילון סטריליים מעל כרית החימום.
   2. חכה שהעכבר יסתובב על צידו ועקוב אחרי הנשימה שלו. כאשר הנשימה מאטה והופכת לרגועה, עצור את זרימת האיזופלוראן לתא. חבר את הצינורות לתא ופתח את הצינורות מהאף לשימוש. התחל את זרימת האיזופלוראן (2%) לאף-חרוט.
   3. להוציא את העכבר מהתא ולשים את האף שלו בקונוס האף של כרית החימום. הוסיפו משחה עינית לשתי העיניים.
   4. שקלו את העכבר על משקל ואז חזרו לאף. קבעו את נפח 1 מ"ג/מ"ל מלוקסיקאם שיש להעניק. במינון של 5 מ"ג/ק"ג, מכפיל את משקל העכבר בגרמים ב-5 כדי לקבל את המיקרוליטרים של מלוקסיקאם.
   5. רסס את מכסה הבקבוקון של 1 מ"ג/מ"ל מלוקסיקאם עם 70% אתנול, ונגב ייבוש עם מגב עדין. לאחר מכן, באמצעות מזרק אינסולין של 0.3 מ"ל, משוך את הנפח הנכון של מלוקסיקאם. הסר את כל בועות האוויר מהמזרק.
   6. החזק את העכבר ביד אחת, כשהראש מוטה כלפי מטה. הכנס את המחט בזווית של 30°–45° ברבע הימני התחתון של הבטן כשהזדמון פונה כלפי מעלה. שאפו כדי לאשר את מיקום המחט הנכון.
   7. אם לא נצפה שאיפה, לחץ בצורה חלקה על הבוכנה והזריק מלוקסיקאם תוך-פריטוני.
   8. החזיר את העכבר לקונוס האף ולכרית החימום. לגלח במלואו 150% מהאזור סביב אתר ההשתלה (הגב האמצעי עד העליון) עם מכונת תספורת כירורגית. לאחר שסיימו, שאבו בעדינות את השיער מהחיה והשליכו את הווילון הראשון.
      הערה: גילוח נקי הוא הכרחי לביצוע ניתוח אספטי. לפחות, כל חתך חייב להיות נקי לחלוטין משיער של בעלי חיים.
   9. מקם את העכבר כך שהראש שלו פונה למנתח. בצע שפשוף לסירוגין עם פובידון-יוד ו-70% אתנול, באמצעות אפליקטורים עם קצה כותנה, לסך הכל 3 יישוחים. ודא שאתה מתחיל באמצע החתך המתוכנן ומסתובב החוצה עם האפליקטטורים עם קצה הכותנה.
   10. כיסו את בעל החיים בווילונות ניתוחים סטריליים עם קצוות והשתמשו בטכניקה אספטית נכונה כדי ללבוש כפפות כירורגיות.
   11. לפני ביצוע חתכים, ודאו שאתם בודקים היטב את רפלקסי הפדלים על ידי צביטה חזקה של שתי הרגליים עם מלקחי רקמה. אל תמשיך עד אחרי לחיצות מרובות, אין תנועה. זה מאשר מישור ניתוחי של הרדמה.
   12. החזקו את עור מרכז השכמה עם מלקחיים וצרו חתך באורך 1 ס"מ בניצב לעמוד השדרה באמצעות מספריים כירורגיים קטנים. כדי לבצע חיתוך ישר, חתכו עם מספריים ניתוחים של איריס בזווית של 90° לעכבר.
   13. השתמשו במלקחיים המוסטטיים קטנים בתוך החתך כדי לפזר את הרקמה התת-עורית וליצור כיס למשאבה. ודאו שהכיס של המשאבה רחוק מהחזית של החיה וממוקם מעט לצד אחד של החיה. השתמשו במלקחיים ההמוסטטיים כדי לשחרר את העור מכל צדדי החתך.
   14. פתחו את החתך עם מלקחיים רקמיים והכניסו את המשאבה באמצעות מלקחיים ההמוסטטיים. הכנס את המשאבה עם מתון הזרימה שנכנס קודם.
       זהירות: יש להכניס את המשאבה כך שתהיה רחוקה מספיק מהחתך, כלומר כך שהעור סביב החתך לא יהיה תחת מתיחה. אם לא ממקמים אותו כראוי, זה עלול לגרום לפירוק הפצע. המשאבה עשויה גם לשנות את מיקומה במהלך ההתאוששות של בעל החיים.
   15. באמצעות מלקחיים ברקמה, הדק בעדינות את העור ומשך את שני צידי החתך זה עם זה. מתחילים בקצה אחד של החתך, השתמשו במכשיר הקליפס כדי להניח קליפסים פצועים בקוטר 7 מ"מ לאורך כל החתך (ייתכן שיידרשו 2–4 קליפים).
   16. לכל רווח בחתך שאינו מתאים לקליפס פצע נוסף, יש להניח כמות קטנה של דבק רקמה באמצעות האפליקציה הסטרילית. לחץ קרוב עם מלקחי הרקמה.
   17. משוך בעדינות ומתוח את העור סביב החתך כדי לוודא שהפצע סגור. לאחר מכן, כבה את זרימת האיזופלוראן לאף וחבר את הצינורות הרלוונטיים. הניחו את העכברים בכלוב ההתאוששות על כרית החימום.
   18. עקוב מלא אחרי העכבר עד שיתעורר ויתחיל ללכת. עקבו אחרי בעלי החיים לעיתים קרובות לסימני מצוקה או כאב, ושמרו אותם מבודדים מעכברים אחרים עד שיתאוששו.
   19. לאחר 24 שעות, יש להזריק מחדש 5 מ"ג/ק"ג של מלוקסיקאם באמצעות הזרקה תוך-פריטוניאלית. (אופציונלי) כדי לסייע בהתאוששות בעלי חיים, יש לספק תוספי אלקטרו-ג'ל, ו/או להניח את המזון על רצפת הכלוב.
   20. לאחר 10–14 ימים, שוב יש להרדים את בעלי החיים באיזופלורן, למרוח משחה עינית ולהסיר את הקליפים עם מסיר הקליפ.
       הערה: יש להסיר את הקליפים עד לתקופה זו כדי למנוע צמיחת שיער מחודשת מעל הקליפים. בנוסף, לכל המשאבות האוסמוטיות יש תקופת משך מוגדרת. ודא או להוציא את המשאבות החוצה או להמית את החיות עד סוף תקופת התקופה שלהן. לתקופות טיפול ארוכות יותר, ניתן לבצע השתלות משאבות מרובות ברצף על אותו בעל חיים.

2. קיבוע, הטמעה וחתך של רקמות

1. קיבוע רקמות
   הערה: כל ההליכים עם בעלי חיים צריכים להתבצע על ידי צוות מנוסה כדי למזער את הלחץ והסבל של בעלי החיים. יש לנקות ולשפוך את תא ההרדמה פיזית בין כל בעל חיים כדי להסיר שאריות פחמן דו-חמצני. כדי למזער לחץ, יש להרדים בעלי חיים בכלובים הביתיים שלהם כאשר הדבר אפשרי. ולבסוף, אין להמתים בעלי חיים בקרבה מרחבית או מול עכברים אחרים. כלים כירורגיים נקיים נדרשים לפרוצדורות שאינן הישרדות, אך הם אינם חייבים להיות סטריליים (כלומר, אוטוקלב).
   1. מניחים את העכבר בתא האינדוקציה ופתחו את הרגולטור עד שמד הזרימה מגיע לקצב הזרימה המיועד (~40%–70% מנפח התא לדקה).
   2. עקבו אחרי העכבר לאורך כל התהליך, וודאו שאין סימני מצוקה כמו קפיצה. יש לעקוב אחרי הפסקת פעילות נשימתית, ולשמור על זרימת_CO2 לפחות 2 דקות לאחר הפסקת פעילות הנשימה. ודאו שזמן החשיפה הכולל ל-CO₂ הוא לפחות 5 דקות.
   3. שלפו את העכבר ובצעו שיטת המתת חסד משנית כמו ניתוק צוואר הרחם.
   4. הצמיד את גפיו של החיה לחתיכת קצף פוליסטירן המכוסה בנייר אלומיניום באמצעות מחטי 23-G. הרטיב את הפרווה על ידי ריסוס של 70% אתנול.
   5. עשה חתך קטן ליד בסיס הבטן וחתוך את העור עד לצוואר. עקוב אחרי אותו חתך כדי לפתוח את חלל הגוף וחתך בזהירות דרך כלוב הצלעות.
   6. בצע חתכים בצורת U שמתחילים בבסיס הבטן ודקר את העור באמצעות מחטים של 23G.
   7. נתח את האיבר/ים הרלוונטיים והנח בצינור קוני של 15 מ"ל מלא מראש ב-5 מ"ל של 4% פאראפורמלדהיד (PFA). קבע ל-24 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על רוטיסרי.
      זהירות: תמיסת PFA מסוכנת. הימנע ממגע עם העור. ציוד מגן מתאים בזמן טיפול כולל מעיל מעבדה, כפפות ניטריל ומשקפי מגן.
      הערה: אם יש צורך להזריק דם מהרקמות, ו/או אם רצוי קיבוע פרפוזיה, יש לבצע פרפוזיה לבבית כפי שתואר קודם⁵¹. בקיבוע טבילה (הטבילה), כפי שמתבצע כאן, ייתכן שייקח זמן עד שהקיבע יתפזר דרך הרקמה, במיוחד בחתיכות גדולות יותר של רקמה. דבר זה עשוי לשנות את המורפולוגיה המיטוכונדרית; יתרה מזאת, קיבוע עם PFA יכול גם לגרום לרקמות להתכווץ⁵².
   8. לאחר 24 שעות, יש להסיר את תמיסת הפרפורמלדהיד ולשטוף את הרקמות ב-10 מ"ל של 1× PBS. בצע סך הכל 3 פעמים למשך 10 דקות כל אחת בטמפרטורת החדר על רוטיסרי.
   9. הסר את ה-PBS וטבול רקמות ב-10 מ"ל של סוכרוז 30% למשך 48 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על רוטיסרי. החדירה של סוכרוז מושלמת כאשר הרקמות שוקעות.
      הערה: כדי לוודא שהממס סופק לחיה, מדוד את הכמות שנותרה במשאבה.
2. הטמעת רקמות
   הערה: ודא שאתה עוקב אחרי מיקום הרקמה וכיוון הרקמה בתבניות.
   1. מלאו מיכל קצף פוליסטירן בקרח יבש והניחו עליו יריעת מתכת שטוחה.
   2. הניחו את התבניות על גבי יריעת מתכת ומלאו 2/3–3/4 למעלה עם תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) (מדיום הטמעת רקמה). הביאו בועות אוויר אל פני השטח או לפינות עם זוג מלקחיים דקים. כדי להאיץ את קצב ההקפאה, הנח כדורי קרח יבש ישירות על התבניות.
   3. הניחו מדיום להטמעת רקמות בסירת שקילה וערבבו את הרקמות בתוכה. נסה להימנע מהעברת תמיסת סוכרוז.
   4. לאחר שמדיום ההטמעה של הרקמה קפא לחלוטין בתחתית התבנית (הוא אמור להיות אטום לחלוטין), טבלו את הרקמה בתוך התבנית כך שלא תיגע בצדדים של התבנית או במשטח השטח. למקם במקום ובכיוון הרצויים.
   5. המתינו עד שהמדיום המוטמע של הרקמה יקפא לחלוטין לפני שמעבירים את התבניות למקפיא בטמפרטורה של מינוס 80°C.
      הערה: (נקודת הפסקה) ניתן לאחסן את הרקמות המוטבעות לפחות 3 חודשים.
3. חתך רקמות
   הערה: כדי להפחית את השונות בעובי החתך בין אצווה, יש לחלק את כל הרקמות שיש לנתח יחד במפגש אחד.
   1. שלפו טישו מוטמעים מהמקפיא בטמפרטורה של מינוס 80°C והניחו במיכל קצף פוליסטירן מלא בקרח יבש.
   2. קיררו מראש את טמפרטורת תא הקריוסטט ואת מחזיק הדגימה ל-24- מעלות צלזיוס ו-25- מעלות צלזיוס, בהתאמה.
   3. הניחו להב מיקרוטום חדש במחזיק הלהב, והכניסו את לוח האנטי-רול. לניקוי קל יותר, ריפד את תא הקריוסטט במגבות נייר.
   4. הסר את הצ'אק של הדגימה מתא הקריוסטאט וחמם לטמפרטורת החדר.
   5. השתמש בלהב גילוח כדי לחתוך בזהירות כל פינה של תבנית הרקמה. פרקו בעדינות את הבלוק כדי להסיר את הבלוק הבינוני שמחזיק ברקמה.
   6. לחץ בחוזקה את בלוק הרקמה אל הצ'אק של הדגימה תוך כדי סיבוב קדימה ואחורה. לאחר שהדבק היטב, מניחים את הצ'אק של הדגימה בתא הקריוסטט לכמה דקות להקפאה.
      הערה: ודאו שאתם מניחים את בלוק הרקמה על הצ'אק בכיוון הנכון, כך שהרקמה תתחלק בכיוון הרצוי.
   7. לאחר שבלוק הרקמה קפא לגמרי לצ'אק הדגימה, הניחו את הצ'אק במחזיק הצ'אק והדקו אותו במקום. הזז את להב הקריוסטאט כך שיהיה ממש מול בלוק הרקמה מבלי לגעת בו.
   8. הגדר את הגדרת החיתוך ל-50 מיקרון והתחל לגזום את הבלוק עד לחשוף חתך רוחב מלא של הרקמה.
   9. בטל את הגדרת הtrim והגדר את עובי החתך ל-20 מיקרון. חתכו כמה פרוסות בעובי הזה לפני שמורדים את צלחת האנטי-רול. לחתוך לאט ובחלק ~80%–90% מהקטע לפני שעצר.
   10. הרם את פלטת האנטי-גלגול. שלפו גלשית זכוכית טעונה ולחצו את הצד הטעון על חלק הרקמה במיקום הרצוי.
       הערה: אם חלק הרקמה מתגלגל כלפי מעלה לאחר הרמת הפלטה, השתמש במברשות הדקות כדי לפתוח אותו.
   11. הסר את הצ'אק ממחזיק הצ'אק. הסר את הצ'אק מהקריוסטאט וחמם לטמפרטורת החדר. הוציאו את בלוק הרקמה מהצ'אק והחזירו אותו לתבנית.
   12. עטוף בנייר כסף כדי למנוע מבלוק הרקמה ליפול מהעובש, והחזר למקפיא בטמפרטורה של מינוס 80°C.
   13. הניחו את חלקי הרקמה המותקנים בטמפרטורה של -20°C.
       הערה: (נקודת הפסקה) ניתן לאחסן חתכי רקמה בבטחה בטמפרטורה של -20°C ללא הגבלת זמן.

3. צביעת אימונופלואורסצנציה

1. שלפו את החתכים הקריוסופיים ואפשרו להם להתייבש במשך 10 דקות בטמפרטורה של 37°C באינקובטור.
2. שטפו את השקופיות כדי להסיר את המדיום המוטבע של הרקמה העודפת.
   1. הכינו ליטר אחד של 1× PBS המכיל 0.1% v/v טריטון X-100 (PBS-T)
   2. מלאו 3 צנצנות צביעה ב-PBS-T.
   3. הניחו את המגלשות במתקן השקופיות. טבלו את החלקים בצנצנת צביעה למשך 10 דקות. חזור על זה בסך הכל 3 פעמים.
3. חסום את הרקמה לצביעה.
   1. הקישו בעדינות על כל שקופית על מגב עדין לייבוש. הנח את המחסניות תלויות בתוך קופסת שקופיות כשהרקמה פונה כלפי מעלה.
   2. הכינו תמיסת חסימה של 20 מ"ל של 1× PBS, 0.3% v/v טריטון X-100, ו-5% עם אלבומין סרום בקר (BSA).
   3. פיפט 1 מ"ל של תמיסת חסימה על כל שקופה, כדי לוודא שהרקמות מכוסות במלואן.
   4. דגרו בטמפרטורת החדר במשך שעה.
4. דגר את הרקמות עם הנוגדן הראשי.
   1. הקישו בעדינות על כל שקופית על מגב עדין לייבוש. השתמש במגבון עדין נוסף כדי לסחוט בעדינות את הנוזל שנותר בין חלקי הרקמה.
   2. הכינו דילול של 1:200 של נוגדן עכבר α ארנב Tom20 בתמיסת חסימה (200 מיקרוליטר לשקופית)
   3. בתחתית קופסת הגלייד, הניחו מגבות נייר והרטיבו אותן במלואן במים.
   4. הנח את המגלשות תלויות בקופסת המחסנית כשהטישו פונה כלפי מעלה. פיפט 200 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני מדולל על כל שקופה, כדי להבטיח שהרקמות מכוסות במלואן.
   5. חתיכות של סרט פרפין בגודל בערך של הכיסוי לשימוש. חתוך חתיכת סרט פרפין אחת לכל שקופית.
   6. הניחו כל חתיכת סרט פרפין על כל שקופית כדי לפזר את דילול הנוגדנים על פני חלקי הרקמה. סגור את תיבת המחסלות ודוגר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
5. שטפו את השקופיות לאחר הדגירה עם הנוגדן הראשוני.
   1. מלאו 3 צנצנות צביעה ב-PBS-T. אסוף שקופיות והסר חתיכות סרט פרפין.
   2. הניחו את המגלשות במתקן השקופיות. טבלו את החלקים בצנצנת צביעה למשך 10 דקות. חזור על זה בסך הכל 3 פעמים.
6. דגור את השקופיות בנוגדן המשני.
   הערה: כדי לאשר סימון ספציפי של מיטוכונדריה, יש להכין לפחות שקופית אחת מכל קבוצה שמוצבעת רק בנוגדן משני.
   1. הקישו בעדינות על כל שקופית על מגב עדין לייבוש. השתמש במגבון עדין נוסף כדי לסחוט בעדינות את הנוזל שנותר בין חלקי הרקמה.
   2. הכינו דילול של 1:200 של נוגדן Alexa Fluor 568 α-ארנב של עזים ו-5 מיקרוגרם/מ"ל 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) בתמיסת חסימה (200 מיקרוליטר לשקופית).
   3. הנח את המגלשות תלויות בקופסת המחסנית כשהטישו פונה כלפי מעלה. פיפט 200 מיקרוליטר של נוגדן משני מדולל על כל שקופה, כדי להבטיח שהרקמות מכוסות במלואן.
   4. חתיכות של סרט פרפין בגודל בערך של הכיסוי לשימוש. חתוך חתיכת סרט פרפין אחת לכל שקופית.
   5. הנח חתיכת פרפילם על כל שקופית כדי לפזר את דילול הנוגדנים על פני חלקי הרקמה. סגור את תיבת המחסלות ודוגר בטמפרטורת החדר למשך 4 שעות, או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
7. שטוף את הכיסוי.
   הערה: השתמש במלקחיים מפלסטיק כדי להרים ולטפל בכיסויי כיסוי
   1. הניחו את הכיסויים אחד אחד בבקבוק מלא במי ברז חמים ובחומר ניקוי לכלי זכוכית, כמו Contrad 70. כיסו עם חתיכת סרט פרפין.
   2. סוניקייט ל-30 דקות באמבט סוניקטור.
   3. שטוף מספר פעמים במי ברז חמים. לאחר מכן שטוף עוד כמה פעמים במים מזוקקים כפול. סוניקט ל-15 דקות בשטיפת מים מזוקקים כפולה אחרונה.
   4. הניחו את הכיסוי ב-70% אתנול ואחסנו. כשאתה מוכן להתקנת כיסויי כיסוי, הסר אותם מהאתנול של 70% ותן להם להתייבש באוויר במכסה אדים.
8. שטפו את השקופיות לאחר הדגירה עם הנוגדן המשני.
   1. מלאו 3 צנצנות צביעה ב-PBS-T. אסוף שקופיות והסר חתיכות סרט פרפין.
   2. הניחו את המגלשות במתקן השקופיות. טבלו את החלקים בצנצנת צביעה למשך 10 דקות. חזור על זה בסך הכל 3 פעמים.
   3. הקישו בעדינות על כל שקופית על מגב עדין לייבוש. השתמש במגבון עדין נוסף כדי לסחוט בעדינות את הנוזל שנותר בין חלקי הרקמה.
9. להרכיב את הכיסוי.
   1. הוסיפו 2–3 טיפות של מגדל אנטי-פייד מפוזרות באופן שווה על מגלש.
   2. כדי להימנע מבועות אוויר, קח כיסוי #1.5 מנוקה והחזק בזווית של 45° לסלייד לאורך הציר הארוך. הטה בעדינות ואיטיות את הכיסוי אל המגלשה. חזור על זה לכל השקופיות.
   3. תן למחסניות להתייבש במשך 18–60 שעות בטמפרטורת החדר כשהן מוגנות מאור.
   4. אחסן את המגלשות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס מוגנות מאור.
      הערה: (נקודת עצירה) ניתן לצלם שקופיות מיד לאחר תקופת התייבשות, או עד חודש כאשר נשמרות בטמפרטורה של 4°C. אין צורך לאטום את הקצוות. תוודא להשתמש בכיסויי כיסוי #1.5 או #1.5H, כי עוביים אחרים יגרמו לסטייה כדורית ולהוריד את איכות התמונה. אין להשתמש במדיה להרכבה עם DAPI, שכן ל-DAPI יש ספקטרום רחב של עירור ופליטה. זמן ההתייבשות תלוי בעובי הדגימה; כאן, 48 שעות.

4. הדמיה ברזולוציה על-

הערה: פרוטוקול זה עושה שימוש ב-ZEISS Airyscan2 קונפוקל LSM 980 סורק נקודות, המבוסס על ZEISS Axio Observer Z1 ומצויד בשני צינורות פוטומולטיפלייר רב-אלקליים (PMTs) וגלאי ספקטרלי GaASP 32 ערוצים, מארז סביבתי, ומטרה של Plan Apo 63×/1.4 להפרעות נפט (DIC) III.

1. תארגן את הרכישה.
   1. הוסף מסלול SR אחד של Airyscan ובחר את הפלואורופור המתאים.
   2. בחר את פלטת ה-10 אינץ' ואת מסנני פס הפליטה המתאימים.
      הערה: לוחית ה-10 אינץ' ייחודית למיקרוסקופ זה, שכן היא מצוידת גם בגלאי אינפרא-אדום (IR).
   3. בחר את הלייזר(ים) המתאימים. הגדר את קריטריון הדגימה של נייקוויסט ל-2 על ידי לחיצה על SR (גודל הפיקסל צריך להיות מכוון ל-0.05 מיקרון).
   4. לחץ על live ויישר את גלאי Airyscan (בחר בתכונת יישור חי). לחץ עצור כאשר העוצמה ממוקמת במרכז סמל הגלאי וכאשר הגלאי ירוק.
      הערה: אם הכל מוגדר כראוי, אמורה להופיע הודעה בצד שמאל של התוכנה שאומרת "הגדרות Airyscan מותאמות בהצלחה".
   5. תעלה שוב לשידור ותכוון את עוצמת הלייזר כך שיהיה אות טוב אבל בלי פיקסלים רוויים (לחץ על מד הטווח). לחץ על עצירה לאחר האופטימיזציה.
      1. (אופציונלי) כדי להעלות את האות מבלי לכוון את עוצמת הלייזר, הגבר את הרווח.
2. בצע איסוף נתונים.
   1. לחץ על z-stack וודא שגודל הצעד מוגדר ל-0.1 מיקרון (אם לא).
   2. לחץ על live והגדר את הגבולות התחתונים והעליונים של מחסנית ה-z.
   3. לחץ על Start Experiment.
   4. לאחר שנאסף את ערימת ה-z, גש ללשונית Airyscan מתחת לתמונה ולחץ על תהליך תלת-ממד. שמור על פרמטרי מסנן Weiner המפחיתים את הרעש המשמש כאן עקביים בין שכפולים וקבוצות טיפול שונות.
   5. שמור את ערימת ה-Z המעובדת של Airyscan.
      הערה: אם משתמשים בשני מסלולי SR של Airyscan, ודאו שהמיקרוסקופ מתחלף בכל פריים.

5. יצירת צינור אוטומטי לכימות מורפולוגיית מיטוכונדריה

הערה: פרוטוקול זה מתאר את פיתוח צינור ניתוח תמונות אוטומטי לכימות תלת-ממדי של מורפולוגיה מיטוכונדריאלית באמצעות ZEISS arivis Pro Software 4.1.2.

1. המרו קבצי .czi מעובדים על ידי Airyscan, לפורמט .sis באמצעות כלי ההמרה arivis.
   הערה: אם התמונה המלאה גדולה וזמן העיבוד ארוך מדי במהלך אופטימיזציית הפרמטרים, חתוך תת-אזור קטן ומייצג של התמונה לשימוש כהפניה לעבודה לאופטימיזציה של הגדרות. תמונה חתוכה זו צריכה לכלול גם מיטוכונדריה מבודדת היטב וגם אזורים בעלי צפיפות גבוהה יותר, כך שתייצג במדויק את שדה התמונה המלא. לאחר שהושג סגמנטציה מספקת בתמונה החתוכה, ניתן ליישם את הצינור האופטימלי על מערך התמונה המלא. גישה זו תחסוך זמן משמעותית, ותקל על כוונון כל הפרמטרים מבלי לפגוע באיכות הצינור.
2. להקים ולייעל את הצינור.
   1. פתח תמונה מייצגת (למשל, מקבוצת הביקורת) בתוכנה.
   2. בחר את ערוץ האימונופלואורסצנציה Tom20 כקלט לניתוח.
   3. הפעילו שלב הסרת רעש לפני הסגמנטציה. כאן נעשה שימוש באלגוריתם שיפור החלקיקים, בקוטר 5.42 וחוזק של 0.5.
      הערה: מסנן שיפור החלקיקים הוא אלגוריתם לשימור מבנה, שמטרתו להגביר עצמים קומפקטיים, כדוריים או מוארכים תוך דיכוי רעשי רקע. הוא פועל על ידי הגברת עוצמה מקומית בקנה מידה מרחבי מוגדר (קוטר), מה שהופך אותו למתאים במיוחד למיטוכונדריה, שמופיעה כחלקיקים או צינורות מבודדים ובהירים על רקע כהה. אם ערך הפרמטר של קוטר מוגדר קטן מדי, הוא יגביר רעש, בעוד שערך גדול מדי יטשטש עצמים סמוכים יחד. פרמטר העוצמה שולט במידת ההעצמה, שבה ערכים גבוהים מגבירים את הגברת האות אך עלולים לגרום לארטיפקטים אם נגדם גבוה מדי. התחל מהערכים ברירת המחדל והתאים תוך בדיקה ויזואלית של הפלט באזור ייצוגי שמעניין אותו. קיימות מספר שיטות להסרת רעש ב-arivis Pro. החלקה גאוסית היא אפשרות פשוטה ומהירה שמפחיתה רעש בתדר גבוה באופן אחיד אך יכולה לטשטש פרטים מבניים דקים. סינון חציוני טוב יותר בשימור קצוות חדים תוך הסרת רעש מלח ופלפל. שיפור חלקיקים (משמש כאן) מועדף כאשר המטרה היא לזהות אובייקטים פלואורסצנטיים בדידים, שכן הוא מגביר באופן סלקטיבי אות ממבנים התואמים את טווח הגודל שצוין. לתמונות עם יחס אות לרעש נמוך או הטרוגניות ברקע משמעותית, ייתכן שיהיה צורך במעבר חזק יותר להסרת רעשים. מומלץ לבדוק שתי או שלוש שיטות על אותה תמונה מייצגת ולהשוות את איכות הסגמנטציה במורד הזרם.
   4. סגמנט של מיטוכונדריה בודדת באמצעות אלגוריתם Blob Finder, שמזהה עצמים במרחב תלת-ממדי.
   5. כוון את פרמטרי הסגמנטציה, כולל גודל האובייקט וסף הרגישות, ובדוק ויזואלית את החפיפה בין האובייקטים שזוהו לתמונה המנותקת כדי להבטיח סגמנטציה מדויקת. כאן נעשה שימוש בפרמטרים הבאים: קוטר של 0.244 מיקרון, סף הסתברות של 25%, ורגישות פיצול של 22.22%, עם נרמול מוגדר לנקודת ההתחלה הראשונה.
      הערה: פרמטרי הסגמנטציה תלויים ברזולוציית התמונה ובגודל הווקסלים. במחקר זה, ממדי התמונה היו 1354 × 1354 פיקסלים עם גודל פיקסל XY של 0.049 מיקרון וגודל ווקסל 0.049 × 0.049 × 0.100 מיקרון³.
3. בצע חילוץ תכונות ובקרת איכות.
   1. להוציא פרמטרים מורפולוגיים עבור כל עצם שזוהה, כולל נפח (^{μm 3}), שטח פנים (μm²) וספריות (שטח פנים של כדור עם אותו נפח/שטח פנים של המיטוכונדריה).
   2. ייצוא אובייקטים מחולקים כקבצי TIFF לאימות ויזואלי.
   3. פתח קבצים מיוצאים ב-FIJI או Arivis ושכב אותם עם התמונה המקורית לבדיקה ויזואלית של דיוק הסגמנטציה.
   4. ייצוא מדידות כמותיות כקבצי גיליון אלקטרוני נפרדים לכל דגימה.
4. יישם את הצינור.
   1. שמור את הצינור האופטימלי. דוגמה לצינור ניתן למצוא בקובץ המשלים 1.
   2. החלו את הצינור על תמונות נוספות מכל קבוצות הניסוי מהמחקר.
   3. לחדד באופן איטרטיבי פרמטרי סגמנטציה במידת הצורך כדי להבטיח ביצועים עקביים בכל קבוצות הניסוי.
   4. לאחר הסיום, החלו את הצינור במצב אצווה על כל התמונות במחקר.
5. ביצוע ניתוח נתונים
   1. ייבא את הנתונים המיוצאים ל-RStudio (גרסה 4.3.2) לניתוח סטטיסטי.
   2. אם לא מותקן, התקן את החבילות: readxl, dplyr, tidyr, purrr, ggplot2, ggpubr, patchwork, scales, randomForest, caret, umap, factoextra, RColorBrewer, mclust, outliers ו-tidyverse.
   3. העלה את הסקריפט (קובץ משלים 2) כדי למזג את כל מערכי הנתונים יחד, לסנן נתונים (ראו להלן), לשרטט את הנפח, שטח הפנים וערכי הכדור, ולנתח את המיטוכונדריה המקוטעת עבור פרופורציות תת-סוג לכל מדגם.
   4. (אופציונלי) סינון מיטוכונדריה מקוטעת לפי נפח כדי להוציא ארטיפקטים של סגמנטציה ורעש.
      1. כדי לקבוע מסננים מתאימים, יש לבדוק ויזואלית את התפלגות הנפח.
         הערה: כל הדגימות הראו קפיצה בולטת בנפחים קטנים מאוד (מתחת ל-0.0003 מיקרומטר³), בהתאם לרעש סגמנטציה ולא למיטוכונדריה אמיתית.
      2. כדי לזהות את הגבול התחתון, הערך את שימור החלקיקים על פני ספי מועמדים (0.0009, 0.003, 0.005, 0.007 ו-0.01 מיקרומטר³). הירידה החדה ביותר במספר החלקיקים התרחשה מתחת ל-0.003 מיקרומטר^מעוקב, מה שמעיד שרוב חלקיקי הרעש נופלים בטווח זה. בדיקה ויזואלית אישרה כי 0.003 מיקרומטר³ מתאים לקצה הימני של שיא הרעש.
      3. עבור הגבול העליון, ההתפלגויות הצטמצמו באופן טבעי הרבה מתחת ל-10 מיקרון³; להגדיר גבול זה כך שלא יהיו אובייקטים ארטיפקטואליים גדולים כגון רשתות מיטוכונדריה מחולקות יתר על המידה. הסינון הסופי שמר על חלקיקים בנפחים בין 0.003 ל-10 מיקרון³.
         הערה: סקריפט זה מחשב ערכי חציון לכל דגימה בכל המיטוכונדריה שזוהתה ומשתמש בהם כיחידת ניתוח. גישה זו מתחשבת באי-העצמאות של מיטוכונדריה בודדת בתוך אותה דגימה ביולוגית.

תוצאות

הפרוטוקול שתואר לעיל בוצע (איור 1) על עכברים זכרים בני 20 חודשים מסוג UM-HET3. העכברים קיבלו או רכב (בקרה) או קוקטייל תכנות כימי (מטופל) באמצעות מינימפאפים אוסמוטיים מדגם 2004⁵³. הכבדים נחתכו לאחר מכן וצולמו במיקרוסקופ קונפוקלי Airyscan2 לפני עיבוד ה-z-stacks באמצעות צינור הניתוח.

תמונות הפלואורסצנציה התלת-ממדיות עובדו ונותחו באמצעות ZEISS arivis Pro Software 4.1.2. לפני סגמנטציה של המיטוכונדריה, אלגוריתם שיפור החלקיקים יושם להסרת רעש מהתמונות ולהסיר את הרקע, אור מחוץ לפוקוס, אוטופלואורסצנציה ו/או פלואורסצנציה שמקורם בקישור לא ספציפי. שדרוג החלקיקים מגביר באופן סלקטיבי את האות מקוטר נתון. לאחר הדנואיזציה, מיטוכונדריה בודדת חולקה בתלת-ממד באמצעות אלגוריתם Blob Finder, שמזהה עצמים על פי מקסימום עוצמה מקומית בטווח גודל מוגדר. לבסוף, סגמנטציה של אובייקטים מצמצמת כל פרוסה דו-ממדית לתמונה בינארית.

כדי להמחיש את תהליך הסגמנטציה, איור 2 מציג פרוסות אופטיות מייצגות בכל שלב בצינור העיבוד עבור דגימות בקרה ומטופלות. תמונת הפלואורסצנציה הגולמית מציגה את אות Tom20 הלא מעובד, המכיל תערובת של פלואורסצנציה מיטוכונדריאלית ספציפית ואור רקע לא רצוי, אור מחוץ לפוקוס ואוטופלואורסצנציה. לאחר יישום דה-אנואיזציה של הגברת חלקיקים, אות הרקע הופחת משמעותית, והפלואורסצנציה שנותרה מוגבלת למבנים בדידים ומוגדרים היטב (איור 2). כתוצאה מכך, ייצוג נקי יותר של גבולות המיטוכונדריה, שמקל על סגמנטציה מדויקת.

הפלט של סגמנטציה של Blob Finder מוצג בירוק. כדי לוודא שערימות ה-z מחולקות בדיוק, הפרוסות הדו-ממדיות המנותקות עם התמונות הבינאריות המחולקות הוקמו (איור 2). אם תהליך הסגמנטציה מותאם מספיק, יש להבחין בקולוקליזציה חזקה ועקבית של פלואורסצנציה מיטוכונדריאלית עם האובייקטים הבינאריים. אם תהליך הסגמנטציה הוא מקטע יתר (כלומר, פיצול מיטוכונדריה בודדת לאובייקטים מרובים) או תת-קטע (כלומר, שילוב של מספר מיטוכונדריות לאחת), התאם את פרמטרי הסגמנטציה. בדיקה ויזואלית של ההטמעות מאשרת סגמנטציה איכותית: אובייקטים שזוהו מתמקמים בדיוק עם אות הפלואורסצנציה של Tom20 המנוטרל, ללא עדות לפיצול יתר, הגדלת עצמים, מיזוג לא מתאים של מיטוכונדריה סמוכה במרחב לאובייקטים בודדים, או יצירת עצמים מזויפים באזורים ללא אות Tom20. רמת נאמנות סגמנטציה זו הושגה בעקביות הן בדגימות בקרה והן בדגימות מטופלות, מה שמראה כי פרמטרי הצינור שאופטימיזציה בתוכנת ZEISS arivis הם עמידים וניתנים להכללה בין קבוצות הניסוי. יחד, תוצאות אלו מאשרות את גישת הסגמנטציה ותומכות באמינות המדידות המורפולוגיות הנגזרות ממנה.

ניתן למדוד את העצמים המקוטעים עבור פרמטרים מיטוכונדריאליים כגון נפח, כדוריות ושטח פנים (איור 3). כדי להתחשב במספר הרב של מיטוכונדריה שזוהתה בכל דגימה ביולוגית ובחוסר העצמאות של האברונים הבודדים בתוך תא, חושבו ערכי החציון לכל דגימה ושימשו כיחידת השוואה סטטיסטית. ההבדלים בקבוצות הוערכו באמצעות מבחן וילקוקסון. הדגימות המטופלות הציגו נפח ושטח פנים מיטוכונדריאלי גבוהים משמעותית בהשוואה לביקורת, מה שמעיד כי תכנות מחדש כימי גורם לעיצוב מחדש משמעותי של המורפולוגיה המיטוכונדרית.

לבסוף, ניתן לסווג את המיטוכונדריה המקוטעת לתת-סוגים שונים^54,55 (איור 4). שיטת המרפק⁵⁶ שימשה לקביעת מספר האשכולות האופטימלי לאשכולות k-ממוצעים ^57.58 (איור 4A). לאחר מכן, באמצעות k = 4 אשכולות, תתי-דגימות אקראיות של מיטוכונדריה עבור קבוצות ביקורת וטופלות צוירו באמצעות קירוב אחיד של מניפולד והפחתת ממד (UMAP) (איור 4B), וצבוע על ידי תת-סוג מיטוכונדריה (משמאל) וקבוצת הטיפול (מימין). לבסוף, הפרופורציות של כל תת-סוג מיטוכונדריאלי (איור 4C) עבור קבוצות הביקורת והמטופלות צוירו. בקבוצת הטיפול, היו פחות מיטוכונדריה מפורקת אך לא היה שינוי משמעותי ביחס של מיטוכונדריה מרושתת או מוארכת.

איור 1: סקירה כללית של הפרוטוקול. עכברים מטופלים בתרופות או בכלי רכב למשך עד 6 שבועות באמצעות השתלת מינימאפ אוסמוטית תת-עורית (1). לאחר הטיפול, רקמות העכבר מקובעות, מוזרמות בסוכרוז, מוטמעותן ב-OCT Compound ומועברות לחתך קריוג'י (2). לאחר מכן מקטעי הרקמה צובעים בנוגדנים נגד Tom20 ובנוגדנים משניים המסומנים ב-Alexa Fluor 568 (3). ערימות z ברזולוציה על-גבוהה נאספות במיקרוסקופ קונפוקלי סורק Airyscan2 (4), וערימות ה-z המעובדות ללא רעש מחולקות באריביס כדי לכמת את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית (5). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: צינור אוטומטי לסגמנטציה וניתוח מורפולוגיה של מיטוכונדריה.
פרוסות אופטיות בודדות מייצגות מדגימות Control (פאנלים עליונים) ודגימות מטופלות (פאנלים תחתונים). אות האימונופלואורסצנציה של Tom20 מוצג באפור (משמאל). אותה תמונה לאחר הסרת רעש מוצגת באפור, ואחריה פלט סגמנטציה המדגישה עצמים מיטוכונדריאליים שזוהו בירוק. התמונה המאוחדת מראה את החפיפה בין האות המנותק לאובייקטים מחולקים. השקיעות מציגות תצוגות הגדלה גבוהה יותר של האזורים המצוינים, וממחישות את השפעות הסרת הרעש ואת דיוק הסגמנטציה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: מורפולוגיה מיטוכונדריאלית בקבוצות הביקורת והמטופלת. תרשימי קופסה מראים את טווח החציון ± הרבעון של ערכי החציון לדגימה (n = 10 לכל קבוצה). כל נקודה מייצגת דגימה ביולוגית אחת, המסוכמת כחציון על פני כל המיטוכונדריות שזוהו בתוך אותה דגימה. הנפח ושטח הפנים מוצגים בקנה מידה log₁₀ . הקבוצות הושוו באמצעות מבחני סכום דירוג של וילקוקסון. רמות מובהקות: ns p ≥ 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4: סיווג מורפומטרי לא מפוקח של תת-סוגים מיטוכונדריאליים. (א) תרשים מרפק המציג את הסכום הכולל בתוך אשכול של ריבועים (WSS) כפונקציה של מספר האשכולות (k), המחושב על תת-מדגם אקראי של 10,000 מיטוכונדריה. נקודת המפנה ב-k = 4 נבחרה כמספר האשכולות האופטימלי לניתוח במורד הזרם. (B) (משמאל) הפחתת ממדיות UMAP של תכונות מורפומטריות מיטוכונדריאליות (n = 20,000 מיטוכונדריה שנדגמו באקראי), צבועה לפי תת-סוג שהוקצה. זוהו ארבעה תת-סוגים מורפולוגיים מובחנים: מפורקים (קטנים, כדוריים גבוהים), מוארכים (ארוכים, כדוריים נמוכים), מרושתים (גדולים, לא סדירים) ובינוניים. (מימין) הקרנת UMAP צבועה על ידי קבוצת ניסוי (בקרה מול מטופלת) המראה את התפלגות כל קבוצה במרחב המורפולוגי. (C) פרופורציות לדגימה של כל תת-סוג מיטוכונדריאלי בכל קבוצת ניסוי. כל נקודת נתונים מייצגת מדגם ביולוגי אחד (n = 10 לכל קבוצה). גרשי קופסה מראים את הטווח הבין-רבעוני והחציון, כאשר השפמים מתרחבים עד פי 1.5 מהטווח הבין-רבעוני. יחס תת-הסוגים הושוו בין קבוצות באמצעות מבחן סכום הדירוג של וילקוקסון, וערכי p תוקנו להשוואות מרובות באמצעות שיטת בנג'מיני-הוכברג. NS P ≥ 0.05, ****p < 0.0001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

קובץ משלים 1: דוגמה לצינור אריוויס. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 2: כתב R לכימות מורפולוגיית מיטוכונדריה ואוכלוסיות תת-סוג.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

שני השלבים הקריטיים ביותר לביצוע מוצלח של פרוטוקול זה הם (i) סגירת החתך במהלך השתלת המשאבה האוסמוטית, ו-(ii) סגמנטציה מדויקת. לגבי הראשונים, יש להקפיד במיוחד ליצור כיס תת-עורי שגדול מספיק למשאבה, אך לא גדול מדי כדי שהמשאבה תחליק לאורך צדי החיה. כאשר החתך נסגר, יש למקם את המשאבה במרחק מספיק כדי שלא תגרום למתח בעור הסובב, מה שעלול להוביל להתפרקות. ודאו שאתם מושכים את העור סביב החתך הסגור בכל הכיוונים כדי לוודא שהפצע סגור מספיק לפני תחילת ההחלמה של החיה. קליפסים לפצעים הם יתרון כי הם מהירים ליישום ולהסרה. עם זאת, אם מתעוררות בעיות כתוצאה מאי סגירת החתכים כראוי, ניתן להשתמש בתפרים מופרעים במקום זאת. באחרון, סגמנטציה מדויקת דורשת להשוות כל הזמן את תוצאות הסגמנטציה לתמונות המנוקלות עד שיש דמיון מספיק בתמונה. ערימות Z מבעלי חיים מבוקרים ומטופלים חייבים להיאסף באמצעות אותם פרמטרי איסוף ורצוי במהלך אותו סשן הדמיה. באופן דומה, כל שלבי העיבוד חייבים להיות מיושמים על כל התמונות באמצעות אותם פרמטרים בדיוק. פרמטר סגמנטציה בקוטר מגדיר את הגודל הצפוי של האובייקטים שיש לזיהוי. נקודת התחלה טובה היא הרוחב הממוצע המיטוכונדריאלי שנמדד מכמה עצמים שנבדקו ידנית באמצעות פרוסה אופטית אחת. סף ההסתברות שולט בביטחון הזיהוי המינימלי הנדרש לקבלת אובייקט. ערכים נמוכים יותר מגבירים רגישות ומזהים יותר אובייקטים, אך חלק מהאובייקטים הללו עשויים להיות שגויים. לעומת זאת, ערכים גבוהים משפרים את הספציפיות אך עלולים לגרום לאובדן עצמים עם אות נמוך יותר. טווח התחלתי מומלץ הוא 25%–30%. לבסוף, רגישות מפוצלת קובעת כיצד עצמים נוגעים או חופפים באגרסיביות מופרדים לאובייקטים בודדים. רגישות מפוצלת נמוכה תשאיר מיטוכונדריה מקובצת כאובייקטים מאוחדים בודדים. מצד שני, רגישות גבוהה לפיצול עלולה לגרום לפיצול יתר של מיטוכונדריה מוארכת או מסועפת לחתיכות. ערכים בין 15%–30% סבירים למחקרים מורפולוגיים טיפוסיים של מיטוכונדריה. אם סגמנטציה מדויקת עדיין מאתגרת, ניתן לבצע סגמנטציה באמצעות מנתח מיטוכונדריה⁵⁹ ב-FIJI⁶⁰. צינור חצי-אוטומטי לכימות של מורפולוגיות מיטוכונדריאליות הן בתאים והן ברקמות באמצעות תוכנת Huygens Professional וסקריפט Python מותאם אישית תואר לאחרונה גם הוא^ב-61.

מגבלה אחת היא מגבלת הרזולוציה של מיקרוסקופ קונפוקלי Airyscan2, שהוא ~150 ננומטר ב-XY ו~350 ננומטר במישור Z. דבר זה מונע הדמיה ברזולוציה גבוהה של הקריסטה המיטוכונדריאלית, שכן המרחקים בין הקריסטות הבודדים הם ~40–120 ננומטר 62,63,64. לעומת זאת, דלדול פליטה מגורה (STED) יכול להגיע לגבולות רזולוציה של ~20–50 ננומטר לרוחב ויכול להבחין בבירור בין קריסטה מיטוכונדריאלית^{בודדת 62,63,64}. מספר צבעי STED פותחו לאחרונה המאפשרים צביעה והדמיה יעילים של קרום המיטוכונדריה הפנימי בתאים חיים^{וקבועים} 63,64,65. בהינתן שניתוח של מורפולוגיות קריסטה עשוי להעניק תובנות לגבי בריאות הביואנרגטית המיטוכונדריאלית¹⁰, נתונים כאלה רצויים לפיכך. עם זאת, המורפולוגיה המיטוכונדריאלית שונה מאוד בין רקמות יונקים לתרבות תאים (תידון בהרחבה בהמשך), וכיום אין שיטה לצביעה של הממברנה הפנימית של רקמות להדמיית STED וניתוח מבני קריסטה.

כימות המורפולוגיה המיטוכונדרית ברקמה שלמה מציבה אתגרים ייחודיים בהשוואה למערכות תרביות תאים. בתאים מתורבתים, המיטוכונדריה בדרך כלל מתפזרת ברחבי הציטופלזמה ברשתות מופרדות היטב עם חפיפה מינימלית בין התאים. בחתכי רקמה או תכשירים שלמים, לעומת זאת, התאים דחוסים בצפיפות, וגבולותיהם אינם מוגדרים היטב. אם נדרש ניתוח ברמת התא, יש לשלב תווית פלואורסצנטית נוספת המיועדת לממברנת הפלזמה או סמן ספציפי לסוג התא, יחד עם שלב סגמנטציה מתאים בצינור ניתוח התמונה להגדרת גבולות התאים הבודדים לפני כימות המורפולוגיה המיטוכונדרית. הבדל חשוב נוסף הוא שבתאים מתורבתים, המיטוכונדריה לעיתים קרובות יוצרת רשתות רטיקולריות רציפות ומקושרות שקל להמחיש ולפענח. ברקמות, דפוס זה נדיר מאוד. לדוגמה, מיטוכונדריה מחלקי כבד מציגות דפוס מנוקב, מוט וחבילות שמכסה את כל הציטוזול⁶⁶. עם זאת, הפטוציצים בתרבית מראים מורפולוגיות צינוריות עם תצורות רשת ברורות⁶⁶. באופן דומה, כאשר משווים מיטוכונדריה מרקמה חלקה לאלו מתאי שריר חלק בתרבית, נצפים הבדלים מובחנים במורפולוגיות ובתבנית הרשת שלהן^. הארכיטקטורה התלת-ממדית, בשילוב עם הבדלים ספציפיים לסוג התא בהתפלגות המיטוכונדריה, גורמת למיטוכונדריה ברקמות אלו להיראות כנקודות בדידות וצפופות או כמקטעים קצרים במקום רשתות מוארכות. לכן, יש צורך בפרשנות זהירה של הנתונים כאשר משווים תכונות מורפולוגיות בין רקמות לתרבות תאים, שכן ההבדלים בין השתיים עשויים להיות חלקית מהקשר דימות ולא מהשונות הביולוגית האמיתית.

נקודת שיא של פרוטוקול זה היא היכולת למדוד באופן כמותי מבנים מיטוכונדריאליים ברקמות באמצעות מיקרוסקופיה אורית. בעוד שישנן שיטות נוספות לכימות מורפולוגיית מיטוכונדריה מתמונות מיקרוסקופ אור ברזולוציה על, רבות מהן מתאימות רק לתאים בתרבית. יתרה מזאת, בניגוד לשיטות ניתוח אחרות, הצינור המוצג כאן הוא אוטומטי לחלוטין, מכמת הן את הממדים המיטוכונדריאליים והן את הפרופורציות של תת-הסוגים, ודורש מעט ניסיון בקידוד כדי לבצע בהצלחה. מיקרוסקופ אלקטרוני סריקה/שידור (SEM/TEM) וקריו-ET שימשו בעבר להדמיית מבנים מיטוכונדריאליים ברקמות ב-2D^ו-3D 10,68,69. עם זאת, לגבי הראשון, קיימות חששות לגבי שימור מבנים מקומיים לאחר קיבוע דגימה, ייבוש והטמעה^70,71. יתרה מזאת, מדידה ידנית של פרמטרים מיטוכונדריאליים ב-FIJI⁶⁰ היא לעיתים שיטת הניתוח המועדפת לתמונות TEM⁷², שדורשת עבודה משמעותית ועלולה להוביל להטיית דגימה. שיטות למידה עמוקה לכימות אוטומטי של מורפולוגיות מיטוכונדריאלית מתמונות TEM תוארו לאחרונה^73,74. יתרון בגישה המוצגת הוא שברגע שצינור הניתוח מוקם, הוא יכול לעבד תמונות באצווה עם מעט מאוד או ללא קלט ממשתמש. במקרה האחרון, הקפאה בלחץ גבוה יכולה לשמר את מבני הרקמה בתנאים כמעט טבעיים⁷⁵. עם זאת, הקפאת דגימות קריו-ET, חיתוך, מילינג, איסוף נתונים ועיבוד נתונים דורשים הכשרה נרחבת וציוד מתקדם מאוד. לעומת זאת, מיקרוסקופיה קונפוקלית סופר-רזולוציה נגישה יחסית יותר ודורשת פחות אימון ומשאבים כדי לבצע בהצלחה.

ניתן לבצע השתלות במשאבה אוסמוטית בבטחה בעכברים מבוגרים כדי להעריך את השפעות התרכובות הפרמקולוגיות השונות על ירידות בתפקוד פיזיולוגי הקשור להזדקנות. בנוסף, השיטות המתוארות כאן ניתנות להכללה לאיברים רבים ושונים. ידוע היטב כי ירידות בתפקוד המטבוליזם הקשורות להזדקנות תורמות למחלות ונובעות מתפקוד לקוי של מיטוכונדריה, אחת מהמאפיינים המדוברים של גיל⁷⁶. יתרה מזאת, מובן שמבנים מיטוכונדריאליים משפיעים על היכולת הביואנרגטית והמצב המטבולי של המיטוכונדריה^77,78. לכן, הערכה כמותית של תרכובות להשפעתן על מבנה המיטוכונדריה במהלך הזדקנות העכברים, באמצעות השיטות המתוארות כאן, עשויה לסייע בזיהוי תרופות שיכולות להאריך את תוחלת הבריאות האנושית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Airyscan2 point scanning confocal microscope	ZEISS	LSM 980 with Airyscan2	ZEISS point scanning LSM 980 confocal built around a ZEISS Axio Observer Z1 and equipped with two multi-alkali PMTs and a GaASP 32 channel spectral detector, an environmental enclosure, and a Plan Apo 63×/1.4 Oil DIC III objective. The microscope used in this study is also equipped with two external NIR detectors, as well as the following laser lines: 405, 458, 488, 514, 561, 594, 639, and 730 nm.
Aluminum foil	Essendant	BWK7112
Analytical balance	Mettler Toledo	MR204
Anti-roll glass plate	Gel Company	LGI70
Arivis Pro Software	ZEISS	Version 4.1.2
Bath sonicator	Branson Ultrasonics	71020-MT
Bovine serum albumin	Research Products International	A30075
Centrifuge tubes, 15 mL	CELLTREAT	229411
Charged microscope slides	Globe Scientific	1358W
Clip remover	Alzet	0009976
CO2	Airgas	CD 50
Contrad 70	Decon Labs	1003
Cotton-tipped applicators	Puritan Medical	25-8061WC
Cryostat	Leica Biosystems	CM3050 S
Cryostat blades	Sakura Finetek USA Inc	4689
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	הכן ל-5 מ"ג/מ"ל ב-ddH2O, מחלקים למנות ושומרים ב-20 °C מוגנים מפני אור
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
EasyDip slide staining system	Electron Microscopy Services	71388-01
Electro-Gel	Bio-Serv	EGS-1
Embedding molds, 22 mm × 22 mm × 20 mm	Polysciences	18646A-1
Ethanol, 200 proof	Decon Labs	V1001
Fenestrated sterile drape sheets	Dukal	20001
Fine forceps	Fine Science Tools	11445-12
Glass bead sterilizer	VWR	75999-324
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11036
Heating pad	CVS	215313
Hemostatic forceps	World Precision Instruments	501705
Immersion oil Immersol 518 F	ZEISS	433802-9010-000
Induction chamber	World Precision Instruments	EZ178
Insulin syringes, 0.3 mL	BD	328431
Iris surgical scissors	Sklar Surgical Instruments	47-1135
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-890-8115
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120
Luer-Lok 1 mL syringes	BD	309628
Luer-Lok 3 mL syringes	BD	309657
Luer-Lok 50 mL syringes	BD	309653
Meloxivet (meloxicam)	Patterson Veterinary	07-894-8524
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	CELLTREAT	229443
Microscope slide box	Heathrow Scientific	15994E
Microscope slide cover glass, #1.5, 22 mm × 50 mm	Electron Microscopy Services	72204-04
Non-CO2 incubator	Benchmark Scientific	H2200-H
Non-fenestrated sterile drape sheets	Dukal	20-002
OCT Compound	Sakura Finetek USA Inc	4583
Opthalmic ointment	Patterson Veterinary	07-888-2572
Osmotic minipumps	Alzet	2004
Parafilm	Bemis	PM999
Paraformaldehyde, 4% w/v	Santa-Cruz Biotechnology	sc-281692
PBS, 1×	Thermo Scientific	10010023
PEG300	Sigma-Aldrich	90878
PES syringe filters, 0.22 μm	CELLTREAT	229747
Povidone iodine 10% USP swabsticks	Medline	MDS093901ZZ
ProLong Glass Antifade	Invitrogen	P36980
Rabbit anti-Tom20 antibody	Novus Biologicals	NBP2-67501
Razor blades, 0.22 mm	VWR	55411-050
Rotator/rotisserie	Labnet	H5500
RStudio	The R Project for Statistical Computing	version 4.3.2
Scale	Fisher Scientific	S72422
SomnoSuite low-flow anesthesia system	Kent Scientific	SS-01
Steam sterilization indicator strips	Crosstex	SIS-250
Sterile glass vials, 5 mL	Thermo Scientific	ST5
Sterile needles, 0.5", 23 G	BD	305145
Sterile needles, 0.5", 27 G	BD	305109
Sterilization pouches	Cardinal Health	92510
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378	הכן תמיסה של 30% w/v ב-1× PBS
Surgical clippers	3M	9680
Surgical gloves	Cardinal Health	2D73DP75
Tissue forceps	Sklar Surgical Instruments	47-1447
Toploading balance	Cole-Parmer	EW-55000-14
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Vetbond tissue adhesive	3M	1469SB